CN110885804B - 一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法 - Google Patents

一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法 Download PDF

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Abstract

一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖‑6‑磷酸的方法，属于酶工程领域，本发明包括克隆耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中；诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，亲和层析纯化获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；将浓度为0.01‑10μg/ml的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、浓度为0.1‑20mM的果糖‑6‑磷酸和浓度为0.1‑20mM的二磷酸尿苷葡糖在70℃下反应1‑24h获得蔗糖‑6‑磷酸。该重组耐高温蔗糖磷酸合成酶最适反应温度为70℃，可耐受温度达100℃，能够在100℃保持酶活性，并催化蔗糖‑6‑磷酸的生成，适用于工业生产蔗糖‑6‑磷酸。

Description

一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的 方法
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法。
背景技术
蔗糖磷酸合成酶(EC 2.4.1.14)(Sucrose-phosphate synthase，SPS)属于GT-B型糖苷转移酶。SPS存在于植物、蓝藻等生命体中。SPS是植物和蓝藻合成蔗糖的一个关键酶，也是合成蔗糖的限速酶。植物和蓝藻可进一步应用磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)水解蔗糖-6-磷酸上的磷酸根而生成蔗糖。
目前，由于蔗糖-6-磷酸的制备和纯化具有一定难度，因此在世界范围内，蔗糖-6-磷酸还没有被商业化。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，以使蔗糖-6-磷酸商业化。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，包括以下步骤：
步骤一、制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；
步骤二、克隆或合成耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中；
步骤三、诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，经亲和层析纯化后获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；
步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1-24h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为0.01-10μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为0.1-20mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为0.1-20mM。
作为优选的实施方式，步骤一的具体操作步骤如下：
摇3-5ml大肠杆菌BL21(DE3)至指数生长期；10000g离心1-2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细胞；10000g离心1-2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细菌，冰浴15-60min；42℃，热激1-2min；加入37℃预热的LB培养基，置于摇床摇1-2小时；离心收菌，将细菌涂于含有卡那霉素的琼脂糖凝胶LB板上。
作为优选的实施方式，步骤二的具体操作步骤如下：
将耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因插入到质粒pET28a中，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因对应的uniprot数据库编号是tll1590，限制性内切酶位点为NdeI和XhoI，耐高温蔗糖磷酸合成酶的cDNA或合成基因末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET28a_tll1590；每0.1ml大肠杆菌BL21(DE3)转0.1-10μg质粒pET28a_tll1590。
作为优选的实施方式，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因是从细长嗜热聚球藻BP-1中克隆或基因合成得到。
作为优选的实施方式，步骤三的具体操作步骤如下：
(1)挑取若干大肠杆菌菌落，并置于5-10ml LB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-220rpm，过夜培养；扩大到1L LB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-220rpm，培养至指数生长期；加入0.1-10mM IPTG诱导蛋白质表达，诱导温度37℃，诱导时间为2-24h；第二天4000-6000g离心收集细菌；
(2)弃上清，加入50ml细菌裂解液，充分悬浮细菌，超声裂解细菌5-30min，功率30％，开3秒，关3秒；
(3)12000-16000g离心15-60min去沉淀，收集上清，上清中含有带His标签的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；
(4)将上清与Ni-NTA结合，结合温度为4℃，结合时间为0.5-2h；
(5)washbuffer洗脱杂蛋白，elutionbuffer洗脱目的蛋白；
(6)按照每管收集1ml蛋白质洗脱液的量收集，采用考马斯亮蓝染液检测目的蛋白；
(7)按照5-10U凝血酶切1mg蛋白的量切His标签，并进行透析，透析液为10mM、pH7.5的Tris-HCl和150mM的NaCl，操作温度为4℃。
作为优选的实施方式，步骤(2)中，所述细菌裂解液中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑。
作为优选的实施方式，步骤(5)中，所述washbuffer中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑。
作为优选的实施方式，步骤(5)中，所述elution buffer中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和500mM的咪唑。
作为优选的实施方式，步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为2μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为10mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为10mM。
本发明还提供一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法合成的蔗糖-6-磷酸。
本发明的有益效果是：本发明利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖合成了蔗糖-6-磷酸。通过对耐高温蔗糖磷酸合成酶进行了原核表达、分离纯化以及酶学性质的鉴定，发现该重组耐高温蔗糖磷酸合成酶具有耐高温的特性，耐受温度可达100℃，适用于工业生产蔗糖-6-磷酸并使蔗糖-6-磷酸商业化。
本发明中的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶能够在100℃保持酶活性，并催化蔗糖-6-磷酸的生成，适用于工业生产蔗糖-6-磷酸。
附图说明
图1为本发明的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法的流程图。
图2为重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的SDS-PAGE分析结果。图中，M、非预染的蛋白质Marker；1、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的条带；2、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的washbuffer流出；3、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的蛋白流出；4、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的蛋白上清；5、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的菌体沉淀；6、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶诱导后；7、重组耐高温的蔗糖磷酸合成酶诱导前。
图3为实施例5中重组耐高温蔗糖磷酸合成酶反应体系的薄层层析(TLC)结果。图中，1、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖生成的蔗糖-6-磷酸；2、蔗糖；3、果糖-6-磷酸。
图4为实施例6中重组耐高温蔗糖磷酸合成酶和磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)反应体系的薄层层析(TLC)结果。图中，1、蔗糖；2、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶和磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)反应生成的蔗糖；3、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖生成的蔗糖-6-磷酸。
图5为温度、pH和反应时间对重组耐高温蔗糖磷酸合成酶活性稳定性的影响。图5a为温度对重组耐高温蔗糖磷酸合成酶活性稳定性的影响；图5b为pH对重组耐高温蔗糖磷酸合成酶活性稳定性的影响；图5c为反应时间对重组耐高温蔗糖磷酸合成酶活性稳定性的影响。
图6为实施例10中质谱分析结果图。图6a为重组耐高温蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖生成的蔗糖-6-磷酸，其中箭头所指的峰就是蔗糖-6-磷酸；图6b为重组耐高温蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖生成的蔗糖-6-磷酸后，加入磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)去磷酸化蔗糖-6-磷酸后产生蔗糖，其中箭头所指的峰就是蔗糖；图6c为蔗糖的标准品，其中箭头所指的峰就是蔗糖。
具体实施方式
如图1所示，本发明的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，主要包括以下步骤：
步骤一、制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞：
摇3-5ml大肠杆菌BL21(DE3)至指数生长期；10000g离心1-2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细胞；10000g离心1-2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细菌，冰浴15-60min；42℃，热激1-2min；加入37℃预热的LB培养基，置于摇床摇1-2小时；离心收菌，将细菌涂于含有卡那霉素的琼脂糖凝胶LB板上。
步骤二、克隆或合成耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中：
将耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因插入到质粒pET28a中，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因对应的uniprot数据库编号是tll1590，限制性内切酶位点为NdeI和XhoI，耐高温蔗糖磷酸合成酶的cDNA或合成基因末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET28a_tll1590；每0.1ml大肠杆菌BL21(DE3)转0.1-10μg质粒pET28a_tll1590。
其中，耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因是从细长嗜热聚球藻BP-1中克隆或基因合成得到。
步骤三、诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，经亲和层析纯化后获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶：
(1)挑取若干大肠杆菌菌落，并置于5-10ml LB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-220rpm，过夜培养；扩大到1L LB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-220rpm，培养至指数生长期；加入0.1-10mM IPTG诱导蛋白质表达，诱导温度37℃，诱导时间为2-24h；第二天4000-6000g离心收集细菌；
(2)弃上清，加入50ml细菌裂解液(50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑)，充分悬浮细菌，超声裂解细菌5-30min，功率30％，开3秒，关3秒；
(3)12000-16000g离心15-60min去沉淀，收集上清，上清中含有带His标签的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；
(4)将上清与Ni-NTA结合，结合温度为4℃，结合时间为0.5-2h；
(5)washbuffer(50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑)洗脱杂蛋白，elutionbuffer(50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和500mM的咪唑)洗脱目的蛋白；
(6)按照每管收集1ml蛋白质洗脱液的量收集，采用考马斯亮蓝染液检测目的蛋白；
(7)按照5-10U凝血酶切1mg蛋白的量切His标签，并进行透析，透析液为10mM、pH7.5的Tris-HCl和150mM的NaCl，操作温度为4℃。
步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1-24h，优选的，反应1h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为0.01-10μg/ml，优选的，浓度为2μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为0.1-20mM，优选的，浓度为10mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为0.1-20mM，优选的，浓度为10mM。
通过本发明的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法合成了一种商业化的蔗糖-6-磷酸。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
材料来源：
质粒pET28a购自Novagen公司。
大肠杆菌感受态BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)有限公司。
超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
Ni-NTA购自Qiagen。
实施例1大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备
摇4ml大肠杆菌BL21(DE3)至指数生长期；10000g离心2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细胞；10000g离心2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细菌，冰浴45min；42℃，热激2min；加入37℃预热的LB培养基，置于摇床摇1.5小时；离心收菌，将细菌涂于含有卡那霉素的琼脂糖凝胶LB板上。
实施例2耐高温蔗糖磷酸合成酶基因的克隆，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)
将耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因(uniprot数据库编号为tll1590)插入到质粒pET28a中，限制性内切酶位点为NdeI和XhoI，耐高温蔗糖磷酸合成酶的cDNA末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET28a_tll1590；每0.1ml大肠杆菌BL21(DE3)转0.1-10μg质粒pET28a_tll1590。
实施例3耐高温蔗糖磷酸合成酶的诱导表达和亲和层析纯化
(1)挑取若干大肠杆菌菌落，并置于10ml LB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为200rpm，过夜培养；扩大到1L LB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为200rpm，培养至指数生长期；加入0.1-10mM IPTG诱导蛋白质表达，诱导温度37℃，诱导时间为16h；第二天5000g离心收集细菌；
(2)弃上清，加入50ml细菌裂解液(50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑)，充分悬浮细菌，超声裂解细菌20min，功率30％，开3秒，关3秒；
(3)12000g离心1h去沉淀，收集上清，上清中含有带His标签的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；
(4)将上清与Ni-NTA结合，结合温度为4℃，结合时间为1h；
(5)washbuffer(50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑)洗脱杂蛋白，elutionbuffer(50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和500mM的咪唑)洗脱目的蛋白；
(6)按照每管收集1ml蛋白质洗脱液的量收集，采用考马斯亮蓝染液检测目的蛋白；
(7)按照10U凝血酶切1mg蛋白的量切His标签，并进行透析，透析液为10mM、pH7.5的Tris-HCl和150mM的NaCl，操作温度为4℃。
实施例4 SDS-PAGE跑胶验证
将实施例3中纯化过程每一步留样，分别加10μl 4×buffer，混匀，100℃煮样10min，上样，跑胶120-220V，使用考马斯亮蓝R-250染液染色，过夜脱色。
结果如图2所示，耐高温蔗糖磷酸合成酶在大肠杆菌中可以表达，并且保持溶解状态，可以使用Ni-NTA亲和层析柱纯化获得，如第1个条带所示。
实施例5薄层色谱分析
(1)重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的反应体系如下：
反应体系总体积：10μl；
10mM Tris-HCl，pH7.5；
10mM果糖-6-磷酸(F6P)；
10mM二磷酸尿苷葡糖(UDPG)；
20ng重组耐高温蔗糖磷酸合成酶。
作空白对照，反应温度为40℃，反应时间为1h。
(2)薄层层析(TLC)
裁适宜大小的硅胶板，四边平行；铅笔划线(注意不要弄坏硅胶，轻轻划线)，距离下边缘大约3mm，点好上样位置，距离适中，做好标记，上边缘也划一条线，防止跑出胶外；毛细管上样，上样10μl，垂直上样，垂直吹干(吹风机)，上一点吹一点(防止晕染)，上完样吹干；展开剂(正丁醇、丙酮、水的体积比为4:3:1)展开，展开剂倒入槽内(提前倒入)，不能高于下边缘划线处，用镊子将点好样的硅胶板放入槽内，尽量垂直，下边缘没入展开剂中，盖上盖子展开1-2h，镊子取出，吹风机吹干；染色，用镊子将硅胶板放入显色剂(2％苯胺丙酮溶液、2％二苯胺丙酮溶液、85％磷酸的体积比为5:5:1)中完全浸没，拿出吹干，放入85℃烘箱，待其显色10-15min，注意全过程干燥。
结果如图3所示，1为重组耐高温蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖而产生蔗糖-6-磷酸(箭头所指)，但是由于蔗糖-6-磷酸的极性很强，所以大部分蔗糖-6-磷酸一直停留在原点，不能在TLC上很好的展开；2为1的反应后，加入了磷酸蔗糖磷酸化酶去磷酸化蔗糖-6-磷酸的结果，该分子可以在TLC上很好的展开；3为单纯的蔗糖-6-磷酸样品(箭头所指)，可以看到该标准样也不能在TLC上很好的展开。总之，通过本次TLC实验可以看到加入磷酸蔗糖磷酸化酶后，反应溶液中出现了一种可以被TLC展开的分子，这种分子是蔗糖。
实施例6薄层色谱分析
(1)重组耐高温蔗糖磷酸合成酶和磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)的反应体系如下：
反应体系总体积：10μl；
10mM Tris-HCl，pH7.5；
10mM果糖-6-磷酸(F6P)；
10mM二磷酸尿苷葡糖(UDPG)；
20ng重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；
20ng磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)。
作空白对照，反应温度为40℃，反应时间为1h。
(2)薄层层析(TLC)：同实施例5步骤(2)。
结果如图4所示，1为单纯的蔗糖标准品(箭头所指)，可以看到该标准样可以在TLC上很好的展开；2为耐高温蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖而产生蔗糖-6-磷酸后，加入了磷酸蔗糖磷酸化酶去磷酸化蔗糖-6-磷酸的结果，该分子可以在TLC上很好的展开，条带的位置和蔗糖标准品一致，说明产生了蔗糖；3为单纯的蔗糖-6-磷酸标准品(箭头所指)，可以看到该标准样不能在TLC上很好的展开。总之，通过本次TLC实验可以证明耐高温蔗糖磷酸可以合成蔗糖-6-磷酸，并且磷酸蔗糖磷酸化酶可以去磷酸化蔗糖-6-磷酸产生蔗糖。
实施例7薄层色谱分析
(1)重组耐高温蔗糖磷酸合成酶反应时间梯度的反应体系如下：
反应体系总体积：10μl；
10mM Tris-HCl，pH7.5；
10mM果糖-6-磷酸(F6P)；
10mM二磷酸尿苷葡糖(UDPG)；
20ng重组耐高温蔗糖磷酸合成酶。
反应温度为40℃，分别反应0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h。
(2)将上述反应完的样品加热至130℃，保持2min，使酶失活；-20℃冻实，离心后加入20ng磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)反应1h，反应温度为40℃，置-20℃终止反应。
(3)薄层层析(TLC)：同实施例5步骤(2)。
结果如图5a所示，重组耐高温蔗糖磷酸合成酶催化的蔗糖-6-磷酸的产量有时间依赖性，在1小时时最大；在1小时之前，蔗糖-6-磷酸的产量在迅速上升；在1小时之后，蔗糖-6-磷酸的产量在逐渐下降。
实施例8薄层色谱分析
(1)重组耐高温蔗糖磷酸合成酶反应温度梯度的反应体系如下：
反应体系总体积：10μl；
10mM Tris-HCl，pH7.5；
10mM果糖-6-磷酸(F6P)；
10mM二磷酸尿苷葡糖(UDPG)；
20ng重组耐高温蔗糖磷酸合成酶。
反应时间为1h，反应温度梯度分别设置为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃。
(2)将上述反应完的样品加热至130℃，保持2min，使酶失活；-20℃冻实，离心后加入20ng磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)反应1h，反应温度为40℃，置-20℃终止反应。
(3)薄层层析(TLC)：同实施例5步骤(2)。
结果如图5b所示，重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的活性有温度依赖性，在70℃时活性最大；在10℃和100℃时，该酶还有活性，说明该酶耐低温也耐高温，尤其是其耐高温的特点，具有应用在工业生产中的巨大潜力。
实施例9薄层色谱分析
(1)根据上述实施例5-8中的薄层层析结果制备相关趋势图：重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的pH稳定性(pH4-10)。
结果如图5c所示，重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的活性有pH依赖性，在pH为8时活性最大；在其他pH也具有活性，所以该重组耐高温蔗糖磷酸合成酶是一个可以耐受各种pH的酶。
实施例10质谱分析
(1)反应体系总体积为100μl。
样品1：0.1mM蔗糖。
样品2：
10mM Tris-HCl，pH7.5；
10mM果糖-6-磷酸(F6P)；
10mM二磷酸尿苷葡糖(UDPG)；
20ng重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；
反应温度为40℃，将反应完的样品加热至130℃，保持2min，使酶失活。
样品3：
10mM Tris-HCl，pH7.5；
10mM果糖-6-磷酸(F6P)；
10mM二磷酸尿苷葡糖(UDPG)；
20ng重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；
反应温度为40℃，将反应完的样品加热至130℃，保持2min，使酶失活；
加入20ng磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)反应过夜，反应温度为40℃。
(2)将上述反应完的样品1、样品2和样品3共同加热至130℃，保持2min，使酶失活；12000rpm离心5分钟，收集上清液。
(3)使用质谱检测反应溶液中的成分。结果如图6所示，重组耐高温蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖生成的蔗糖-6-磷酸，在图6a中箭头所指的峰就是蔗糖-6-磷酸；磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)可以去磷酸化蔗糖-6-磷酸后产生蔗糖，在图6b中箭头所指的峰就是蔗糖。
实施例11蔗糖-6-磷酸的合成
将上述制备并经过鉴定的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1h，获得蔗糖-6-磷酸；重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为2μg/ml，果糖-6-磷酸的浓度为10mM，二磷酸尿苷葡糖的浓度为10mM。
本发明公开了一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

Claims (7)

1.一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；
步骤二、克隆或合成耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中；
步骤二的具体操作步骤如下：
将耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因插入到质粒pET28a中，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因对应的uniprot数据库编号是tll1590，限制性内切酶位点为NdeI和XhoI，耐高温蔗糖磷酸合成酶的cDNA或合成基因末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET28a_tll1590；每0.1ml大肠杆菌BL21(DE3)转0.1-10μg质粒pET28a_tll1590；
步骤三、诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，经亲和层析纯化后获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；
步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1-24h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为0.01-10μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为0.1-20mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为0.1-20mM。
2.根据权利要求1所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因是通过基因合成得到。
3.根据权利要求1所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤三的具体操作步骤如下：
（1）挑取若干大肠杆菌菌落，并置于5-10ml LB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-220rpm，过夜培养；扩大到1L LB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-220rpm，培养至指数生长期；加入0.1-10mM IPTG诱导蛋白质表达，诱导温度37℃，诱导时间为2-24h；第二天4000-6000g离心收集细菌；
（2）弃上清，加入50ml细菌裂解液，充分悬浮细菌，超声裂解细菌5-30min，功率30%，开3秒，关3秒；
（3）12000-16000g离心15-60min去沉淀，收集上清，上清中含有带His标签的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；
（4）将上清与Ni-NTA结合，结合温度为4℃，结合时间为0.5-2h；
（5）wash buffer洗脱杂蛋白，elution buffer洗脱目的蛋白；
（6）按照每管收集1ml蛋白质洗脱液的量收集，采用考马斯亮蓝染液检测目的蛋白；
（7）按照5-10U凝血酶切1mg蛋白的量切His标签，并进行透析，透析液为10mM、pH7.5的Tris-HCl和150mM的NaCl，操作温度为4℃。
4.根据权利要求3所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述细菌裂解液中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑。
5.根据权利要求3所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述wash buffer中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑。
6.根据权利要求3所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述elution buffer中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和500mM的咪唑。
7.根据权利要求1所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为2μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为10mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为10mM。
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