CN106755072A - 一种培育转基因青蒿的方法、所构建的表达载体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种培育转基因青蒿的方法、所构建的表达载体及应用，将青蒿素代谢通路的5个重要酶基因及分支途径鲨烯合酶基因发夹RNA(hpSQS)利用GoldenBraid方法组装为一个T‑DNA，转化青蒿素单倍体植株，进而将阳性转化植株染色体加倍，获得了青蒿素含量高的青蒿纯合品系。本发明的转基因青蒿的青蒿素含量是非转化对照青蒿的3.43倍，本发明的方法对于以青蒿为原料提取青蒿素的药厂节约成本具有重要意义。

Description

一种培育转基因青蒿的方法、所构建的表达载体及应用
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种培育转基因青蒿的方法、所构建的表达载体及应用。
背景技术
青蒿素是从传统中草药黄花蒿(习惯称为青蒿)(Artemisia annua L.)中分离提纯的一种具有抗疟功效的倍半萜内酯过氧化物。青蒿素的高生物利用度衍生物青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚、双氢青蒿素等已被广泛用于疟疾临床治疗，疗效确切且显著，尤其对氯喹抗性疟原虫及致命性脑型疟有效，成为疟疾治疗的一线药物。以青蒿素为基础的联合疗法(ACT)被世界卫生组织(WHO)推荐为治疗抗药性疟疾的首选疗法，其中青蒿琥酯、蒿甲醚及蒿甲醚复方被列入“基本药品目录”。
青蒿素在野生青蒿植株中的含量相对很低，并且变异幅度很大。野生型青蒿中青蒿素含量范围在0.01％-1.0％(植物干重)之间，这使得青蒿素的医疗需求、商业化生产及进一步的研究都受到了很大限制。虽然人工可以合成青蒿素，但成本太高，难度大，产量也比较低，不具备实际生产条件。也有科学家尝试用合成生物学技术手段在微生物体内合成青蒿素，并且取得了很大成就：2003年，美国加州大学的Keasling小组将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS)经密码子优化后导入大肠杆菌中表达，同时用酵母萜类合成途径代替大肠杆菌萜类合成途径，首次在微生物体内合成出青蒿素的第一个关键前体—紫穗槐-4,11-二烯，在6L发酵罐中培养60h的产率达到450mg/L，2013年，Keasling领导的团队又在酿酒酵母中合成青蒿酸(青蒿酸产率达25g/L)，将微生物半合成青蒿素产业化进程向前推进了一大步。
如果说青蒿素合成生物学研究具有革命性和前瞻性，在未来可能取得突破性成果，那么青蒿转基因研究则更有现实意义，因为其成果是优良的青蒿种质。目前国内外在青蒿转基因育种方面已取得诸多进展。中国科学院植物研究所叶和春教授研究小组最早开展转基因青蒿研究，他们将青蒿素合成途径上游的法呢基焦磷酸合成酶基因(FPS)导入青蒿，通过增大青蒿素合成途径的碳流，获得青蒿素含量比对照高3-4倍的转基因青蒿发根(0.2％-0.3％)及比对照高2-3倍的转基因青蒿植株(0.8-1％)。类似地，印度科学家用重组羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(HMGR)培育转基因青蒿植株，其青蒿素含量提高22.5％。Banyai等在青蒿中过表达了FPS基因，使青蒿素含量提高了1.5倍。广州中医药大学曾庆平研究员团队将反义鲨烯合酶基因(asSQS)导入青蒿，通过阻断青蒿类固醇合成分支途径对青蒿素合成分支途径所需法呢基焦磷酸(FPP)的竞争，获得类固醇含量比对照(0.08％)下降约一半(0.04％-0.05％)及青蒿素含量比对照(0.45％)提高近3倍(1.23％)的转基因青蒿植株。上海交通大学唐克轩教授研究小组利用发夹RNA介导以抑制青蒿类固醇合成，使转基因青蒿中的青蒿素含量达到3.14％，比对照提高3.14倍。这些研究结果表明采用基因工程手段，在植物中过量表达次生代谢产物生物合成途径上的基因或者干扰分支途径的表达，对于提高青蒿中青蒿素含量而言是有效的。
青蒿素属于类异戊二烯化合物(isoprenoid)，也称为萜烯类化合物(terpenoid)、萜烯(terpene)。青蒿素的代谢属于植物次生代谢，青蒿素跟其他大多数萜类物质由异戊二烯基本单位构成一样，有共同的前体：异戊烯焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)。高等植物中IPP和DMAPP可以通过胞质途径的甲羟戊酸途径(MVA途径)和质体的非甲羟戊酸途径(MEP途径)合成。并且由这两个途径合成的IPP之间可以互相补充。在IPP前体的两个合成路径中有两个比较关键的酶：一个是3-基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGR)，另外一个是1-去氧木糖-5-磷酸还原酶(1-deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)，2007年Towle等通过抑制MVA或MEP途径证明了青蒿素可以通过胞质的甲羟戊酸途径或质体的非甲羟戊酸途径合成。Schramek等通过同位素标记的13CO2发现法尼基焦磷酸(FPP)由一单位MVA途径生成的异戊二烯和两单位的MEP途径合成的异戊二烯生成。法尼基焦磷酸通过后续的环化氧化等过程可以生成各种类异戊二烯终产物，如青蒿素。
青蒿素特异的合成途径实际上是从紫穗槐二烯合成酶(amorhph-4,11-dienesynthase,ADS)催化FPP生成紫穗槐二烯(amorhph-4,11-diene)开始的，ADS是青蒿素合成途径的第一个关键酶，接下来紫穗槐二烯经过一个细胞色素氧化酶P450(CYP71AV1)的两次氧化生成青蒿醇(artemisinic alcohol)、青蒿醛(artemisinic aldehyde)，从青蒿醛开始到青蒿素的合成目前有两种不同的意见路径:一条通向青蒿素B再由青蒿素B转变为青蒿素,另外一条是通向二氢青蒿酸再转变青蒿素。通向青蒿素B的途径是通过CYP71AV1或一个青蒿醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenasehomologue,ALDH1)催化青蒿醛生成青蒿酸，由青蒿酸到青蒿素B的过程被认为是一个非酶参与的光催化的自发反应，Dhingra和Narasu曾认为青蒿素B可以转化为青蒿素。然而目前在青蒿中还未发现催化青蒿素B到青蒿素的酶。Brown等在2007年的研究结果倾向于证明不存在青蒿素B向青蒿素转变的这一途径，所以目前认为青蒿素B是青蒿素代谢途径中一个分支的终产物。另外一条途径是青蒿醛被一个青蒿醛双键还原酶(Artemisinic Aldehyde△-11(13)Reductase,DBR2)转变为二氢青蒿醛，二氢青蒿醛又经过青蒿醛脱氢酶(ALDH1)的催化转变为二氢青蒿酸(DihydroartemisinicAcid,DHAA)，目前认为二氢青蒿酸是青蒿素的直接前体，由它向青蒿素的转变是一个非酶参与的光催化的自发反应。Wallaart等发现二氢青蒿酸在青蒿素含量高植株中大量积累，并且其含量和青蒿素含量成正比。因此这暗示着在植物体内二氢青蒿酸向青蒿素的转变是一个限速步骤，虽然目前很多证据证明这是一个自发反应，但从理论上讲我们可以找到或创造一个催化此步骤的酶。Ryden等在2010年克隆到一个二氢青蒿醛还原酶(Red1)，发现这个酶同ALDH1竞争共同底物二氢青蒿醛，它将二氢青蒿醛转变为二氢青蒿醇，因此这个酶的作用会减少青蒿素的合成。
多基因的组装往往受载体多克隆位点的限制。目前，有多种载体系统可以提供多基因的组装。如pBECKS2000系列提供一种多基因连接策略，但这个系统仍需要通过常规的酶切除去中间载体骨架，组装只能进行2-3次循环。Goderis等发展了一套最多可以插入6个基因的多基因组装载体系统，转化载体pPZP-RCS的多克隆位点含有13个六碱基限制位点，6个八碱基限制位点和5个homing endonuclease位点。6个中间载体pAUX系列的多克隆位点两侧分别置有上述稀有酶切位点相对应的其中一个。通过酶切连接可以依次将6个中间载体上的表达卡盒转移至转化载体中。Lin等将TAC发展成一套有效的多基因组装系统，利用Cre/loxP位点特异性重组进行多个目的基因的组装。而以homing endonuclease切除中间载体骨架，并使载体在重新连接时接口形成NotI位点，使组装的每个基因两侧都具有NotI位点，可以通过NotI酶切进行鉴定。
上述多基因克隆系统都涉及繁杂的克隆操作，基于IIs型限制性内切酶建立的GoldenBraid系统则具有独特的优势。传统II型限制性内切酶结合和切割回文序列(例如GGATCC)，形成粘性末端。而IIs型限制性内切酶结合不对称的识别元件，并在识别位点以外进行切割。TypeIIs克隆法就是在同一反应体系中，利用IIs型限制性内切酶在识别位点之外切开DNA，产生含粘性末端的片段，再用连接酶将几个片段按顺序连接，拼成不含酶识别位点的DNA。GoldenBraid系统是一种模块化的组装系统，对于启动子、编码序列、终止子等组件(GBparts)赋予不同的首尾部标记，通过两种IIs型限制性内切酶(BsaI和BsmBI)的交叉使用，GoldenBraid系统可以实现转录单位在两类载体中(LEVELα和LEVELΩ载体)的来回组装以致无穷(类似于“编织”，固命名“Braid”)，而仅仅取决于载体的容量。另一方面，由于有多种预制组件(如启动子，终止子，报告基因等)可以使用，大大减少了多基因组装所需的工作量。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是，野生青蒿青蒿素含量过低的问题，主要通过转基因来解决，提供一种青蒿素含量高的转基因青蒿的培育方法。
本发明要解决的技术问题之二是，目前国内外青蒿转基因研究主要集中于1到2个基因。然而，青蒿素的生物合成途径牵涉到复杂的新陈代谢途径，这些途径或反应是由多个基因控制的，多个基因的组装涉及复杂的分子克隆操作。具体来说，青蒿中特有的青蒿素合成代谢途径涉及到紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS)、细胞色素P450单氧化酶基因(CYP71AV1,AMO)及其还原酶基因(CPR)、青蒿醇脱氢酶(ADH1)和青蒿醛脱氢酶(ALDH1)等。
本发明利用植物合成生物学手段快速组装了6个转录单位于一个双元载体。即，将青蒿素合成通路特异基因ADS、AMO、CPR、ADH1、ALDH1五个基因及针对鲨烯合酶基因的内含子发夹RNA(hpSQS)通过GoldenBraid方法组装为一个T-DNA单元进行转化，不仅能简化多基因导入的操作过程，而且使多个基因以一个连锁的基因座整合至植物染色体中，将能更稳定地遗传。
本发明要解决的技术问题之三是，青蒿具有严重的自交不亲合性，难以通过自交等传统育种手段在短期内获得纯合品系，本发明利用花药离体培养产生青蒿单倍体植株，对离体培养的单倍体植株进行农杆菌介导的转基因，再对单倍体进行染色体加倍的方法，来解决这一问题。
在本发明的技术方案中，将青蒿素代谢通路的5个重要酶基因及分支途径鲨烯合酶基因发夹RNA利用GoldenBraid方法组装为一个T-DNA，转化青蒿素单倍体植株，进而将阳性转化植株染色体加倍，获得了青蒿素含量高的青蒿纯合品系。两套染色体上均具有目的基因，后代就不存在性状分离的困扰，从而大大提高了培育效率。
本发明一个具体实施方式提供的方法，为将青蒿素合成代谢通路关键酶基因分别组装为过表达转录单位，将针对于青蒿素分支代谢的鲨烯合酶基因的发夹RNA模块组装为转录单位，然后再利用限制性酶切-连接的方法将上述多个转录单位组装为一个T-DNA单元，转化青蒿单倍体植株，将阳性单倍体植株染色体加倍，得到转基因青蒿。
所述关键酶基因为紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS)、细胞色素P450单氧化酶基因(AMO)及其还原酶基因(CPR)、青蒿醇脱氢酶(ADH1)和青蒿醛脱氢酶(ALDH1)。
所述的过表达转录单位由启动子-关键酶基因的编码序列-终止子三类元件组成。
所述的发夹RNA模块组装的转录单位由NOS启动子-SQS基因片段-内含子-SQS基因倒置片段-NOS终止子几类元件组成。
所述的SQS基因片段大小为363bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.18所示。
在一个具体的实施例中，包括如下步骤：
1.构建含有多个转录单位的T-DNA单元：
1)叶片cDNA的获取：采用Plant Mini Kit(Qiagen,Cat.74904)试剂盒从新鲜叶片中提取总RNA。利用FastQuant RT Kit(Tiangen,Cat.KR106-2)合成cDNA第一链。按照厂商提供的说明书进行实验操作。
2)将各个基因连入入门载体pUPD2：PCR扩增并限制酶切-连接到pUPD2的BsmBI位点。测序鉴定各阳性克隆。内化后的质粒(含有GBparts)分别命名为：pADS、pAMO、pCPR、pADH1、pALDH1、pSQSGOI及pSQSIOG。
3)将各个基因组装为转录单位(TU)：将pADS、pP35S、pTnos通过BtgZI/BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1载体，构建为转录单位TU_P35S:ADS:T35S_Ω1(TU1)，用同样的方法将其余基因组装为：TU_PMtb:AMO:TAct2_Ω2(TU2)，TU_PUbc:CPR:THsp18.2_Ω1(TU3)，TU_PAtUbq10:ADH1:TAtUbq3_Ω2(TU4)，TU_PML1:ALDH1:TE8_α1(TU5)，TU_Pnos:SQSGOI:INT:SQSIOG:Tnos_α2(TU6)。
4)将各个转录单位进行双元组装：TU1与TU2通过BsaI酶切-连接到pDGB1α1(获得的新的质粒称为TU1_TU2_α1)，TU3与TU4通过BsaI酶切-连接到pDGB1α2(获得TU3_TU4_α2)，TU5与TU6通过BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω2(获得TU5_TU6_Ω2)。
5)TU1_TU2_α1与TU3_TU4_α2通过BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1载体(获得的新质粒命名为TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1)，将TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1与TU5_TU6_Ω2通过BsaI酶切-连接到pDGB1α2R载体获得TU1_TU2_TU3_TU4_TU5_TU6_α2R(TU123456_α2R)。
6)将TU123456_α2R与pEGB 1alfa1R Tnos:Hygromycin:PNos(GB0235)通过BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1，由于pDGB1系列载体是基于pGreenII骨架构建的，即将上述7个转录单位连接成了一个T-DNA单元(TU1234567_Ω1)。
2.多基因T-DNA单元转化青蒿单倍体植株，采用潮霉素筛选阳性植株。
3.通过秋水仙碱诱导处理，将青蒿素含量高的单倍体转基因青蒿植株染色体加倍，筛选获得高青蒿素含量的纯系转基因青蒿品种。
上述方法所构建的表达载体在农杆菌介导的植物遗传转化中的应用属于本发明的保护范围。
上述方法所构建的表达载体在培育转基因青蒿的应用也属于本发明的保护范围。
总之，本发明采用多基因组装载体系统结合单倍体育种技术，将关键酶基因及针对分支代谢的鲨烯合酶基因发夹RNA共转化青蒿，提高青蒿中青蒿素的合成，再利用染色体加倍方法培育出青蒿素含量高的青蒿纯合品系。本发明的转基因青蒿的青蒿素含量可以达到非转化对照青蒿的3.43倍。这对于控制青蒿素的成本，促进青蒿素的更广泛应用有重要的价值。对于以青蒿为原料提取青蒿素的药厂节约成本具有重要意义。
附图说明
图1为本发明构建的T-DNA质粒图谱；
图2为候选单倍体青蒿转化植株的PCR检测结果；
图中M标示Marker，WT为未转化的单倍体青蒿植株；
图3为候选转基因植株的实时定量PCR检测结果；
图4为阳性转基因植株青蒿素含量检测结果。
具体实施方式
下述实施例中涉及到多基因组装的质粒(pUPD2、pDGB1Ω1、pDGB1Ω2、pDGB1α1、pDGB1α2、pDGB1α2R及含启动子元件(或终止子元件)的载体)采用Dr.Diego Orzaez实验室的GoldenBraid 2.0Kit(addgene ID:1000000076)，下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
实施例1
pADS的构建
①以SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物，以野生型青蒿叶片cDNA为模板，用Q5DNA聚合酶扩增，获得1#片段(SEQ ID No3)，PCR反应体系为：
5×Q5反应缓冲液 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
cDNA 2μL
Q5超保真DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 28.5μL
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30个循环。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收1.7kb大小的片段。
②在02mL PCR管内配制10μL反应体系：
1#片段 3μL(100ng)
pUPD2(100ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
0.01M DTT 1μL
BsmBI 0.5μL
1μL T4ligase 1μL
ddH2O 2.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pADS，并测序确认。
实施例2
载体pAMO的构建
①以SEQ ID No.4所示的正向引物和SEQ ID No.5所示的反向引物，以野生型青蒿叶片cDNA为模板，用Q5DNA聚合酶扩增，获得2#片段(SEQ ID No.6)，PCR反应体系为：
5×Q5反应缓冲液 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
cDNA 2μL
Q5超保真DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 28.5μL
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30个循环。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收1.5kb大小的片段。
②在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
2#片段 3μL(100ng)
pUPD2(100ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
0.01M DTT 1μL
BsmBI 0.5μL
1μL T4ligase 1μL
ddH2O 2.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pAMO，并测序确认。
实施例3
载体pCPR的构建
①以SEQ ID No.7所示的正向引物和SEQ ID No.8所示的反向引物，以野生型青蒿叶片cDNA为模板，用Q5DNA聚合酶扩增，获得3#片段(SEQ ID No.9)，PCR反应体系为：
5×Q5反应缓冲液 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
cDNA 2μL
Q5超保真DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 28.5μL
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30个循环。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收2.1kb大小的片段。
②在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pCPR，并测序确认。
实施例4
载体pADH1的构建
①以SEQ ID No.10所示的正向引物和SEQ ID No.11所示的反向引物，以野生型青蒿叶片cDNA为模板，用Q5DNA聚合酶扩增，获得4#片段(SEQ ID No.12)，PCR反应体系为：
5×Q5反应缓冲液 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
cDNA 2μL
Q5超保真DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 28.5μL
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30个循环。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收1.2kb大小的片段。
②在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
4#片段 3μL(100ng)
pUPD2(100ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
0.01M DTT 1μL
BsmBI 0.5μL
1μL T4ligase 1μL
ddH2O 2.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pADH1，并测序确认。
实施例5
载体pALDH1的构建
①以SEQ ID No.13所示的正向引物和SEQ ID No.14所示的反向引物，以野生型青蒿叶片cDNA为模板，用Q5DNA聚合酶扩增，获得5#片段(SEQ ID No.15)，PCR反应体系为：
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30个循环。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收1.6kb大小的片段。
②在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
5#片段 3μL(100ng)
pUPD2(100ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
0.01M DTT 1μL
BsmBI 0.5μL
1μL T4ligase 1μL
ddH2O 2.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pALDH1，并测序确认。
实施例6
载体pSQSGOI及pSQSIOG的构建
①以SEQ ID No.16所示的正向引物和SEQ ID No.17所示的反向引物，以野生型青蒿叶片cDNA为模板，用Q5DNA聚合酶扩增，获得6#片段(SEQ ID No.18)，PCR反应体系为：
5×Q5反应缓冲液 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
cDNA 2μL
Q5超保真DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 28.5μL
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，30sec；72℃，10min，30个循环。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收400bp大小的片段。
②在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
6#片段 3μL(100ng)
pUPD2(100ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
0.01M DTT 1μL
BsmBI 0.5μL
1μL T4ligase 1μL
ddH2O 2.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pSQSGOI，并测序确认。
③以SEQ ID No.19所示的正向引物和SEQ ID No.20所示的反向引物，以野生型青蒿叶片cDNA为模板，用Q5DNA聚合酶扩增，获得7#片段(SEQ ID No.21)，PCR反应体系为：
5×Q5反应缓冲液 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
cDNA 2μL
Q5超保真DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 28.5μL
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，30sec；72℃，10min，30个循环。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收400bp大小的片段。
④在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
7#片段 3μL(100ng)
pUPD2(100ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
0.01M DTT 1μL
BsmBI 0.5μL
1μL T4ligase 1μL
ddH2O 2.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pSQSIOG，并测序确认。
实施例7
TU_P35S:ADS:T35S_Ω1(TU1)的构建
将pP35S、pADS、pT35S通过BtgZI/BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1载体，构建为ADS过表达转录单位。在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
pP35S(GB0030)(75ng/μL) 1μL
pADS(75ng/μL) 1μL
pT35S(GB0036)(75ng/μL) 1μL
pDGB1_omega1(75ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
BsmBI 0.5μL
BtgZI 0.5μL
T4ligase 1μL
ddH2O 3μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU_P35S:ADS:T35S_Ω1(TU1)。
实施例8
TU_PMtb:AMO:TAct2_Ω2(TU2)的构建
将pPMtb、pAMO、pTAct2通过BtgZI/BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω2载体，构建为AMO过表达转录单位。在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
pPMtb(GB0080)(75ng/μL) 1μL
pAMO(75ng/μL) 1μL
pTAct2(GB0210)(75ng/μL) 1μL
pDGB1_omega2(75ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
BsmBI 0.5μL
BtgZI 0.5μL
T4ligase 1μL
ddH2O 3μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU_PMtb:AMO:TAct2_Ω2(TU2)。
实施例9
TU_PUbc:CPR:THsp18.2_Ω1(TU3)的构建
将pPUbc、pCPR、pTHsp18.2通过BtgZI/BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1载体，构建为CPR过表达转录单位。在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
pPUbc(GB0145)(75ng/μL) 1μL
pCPR(75ng/μL) 1μL
pTHsp18.2(GB0035)(75ng/μL) 1μL
pDGB1_omega1(75ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
BsmBI 0.5μL
BtgZI 0.5μL
T4ligase 1μL
ddH2O 3μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU_PUbc:CPR:THsp18.2_Ω1(TU3)。
实施例10
TU_PAtUbq10:ADH1:TAtUbq3_Ω2(TU4)的构建
将pPAtUbq10、pADH1、pTAtUbq3通过BtgZI/BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω2载体，构建为ADH1过表达转录单位。在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU_PAtUbq10:ADH1:TAtUbq3_Ω2(TU4)。
实施例11
TU_PML1:ALDH1:TE8_α1(TU5)的构建
将pPML1、pALDH1、pTE8通过BsaI酶切-连接到pDGB1α1载体，构建为ALDH1过表达转录单位。在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
pPML1(GB0045)(75ng/μL) 1μL
pALDH1(75ng/μL) 1μL
pTE8(GB0144)(75ng/μL) 1μL
pDGB1_alpha1(75ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
BsaI 0.5μL
T4ligase 1μL
ddH2O 3.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU_PML1:ALDH1:TE8_α1(TU5)。
实施例12
TU_Pnos:SQSGOI:INT:SQSIOG:Tnos_α2(TU6)的构建
将pPnosNoATG、pSQSGOI、pUPD2_hpIntron、pSQSIOG、pTnos通过BsaI酶切-连接到pDGB1α2载体。在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系，组装为针对鲨烯合酶(SQS)hpRNA的转录单位：
pPnosNoATG(GB0555)(75ng/μL) 1μL
pSQSGOI(75ng/μL) 1μL
pUPD2_hpIntron(GB01281)(75ng/μL) 1μL
pSQSIOG(75ng/μL) 1μL
pTnos(GB0037)(75ng/μL) 1μL
pDGB1_alpha2(75ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
BsaI 0.5μL
T4ligase 2.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU_Pnos:SQSGOI:INT:SQSIOG:Tnos_α2(TU6)。
实施例13
载体TU1_TU2_α1的构建
将TU1、TU2通过BsaI酶切-连接到pDGB1α1载体，组装为载体TU1_TU2_α1。在0.2mLPCR管内配制10μL反应体系：
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU1_TU2_α1。
实施例14
载体TU3_TU4_α2的构建
将TU3、TU4通过BsaI酶切-连接到pDGB1α2载体，组装为载体TU3_TU4_α2。在0.2mLPCR管内配制10μL反应体系：
TU3(75ng/μL) 1μL
TU4(75ng/μL) 1μL
pDGB1_alpha2(75ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
BsaI 0.5μL
T4ligase 2.5μL
ddH2O 3μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU3_TU4_α2。
实施例15
载体TU5_TU6_Ω2的构建
将TU5、TU6通过BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω2载体，组装为载体TU5_TU6_Ω2。在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
TU5(75ng/μL) 1μL
TU6(75ng/μL) 1μL
pDGB1_omega2(75ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
BsmBI 0.5μL
T4ligase 2.5μL
ddH2O 3μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU5_TU6_Ω2。
实施例16
载体TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1的构建
将TU1_TU2_α1与TU3_TU4_α2通过BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1载体，获得载体TU1TU2TU3TU4Ω1。在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1。
实施例17
载体TU123456_α2R的构建
将TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1与TU5_TU6_Ω2通过BsaI酶切-连接到pDGB1α2R载体获得TU1_TU2_TU3_TU4_TU5_TU6_α2R(TU123456_α2R)。在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1(75ng/μL) 1μL
TU5_TU6_Ω2(75ng/μL) 1μL
pDGB1_alpha2R(75ng/μL) 1μL
10×T4Ligase Buffer 1μL
BsaI 0.5μL
T4ligase 2.5μL
ddH2O 3μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU123456_α2R。
实施例18
载体TU1234567_Ω1的构建
将TU123456_α2R与pEGB 1alfa1R Tnos:Hygromycin:PNos(GB0235)通过BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1，由于pDGB1系列载体是基于pGreenII骨架构建的，即将上述7个转录单位连接成了一个T-DNA单元(TU1234567_Ω1)。在0.2mL PCR管内配制10μL反应体系：
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取2μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体TU1234567_Ω1。
实施例19
建立青蒿单倍体植株，具体步骤如下：
(1)青蒿小孢子发育时期的鉴定：在现蕾期，采集不同发育直径的花蕾，将其置于解剖镜下，用针灸针和医用解剖镊剥取花药。将剥离的花药置于普通载玻片上，滴加适量1mol/LHCl解离10min，之后通过常规压片技术压片，并用醋酸洋红染色液染色后镜检。
(2)青蒿花药愈伤组织诱导：通过镜检观察后根据镜检结果选取小孢子发育处于单核期的青蒿花蕾，采集后置于2.0mL无菌离心管，在超净台完成花药的分离和接种操作。愈伤组织诱导培养以MS为基本培养基，补充30g/L的蔗糖、1mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA。装于90mm常规培养皿。将接种过花药后的培养皿置于25℃下黑暗培养20d，以诱导出愈伤组织，之后进行见光培养，培养条件为25℃、光照强度为2 000lx、光照周期为16/8h(光照/黑暗时间比)，见光培养时间为7d。
(3)青蒿花药愈伤组织分化：在诱导出愈伤组织后，将健康的胚性愈伤组织转移至愈伤组织分化培养基，以分化出芽。愈伤组织分化培养基装于150mL三角瓶，每瓶盛装50mL，每个三角瓶内接种5个愈伤组织块。培养基也以MS为基本培养基，补充30g/L的蔗糖，4mg/L6-BA、0.05mg/L NAA。培养条件同愈伤组织诱导见光培养的条件。愈伤组织分化培养的时间为25d左右。
(4)生根壮苗：愈伤组织经过在分化培养基上生长一段时间后会分化出很多丛生芽，剪取茁壮的嫩芽接种于生根培养基。生根培养基装于150mL三角瓶，每瓶盛装50mL，培养基也以1/2MS为基本培养基，补充0.5mg/L NAA。每瓶接种4～6株。生根培养20d左右之后，将再生青蒿小苗移入盛装有珍珠岩的塑料小钵炼苗7d，为之后的入土栽培进行驯化。
实施例20
多基因T-DNA单元转化青蒿单倍体植株，具体方法如下：
(1)采用常规方法制备根癌农杆菌工程菌：将多基因T-DNA单元(TU1234567_Ω1)采用冻融法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，利用含终浓度50μg/mL利福平和100μg/mL壮观霉素的LB固体培养基筛选阳性菌株，得到含有目的基因载体的根癌农杆菌工程菌。
(2)预处理：取青蒿单倍体植株的叶片，在叶片基部切出伤口，浸泡于无菌的0.4M甘露醇溶液中，100rpm振荡6h。
(3)侵染：将经过预处理的叶片置于OD600为0.6-0.8工程菌液中浸泡8-10min，使叶片充分浸润。
(4)共培养：用无菌滤纸吸干叶片表面多余的菌液，然后转至共培养培养基(MS基本培养基+4mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+200umol/L乙酰丁香酮+30g/L蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8-6.0)，28℃暗培养4d。
(5)恢复培养：用上述共培养过的叶片，接入恢复培养基(MS基本培养基+6mg/L6-BA+0.025mg/L NAA+300mg/L Timentin+30g/L蔗糖+0.7％琼脂，pH 5.8-6.0)，在100lx光照下培养10d。
(6)选择培养：共培养结束后，将上述叶片转入选择培养基(MS+6mg/L 6-BA+0.025mg/L NAA+300mg/L Timentin+30mg/L潮霉素+30g/L蔗糖+0.7％琼脂，pH 5.8-6.0)，脱菌的同时对抗性芽进行筛选。培养条件为25℃、光照强度为2 000lx、光照周期为16/8h(光照/黑暗时间比)，每隔2周更换1次新鲜培养基，经过2～3次继代后获得经抗性筛选后的丛生芽。
(7)生根培养：剪取发育良好的抗性丛生芽，转入生根培养基(1/2MS+0.05mg/LNAA+30mg/L潮霉素+30g/L蔗糖+0.7％琼脂，pH 5.8-6.0)上培养、生根，即可获得具潮霉素抗性的青蒿单倍体再生植株。
(8)PCR扩增检测转基因青蒿植株，具体方法如下：
根据HptII报告基因设计引物，采用SEQ ID No.22所示上游引物和SEQ ID No.23所示下游引物进行扩增，PCR反应结束后用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析(结果如图2所示)。
(9)外源基因转录水平的检测：采用Plant Mini Kit(Qiagen,Cat.74904)试剂盒从新鲜叶片中提取总RNA。利用FastQuant RT Kit(Tiangen,Cat.KR106-2)合成cDNA第一链。实时荧光定量PCR检测采用Powrup SYBR master mix(appliedbiosystems,Cat.A25741)，在StepOnePlusTM实时荧光定量PCR仪(ABI)上进行Real-TimePCR扩增。以野生型青蒿作为对照组，检测的目的基因为前述6个基因，即ADS(GenBankaccession No.EF197888.1，所用上下游引物如SEQ ID No.26和27所示)、AMO(GenBankaccession No.DQ268763.1，所用上下游引物如SEQ ID No.28和29所示)、CPR(GenBankaccession No.JN594507.1，所用上下游引物如SEQ ID No.30和31所示)、ADH1(GenBankaccession No.JF910157.1，所用上下游引物如SEQ ID No.32和33所示)、ALDH1(GenBankaccession No.FJ809784.1，所用上下游引物如SEQ ID No.34和35所示)、SQS(GenBankaccession No.AY445506.1，所用上下游引物如SEQ ID No.36和37所示)，内参为管家基因β-ACTIN(GenBank accession No.EU531837.1，所用上下游引物如SEQ ID No.24和25所示)。结果如图3所示。
实施例21
对高青蒿素含量的基因工程青蒿单倍体植株进行染色体加倍，具体方法如下：
(1)选取青蒿素含量高的单倍体植株，切取茎尖(长约5mm)，置于含0.25％秋水仙碱的液体诱导和生长培养基(MS+1mg/L 6-BA+30g/L蔗糖，pH 5.8-6.0)，在100lx光照强度下，120rpm振荡培养48h。
(2)取出茎尖用无菌水冲洗1次，再插入固体诱导和生长培养基(MS+1mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.7％琼脂，pH 5.8-6.0)诱导茎尖生长。培养条件为25℃、光照强度为2 000lx、光照周期为16/8h(光照/黑暗时间比)，每隔2周更换1次新鲜培养基，培养4周。
(3)生根培养：剪取发育良好的无根苗，转入生根培养基(1/2MS+0.25mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.7％琼脂，pH 5.8-6.0)上培养、生根，得到染色体加倍的纯系二倍体植株。
(4)染色体鉴定：生根后切取根尖鉴定植株倍性。
根尖制片方法如下：幼根用0.002mol/L 8-羟基喹啉溶液15℃处理4h，蒸馏水冲洗1次，再用新配置的卡诺氏固定液(无水乙醇与冰醋酸体积比为3:1)室温固定24h，蒸馏水冲洗4次，再用1mol/L HCl 60℃下，解离10min，蒸馏水冲洗2次，再将处理后的根尖置于载玻片上，切取少于1mm的分生组织，加一滴醋酸洋红染色液染色，压片镜检。
实施例22
本发明采用HPLC-ELSD检测青蒿素的含量。以色谱纯的青蒿素标准品作为标准，对转基因青蒿植株、野生青蒿植株等样品的青蒿素含量进行定性与定量分析，具体方法如下：
(1)样品提取：待青蒿长至花蕾前期，收获植株枝条，于55℃烘箱中烘48h至质量恒定。记录此时干重。从其上轻敲下花蕾和叶，研磨成粉末。称取约0.1g干粉溶解于1.5mL甲醇，用40W超声波处理提取20min，4500g离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤收集滤液。
(2)色谱分析：HPLC采用Water Alliance 2695系统控制，分离柱采用美国SepaxRechnologies公司生产的Amethyst C18-H column(250mm×4.6mm；5μm)；流动相为：甲醇和水(体积比为75:25)；流速1mL/min；ELSD检测系统采用water alliance 2420，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，增益为7，载气为纯度0.999氮气。进样量为20μL，每个样品重复进样3次。标准曲线的制作：将青蒿素标准品1mg用1mL色谱纯甲醇溶解(终浓度为1mg/mL)。分别取3、6、9、12、15、18μL进样，每个体积重复进样3次。分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)拟合回归曲线。经计算青蒿素标准曲线方程为y＝6E-08x+0.3221，R2＝0.9937。根据标准曲线计算出青蒿素含量(μg)，再除以样品干重(g)，从而计算出青蒿素占样品干重的百分含量。测定结果如图4所示。
以上实验操作步骤描述了本发明的实施方式，但实施过程中可以有许多等效的修改或者替换。本发明的权利以权利要求书的要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南农业大学
<120> 一种培育转基因青蒿的方法
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
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<212> DNA
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atgtcactta cagaagaaaa acctattcgc cccattgcca actttcctcc aagcatttgg 60
ggagatcagt ttctcatcta tgaaaagcaa gtagagcaag gggtggaaca gatagtgaat 120
gatttaaaaa aagaagtgcg gcaactacta aaagaagctt tggatattcc tatgaaacat 180
gccaatttgt tgaagctgat tgatgaaatc caacgccttg gaataccgta tcactttgaa 240
cgggagattg atcatgcatt gcaatgtatt tatgaaacat atggtgataa ctggaatggt 300
gaccgctctt ccttatggtt ccgtcttatg cgaaagcaag gatattatgt tacatgtgat 360
gttttcaata actataaaga caaaaatgga gcgttcaagc aatcgttagc taatgatgtt 420
gaaggtttgc ttgagttgta cgaagcaact tctatgaggg tacctgggga gattatatta 480
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atggatacat acacagaaat ggaagaattt cttgcaaagg agggaagaac agatctattt 1080
aactgcggca aagaatttgt gaaagagttt gttagaaacc tgatgtttga agcaaaatgg 1140
gcaaatgagg gacacatacc aaccactgaa gagcatgatc cagttgtaat cattactggc 1200
ggtgctaacc tgcttacaac aacttgttat cttggcatga gtgatatatt cacaaaagag 1260
tctgtcgaat gggctgtctc tgcacctcct ctttttagat actcaggtat acttggtcga 1320
cgcctaaatg atctcatgac ccacaaggcc gagcaagaaa gaaaacatag ttcatcgagc 1380
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aaggaagtag aagatgtgtg gaaagatata aaccgagagt acctcacaac taaaaacatt 1500
ccaaggccgt tattgatggc tgtgatctat ttgtgccagt ttcttgaagt tcaatatgca 1560
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<400> 6
atgaagagta tactaaaagc aatggcactc tcactgacca cttccattgc tcttgcaacg 60
atccttttgt tcgtttacaa gttcgctact cgttccaaat ccaccaaaaa aagccttcct 120
gagccatggc ggcttcccat tattggtcac atgcatcact tgattggtac aacgccacat 180
cgtggggtta gggatttagc cagaaagtat ggatctttga tgcatttaca gcttggtgaa 240
gttccaacaa tcgtggtgtc atctccgaaa tgggctaaag agattttgac aacgtacgac 300
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gagcttttga gtgttaagaa agtaaagtca tttcagtcac ttcgtgaaga ggagtgttgg 480
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gttttcaagt tgattgcaac gatacttagt agagccgcat ttgggaaagg gatcaaggac 600
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gcagatatct ttccttcaaa gaaatttctt catcatcttt cgggcaagag agctcggtta 720
actagccttc gcaaaaagat cgataattta atcgataacc ttgtagctga gcatactgtt 780
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ttgcaccctc cactaccctt ggttctgcca agagagtgcc gccaaccagt caatttggct 1140
ggatacaaca tacccaataa gaccaaactt attgtcaacg tctttgcgat aaatagggac 1200
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<211> 2115
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<213> 人工序列
<400> 9
atgcaatcaa caacttccgt taagttatct cccttcgatc taatgacggc gttacttaac 60
ggcaaggtat cgttcgacac atcaaacaca tccgatacga atattccgtt agcggtgttt 120
atggagaatc gtgagctttt gatgatttta actacttcag ttgcggtgtt gatcggatgc 180
gttgtggtgc ttgtgtggag gcggtcgtcg tcggcggcga agagagcggc ggagtcgccg 240
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catgataaac cagagacata tgatcaggat caactgacaa atggccatgc tgttcatgat 900
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acttcggata tctggaattt actctctgag ggagcatatt tgtatgtttg cggtgatgcc 1980
aaaggcatgg ccaaagatgt acatcggact ctgcacacta ttgtgcaaga acagggatct 2040
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atggcccaaa aagctcccgg tgtcatcact tgtaaagccg cggtggtatg ggagtcaagt 60
ggcccagtgg tgctcgagga gataagggtg gatccgccaa aagcatctga agttaggatc 120
aagatgttgt gtgcaagcct ttgtcatact gacgtcttat gcaccaaagg atttcccatt 180
cctttgtttc ctcgtattcc aggacatgaa ggtgttgggg tgattgaaag catagggaaa 240
gacgcaaaag gtttgaaacc aggagacata gtgatgccac tctaccttgg tgaatgtgga 300
caatgcttga actgcaaaac aggaaagacc aacctatgtc atgtttatcc accttcattt 360
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ctcaagatca acccaaaaat ttcttaccct catgctagtt tcctctcatg tggcttcacc 540
actggctttg gtgcgacgtg gagagaaacc caagtctcta agggctcctc agttgctgtt 600
tttggcattg gtactgttgg tttaggggtg ataaaaggag cacagttgca aggagcatca 660
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aacgaagccc ttgaagcctc caaaattgga ataggtacag tggtaccaat aggagcgggt 900
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accgcttttg gtggcgtaag aacccaatct gatcttcctg tcataatcga taaatgcttg 1020
aataaggaaa tacaacttga tgagcttttg acacatgaga tacatttgga caatatacaa 1080
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atgagctcag gagctaatgg aagttctaag tcagcaagcc ataaaatcaa gttcaccaag 60
ctttttatca atggcgaatt tgttgattct atttcaggaa acacttttga cacgattaat 120
ccagcgacag aagaagtgtt agcaacagtg gccgaaggaa gaaaggaaga cattgatttg 180
gccgttaagg ctgcccgtga agctttcgac aatggacctt ggcctcgcat gtctggcgag 240
gcacgccgaa aaatcatgtt aaagttcgca gacttgatcg atgaaaatgc tgacgagtta 300
accaccttag aagtaatcga tggaggaaaa ttgtttggcc cagtgaggca ctttgaagtc 360
ccggtttcat cagatacatt tcgttacttt gcgggtgcag ccgataaaat ccgtggagca 420
actcttaaaa tgtcaagtaa tattcaagct tatacgctac gtgaacccat cggagtagtt 480
ggtcacatca ttccttggaa tggtcctgcc ttcatgttcg ctacaaaggt tgcaccagct 540
ttagctgctg gctgcaccat ggtcatcaag cctgccgaac atactcccct tacagttctc 600
tttttagctc acctgtcgaa gctggctggt gttcctgatg gcgtgattaa tgtggttaac 660
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tttacgggat ccacagaagt tggccgcacc gtaatgcaag ctgcagctct aagtaatctg 780
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gaaggagcgg tgaaagcgtg ggcaacaagg gacccttttg atctcgccac tcgtcatgga 1020
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gaaggtgcga ctttggtaac cggtggtaag ccatttggga agaaaggata ctacattgag 1140
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ctt 363
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cttgatactg ttgaggatga tac 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cacgattgta gatatgctta tga 23

Claims (10)

1.一种培育转基因青蒿的方法，其特征在于包括：
将青蒿素合成通路特异基因ADS、AMO、CPR、ADH1和ALDH1五个基因及针对鲨烯合酶基因的内含子发夹RNA通过GoldenBraid方法组装为一个T-DNA单元；
利用所述T-DNA单元转化青蒿素单倍体植株，然后将阳性转化植株染色体加倍，得到转基因青蒿。
2.根据权利要求1所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：将青蒿素合成通路特异基因分别组装为过表达转录单位，将针对鲨烯合酶基因的内含子发夹RNA模块组装为转录单位，然后再利用限制性酶切-连接的方法将上述多个转录单位组装为一个T-DNA单元。
3.根据权利要求2所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：所述过表达转录单位由启动子-关键酶基因的编码序列-终止子三类元件组成。
4.根据权利要求2或3所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：发夹RNA模块组装的转录单位由NOS启动子-SQS基因片段-内含子-SQS基因倒置片段-NOS终止子组成。
5.根据权利要求4所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：所述的SQS基因片段核苷酸序列如SEQ ID No.18所示。
6.根据权利要求1、2、3或5所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：将各个基因扩增并限制酶切-连接到pUPD2的BsmBI位点，得到载体：pADS、pAMO、pCPR、pADH1、pALDH1、pSQSGOI及pSQSIOG。
7.根据权利要求6所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：将pADS、pP35S、pTnos通过BtgZI/BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1载体，构建为转录单位TU_P35S:ADS:T35S_Ω1(命名为TU1)，用同样的方法将其余基因组装为：TU_PMtb:AMO:TAct2_Ω2(TU2)，TU_PUbc:CPR:THsp18.2_Ω1(TU3)，TU_PAtUbq10:ADH1:TAtUbq3_Ω2(TU4)，TU_PML1:ALDH1:TE8_α1(TU5)，TU_Pnos:SQSGOI:INT:SQSIOG:Tnos_α2(TU6)；
将TU1与TU2通过BsaI酶切-连接到pDGB1α1(获得的新的质粒称为TU1_TU2_α1)，TU3与TU4通过BsaI酶切-连接到pDGB1α2(获得TU3_TU4_α2)，TU5与TU6通过BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω2(获得TU5_TU6_Ω2)；
TU1_TU2_α1与TU3_TU4_α2通过BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1载体(获得的新质粒命名为TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1)，将TU1_TU2_TU3_TU4_Ω1与TU5_TU6_Ω2通过BsaI酶切-连接到pDGB1α2R载体获得TU1_TU2_TU3_TU4_TU5_TU6_α2R(TU123456_α2R)；
将TU123456_α2R与pEGB 1alfa1R Tnos:Hygromycin:PNos(GB0235)通过BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1，得到T-DNA单元。
8.根据权利要求1所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：利用花药离体培养产生青蒿单倍体植株，对离体培养的单倍体植株进行农杆菌介导的转基因，采用潮霉素筛选阳性植株；通过秋水仙碱诱导处理，将单倍体转基因青蒿植株染色体加倍。
9.一种权利要求1～7之一所述方法中所构建的T-DNA单元。
10.一种权利要求9所述T-DNA单元在培育转基因青蒿中的应用。
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