CN115918546B - 一种转基因青蒿以及提高青蒿中青蒿素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种转基因青蒿以及提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明第一方面提供一种转基因青蒿，所述转基因青蒿能够表达ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1、MsGSW2基因，所述ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1、MsGSW2基因分别具有如SEQ ID NO.1‑4、6所示的核苷酸序列。本发明通过多基因组装技术，获得了转基因青蒿，能够有效提高青蒿腺毛密度以及青蒿素含量，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种转基因青蒿以及提高青蒿中青蒿素含量的方法，涉及转基因技术领域。
背景技术
青蒿素是一种含有过氧桥键的倍半萜内酯化合物，对疟原虫具有较强的杀灭作用，是治疗效果最好的抗疟疾药物。青蒿素在青蒿中的含量低，仅占叶片干重的0.1-1％。青蒿是青蒿素的主要来源，提高青蒿中青蒿素的含量具有重要的应用价值和实际意义。通过杂交育种、控制生长环境等方式有助于提高青蒿中青蒿素的含量，但提高效果有限。通过基因工程技术提高青蒿腺毛密度以及提高控制青蒿素合成关键酶的基因的表达，是提高青蒿中青蒿素含量的有效手段。
如何确定合适的基因从而提高青蒿腺毛密度以及青蒿素含量，是本领域技术人员持续关注的问题。
发明内容
本发明提供一种转基因青蒿以及提高青蒿中青蒿素含量的方法，用于提高青蒿腺毛密度以及青蒿素含量。
本发明第一方面提供一种转基因青蒿，所述转基因青蒿能够表达ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1、MsGSW2基因，其中：
所述ADS具有如SEQ ID NO.1所示的核酸序列；
所述CYP71AV1具有如SEQ ID NO.2所示的核酸序列；
所述DBR2具有如SEQ ID NO.3所示的核酸序列；
所述ALDH1具有如SEQ ID NO.4所示的核酸序列；
所述MsGSW2具有如SEQ ID NO.6所示的核酸序列。
进一步地，基于每平方毫米的转基因青蒿叶片，腺毛密度大于等于32个/mm2。
进一步地，基于每片转基因青蒿叶片的干重，青蒿素的含量为16.4-24.7mg/g。
本发明第二方面提供一种提高青蒿中青蒿素的方法，所述方法包括：使青蒿表达ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1、MsGSW2基因。
进一步地，使青蒿表达ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1、MsGSW2基因，具体包括如下步骤：
构建包括所述ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2、MsGSW2、HPTII、Bar基因的重组载体，所述HPTII具有如SEQ ID NO.5所示的核酸序列，所述Bar具有如SEQ ID NO.7所示的核酸序列；
构建包括所述重组载体的重组转化体；
将所述重组转化体转入青蒿中，筛选得到能够表达所述基因的青蒿植株。
进一步地，使青蒿表达ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1、HPTII、MsGSW2、Bar基因，具体包括如下步骤：
构建包括所述ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2、MsGSW2、HPTII、Bar基因的重组载体；
构建包括所述重组载体的重组转化体；
将所述重组转化体转入青蒿中，筛选得到能够表达所述基因的青蒿植株。
进一步地，构建包括所述ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2、MsGSW2、HPTII、Bar基因的重组载体具体包括如下步骤：
分别以所述ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2、MsGSW2、HPTII、Bar基因为模板，在其上游和下游分别连接引物，得到基因扩增片段；所述引物分别具有SEQ ID NO.21-34所示的核苷酸序列；
将所述ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2、MsGSW2、HPTII、Bar的基因扩增片段与pUPD2质粒进行边切边连，获得pUPD2-ADS-2A-CYP71AV1、pUPD2-DBR2-2A-ALDH1、pUPD2-MsGSW2、pUPD2-HPTII、pUPD2-Bar五个一级载体；
将pUPD2-MsGSW2、pUPD2-ADS-2A-CYP71AV1两个一级载体分别与启动子和终止子组合并构建至pDGB3_alpha1载体质粒上，将pUPD2-DBR2-2A-ALDH1、pUPD2-HPTII、pUPD2-Bar三个一级载体分别与启动子和终止子组合并构建至pDGB3_alpha2载体质粒上，获得α1-MsGSW2、α1-ADS-2A-CYP71AV1、α2-DBR2-2A-ALDH1、α2-HPTII、α2-Bar五个二级载体；
将α1-ADS-2A-CYP71AV1与α2-DBR2-2A-ALDH1组合并构建至pDGB3_omega1载体质粒上，将α1-MsGSW2、α2-HPTII组合并构建至pDGB3_omega2载体质粒上，获得Ω1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1和Ω2-MsGSW2-HPTII两个三级载体；
将Ω1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1和Ω2-MsGSW2-HPTII两个三级载体组合并构建至pDGB3_alpha1载体质粒上，得到α1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1-MsGSW2-HPTII四级载体；
将所述α1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1-MsGSW2-HPTII四级载体与α2-Bar二级载体组合并构建至pDGB3_omega2载体质粒上，得到所述重组载体。
进一步地，所述重组载体还包括tpACT启动子，所述tpACT启动子具有如SEQ IDNO.8所示的核酸序列。
进一步地，所述方法还包括：以tpACT启动子为模板，在其上游和下游分别连接引物，得到启动子扩增片段；将所述tpACT启动子分别与pUPD2-ADS-2A-CYP71AV1、pUPD2-DBR2-2A-ALDH1两个一级载体连接，得到α1-ADS-2A-CYP71AV1以及α2-DBR2-2A-ALDH1两个二级载体。
进一步地，所述重组转化体为包括所述重组载体的根癌农杆菌。
进一步地，采用冻融法将所述重组载体导入所述根癌农杆菌中。
本方面通过多基因组装技术，获得了转基因青蒿，能够有效提高青蒿腺毛密度以及青蒿素含量，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。
附图说明
图1为本发明实施例提供的重组载体的构建示意图；
图2为转基因青蒿中MsGSW2的表达量；
图3为转基因青蒿中ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2的表达量；
图4为野生型青蒿与转基因青蒿叶片腺毛的荧光显微镜观察结果；
图5为野生型青蒿与转基因青蒿叶片腺毛的密度统计结果；
图6为野生型青蒿与转基因青蒿中青蒿素含量测定结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1MsGSW2基因的克隆
步骤1、薄荷叶片总RNA的提取
取薄荷叶片组织置于含有2颗钢珠的1.5mL离心管中，液氮速冻，使用研磨仪55HZ，研磨45s，采用康为RNA提取试剂盒提取总RNA。
步骤2、薄荷MsGSW2的PCR扩增
取1μg总RNA采用Takara公司反转录试剂盒PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit(中国，大连)进行反转录，以反转录的cDNA为模板，使用正向引物MsGSW-F(SEQ ID NO.9)和反向引物MsGSW-R(SEQ ID NO.10)进行PCR扩增，得到MsGSW2基因片段，并测序验证，通过测序结果，表明获得了MsGSW2基因，具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
正向引物MsGSW-F:ATGGATAACTATTCCCAACCTTCTTCT；
反向引物MsGSW-R:TTAGAAGGCAGTATAAATCTGCATT。
实施例2ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1基因的克隆
步骤1、青蒿叶片总RNA的提取
取青蒿叶片组织置于含有2颗钢珠的1.5mL离心管中，液氮速冻，使用研磨仪55HZ，研磨45s，采用康为RNA提取试剂盒提取总RNA。
步骤2、ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1的PCR扩增
取1μg总RNA采用Takara公司反转录试剂盒PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit(中国，大连)进行反转录，以反转录的cDNA为模板，使用正向引物ADS-F(SEQID NO.11)和反向引物ADS-R(SEQ ID NO.12)进行PCR扩增，得到ADS基因片段；
正向引物ADS-F:ATGTCACTTACAGAAGAAAAAC；
反向引物ADS-R:TCATATACTCATAGGATAAACG。
使用正向引物CYP71AV1-F(SEQ ID NO.13)和反向引物CYP71AV1-R(SEQ IDNO.14)进行PCR扩增，得到CYP71AV1基因片段，
正向引物CYP71AV1-F:ATGAAGAGTATACTAAAAGC；
反向引物CYP71AV1-R:CTAGAAACTTGGAACGAGTA。
使用正向引物DBR2-F(SEQ ID NO.15)和反向引物DBR2-R(SEQ ID NO.16)进行PCR扩增，得到DBR2基因片段，
正向引物DBR2-F:ATGTCTGAAAAACCAACCTTGTTTT；
反向引物DBR2-R:CTAGAGGAGTGACCCTTTGTCAAGA。
使用正向引物ALDH1-F(SEQ ID NO.17)和反向引物ALDH1-R(SEQ ID NO.18)进行PCR扩增，得到ALDH1基因片段，
正向引物ALDH1-F:ATGAGCTCAGGAGCTAATGGAAGTT；
反向引物ALDH1-R:TTAAAGCCACGGGGAATCATATATG。
所获得的基因片段送往生工生物公司测序，测序结果显示获得了青蒿ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1的基因，分别具有SEQ ID NO.1-4所示的核苷酸序列。
实施例3青蒿tpACT启动子的克隆
取青蒿叶片组织置于含有2颗钢珠的1.5mL离心管中，液氮速冻，使用研磨仪55HZ，研磨45s，采用康为DNA提取试剂盒提取叶片基因组DNA。使用正向引物tpACT-F(SEQ IDNO.19)和反向引物tpACT-R(SEQ ID NO.20)进行PCR扩增，得到tpACT启动子序列片段，
正向引物tpACT-F:AGCTTTAAGAATAAGTCACAT，
反向引物tpACT-R:CTGGTGAAGAAAAAGGAATGG。
所获得的基因片段送往生工生物公司测序，测序结果显示获得了青蒿tpACT启动子，其具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
实施例4一级载体的构建
以实施例1提供的MsGSW2基因序列为模板，采用带有接头的上游特异引物Pupd2-MsGSW2-F(SEQ ID NO.21)和下游特异引物Pupd2-MsGSW2-R(SEQ ID NO.22)进行PCR扩增，获得带接头的MsGSW2片段：
Pupd2-MsGSW2-F：
GCGCCGTCTCGCTCGAATGGATAACTATTCCCAACCTTCTTCT；
Pupd2-MsGSW2-R：
GCGCCGTCTCGCTCAAAGCTTAGAAGGCAGTATAAATCTGCATT；
以实施例2提供的ADS基因序列为模板，采用带有接头的上游特异引物Pupd2-ADS-2A-CYP-F1(SEQ ID NO.23)和下游特异引物Pupd2-ADS-2A-CYP-R1(SEQ ID NO.24)扩增带接头的ADS片段:
Pupd2-ADS-2A-CYP-F1：
GCGCCGTCTCGCTCGA ATGTCACTTACAGAAGAAAAAC；
Pupd2-ADS-2A-CYP-R1：
GCGCCGTCTCGCATCTCCCGCCAACTTGAGAAGGTCAAAATTCAAAGTCTGTTTCACTATACTCATAGGATAAACG。
以实施例2提供的CYP71AV1基因序列为模板，采用带有接头的上游特异引物Pupd2-ADS-2A-CYP-F2(SEQ ID NO.25)和下游特异引物Pupd2-ADS-2A-CYP-R2(SEQ IDNO.26)扩增带接头的2A-CYP71AV1片段；Pupd2-ADS-2A-CYP-F2：
GCGCCGTCTCGGATGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCATGAAGAGTATACTAAAAGC；
Pupd2-ADS-2A-CYP-R2：
GCGCCGTCTCGCTCAAAGCCTAGAAACTTGGAACGAGTA。
以实施例2提供的DBR2基因序列为模板，采用带有接头的上游特异引物Pupd2-DBR2-2A-ALDH1-F1(SEQ ID NO.27)和下游特异引物Pupd2-DBR2-2A-ALDH1-R1(SEQ IDNO.28)扩增带接头的DBR2-2A片段；
Pupd2-DBR2-2A-ALDH1-F1：
GCGCCGTCTCGCTCGAATGTCTGAAAAACCAACCTTGTTTT；
Pupd2-DBR2-2A-ALDH1-R1:
GCGCCGTCTCGCATCTCCCGCCAACTTGAGAAGGTCAAAATTCAAAGTCTGTTTCACGAGGAGTGACCCTTTGTCAAGA。
以实施例2提供的ALDH1基因序列为模板，采用带有接头的上游特异引物Pupd2-DBR2-2A-ALDH1-F2(SEQ ID NO.29)和下游特异引物Pupd2-DBR2-2A-ALDH1-R2(SEQ IDNO.30)扩增带接头的2A-ALDH1片段；
Pupd2-DBR2-2A-ALDH1-F2：
GCGCCGTCTCGGATGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCATGAGCTCAGGAGCTAATGGAAGTT；
Pupd2-DBR2-2A-ALDH1-R2：
GCGCCGTCTCGCTCAAAGCTTAAAGCCACGGGGAATCATATATG。
HPTII基因用于转基因过程中的筛选标记，以人工合成的HPTII基因序列为模板采用带有接头的上游特异引物Pupd2-HPTII-F(SEQ ID NO.31)和下游特异引物Pupd2-HPTII-R(SEQ ID NO.32)扩增带接头的HPTII片段；
Pupd2-HPTII-F：
GCGCCGTCTCGCTCGAATGAAAAAGCCTGAACTCAC
Pupd2-HPTII-R：
GCGCCGTCTCGCTCAAAGCTCATTCCTTTGCCCTCGGAC。
Bar基因用于后代筛选的抗性基因，以人工合成的Bar基因序列为模板采用带有接头的上游特异引物Pupd2-Bar-F(SEQ ID NO.33)和下游特异引物Pupd2-Bar-R(SEQ IDNO.34)扩增带接头的Bar片段；
Pupd2-Bar-F：
GCGCCGTCTCGCTCGAATGAGCCCAGAACGACGCCC
Pupd2-Bar-R：
GCGCCGTCTCGCTCAAAGCTCAGATTTCGGTGACGGGCA
以实施例3提供的tpACT启动子为模板，采用带有接头的上游特异引物Pupd2-tpACT-F(SEQ ID NO.35)和下游特异引物Pupd2-tpACT-R(SEQ ID NO.36)扩增带接头的tpACT片段；
Pupd2-tpACT-F：
GCGCCGTCTCGCTCGGGAGAGCTTTAAGAATAAGTCACATGCT；
Pupd2-tpACT-R：
GCGCCGTCTCGCTCACATTCTGGTGAAGAAAAAGGAATGG。
将MsGSW2扩增片段胶回收后，检测浓度，与pUPD2质粒进行边切边连，获得Pupd2-MsGSW2的一级载体。边切边连体系为：75ng的pUPD2质粒，回收扩增片段的使用量为pUPD2质粒的摩尔数的4倍，1μL的Esp3 I内切酶，1μL的T4连接酶，1μL的F-ATP，无菌水补齐至10μL。反应条件为：37℃10s；37℃4min，16℃5min，25个循环；25℃5min。转化大肠杆菌，阳性克隆进行测序鉴定。
采用与MsGSW2相同的方法，将HPTII、Bar、tpACT的扩增片段回收后与pUPD2质粒进行边切边连，构建得到pUPD2-HPTII、pUPD2-Bar、pUPD2-tpACT三个一级载体，将ADS、CYP71AV1的扩增片段回收后与pUPD2质粒进行边切边连，将DBR2、ALDH1扩增片段回收后与pUPD2质粒进行边切边连，构建得到pUPD2-ADS-2A-CYP71AV1、pUPD2-DBR2-2A-ALDH1两个一级载体。
实施例5二级载体的构建
将实施例4得到的一级载体，与不同的启动子和终止子组合构建至pDGB3_alpha载体上，从而得到二级载体。构建过程如下：
75ng的pDGB3_alpha1载体质粒，75ng的pUPD2-2×35S(启动子)，75ng的pUPD2-MsGSW2，75ng的pUPD2-T35S(终止子)，1μL的Eco31I内切酶，1μL的T4连接酶，1μL的F-ATP，无菌水补齐至10μL，反应条件同实施例3。
75ng的pDGB3_alpha2载体质粒，75ng的pUPD2-2×35S(启动子)，75ng的pUPD2-HPTII，75ng的pUPD2-TNOS(终止子)，1μL的Eco31 I内切酶，1μL的T4连接酶，1μL的F-ATP，无菌水补齐至10μL，反应条件同上。
75ng的pDGB3_alpha2载体质粒，75ng的pUPD2-2×35S(启动子)，75ng的pUPD2-Bar，75ng的pUPD2-T35S(终止子)，1μL的Eco31 I内切酶，1μL的T4连接酶，1μL的F-ATP，无菌水补齐至10μL，反应条件同上。
75ng的pDGB3_alpha1载体质粒，75ng的pUPD2-tpACT(启动子)，75ng的pUPD2-ADS-2A-CYP71AV1，75ng的pUPD2-T35S(终止子)，1μL的Eco31 I内切酶，1μL的T4连接酶，1μL的F-ATP，无菌水补齐至10μL，反应条件同上。
75ng的pDGB3_alpha2载体质粒，75ng的pUPD2-tpACT(启动子)，75ng的pUPD2-DBR2-2A-ALDH1，75ng的pUPD2-TNOS(终止子)，1μL的Eco31 I内切酶，1μL的T4连接酶，1μL的F-ATP，无菌水补齐至10μL，反应条件同上。
经过大肠杆菌转化、菌检和测序获得一系列二级载体，包括：α1-MsGSW2、α2-HPTII、α2-Bar、α1-ADS-2A-CYP71AV1以及α2-DBR2-2A-ALDH1。
实施例6三级载体的构建
将实施例5得到的二级载体，组合构建至pDGB3_omega载体质粒上，由于pDGB3_alpha1和pDGB3_alpha2载体质粒具有不同的酶切位点，能够保证α1在前α2在后，得到三级载体，构建过程如下：
75ng的pDGB3_omega1载体质粒，75ng的α1-ADS-2A-CYP71AV1，75ng的α2-DBR2-2A-ALDH1，1μL的Esp3 I内切酶，1μL的T4连接酶，1μL的F-ATP，无菌水补齐至10μL，反应条件同实施例3。
75ng的pDGB3_omega2载体质粒，75ng的α1-MsGSW2，75ng的α2-HPTII，1μL的Esp3 I内切酶，1μL的T4连接酶，1μL的F-ATP，无菌水补齐至10μL，反应条件同上。
经过大肠杆菌转化、菌检和测序获得一系列三级载体，包括：Ω1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1和Ω2-MsGSW2-HPTII。
实施例7四级载体的构建
将实施例6得到的三级载体，组合构建至pDGB3_alpha载体上，由于pDGB3_omega1和pDGB3_omega2载体质粒具有不同的酶切位点，能够保证Ω1在前Ω2在后，得到四级载体。构建过程如下：
75ng的pDGB3_alpha1载体质粒，75ng的Ω1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1，75ng的Ω2-MsGSW2-HPTII，1μL的Eco31 I内切酶，1μL的T4连接酶，1μL的F-ATP，无菌水补齐至10μL，反应条件同实施例3。
经过大肠杆菌转化、菌检和测序获得四级载体：α1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1-MsGSW2-HPTII。
实施例8最终重组载体(Ω1-ACDAGHB)的构建
将实施例5得到的四级载体与α2-Bar组合构建至pDGB3_omega(Ω)载体上，从而得到最终载体。构建过程如下：
75ng的pDGB3_omega1载体质粒，75ng的α1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1-MsGSW2-HPTII，75ng的α2-Bar，1μL的Esp3 I内切酶，1μL的T4连接酶，1μL的F-ATP，无菌水补齐至10μL，反应条件同实施例3。
经过大肠杆菌转化、菌检和测序获得最终重组载体：Ω1-ACDAGHB。
实施例9转基因青蒿的获得
步骤1、含Ω1-ACDAGHB载体的根癌农杆菌工程菌的获得
将实施例8得到的重组载体采用冻融法转入根癌农杆菌(EHA105，购自澳大利亚CAMBIA公司，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证，验证结果表明，表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
步骤2、根癌农杆菌介导Ω1-ACDAGHB载体转化青蒿
2.1、外植体的预培养
青蒿种子置于2mL离心管中，用70％乙醇消毒45s，12000离心30s，再用30％NaClO消毒10min，12000离心30s，无菌蒸馏水冲洗3-5次，加入1mL蒸馏水重悬种子，倒入MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基中，用移液枪吸取多余液体，置于25℃、16h/8h(光/暗)光照培养间培养，即可获得青蒿无菌苗。待青蒿幼苗第一对真叶完全展开后，剪取无菌苗第一对真叶作为外植体用于转化。
2.2、农杆菌与外植体的共培养
将剪取的第一对真叶置于共培养培养基平板(MS+30g/L Sugar+8g/LAgar+0.5mg/L 6-BA+0.06mg/L NAA)中，倒入稀释好的菌液使菌液没过外植体，轻轻摇晃平板使菌液与外植体充分接触，侵染10min，侵染结束后，用移液枪吸去菌液，将侵染过的外植体置于28℃，黑暗条件下进行共培养2天。
2.3、抗性再生植株的筛选
共培养结束后，将外植体置于筛选培养基平板(MS+30g/L Sugar+8g/LAgar+0.5mg/L 6-BA+0.06mg/L NAA+300mg/L Cef+5mg/L Hyg)中，置于25℃，16/8光周期的温室培养，每隔2周进行一次继代培养，直至丛生芽分化出来，将再生的丛生芽，切去多余组织后放入到壮苗培养基(MS+30g/LSugar+8g/L Agar+0.064mg/L 6-BA+0.026mg/L NAA+300mg/LCef+5mg/LHyg)中进行壮苗培养，当生长状态良好的再生芽生长至约2～3cm长时，用剪刀剪下转移到生根培养基(MS+30g/L Sugar+8g/L Agar+0.05mg/LIBA+300mg/L Cef+4mg/LHyg)中进行生根培养，将生根后的抗性青蒿幼苗从培养瓶中取出，清水洗去根上面附着的培养基，移栽至装有湿润的土壤基质(泥炭土：蛭石＝7:3)的穴盘中，盖上透明的塑料盖以保持湿度。
步骤3、再生转基因青蒿植株的PCR检测
根据目的基因分别设计正向引物计和反向引物对目的基因进行检测，图2为转基因青蒿中MsGSW2的表达量，T2、T8、T9、T10、T12、T15、T16分别代表不同的转基因株系，图3为转基因青蒿中ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2的表达量。
实施例10转基因青蒿叶片表面盾状腺毛密度统计
使用奥林巴斯公司的BX51型号显微镜，在波长为450nm-480nm的激发光下观察非转基因青蒿和再生转基因青蒿的叶片。取同等大小的青蒿叶片，在不同的5个位置随机取样，统计腺毛密度。
图4为野生型青蒿与转基因青蒿叶片腺毛的荧光显微镜观察结果，图5为野生型青蒿与转基因青蒿叶片腺毛的密度统计结果，其中，CK代表野生型青蒿植株，T2\T8\T9分别代表不同的Ω1-ACDAGHB载体转基因青蒿株系，如图5所示，在非转基因青蒿的腺毛密度为19个每平方毫米时，再生转基因青蒿的叶片腺毛密度30个每平方毫米以上，最高提高到42个每平方毫米。**，P<0.01(t检验)。
实施例11利用HPLC-ELSD测定青蒿中的青蒿素含量
(1)HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShield TM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。
ELSD：采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数(gain)为7，载气压力5bar；
精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。
本实施例中流动相为甲醇∶水，比例为70％∶30％时，青蒿素的保留时间为5.1min，峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。
(2)标准曲线的制作
将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μL，4μL，6μL，8μL，10μL记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)进行回归分析。通过研究，本实施例中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为Y＝5.404e+0000X+1.858e+0000，R2＝0.999184。
(3)样品的制备和青蒿素含量的测定
在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于50℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶片，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL离心管中，加入2mL甲醇，用50W低频超声波处理30min，12000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC-ELSD测定青蒿素的含量。采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μL，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。
图6为野生型青蒿与转基因青蒿中青蒿素含量测定结果，如图6所示，转基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到叶片干重的24.7mg/g，是野生型青蒿(7.2mg/g)的3.43倍。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (3)
1.一种提高青蒿中青蒿素的方法，其特征在于，所述方法包括：使青蒿表达ADS、 CYP71AV1、DBR2、ALDH1、MsGSW2基因；
使青蒿表达ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1、MsGSW2基因，具体包括如下步骤：
构建包括所述ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2、MsGSW2、HPTII、Bar基因的重组载体，所述HPTII具有如SEQ ID NO. 5所示的核酸序列，所述Bar具有如SEQ ID NO. 7所示的核酸序列；
分别以所述ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2、MsGSW2、HPTII、Bar基因为模板，在其上游和下游分别连接引物，得到基因扩增片段；所述引物分别具有SEQ ID NO.21-34所示的核苷酸序列；
将所述ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2、MsGSW2、HPTII、Bar的基因扩增片段与pUPD2质粒进行边切边连，获得pUPD2-ADS-2A-CYP71AV1、pUPD2-DBR2-2A-ALDH1、pUPD2-MsGSW2、pUPD2-HPTII、pUPD2-Bar五个一级载体；
将pUPD2-MsGSW2、pUPD2-ADS-2A-CYP71AV1两个一级载体分别与启动子和终止子组合并构建至pDGB3_alpha1载体质粒上，将pUPD2-DBR2-2A-ALDH1、pUPD2-HPTII、pUPD2-Bar三个一级载体分别与启动子和终止子组合并构建至pDGB3_alpha2载体质粒上，获得α1-MsGSW2、α1-ADS-2A-CYP71AV1、α2-DBR2-2A-ALDH1、α2-HPTII、α2-Bar五个二级载体；
将α1-ADS-2A-CYP71AV1与α2-DBR2-2A-ALDH1组合并构建至pDGB3_omega1载体质粒上，将α1-MsGSW2、α2-HPTII组合并构建至pDGB3_omega2载体质粒上，获得Ω1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1和Ω2-MsGSW2-HPTII两个三级载体；
将Ω1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1和Ω2-MsGSW2-HPTII两个三级载体组合并构建至pDGB3_alpha1载体质粒上，得到α1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1-MsGSW2-HPTII四级载体；
将所述α1-ADS-2A-CYP71AV1-DBR2-2A-ALDH1-MsGSW2-HPTII四级载体与α2-Bar二级载体组合并构建至pDGB3_omega2载体质粒上，得到所述重组载体；
所述重组载体还包括tpACT启动子，所述tpACT启动子具有如SEQ ID NO. 8所示的核酸序列；
以tpACT启动子为模板，在其上游和下游分别连接引物，得到启动子扩增片段；将所述tpACT启动子分别与pUPD2-ADS-2A-CYP71AV1、pUPD2-DBR2-2A-ALDH1两个一级载体连接，得到α1-ADS-2A-CYP71AV1及α2-DBR2-2A-ALDH1两个二级载体；
构建包括所述重组载体的重组转化体；
将所述重组转化体转入青蒿中，筛选得到能够表达所述基因的青蒿植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组转化体为包括所述重组载体的根癌农杆菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用冻融法将所述重组载体导入所述根癌农杆菌中。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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