CN105177027A - 一种桃脂肪酸去饱和酶基因PpFAD2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桃脂肪酸去饱和酶基因<i>PpFAD2</i>，来源于桃的脂肪酸去饱和酶基因。通过PCR扩增获得<i>PpFAD2</i>全长序列。<i>PpFAD2</i>的表达量与桃果实亚油酸的积累呈正相关关系。在酵母中进行的体外功能验证表明，<i>PpFAD2</i>可以将油酸转化为亚油酸，具有ω-6脂肪酸去饱和酶功能。在普通烟草中过量表达<i>PpFAD2</i>，转基因植株的脂肪酸组分发生显著变化，主要表现为油酸含量显著下降和亚油酸增加，所述的来源于桃的脂肪酸去饱和酶编码基因<i>PpFAD2</i>在植物的遗传转化中应用。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一个可以改变植物脂肪酸组分比例的桃脂肪酸去饱和酶基因PpFAD2及其应用。
背景技术
亚油酸属于不饱和脂肪酸，它可以降低血液中胆固醇和甘油三酯水平，降低血液黏稠度，改善血液微循环，在预防动脉粥样硬化和心肌梗塞等心血管疾病方面有良好作用。已有研究显示，亚油酸属于必需脂肪酸，人体自身不能合成，需要通过食物进行摄入。对于植物而言，不饱和脂肪酸在应对生长发育过程中的生物与非生物逆境过程中具有重要作用，较高含量的不饱和脂肪酸有利于组织适应低温、高温和盐胁迫等。
由ω-6脂肪酸去饱和酶（FAD）基因编码的去饱和酶可将植物体内的油酸（18:1）转化为亚油酸（18:2）。它作用于碳链的C12与C13之间(Δ12)，引入第二个双键，合成油酸等双不饱和脂肪酸。合成的油酸可以被进一步去饱和，形成亚麻酸和花生四烯酸等多不饱和脂肪酸。目前，已有植物的FAD基因功能研究主要集中在模式材料拟南芥，以及油菜、大豆、花生、橄榄等油料作物，有关FAD在多年生木本植物中的研究比较有限。
桃（Prunuspersica）是多年生的木本植物，属于蔷薇科，其果实因为风味浓郁受到广大消费者的喜爱。如上所述，桃果实的亚油酸是人类必须脂肪酸的来源之一。同时，亚油酸对于桃果实品质也具有重要生物学作用。比如，亚油酸是桃果实香气物质的重要来源，脂肪酸中的亚油酸比例也会改变桃果实的低温适应性，进而对贮藏物流和货架品质产生影响。鉴别出参与桃果实亚油酸生物合成的FAD基因，对于阐明果实品质形成的分子基础具有科学意义，并对改良桃果实品质和健康消费具有应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一个来源于桃的ω-6脂肪酸去饱和酶基因PpFAD2，是一个可以改变植物脂肪酸组分比例的桃脂肪酸去饱和酶基因PpFAD2，具有SEQ:NO.1所示的核苷酸序列。
该基因特征功能如下：
1.基因表达特征：随着桃果实发育成熟，PpFAD2的表达持续增加，与果实中亚油酸的积累呈正相关关系。
2.基因定位特征：PpFAD2编码蛋白含有NNKL内质网定位信号，烟草瞬时表达证明其定位于内质网。
3.基因功能特征：在酿酒酵母中表达pYES-PpFAD2重组载体，通过GC测定其脂肪酸产物，产生了野生酿酒酵母中不存在的亚油酸，证明PpFAD2的编码蛋白具有ω-6脂肪酸去饱和功能，属于ω-6类型的脂肪酸去饱和酶；能将油酸去饱和转化为亚油酸。
4.转基因烟草结果表明，过量表达PpFAD2显著改变叶片组织的脂肪酸组分，表现为油酸含量显著下降和亚油酸含量增加。
本发明另一个目的是提供PpFAD2在植物的遗传转化中的应用，利用基因工程技术将PpFAD2-SK重组载体转化普通烟草，获得过表达PpFAD2的转基因烟草植株，使得转基因植株的脂肪酸组分发生显著变化，脂肪酸的不饱和度提高。通过GC检测T1代叶片脂肪酸含量，显示油酸含量显著降低而亚油酸含量增加，说明PpFAD2可以在植物中行使ω-6脂肪酸去饱和功能。
本发明公开了一个新的来源于桃的脂肪酸去饱和酶基因PpFAD2。通过PCR扩增获得PpFAD2全长序列。PpFAD2的表达量与桃果实亚油酸的积累呈正相关关系。在酵母中进行的体外功能验证表明，PpFAD2可以将油酸（18:1）转化为亚油酸（18:2），具有ω-6脂肪酸去饱和酶功能，可用于植物的遗传转化。在普通烟草中过量表达PpFAD2，转基因植株的脂肪酸组分发生显著变化，主要表现为油酸含量显著下降和亚油酸增加，显著改变了烟草中脂肪酸成分亚油酸和油酸的含量和比值。
附图说明
附图1：桃果实的PpFAD2表达与亚油酸含量具有正相关关系。
附图2：PpFAD2编码蛋白定位于内质网。
附图3：真核表达结果显示PpFAD2编码蛋白催化油酸（18:1）生成亚油酸（18:2）。
附图4：烟草过量表达PpFAD2显著改变脂肪酸的含量和比例。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。
实施例1：PpFAD2基因表达
（一）实验方法
1.桃果实材料
不同发育阶段的桃果实取自花后9w、12w、15w，采收后贮藏3d和6d，分为3个重复，每个重复5个果实，果皮和果肉分别取样，液氮冻存后存放于-80℃冰箱待用。
2.桃果实脂肪酸分析
不同发育阶段的果实样品用液氮研磨后，转移至50ml离心管中，加入15ml正己烷：异丙醇（V:V=3:2）溶液和7.5ml0.67%Na2SO4（m:v=0.67%）溶液，涡旋2min混匀后，在10000g，4℃条件下离心10min。转移上清至新的50ml离心管中，于原离心管中加入15ml正己烷：异丙醇溶液，涡旋2min后离心，条件同前，合并两次上清，加入100μl浓度为8mg/ml的内标十七烷酸（17:0）。45℃旋转蒸干溶液，然后加入3ml甲酯化溶液（甲醇：甲苯：浓H2SO4=88:10:2，体积比），涡旋混匀后将其加入4ml带盖玻璃小瓶中，80℃水浴1h，进行甲酯化反应。完成后，加入1ml正庚烷，颠倒混匀，充分静置后，吸取上层300μl上层溶液，加入约0.5g无水硫酸钠，除去多余水分，再用0.22μm有机滤膜除去杂质后，样品即可进行GC检测。检测所用色谱柱为DB-Wax（30m×0.25mmID，0.25μm，Agilent，美国），升温程序为50℃，1min，然后以25℃/min的速率升至200℃，以3℃/min的速度升至230℃，保持3min。
3.RNA提取和cDNA合成
分别称取桃果实果皮和果肉各1g，利用CTAB法提取总RNA，具体步骤如下：样品充分研磨后加入含有65℃预热的4mlCTAB（含有β-巯基乙醇）提取缓冲液的10ml离心管中，涡旋混合后65℃水浴5min；加入4ml氯仿：异戊醇（24:1）溶液进行萃取，涡旋混合；15℃，10000rpm离心10min，吸取上清到新的10ml离心管中，重复上述步骤进行二次萃取，合并两次所得上清；加入1/4体积的10mol/L的LiCl，放置在4℃冰箱过夜。次日，在4℃条件下10000rpm离心30min，弃上清，加入400μl65℃预热的SSTE溶液，溶解沉淀；然后加入500μl氯仿：异戊醇（24:1）溶液涡旋混合进行萃取，将液体全部转移到1.5ml离心管中，10000rpm离心15min，吸取上清转移至新的1.5ml的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），上下颠倒混匀，-80℃放置30min以上；4℃10000rpm离心20min，弃清液，用枪头轻轻吸去残余的液体，加入20μlDEPC水溶解沉淀，所得即为总RNA。
总RNA用TURBODNaseKit（Ambion，美国）试剂盒去除基因组DNA污染后，取1.0μgRNA按iScriptcDNASynthesisKit（Bio-Rad，美国）试剂说明书操作合成cDNA。
4.RT-qPCR分析
以桃PpTEF2（SEQ:NO.16）为内参基因，引物为SEQ:NO.17和SEQ:NO.18，PpFAD2引物为SEQ:NO.4和SEQ:NO.5。RT-qPCR反应体系为20μl，成分分别为：10μlSsofastEvaGreenSupermix（Bio-Rad，美国），上下游引物（10μM，Invitrogen）各1μl，2μlcDNA，6μlH2O。RT-qPCR反应程序为95℃反应3min；95℃反应10s，60℃反应30s，45个循环；熔点曲线检测程序为，从60℃按照0.5℃/s速率上升至95℃，连续读取荧光信号值。所用仪器为CFX96实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国），每次检测都包括以H2O作反应模板的阴性对照，检测数据采用相对定量△Ct方法，用内参基因PpTEF2的Ct值进行归一化。
（二）实验结果
PpFAD2在桃果实果皮和果肉中具有一致的变化趋势，随着果实发育表达量显著增加。而桃果皮和果肉组织中的亚油酸含量，也随着果实发育和成熟衰老显著增加。在果皮和果肉中，PpFAD2的表达量和亚油酸的积累呈显著正相关关系。
实施例2：亚细胞定位
（一）实验方法
1.基因克隆和载体构建
结合引物对SEQ:NO.6和SEQ:NO.7，利用PCR技术，分别扩增所得两个基因，其中PCR体系（50μl）为：10×Buffer(含Mg2+)5μl，dNTP（2.5μm）4μl，上/下游引物各5μl，酶0.5μl，cDNA4μl，DEPC-H2O26.5μl，；PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个热循环；72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物和目标载体pGreen002962-SK-GFP用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行双酶切反应，反应产物用SolutionI连接混合液（Takara）进行连接反应，转化大肠杆菌后，挑取阳性菌落用测序（Invitrogen，美国）手段进一步确定序列的正确性。将构建的表达载体通过电击导入GV3101::pSoup农杆菌感受态细胞中，将菌液涂布于含25μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，筛选阳性克隆后，用甘油保存于-80℃备用。
2.烟草瞬时表达和荧光观察
将含有重组质粒PpFAD2-GFP和含有内质网定位标记载体ER-mcherry的甘油农杆菌分别在含25μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培养基上划线，倒置培养48h，然后挑取单菌落至3ml含有相同抗生素的培养基中，28℃培养24h。室温条件下用3000g转速离心10min，用渗透液（10mMMES，10mMMgCl2，150mM乙酰丁香酮，pH=5.6）将OD600调至0.75。将PpFAD2-GFP与ER-mcherry菌液以1:1比例混合，注射至约4周大小的本氏烟叶片，每株注射三片叶子。恢复生长2d后进行荧光显微观察。将注射的烟草叶片剪至5mm2大小左右，避开叶脉处，下表皮朝上，用蒸馏水浸润后盖上盖玻片，进行观察。观察条件为，GFP的激发波长为488nm，发射波长为507nm；mCherry的激发波长为587nm，发射波长为610nm。
（二）实验结果
烟草瞬时表达结果证明PpFAD2-GFP和内质网定位指示载体ER-mcherry发光区域重叠（附图1），因此说明PpFAD2编码的去饱和酶定位于内质网。
实施例3：酿酒酵母异源表达
（一）实验方法
1.重组载体构建和酵母转化
结合引物对SEQ:NO.8和SEQ:NO.9，利用PCR技术扩增获得PpFAD2，PCR体系及反应程序同实施例1。PCR产物和目标载体（pYES2NT/C，Invitrogen）用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后，分别连接，转化大肠杆菌，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的质粒利用LiAC法（Clontech，美国）转化至酿酒酵母株系INVSc1中，28℃倒置培养3d后挑取阳性菌落，用20%无菌甘油保存于-80℃冰箱中。
2.诱导表达
将保存于-80℃冰箱的酵母甘油菌在冰上解冻，用划线棒沾取少量菌液在SD-Ura平板上划线，平板于30℃培养箱中倒置培养3-4d，直到出现~2mm的单菌落。然后将平板于4℃冰箱中保存，最长可保存2个月。挑取3个直径约2mm左右的单菌落于1mlSD–Ura+glucose培养液中，涡旋混匀后再转移至已灭菌的100ml锥形瓶，补足15mlSD–Ura+glucose培养液。在30℃，250rpm摇床上培养24h后，OD600通常在1.5左右。培养注意事项包括，每5ml培养液需挑取一个菌落，涡旋震荡有助于酵母分散，利于后续培养，此步骤不可省略，且酵母生长时需要大量氧气，培养体积不应超过培养容器的1/5。先取1ml培养24h的菌液，测得OD600，然后按照稀释至50ml体积OOD600为0.4~0.5的培养液计算需要的菌量，计算公式如下：V×1.5=50ml×（0.4~0.5），V为所需菌液体积。将菌液转移至已灭菌的50ml离心管中，4℃，1500g，离心5min，然后弃上清，加入50mlSD–Ura+galactose悬浮菌体后转移至已灭菌的250ml锥形瓶中。在30℃，250rpm条件下培养24h，然后检测OD600，此时将达到1.5~1.7，已经进入酵母对数生长的中后期。离心收集菌体，条件为4℃，1500g，离心5min，弃上清后，加入1ml无菌水，将其转移至2ml离心管中，12000rpm，离心30s，弃上清，然后将收集的菌体于-80℃保存。
3.脂肪酸检测
将收集的菌体用液氮研磨，转移至10ml离心管中，加入5ml正己烷：异丙醇（V:V=3:2）溶液和2.5ml0.67%Na2SO4（m:v=0.67%）溶液，提取过程、甲酯化和检测过程同实施例一中的“桃脂肪酸分析”，所添加的内标十七烷酸（17:0）浓度调整为4mg/ml，添加50μl。
（二）实验结果
在酿酒酵母中诱导PpFAD2-pYES重组载体表达，可大量合成野生型酿酒酵母中不存在的16:2和18:2，证明PpFAD2编码的去饱和酶具有ω-6去饱和功能。
实施例4：烟草过量表达PpFAD2
（一）实验方法
1.载体构建
结合引物对SEQ:NO.11和SEQ:NO.12，利用PCR技术扩增获得PpFAD2，PCR体系及反应程序同实施例1。PCR产物和目标载体（pGreen002962-SK）用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后，分别连接，转化大肠杆菌，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的质粒利用电击法转化农杆菌株系GV3101::pSoup，28℃倒置培养2d后挑取阳性菌落，用20%无菌甘油保存于-80℃冰箱中。
2.转基因植株鉴定
经基因工程技术转化普通烟草获得转化植株后，需要进一步通过PCR和qPCR手段进行验证。利用CTAB法提取烟草叶片DNA，利用所得的DNA做模板，结合引物对SEQ:NO.15和SEQ:NO.16，用PCR进行转基因植株鉴定，其中PCR体系（20μl）为：10×Buffer(含Mg2+)2μl，dNTP（2.5μm）1.6μl，上/下游引物各0.6μl，酶0.1μl，DNA溶液2μl，用DEPC-H2O补足20μl；PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个热循环；72℃延伸7min，4℃保存。
取经过PCR鉴定的植株叶片，利用TRIzol（Invitrogen）提取烟草总RNA，合成cDNA过程如实施例1所述。以普通烟草EF1-α基因（SEQ:NO.19）作为内参基因，引物为SEQ:NO.20和SEQ:NO.21，PpFAD2引物物对为SEQ:NO.14和SEQNO.15。RT-qPCR反应体系和反应程序同实施例1。
3.脂肪酸检测
取0.2g充分研磨的烟草叶片提取脂肪酸，提取过程同实施例2。内标调整为100μl17:0溶液（4mg/ml），检测时采用分流进样，分流比为3:1。
（二）实验结果
与野生的烟草植株相比，过量表达PpFAD2的转基因烟草植株油酸（18:1）含量显著降低，而18:2有所增加，18:2与18:1的比例极显著增加，证明PpFAD2编码的蛋白在植物体内也可以实现ω-6去饱和功能，消耗18:1，合成18:2。
对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
<110>浙江大学
<120>一种桃脂肪酸去饱和酶基因PpFAD2及其应用
<160>11
<210>1
<211>1149
<212>DNA
<213>桃(Prunuspersica)
<221>CDS
<222>(1)...(1149)
<400>
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<213>桃(Prunuspersica)
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<400>
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<212>DNA
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<222>(1)...(22)
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<210>19
<211>1344
<212>DNA
<213>普通烟草（Nicotianatabacum）
<221>CDS
<222>(1)...(1344)
<400>
ATGGGTAAAGAGAAGGTTCACATCAACATTGTGGTCATTGGCCACGTCGACTCTGGTAAGTCGACTACCACTGGTCACTTGATCTACCTTGGTGGTATTGACAAGCGTGTCATTGAGAGGTTTGAGAAAGAAGCTGCTGAGATGCACAAGCGGTCATTCAAGTATGCCTGGGTGCTTGACAAACTAAAGGCTGAGCGTGACCGGGGTATCACTATTGATATCGCCTTGTGGAAGTTTGAGACCACCAAGTACTACTGCACTGTGATTGATCGTCCTGGACACAGGGATTTCATCAAGAATATGATTACTGGTACCTCCCGTGCCTGTCGTGTCCTGATTGTTGCCTCCACCACTGGCTTTGCACAAGCTGGTAATCTCAAGGATGGACAGACCCGTGAAAGACTGCTTATTGACTCCACCACTGGTAACACCCTTGGTGTCACCCAAATGATTTGCTGCTGCAACAAGATGGATGCTACCACCCCCAAGTATTCCAAGGCTAGGTACGATGAAATCGTGAAGGAGGTTTCTTCCTACCTCAAGAAGGTAGGATACAACCCTGACAAGATCCCCTTTGTCCCCATCTCTGGTTTGGAAGGTGACAACATGCTCGAAAGATCAACAAACCTTGACTGGTACAAGGGCCCAACACTTCTTGATGCTCTTGACCAGATTAATGAGCCCAAGAGGCCCACAGACAAGCCTCTCAGGCTCCCACTTCAGGATGTTTACAAGATTGGTGGAATTGGTACTGTCCCTGTTGGTCGTGTGGAAACTGGTGTCCTCAAGCCTGGTATGGTTGTTACTTTTGGTCCCACTGGTCTGACCACTGAAGTTGGATCTGTTGAGATGCACCACGAAGCTCTTCAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTTGGATTTAATGTCAAGAATGTTGCGGTTAAGGATCTCAAGCGTGGGTTTGTTGCTTCCAACTCCGGATGTCCCAGCAATGGGTGCTTCAGCTTTACCTCCCAAGCTATCATCATGAACCATTCAGGACAGATTGGCAATGGATATGCTCCAGTTCTGGACTGCCACACCTCCCATGCTGTCAGTGCAGAAATTTTGACCAATATTGCCAGGCGTTCTGGTCAGGAGATTGCGAAAGAGCCCAGGTTCCTTTTGAATGGTTGTGCTGGTTTTGTTATGATGATTCCCACCCTACCCATGGTTGTTGCAAGGATCCTCTCTGCGTACCCACCATTGGAGCGTTTTGCGTTCAGGAGCATGCGTCAAACTGTTGCTGTTGGTGTTATCAAGAACGTTGTCAAGAAGGACCCAACTGGTGCTATGGTCACCAAGGCTGCTCAGAAGAAGAAATGA
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<222>(1)...(21)
<400>GCCCAACACTTCTTGATGCTC
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<222>(1)...(20)
<400>GACACCAGTTTCCACACGAC
Claims (2)
1.一种桃脂肪酸去饱和酶基因PpFAD2，来源于桃的脂肪酸去饱和酶编码基因，具有SEQ:NO.1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的一种桃脂肪酸去饱和酶基因PpFAD2在植物的遗传转化中应用，其特征在于，利用基因工程技术将PpFAD2-SK重组载体转化普通烟草，获得过表达PpFAD2的转基因烟草植株，使得转基因植株的脂肪酸组分发生变化，脂肪酸的不饱和度提高。
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|---|---|---|---|
| CN201510609420.4A CN105177027A (zh) | 2015-09-22 | 2015-09-22 | 一种桃脂肪酸去饱和酶基因PpFAD2及其应用 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105400805A (zh) * | 2015-12-24 | 2016-03-16 | 浙江大学 | 一个参与桃果实脂肪酸形成的基因及其应用 |
| CN116121092A (zh) * | 2022-11-01 | 2023-05-16 | 四川大学 | 多重胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN1930277A (zh) * | 2004-02-27 | 2007-03-14 | 巴斯福植物科学有限公司 | 在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法 |
-
2015
- 2015-09-22 CN CN201510609420.4A patent/CN105177027A/zh active Pending
Patent Citations (1)
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