CN102367446A - 白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因的序列，以及这种基因序列的制备方法和用途。白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因的制备是用白沙蒿的RNA反转录为cDNA，再根据其它植物的(AsHPT)基因保守区设计相应的简并引物与巢式引物进行扩增得到白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因的全长翻译区核苷酸序列；利用转基因技术进行的功能验证证明该基因表达可以使烟草叶片和种子维生素E含量分别升高7.6倍和9.8倍。本发明的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因可用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的转基因工作中。

Description

白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因及用途

技术领域

本发明涉及一新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)及其制备与用途。

背景技术

维生素E，又被称作生育酚。是一种动物正常繁殖所必须的物质，能抗不育和防止早产、流产，参见宋晓燕，杨天奎“天然维生素E的功能及应用”《中国油脂》2002，25(6)：45-48。维生素E作为饲料添加剂，可以提高动物的免疫力、改善肉质、奶质并提高繁殖能力和缓解动物应激反应参见：肖雄.“维生素E的研究与应用”《畜禽业》2002，4：24-26。维生素E与人体中枢神经系统，心血管系统有着密切的关系，现代医学证明：维生素E可以防治冠心病、高血压、心肌梗塞、血栓等疾病参见：Ajjawi I.and Shintani D.“Engineered plantswith elevated vitamin E：a nutraceutical success story”《Trends Biotech》2004，22(3)：104-107；Vertuani S，Angusti A and Manfredini S.“The antioxidants andpro-antioxidants network：An overview.”《Cur Pharmaceutical Design》2004，10(14)：1677-1694。维生素E还有美容、护肤、防衰老、抗癌等功效，参见：雷炳福“我国天然维生素E产业化前景初探”《中国油脂》2003，28(4)：49-51。

维生素E存在于植物的不同组织：包括绿色光合组织和种子等。不同植物中维生素E的组成、含量及总量有着十分大的差异(参见表一)。尿黑酸叶绿基转移酶(HPT)基因是介导维生素E合成的关键酶基因，控制着生育酚总量的合成。GenBank中已公布了拟南芥、木薯、玉米、小麦、葱、芫荽等植物的尿黑酸叶绿基转移酶(HPT)基因的核苷酸序列和氨基酸序列。

表1沙蒿油与其他植物油VE含量(单位：mg/kg)

发明内容

本发明提供一种取自沙生植物-白沙蒿的HPT基因，以及这种基因的制备方法及用途。

白沙蒿(Artemisia sphaerocephala krasch)是我国特有的优良超旱生固沙植物，是我国沙区畜牧业的重要饲料之一。几乎所有植物油均含有维生素E，但含量远不及国际上公认为植物油含维生素E之冠一，小麦胚芽油。从沙篙籽中提取的沙篙油，经测试维生素E含量达到2779.1mg/kg，高于小麦胚芽油中维生素E的含量，参见：白寿宁，云秀芳“沙篙油开发利用探讨”《粮食与油脂》，2000(3)：31-33。

本发明所述的白沙蒿HPT基因序列为基因序列表中的SEQ 1。

本发明所涉及的白沙蒿HPT基因制备方法是：首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的HPT基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿HPT核心片段核苷酸序列；根据测序得到的HPT基因核心片段序列分别设计白沙蒿HPT基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿HPT基因核心片段序列分别设计白沙蒿HPT基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的白沙蒿HPT  5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿HPT基因的全长翻译区核苷酸序列。

在引物的5’端分别加入XbaI和XhoI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。在模式植物烟草中的功能验证表明：As-HPT的表达显著提高了转基因植物叶片和种子中维生素E的总量，其含量分别为野生型的7.6倍和9.8倍。

维生素E作为一种有效的抗氧化剂，在各种生物逆境(病原体，病原体植物互做)及非生物逆境(干旱、低温、紫外辐射、盐、重金属)胁迫引起的氧化损伤中发挥作用，因此本专利申请中的白沙蒿HPT基因也可能在这些过程中发挥作用。

本发明具体采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下：

P1：5’-CACACRRTWATWGGMACWGC-3’-3’，

P2：5’-YTCWGCRTARAAKAGCTTCC-3’；

P3为：5’-TACTGCAAATCCTAACACCAAAAACC-3’

P4为：5’-TCAGAGCAATGAGACCGGATAACGCC-3’，

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’；

P5为：5’-ATGGTACCGGTACACACAGTCTTGGC-3’，

P6为：5’-AGGGTACTACCGATTTGTATGGAAGC-3’，

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’。

P7：5’-GCTCTAGAGAAAACAATGGAGTTATCAC-3’

P8：5’-CGCTCGAGTCAGATGAAAGGAAAAATG-3’

P9：5’-CGGAGCTCCTCGAGGAATTTCCCC GATC-3’

P10：5’-CGGAATTCAAGCTTCCGATCTAGTAACATAGATG-3’

其中：R＝A or G；Y＝C or T；K＝G or T；W＝A or T；M＝A or C。

本发明所涉及的白沙蒿HPT基因可在油料作物的转基因工作中应用，也可在牧草等作物的转基因工作中应用，也可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的转基因工作中应用，可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。

维生素E对于人类和动物具有不可忽视的营养价值，而它同时在植物体中具有重要生理功能。维生素E可提高植物的抗氧化作用，能通过清除脂质过氧化物所产生的自由基而稳定生物膜的脂双层，使细胞免受过氧化物的伤害，维生素E可以独立或协同细胞中其他抗氧化产物，参与各种抗氧化作用，有效地保护细胞，是一种有效的抗氧化剂，参见：Brigelius-Floh ER and Traber M G..“Vitamin E：Function and metabolism”《The FASEB》1999，13：1145-1155.。同时还具有信号传导，参与光电子循环等作用，参见：Munne-Bosch S，“Function andmetabolism of tocopherols and tocotrienols in plants”《The FASEB》2002，16：1028-1039。

由于白沙蒿生长在干旱荒漠地区，长期经历干旱、高温、冻害等逆境胁迫，使其自身进化出一定的防御机制，而提高维生素E合成量。其维生素E含量提高的作用机制之一有可能是其HPT基因核苷酸编码的氨基酸在催化活性上有特殊性。而我国西北、华北、东北荒漠半荒漠地区的特有植物白沙蒿所具有的抗风沙，耐旱、耐寒、有极强的耐瘠薄性特性，使白沙蒿HPT成为是一种可对植物，如油料作物，或者牧草作物，或其它的植物，甚至非植物的其它生物进行基因改造的最佳材料。

本发明中，经相关实验表明，采用白沙蒿的叶片提取其RNA较采用白沙蒿的其它组织提取RNA更为方便，并且本发明提取的HPT基因在叶片中表达，因此在植物抗逆过程中发挥着更重要的作用。

附图说明：

图1.pBI121载体改造示意图

图2.NOS片段扩增

以pBI121质粒为模板，Np1、Np2为引物扩增nos终止子片段，pBI121中所含终止子片段大小为253bp，由于上下游引物均添加酶切位点，所以扩增出的产物大小约为265bp。电泳检测目的条带也正好与预期扩增片段大小一致(图2)，初步说明获得扩增片段正确，是pBI121终上子nos序列。

图3pBI121-G的验证

将改造的的pBI121-G用XbaI和XhoI进行双酶切，如果能够切掉1812bp大小的GUS片段，则说明终止子nos片段部分改造正确，也即XhoI和HindIII两个酶切位点也已添加上去。酶切后的电泳电泳检测结果(图3)表明，确实有预期大小的片段被切下(pBI121-G上XbaI和XhoI两酶切位点之间大约有1900bp大小的片段)。

图4HPT cDNA RT-PCR扩增结果

图中：1-3.HPT cDNA RT-PCR产物；M.DNA分子量标准

图5：HPT表达载体的构建示意图

用XbaI、XhoI双酶切含HPT基因的T载体和pBI121-G质粒，回收T载体上切下的HPT基因和切掉GUS基因的pBI121-G载体大片段，T4连接酶连接得到植物表达载体pBI121-G-HPT。

图6：植物表达载体pBI121-G-HPT的双酶切鉴定

以引物P11、P12对含有质粒pBI121-G-HPT的大肠杆菌菌液进行PCR，扩增得到片段大小约为1152bp左右(图6)。然后，从含有表达载体的大肠杆菌中提取质粒，利用XbaI、XhoI双酶切进行验证，切下了1152bp的基因片段，说明植物表达载体pBI121-G-HPT已构建完成。

图7植物表达载体导入农杆菌的PCR鉴定

图中1-3.HPT cDNA RT-PCR产物；M.DNA分子量标准

图8：转基因烟草的转化和植株再生过程，其中：A为烟草与农杆菌共培养；B、C为愈伤组织诱导；D、E为芽分化；F为根分化；

具体实施方式

以下提供具体实施方式及相关实验数据：

一、以白沙蒿为材料提取RNA，反转录为cDNA。

白沙蒿(Artemisia sphaerocephala)种子采自内蒙古阿拉善左旗，播种在营养钵内，置于温室，按常规方法培养，3周龄时，取幼嫩的叶片为材料，按上海生工((上海生工生物工程技术服务有限公司，上海市松江区车墩工业区香闵路698号，邮编201611)UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行RNA提取。按照按宝生物(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，得到cDNA。

根据通常的作法，一般多是采用植物的籽种提取RNA。但实验表明，采用白沙蒿的籽种提取RNA非常的困难，经常无法实现操作，经反复试验表明，采用白沙蒿的叶片，特别是用3周龄的嫩叶提取会有极好的效果。

二、核心片段RT-PCR扩增

参照宝生物Taq使用说明书进行，在200μl的离心管中加入下列反应液：

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。将目的片段与克隆载体的连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序，得到837bp核心片段。

三、白沙蒿HPT基因5’和3’末端的克隆(5’RACE和3’-RACE)

3.1白沙蒿总RNA反转录前处理(按照Invitrogen RACE试剂盒操作指南进行)

3.1.1白沙蒿总RNA脱磷酸基团

脱磷酸基团反应：

(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)50℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：

(1)加入90μl DEPC水、100μl酚∶氯仿(25∶24)，漩涡震荡30s。

(2)20℃下12000rpm离心5min，吸取上清(约100μl)转移至新的离心管中。

(3)依次加入2μl 10mg·ml^-1Mussel Glycogen、10μl 3mol·L^-1NaAc(pH5.2)和220μl 95％乙醇，颠倒混匀，冰浴10min。

(4)4℃、12000rpm离心20min，弃上清，小心不要弃掉沉淀，加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀。

(5)4℃、12000rpm离心20min，小心吸去乙醇，再次离心弃去残留乙醇。

(6)20℃下干燥沉淀1-2min，加入7μl DEPC水溶解，为下步去帽反应备用。

3.1.2白沙蒿mRNA去除帽子结构

去帽反应：

(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：方法同3.1.1。

3.1.3去帽后的白沙蒿mRNA和RNA oligo连接

连接反应：

(1)在含有0.25μg GeneRacer^TM RNA Oligo的离心管中加入7μl上述反应液，轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(2)65℃温育5min，消除RNA二级结构。

(3)冰浴2min，短暂离心。

(4)依次加入以下试剂：

(5)轻轻混匀，短暂离心。

(6)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：方法同3.1.1。沉淀用10μl DEPC水溶解。

3.2第一链cDNA的合成

(1)在上述获得的10μl ligated RNA中加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)65℃温育5min以除去RNA二级结构，冰浴1min，短暂离心收集液体。

(4)于冰上依次加入下列试剂：

(5)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(6)25℃温育5min，50℃温育1h，70℃温育5min，冰浴2min，短暂离心收集液体。

(7)加入1μl RNase H(2U·μl^-1)，37℃温育20min，短暂离心收集液体。

(8)-20℃保存备用或即可进行5’和3’外侧PCR扩增反应。

3.3白沙蒿HPT基因5’末端克隆

外侧PCR反应

在200μl离心管中加入下列反应液：

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

巢式PCR反应

取1μl上述PCR产物为模板，加入下列反应液进行巢式PCR

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

反应结束后用1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。回收PCR产物并连接至pGM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选以及菌体PCR，将阳性克隆送去上海生工测序。

3.43’末端PCR扩增

外侧PCR反应

在200μl离心管中加入下列反应液：

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

巢式PCR反应

取1μl 上述PCR产物为模板，加入下列反应液进行巢式PCR

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

反应结束后用1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。回收PCR产物并连接至pGM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选以及菌体PCR，将阳性克隆送去测序。

经过测序，5’和3’RACE巢式PCR扩增产物分别为446bp和300bp，与前述所得到的白沙蒿HPT基因核心片段都有部分核苷酸重叠，并且在与GeneBank中比对发现扩增出来的片段与其他植物HPT基因5’和3’端具有同源性。因此，扩增得到的5’和3’RACE-PCR产物分别为同一cDNA的5’和3’端。

四、PCR扩增翻译区全长序列

根据已克隆到的白沙蒿HPT基因的5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿HPT基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的5’端分别加入XbaI和XhoI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。

在200μl的离心管中加入下列反应液：

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

胶纯化和回收获得的目的基因产物，连接到pGM-T Vector，转化至E.coliDH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序，得到1146bp HPT全长基因翻译区序列。

五、烟草的遗传转化及鉴定

5.1实验中涉及的材料、菌株及培养基

5.1.1植物材料：烟草NC89(中国农业科学院实验室赠送)。

5.1.2载体与菌株pBI121载体、根癌农杆菌GV3101和大肠杆菌DH5α均由本实验室保存；

PMD simple 19T载体购自TaKaRa公司。

5.1.3培养基Trizol RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、高保真酶、Taq酶、引物和各种内切酶均购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自Omega公司；加A试剂盒购自上海生工公司。

5.2具体试验方法

5.2.1pBI121载体的改造(图1)

5.2.1.1引物设计及基因扩增

根据NCBI上公布的pBI121的NOS基因序列设计一对引物P9、P10。扩增体系条件如下：

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、回收(图2)。

5.2.1.2重组质粒及其鉴定

将胶回收后的目的片段，加A后连接T载体，连接产物再转化大肠杆菌感受态细胞。将转化的大肠杆菌感受态细胞涂布在含Amp50mg/L、40μL(50mg/mL)X-gal、40μL(50mg/mL)IPTG的LB平板上进行蓝白斑筛选。对所获得的白斑通过PCR扩增及酶切鉴定后，送阳性菌株到上海生工公司测序，所测序列与原序列进行比对分析，结果表明高保真酶扩得的片段全部正确，两侧酶切位点也均已加上去。。

5.2.1.3pBI121载体改造

T载体和pBI121均用SacI、EcoRI双酶切，T载体回收270bp左右的nos片段，pBI121回收大片段。两回收产物用T4连接酶连接。连接产物再转化大肠杆菌感受态维胞，经菌体PCR和酶切鉴定，完成pBI121改造，命名为pBI121-G(图3)。

5.2.2HPT基因植物表达载体的构建

5.2.2.1RT-PCR扩增HPT基因

采用Trizol法从白沙蒿叶子中提取总RNA，然后通过RT-PCR反转录成cDNA，以反转录的cDNA为模板，P7、P8为上下游引物扩增HPT基因，1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果(图4)。将胶回收后的目的片段，加A后连接T载体，连接产物再转化大肠杆菌感受态细胞，如前描述方法涂布，送阳性菌株测序。

5.2.2.2HPT表达载体构建(图5)

5.2.2.3HPT基因表达载体的验证分析

以引物P7、P8对含有质粒pBI121-G-HPT的大肠杆菌菌液进行PCR，扩增得到片段大小约为1152bp左右(图6)。然后，从含有表达载体的大肠杆菌中提取质粒，利用XbaI、XhoI双酶切进行验证，切下了1152bp的基因片段，说明植物表达载体pBI121-G-HPT已构建完成。

5.3烟草的遗传转化

5.3.1农杆菌GV3101感受态细胞的制备

1)挑单菌落于2mlYEP培养基(含Rif50mg/ml)中28℃过夜活化。

2)取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右。

3)5k rpm离心5分钟。

4)在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5)5krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

5.3.2DNA转化农杆菌GV3101

1)在50μl农杆菌感受态细胞中加1ug质粒，冰上放置30分钟。

2)液氮中冷冻5分钟。

3)37℃水浴热激5min。

4)加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr(低速)

5)取出菌液于相应抗生素(100ug/ml Kan和50ug/mlRif)的平板上，28℃培养2-3天。

5.3.3含有重组质粒pCAMBIA1301-MsD6D的农杆菌PCR鉴定

挑取YEP平板上的单菌落，接种于5mLYEP液体培养基(含有卡那霉素100μg/mL和利福平50μg/mL)，28℃200rpm培养2～3d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR(图7)。

5.3.5农杆菌培养

1)从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3ml YEB液体培养基中(Str 25μg/ml、Rif50μg/ml、Kan 80μg/ml)于恒温摇床上27℃，180rpm摇培过夜至OD₆₀₀为0.6-0.8。

2)摇培过夜的菌液按1％-2％的比例，转入新配置的无抗生素的YEB培养基中，在与上述相同的条件下培养6h左右，OD₆₀₀为0.2-0.5时即可用于转化。

5.3.6侵染

于超净工作台上，将菌液倒入无菌的小培养皿中。取不具Kan抗性的烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm²的小块，放入菌液中，浸泡适当时间(一般5-10min)。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

5.3.7共培养

将侵染后的烟草叶片接种在不含任何激素和抗生素的MS基本培养基(T1)上，用封口膜封好培养皿，28℃黑暗中培养2-4天。

5.3.8选择培养

将黑暗中共培养2-4天的烟草叶片转移到筛选培养基(T2)中，用封口膜封好培养皿，在光照为2,000-10,000lux、25-28℃、16/8hd^-1光暗条件下选择培养。

5.3.9生根培养

约2-3周后，特不定芽长到1cm左右时，切下不定芽并转移到生根培养基(T3)上进行生根培养，5-10天后长出不定根。

转基因烟草再生过程见图8.

六转基因烟草维生素E含量测定

方法参照：Pascal Rippert等“Engineering Plant Shikimate Pathway for Production ofTocotrienol and Improving Herbicide Resistance”Plant Physiology，2004，Vol.134，pp.92-100.具体步骤如下：

每一个株系，采集幼嫩叶片冻干保存。150mg冻干样用液氮研磨，氩存在条件下暗光下加入2mL己烷3次以防止维E降解。将上清液混合，有氩条件下脱水干燥，溶解于3mL充有氩的甲醇中，冻于-80℃用于后期测定。种子中生育酚的测定，提取方法相似，省去冻干过程，用新鲜成熟种子提取测定。对于生育酚的测定，100微升样品注射到C18HPLC column。通过290nm激发产生的荧光来检测维E，在325nm记录。通过与标准物的比较给生育酚定量。HPLC系统包含两个510HPLC泵和一个712WISP自动采样器(Waters)，一个HPLC UV检测器，一个SFM 25荧光检测器(Kontron Instruments，Eching，Germany)。以CH3OH∶H2O(96∶4[v/v])为溶剂，流速设置为：1mLmin-1。定量通过对峰面积的测定进行。通过与标准曲线的对比将峰面积转化生育酚的毫克数。

表2非转基因及转基因植物维生素E含量

生育酚以四种形式天然存在：按甲基位置分为α、β、γ和δ四种。高等植物叶片中生育酚主要以α-生育酚的形式存在，而种子中主要以γ-生育酚为主要存在形式。从表结果可以看出As-HPT的表达显著提高了转基因植物叶片和种子中维生素E的总量，其含量分别为野生型的7.6倍和9.8倍。

Claims (8)

1.白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因，其特征是其基因序列为SEQ1。

2.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因制备方法，其特征是首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的HPT基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿HPT核心片段核苷酸序列；根据测序得到的HPT基因核心片段序列分别设计白沙蒿HPT基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿HPT基因核心片段序列分别设计白沙蒿HPT基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；将所得到的三段序列，白沙蒿HPT核心片段核苷酸序列、5’末端核苷酸序列和3’末端核苷酸序列，进行拼接，得到目标基因。

3.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因制备方法，其特征是采用白沙蒿的叶片提取RNA。

4.权利要求2或3所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因制备方法中所用的相关引物，其特征是：

上游引物P1为：

5’-CACACRRTWATWGGMACWGC-3’-3’，

下游引物P2：

5’-YTCWGCRTARAAKAGCTTCC-3’；

P3为：5’-TACTGCAAATCCTAACACCAAAAACC-3’

P4为：5’TCAGAGCAATGAGACCGGATAACGCC-3’，

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’；

P5为：HPT P3：5’-ATGGTACCGGTACACACAGTCTTGGC-3’，

P6为：5’-AGGGTACTACCGATTTGTATGGAAGC-3’-3’， 

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’。

P7：5’-CGTCTAGAATGCTAAACTCAGATGAAAGG-3’

P8：5’-CGCTCGAGTCAGATGAAAGGAAAAATG-3’

其中：R＝A or G；Y＝C or T；K＝G or T；W＝A or T；M＝A or C。

5.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因在油料作物的转基因工作中的应用。

6.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因在牧草作物的转基因工作中的应用。

7.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因在在除权利要求4或5所述的植物外的植物中的转基因工作中的应用。

8.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因在在除植物外的其它生物的转基因工作中的应用。 

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