CN102367447A - 白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因的序列，以及这种基因序列的制备方法和用途。白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因的制备是用白沙蒿的RNA反转录为cDNA，再根据其它植物的γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因保守区设计相应的简并引物与巢式引物进行扩增得到白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因的全长翻译区核苷酸序列；本发明的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因可用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的转基因工作中。

Description

白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因及用途

技术领域

本发明涉及一种新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因及其制备与用途。

背景技术

维生素E，又被称作生育酚。是一种动物正常繁殖所必须的物质，能抗不育和防止早产、流产，参见：宋晓燕，杨天奎“天然维生素E的功能及应用”《中国油脂》2002，25(6)：45-48。维生素E作为饲料添加剂，可以提高动物的免疫力、改善肉质、奶质并提高繁殖能力和缓解动物应激反应参见：肖雄.“维生素E的研究与应用”《畜禽业》2002，4：24-26。维生素E与人体中枢神经系统，心血管系统有着密切的关系，现代医学证明：维生素E可以防治冠心病、高血压、心肌梗塞、血栓等疾病参见：Ajjawi I.and Shintani D.“Engineered plantswith elevated vitamin E：a nutraceutical success story”《Trends Biotech》2004，22(3)：104-107；Vertuani S，Angusti A and Manfredini S.“The antioxidants andpro-antioxidants network：An overview.”《Cur Pharmaceutical Design》2004，10(14)：1677-1694。维生素E还有美容、护肤、防衰老、抗癌等功效参见：雷炳福“我国天然维生素E产业化前景初探”《中国油脂》2003，28(4)：49-51。

维生素E存在于植物的不同组织：包括绿色光合组织和种子等。不同植物中不仅维生素E总量有差异，在生育酚的4种异构体中的组成比例也存在一定差异。由于人和动物肝脏中有生育酚亲和蛋白，通过它的介导，表现出了对α-生育酚明显的亲和性，因此，α-生育酚总被优先吸收和利用。在生育酚的4种异构体中α-生育酚生物活性最高，β、γ、δ-生育酚分别是α-生育酚相对活性的50％、10％和3％，参见：KamalEldin A and Appelqvist LA.“The chemistryand antioxidant properties of tocopherols and tocotrienols”《Lipids》1996，31：671-701。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因是提高生育酚中α-生育酚的含量和比例的关键酶基因。GenBank中已公布拟南芥、棉花、马铃薯、番茄、小麦、水稻等植物的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列。

发明内容

本发明提供一种取自沙生植物-白沙蒿的γ-TMT基因，以及这种基因的制备方法及用途。

白沙蒿(Artemisia sphaerocephala krasch)是我国特有的优良超旱生固沙植物，是我国沙区畜牧业的重要饲料之一。白沙蒿是我国西北、华北、东北荒漠半荒漠地区的特有植物，其抗风沙，耐旱、耐寒、耐瘠薄性能极强。几乎所有植物油均含有维生素E，但含量远不及国际上公认为植物油含维生素E之冠一，小麦胚芽油。从沙篙籽中提取的沙篙油，经测试维生素E含量达到2779.1mg/kg，高于小麦胚芽油中维生素E的含量，且其α-生育酚含量极高，可以达到2705.7mg/kg。参见：白寿宁，云秀芳“沙蒿油开发利用探讨”《粮食与油脂》，2000(3)：31-33。

表1沙蒿油与其他植物油α-VE含量(单位：mg/kg)

本发明所述的白沙蒿γ-TMT基因序列为基因序列表中的SEQ1或SEQ10。

本发明所涉及的白沙蒿γ-TMT基因制备方法是：首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的γ-TMT基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿γ-TMT核心片段核苷酸序列；根据测序得到的γ-TMT基因核心片段序列分别设计白沙蒿γ-TMT基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿γ-TMT基因核心片段序列分别设计白沙蒿γ-TMT基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的白沙蒿γ-TMT 5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿γ-TMT基因的全长翻译区核苷酸序列。

在引物的5’端分别加入XbaI和SacI酶切位点序列，便于基因编码区与植物表达载体重组。在后续载体构建过程中，我们采用了高保真Taq进行扩增，得到产物经测序发现比前期780bp白沙蒿γ-TMT基因的全长开放阅读框序列，在后面的基因功能验证中采用的是这段序列，即SEQ10。

从表达结果可以看出As-γ-TMT改变了转基因植物中维生素E组成比例，提高了叶片和种子中α-VE的组成比例：野生型烟草叶片中α/γ比值为2.4，转基因烟草中α/γ为7.98。；野生型烟草种子中未检测到α-VE，转基因种子烟草中α-VE含量占为总生育酚量的50％。

维生素E不但是一种营养物质，并且它的抗氧化功能也普遍为人所知。白沙蒿γ-TMT基因有可能在低温、高温、盐、重金属等逆境胁迫中中发挥作用。

本发明具体采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下：

上游引物P1：

5’-AYGAGTCKTCYGGVWTWTGG-3’

下游引物P2：5’-WATCCYTCWATCATCARTGG-3’

P3为：5’-CCTTGCGCTACCCCCGATGCCACACC-3’

P4为：5’-TCAGATATCTCCACAACAGCACCAGG-3’

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’

P5为：5’TACCTTCCTGCTTGGTGTTCTACGGC-3’

P6为：5’-TTAGTAATGCCACTGATGATAGAGGG-3’

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’

P7：5’-GCTCTAGAATGACTTCCTTACACTGCAGCG-3’

P8：5’-CGAGCTCCCACTTATTCAGGCTTTTTACACG-3’

其中：R＝A or G；Y＝C or T；K＝G or T；W＝A or T；V＝A or C or G。

本发明所涉及的白沙蒿γ-TMT基因可在油料作物的转基因工作中应用，也可在牧草等作物的转基因工作中应用，也可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的转基因工作中应用，可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。

维生素E对于人类和动物具有不可忽视的营养价值，而它同时在植物体中具有重要生理功能。维生素E可提高植物的抗氧化作用，能通过清除脂质过氧化物所产生的自由基而稳定生物膜的脂双层，使细胞免受过氧化物的伤害，维生素E可以独立或协同细胞中其他抗氧化产物，参与各种抗氧化作用，有效地保护细胞，是一种有效的抗氧化剂，参见：Brigelius-Floh ER and Traber M G..“Vitamin E：Function and metabolism”《The FASEB》1999，13：1145-1155.。同时还具有信号传导，参与光电子循环等作用，参见：Munne-Bosch S，“Function andmetabolism of tocopherols and tocotrienols in plants”《The FASEB》2002，16：1028-1039。

我们推测由于白沙蒿生长在干旱荒漠地区，长期经历干旱、高温、冻害等逆境胁迫，使其自身进化出一定的防御机制，而提高维生素E合成量。其α-维生素E含量提高的作用机制之一有可能是其γ-TMT基因核苷酸编码的氨基酸在催化活性上有特殊性。其次，在干旱、高温、冻害和贫瘠等逆境胁迫下生长的白沙蒿具有抗旱、耐高温、耐冻和耐贫瘠性的品质。因此白沙蒿γ-TMT基因是一种可对植物，如油料作物，或者牧草作物，或其它的植物，甚至非植物的其它生物进行基因改造的最佳材料。

本发明经相关实验表明，采用白沙蒿的叶片提取其RNA较采用白沙蒿的其它组织提取RNA更为方便。

附图说明：

图1.TMT基因开放阅读框扩增琼脂糖凝胶电泳图

注：M：DNA分子量标准；1：TMT基因开放阅读框PCR扩增产物2：阳性克隆PCR产物

用引物P7和P8经RT-PCR方法扩增含有XbaI和SacI酶切位点的TMT基因ORF，得到一条清晰的约1000bp的单一亮带，与推测的1012bp一致。将该片段与pMD Simple 19克隆载体连接后，进行菌落PCR鉴定，结果得到的片段大小与RT-PCR扩增得到的一致(图1)。将鉴定得到的阳性克隆进行测序，测序结果基因ORF序列完全一致，说明没有发生碱基突变，将该阳性克隆命名为pMD-TMT。

图2.白沙蒿PBI121-TMT植物表达载体构建示意图

将粘性末端pBl121载体和TMT基因ORF进行连接，转化大肠杆菌反应，然后将阳性克隆质粒进行特异PCR扩增和限制性酶切，结果PCR扩增出的片段和质粒的限制性酶切片段长度均在1000bp左右，大小一致，初步认为TMT基因ORF已正确地连接到PBI121表达载体上。阳性克隆菌液送至上海生工测序，测序结果显示目的基因序列正确，插入方向准确无误，表明已得到植物表达载体PBI121-TMT。

图3.PBI121和pBI-TMT双酶切鉴定图

注：M：DNA分子量标准；1-3：SacI和XbaI双酶切质粒PBI121；4-6：SacI和XbaI双酶切重组质粒pBI-TMT；

图4：转基因烟草的转化和植株再生过程

注：A烟草与农杆菌共培养；B愈伤组织诱导；C芽分化；D、E根分化；F：幼苗

具体实施方式

以下提供具体实施方式及相关实验数据：

一、以白沙蒿为材料提取RNA，反转录为cDNA。

白沙蒿(Artemisia sphaerocephala)种子采自内蒙古阿拉善左旗，播种在营养钵内，置于温室，按常规方法培养，3周龄时，取幼嫩的叶片为材料，按上海生工(上海生工生物工程技术服务有限公司，上海市松江区车墩工业区香闵路698号，邮编201611)UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行RNA提取。按照按宝生物(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，得到cDNA。

本发明经相关实验表明，采用白沙蒿的叶片提取其RNA较采用白沙蒿的其它组织提取RNA更为方便，并且本发明提取的γ-TMT基因在叶片中表达，因此在植物抗逆过程中发挥着更重要的作用。经反复试验表明，采用白沙蒿的叶片，特别是用3周龄的嫩叶提取会有极好的效果。

二、白沙蒿γ-TMT基因核心片段RT-PCR扩增

参照宝生物Taq使用说明书进行，在200μl的离心管中加入下列反应液：

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。将目的片段与克隆载体的连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序，得到一个780bp核心片段。

三、白沙蒿γ-TMT基因5’和3’末端的克隆(5’-RACE和3’-RACE)

3.1白沙蒿总RNA反转录前处理(按Invitrogen RACE试剂盒操作指南进行)

3.1.1白沙蒿总RNA脱磷酸基团

脱磷酸基团反应：

(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)50℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：

(1)加入90μl DEPC水、100μl酚∶氯仿(25∶24)，漩涡震荡30s。

(2)20℃下12000rpm离心5min，吸取上清(约100μl)转移至新离心管中。

(3)依次加入2μl 10mg·ml^-1Mussel Glycogen、10μl 3mol·L^-1NaAc(pH5.2)和220μl 95％乙醇，颠倒混匀，冰浴10min。

(4)4℃、12000rpm离心20min，弃上清，加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀。

(5)4℃、12000rpm离心20min，小心吸去乙醇，再次离心弃去残留乙醇。

(6)20℃下干燥沉淀1-2min，加入7μl DEPC水溶解，为下步去帽反应备用。

3.1.2白沙蒿mRNA去除帽子结构

去帽反应：

(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：方法同3.1.1。

3.1.3去帽后的白沙蒿mRNA和RNA oligo连接

连接反应：

(1)在含有0.25μg GeneRacer^TM RNA Oligo的离心管中加入7μl上述反应液，轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(2)65℃温育5min，消除RNA二级结构。

(3)冰浴2min，短暂离心。

(4)依次加入以下试剂：

(5)轻轻混匀，短暂离心。

(6)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：方法同3.1.1。沉淀用10μl DEPC水溶解。

3.2第一链cDNA的合成

(1)在上述获得的10μl ligated RNA中加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)65℃温育5min以除去RNA二级结构，冰浴1min，短暂离心收集液体。

(4)于冰上依次加入下列试剂：

(5)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(6)25℃温育5min，50℃温育1h，70℃温育5min，冰浴2min，短暂离心收集液体。

(7)加入1μl RNase H(2U·μl^-1)，37℃温育20min，短暂离心收集液体。

(8)-20℃保存备用或即可进行5’和3’外侧PCR扩增反应。

3.3白沙蒿γ-TMT基因5’cDNA的克隆

外侧PCR反应

在200μl离心管中加入下列反应液：

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

巢式PCR反应

取1μl上述PCR产物为模板，加入下列反应液进行巢式PCR

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

反应结束后用1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。回收PCR产物并连接至pGM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选以及菌体PCR，将阳性克隆送去测序。

3.4白沙蒿γ-TMT基因3’cDNA的克隆

外侧PCR反应

在200μl离心管中加入下列反应液：

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

巢式PCR反应

取1μl上述PCR产物为模板，加入下列反应液进行巢式PCR

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

反应结束后用1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。回收PCR产物并连接至pGM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选以及菌体PCR，将阳性克隆送上海生工测序。

经过测序，5’和3’RACE巢式PCR扩增产物分别为356bp和286bp，与前述所得到的白沙蒿γ-TMT基因核心片段都有部分核苷酸重叠，并且在与GeneBank中比对发现扩增出来的片段与其他植物γ-TMT基因5’和3’端具有同源性。因此，扩增得到的5’和3’RACE-PCR产物分别为同一cDNA的5’和3’端。

四、PCR扩增翻译区全长序列

4.1全长翻译区扩增

根据已克隆到的白沙蒿γ-TMT基因的5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿γ-TMT基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的5’端分别加入XbaI和SacI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。

在200μl的离心管中加入下列反应液：

振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增

反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测(图1)。

4.2PCR反应液中DNA片段的5’末端磷酸化反应

参照TaKaRa DNA KinationKit试剂盒说明书，方法如下：

(1)在200μl离心管中配制下列反应液，全量为20μl。

(2)37℃反应30min。

(3)70℃加热5-10min使酶失活。

(4)取5μl的上述溶液在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，对上述溶液中的DNA进行粗定量。4.35’末端磷酸化的DNA片段与pMD simple-19T Vector的连接及转化

参照TaKaRa DNA Kination Kit试剂盒说明书，方法如下：

(1)在200μl离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。

(2)加入5μl的Solution I。

(3)16℃反应1h。

(4)全量转化至DH5α感受态细胞中。

4.4阳性克隆的筛选、鉴定和序列分析

经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序，得到1011bp全长γ-TMT基因翻译区序列。选取一管序列分析正确的活性较高的重组质粒菌液命名为pMD-TMT，进行后续实验。

五、烟草载体构建与遗传转化

5.1白沙蒿PBI121-TMT植物表达载体构建(图2)

5.1pMD-TMT和pBI 121的质粒提取

参照北京天根质粒大提试剂盒说明书进行。

5.2pMD-TMT和PBI 121质粒的酶切回收

将含有目的片段的质粒pMD-TMT与质粒PBI121分别进行XbaI和SacI双酶切，二者方法相同，如下：

(1)在200μl离心管中按下列酶切体系加入各试剂。

(2)混合均匀，轻微短暂离心，将液体收集到管底。

(3)37℃温育2h。

(4)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果、回收酶切目的片段。

5.3酶切片段连接

在200μl离心管中按下列酶切体系加入各试剂：

(2)混合均匀，轻微短暂离心3-5s。

(3)22℃温育18h。

(4)65℃，10min，使T4DNA Ligase失活。

(5)吸取10μl转化至DH5α感受态细胞中。

5.4重组质粒的筛选、鉴定和序列分析(图3)

选取一管序列分析正确的活性较高的重组质粒菌液菌液命名为PBI121-TMT，提取质粒，进行后续实验。

5.5烟草的遗传转化

5.5.1农杆菌GV3101感受态细胞的制备(山梨醇法)

(1)挑取单菌落接种于10mL YEB液体培养基中，28℃过夜震荡培养14～16h。

(2)4℃，6000rpm，5min，弃上清，收集菌体，在无菌滤纸上控干后置于冰上。

(3)加入预冷的1mL 10％甘油重新悬浮菌体，冰水浴5min。

(4)4℃，6000rpm，5min，弃上清，离心收集菌体，控干。

(5)重复步骤(4)两次。

(6)用0.5mL预冷的1M山梨醇重新悬浮菌体。

(7)每管40μl分装，液氮速冻后放入-70℃保存或4℃保存备用。

5.5.2农杆菌GV3101转化(冻融法)

①.冰上融化感受态细胞，加入1-2μL质粒DNA，冰浴45分钟，液氮中冷冻1分钟，在37℃水浴3分钟。

②.加入1mL无抗生素的YEP，28℃、200rpm培养3小时。

③.12000rpm离心1分钟以收集菌体，取100μL YEP回溶菌体。

④.将转化后的菌液涂于添加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的固体YEP培养基上，置于28℃下培养2-3天。

⑤.进行菌落PCR反应验证。

5.2.3含有重组质粒PBI121-TMT的农杆菌PCR鉴定

挑取YEB平板上的单菌落，接种于2mLYEB液体培养基(含有卡那霉素100μg/mL和利福平50μg/mL)，28℃200rpm暗培养1～2d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR。

5.2.4烟草的遗传转化(叶盘法)

(1)将含有植物表达载体的农杆菌菌液均匀涂与YEB平板(含有卡那霉素100μg/mL和利福平50μg/mL)，28℃培养过夜。

(2)用枪头轻轻刮取菌体，转入MS液体培养基中，使悬浮液OD₆₀₀≈0.5。

(3)将烟草无菌苗叶片剪去叶缘和主叶脉，剪成0.5cm²大小方块。

(4)将切好的外植体在悬浮好的农杆菌菌液(OD₆₀₀≈0.5)中浸泡5-10分钟，期间轻摇几次。

(5)在无菌滤纸上将叶片表面的菌液吸干，上表面朝下转入表面铺有一层滤纸的MS固体培养基上，28℃暗培养3天。

(6)将叶片从共培养基上转接至分化培养基上，每两周继代一次。

(7)待抗性芽长至2-3cm高时，将芽转接至生根培养基上进行生根培养。

六、转基因植物维生素E含量检测

方法参照：Pascal Rippert等“Engineering Plant Shikimate Pathway for Production ofTocotrienol and Improving Herbicide Resistance”Plant Physiology，2004，Vol.134，pp.92-100.具体步骤如下：

每一个株系，采集幼嫩叶片冻干保存。150mg冻干样用液氮研磨，氩存在条件下暗光下加入2mL己烷3次以防止维E降解。将上清液混合，有氩条件下脱水干燥，溶解于3mL充有氩的甲醇中，冻于-80℃用于后期测定。种子中生育酚的测定，提取方法相似，省去冻干过程，用新鲜成熟种子提取测定。对于生育酚的测定，100微升样品注射到C18 HPLC column。通过290nm激发产生的荧光来检测维E，在325nm记录。通过与标准物的比较给生育酚定量。HPLC系统包含两个510HPLC泵和一个712WISP自动采样器(Waters)，一个HPLC UV检测器，一个SFM25荧光检测器(Kontron Instruments，Eching，Germany)。以CH3OH∶H2O(96∶4[v/v])为溶剂，流速设置为：1mL min-1。定量通过对峰面积的测定进行。通过与标准曲线的对比将峰面积转化生育酚的毫克数。

表2非转基因及转基因植物维生素E含量

生育酚以四种形式天然存在：按甲基位置分为α、β、γ和δ四种。高等植物叶片中生育酚主要以α-生育酚的形式存在，而种子中主要以γ-生育酚为主要存在形式。从表结果可以看出As-γ-TMT的表达改变了转基因植物中维生素E组成比例，提高了叶片和种子中α-VE的组成比例：野生型烟草叶片中α/γ比值为2.4，转基因烟草中α/γ为7.98。；野生型烟草种子中未检测到α-V_E，转基因种子烟草中α-V_E含量占为总生育酚量的50％。

Claims (9)

1.白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因，其特征是其基因序列为SEQ 1。

2.白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因，其特征是其基因序列为SEQ 10。

3.权利要求1或2所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因制备方法，其特征是首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的白沙蒿-生育酚甲基转移酶基因基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因核心片段核苷酸序列；根据测序得到的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因基因核心片段序列分别设计白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因核心片段序列分别设计白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；将所得到的三段序列，白沙蒿白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因核心片段核苷酸序列、5’末端核苷酸序列和3’末端核苷酸序列，进行拼接，得到目标基因。

4.权利要求3所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因制备方法，其特征是采用白沙蒿的叶片提取RNA。

5.权利要求3或4所述的制备方法中所用的相关引物，其特征是：

上游引物P1：

5’-AYGAGTCKTCYGGVWTWTGG-3’

下游引物P2：5’-WATCCYTCWATCATCARTGG-3’

P3为：5’-CCTTGCGCTACCCCCGATGCCACACC-3’

P4为：5’-TCAGATATCTCCACAACAGCACCAGG-3’

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’

P5为：5’TACCTTCCTGCTTGGTGTTCTACGGC-3’

P6为：5’-TTAGTAATGCCACTGATGATAGAGGG-3’

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’

P7：5’-CGTCTAGA ATGCATCATGGCTTTTATG-3’

P8：5’-CGGAGCTCTTATTCAGGCTTTTTAC-3’

其中：R＝A or G；Y＝C or T；K＝G or T；W＝A or T。

6.权利要求1或2所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因在油料作物的转基因工作中的应用。

7.权利要求1或2所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因在牧草作物的转基因工作中的应用。

8.权利要求1或2所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因在在除权利要求4或5所述的植物外的植物中的转基因工作中的应用。

9.权利要求1或2所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因在在除植物外的其它生物的转基因工作中的应用。

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