CN102010874A - 白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因的序列，以及这种基因序列的制备方法和用途。白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因的制备是用白沙蒿的RNA反转录为cDNA，再根据其它植物的γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因保守区设计相应的简并引物与巢式引物进行扩增得到白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因的全长翻译区核苷酸序列；本发明的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因可用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的转基因工作中。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶(As-γ-TMT)基因及其制备与用途。
背景技术
维生素E，又被称作生育酚。是一种动物正常繁殖所必须的物质，能抗不育和防止早产、流产，参见：宋晓燕，杨天奎“天然维生素E的功能及应用”《中国油脂》2002，25(6)：45-48。维生素E作为饲料添加剂，可以提高动物的免疫力、改善肉质、奶质并提高繁殖能力和缓解动物应激反应 参见：肖雄.“维生素E的研究与应用”《畜禽业》2002，4：24-26。维生素E与人体中枢神经系统，心血管系统有着密切的关系，现代医学证明：维生素E可以防治冠心病、高血压、心肌梗塞、血栓等疾病参见：Ajjawi I.and Shintani D.“Engineered plants with elevated vitamin E：a nutraceutical success story”《Trends Biotech》2004，22(3)：104-107；Vertuani S，Angusti A and Manfredini S.“The antioxidants and pro-antioxidants network：An overview.”《Cur Pharmaceutical Design》2004，10(14)：1677-1694。维生素E还有美容、护肤、防衰老、抗癌等功效参见：雷炳福“我国天然维生素E产业化前景初探”《中国油脂》2003，28(4)：49-51。
维生素E存在于植物的不同组织：包括绿色光合组织和种子等。不同植物中不仅维生素E总量有差异，在生育酚的4种异构体中的组成比例也存在一定差异。由于人和动物肝脏中有生育酚亲和蛋白，通过它的介导，表现出了对α-生育酚明显的亲和性，因此，α-生育酚总被优先吸收和利用。在生育酚的4种异构体中α-生育酚生物活性最高，β、γ、δ-生育酚分别是α-生育酚相对活性的50％、10％和3％，参见：KamalEldin A and Appelqvist LA.“The chemistry and antioxidant properties of tocopherols and tocotrienols”《Lipids》1996，31：671-701。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因是提高生育酚中α-生育酚的含量和比例的关键酶基因。GenBank中已公布拟南芥、棉花、马铃薯、番茄、小麦、水稻等植物的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列。
发明内容
本发明提供一种取自沙生植物-白沙蒿的γ-TMT基因，以及这种基因的制备方法及用途。
白沙蒿(Artemisia sphaerocephala krasch)是我国特有的优良超旱生固沙植物，是我国沙区畜牧业的重要饲料之一。白沙蒿是我国西北、华北、东北荒漠半荒漠地区的特有植物，其抗风沙，耐旱、耐寒、耐瘠薄性能极强。几乎所有植物油均含有维生素E，但含量远不及国际上公认为植物油含维生素E之冠一，小麦胚芽油。从沙篙籽中提取的沙篙油，经测试维生素E含量达到2779.1mg/kg，高于小麦胚芽油中维生素E的含量，且其α-生育酚含量极高，可以达到2705.7mg/kg。参见：白寿宁，云秀芳“沙蒿油开发利用探讨”《粮食与油脂》，2000(3)：31-33。
表1沙蒿油与其他植物油α-VE含量(单位：mg/kg)
本发明所述的白沙蒿γ-TMT基因序列为基因序列表中的SEQ1。
本发明所涉及的白沙蒿γ-TMT基因制备方法是：首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的γ-TMT基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿γ-TMT核心片段核苷酸序列；根据测序得到的γ-TMT基因核心片段序列分别设计白沙蒿γ-TMT基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacerTM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿γ-TMT基因核心片段序列分别设计白沙蒿γ-TMT基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacerTM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的白沙蒿γ-TMT 5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿γ-TMT基因的全长翻译区核苷酸序列。
在引物的5’端分别加入XbaI和SacI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。
本发明具体采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下：
上游引物P1：
5’-AYGAGTCKTCYGGVWTWTGG-3’
下游引物P2：5’-WATCCYTCWATCATCARTGG-3’
P3为：5’-CCTTGCGCTACCCCCGATGCCACACC-3’
P4为：5’-TCAGATATCTCCACAACAGCACCAGG-3’
5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’
5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’
P5为：5’TACCTTCCTGCTTGGTGTTCTACGGC-3’
P6为：5’-TTAGTAATGCCACTGATGATAGAGGG-3’
3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’
3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’
P7：5’-CGTCTAGA ATGCATCATGGCTTTTATG-3’
P8：5’-CGGAGCTCTTATTCAGGCTTTTTAC-3’
其中：R＝A or G；Y＝C or T；K＝G or T；W＝A or T；V＝A or C or G。
本发明所涉及的白沙蒿γ-TMT基因可在油料作物的转基因工作中应用，也可在牧草等作物的转基因工作中应用，也可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的转基因工作中应用，可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。
维生素E对于人类和动物具有不可忽视的营养价值，而它同时在植物体中具有重要生理功能。维生素E可提高植物的抗氧化作用，能通过清除脂质过氧化物所产生的自由基而稳定生物膜的脂双层，使细胞免受过氧化物的伤害，维生素E可以独立或协同细胞中其他抗氧化产物，参与各种抗氧化作用，有效地保护细胞，是一种有效的抗氧化剂，参见：Brigelius-Floh ER and Traber M G..“Vitamin E：Function and metabolism”《The FASEB》1999，13：1145-1155.。同时还具有信号传导，参与光电子循环等作用，参见：Munne-Bosch S，“Function and metabolism of tocopherols and tocotrienols in plants”《The FASEB》2002，16：1028-1039。
我们推测由于白沙蒿生长在干旱荒漠地区，长期经历干旱、高温、冻害等逆境胁迫，使其自身进化出一定的防御机制，而提高维生素E合成量。其α-维生素E含量提高的作用机制之一有可能是其γ-TMT基因核苷酸编码的氨基酸在催化活性上有特殊性。其次，在干旱、高温、冻害和贫瘠等逆境胁迫下生长的白沙蒿具有抗旱、耐高温、耐冻和耐贫瘠性的品质。因此白沙蒿γ-TMT基因是一种可对植物，如油料作物，或者牧草作物，或其它的植物，甚至非植物的其它生物进行基因改造的最佳材料。
本发明经相关实验表明，采用白沙蒿的叶片提取其RNA较采用白沙蒿的其它组织提取RNA更为方便。
具体实施方式
以下提供具体实施方式及相关实验数据：
一、以白沙蒿为材料提取RNA，反转录为cDNA。
白沙蒿(Artemisia sphaerocephala)种子采自内蒙古阿拉善左旗，播种在营养钵内，置于温室，按常规方法培养，3周龄时，取幼嫩的叶片为材料，按上海生工(上海生工生物工程技术服务有限公司，上海市松江区车墩工业区香闵路698号，邮编201611)UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行RNA提取。按照按宝生物(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，得到cDNA。
本发明经相关实验表明，采用白沙蒿的叶片提取其RNA较采用白沙蒿的其它组织提取RNA更为方便，并且本发明提取的γ-TMT基因在叶片中表达，因此在植物抗逆过程中发挥着更重要的作用。经反复试验表明，采用白沙蒿的叶片，特别是用3周龄的嫩叶提取会有极好的效果。
二、白沙蒿γ-TMT基因核心片段RT-PCR扩增
参照宝生物Taq使用说明书进行，在200μl的离心管中加入下列反应液：
振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增
反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。将目的片段与克隆载体的连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序，得到一个780bp核心片段。
三、白沙蒿γ-TMT基因5’和3’末端的克隆(5’-RACE和3’-RACE)
3.1白沙蒿总RNA反转录前处理(按照Invitrogen RACE试剂盒操作指南进行)
3.1.1白沙蒿总RNA脱磷酸基团
脱磷酸基团反应：
(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：
(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。
(3)50℃温育1h，短暂离心后置于冰上。
RNA沉淀反应：
(1)加入90μl DEPC水、100μl酚∶氯仿(25∶24)，漩涡震荡30s。
(2)20℃下12000rpm离心5min，吸取上清(约100μl)转移至新的离心管中。
(3)依次加入2μl 10mg·ml-1 Mussel Glycogen、10μl 3mol·L-1NaAc(pH5.2)和220μl 95％乙醇，颠倒混匀，冰浴10min。
(4)4℃、12000rpm离心20min，弃上清，小心不要弃掉沉淀，加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀。
(5)4℃、12000rpm离心20min，小心吸去乙醇，再次离心弃去残留乙醇。
(6)20℃下干燥沉淀1-2min，加入7μl DEPC水溶解，为下步去帽反应备用。
3.1.2白沙蒿mRNA去除帽子结构
去帽反应：
(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：
(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。
(3)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上。
RNA沉淀反应：方法同3.1.1。
3.1.3去帽后的白沙蒿mRNA和RNA oligo连接
连接反应：
(1)在含有0.25μg GeneRacerTM RNA Oligo的离心管中加入7μl上述反应液，轻轻混匀，短暂离心收集液体。
(2)65℃温育5min，消除RNA二级结构。
(3)冰浴2min，短暂离心。
(4)依次加入以下试剂：
(5)轻轻混匀，短暂离心。
(6)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上。
RNA沉淀反应：方法同3.1.1。沉淀用10μl DEPC水溶解。
3.2第一链cDNA的合成
(1)在上述获得的10μl ligated RNA中加入下列试剂：
(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。
(3)65℃温育5min以除去RNA二级结构，冰浴1min，短暂离心收集液体。
(4)于冰上依次加入下列试剂：
(5)轻轻混匀，短暂离心收集液体。
(6)25℃温育5min，50℃温育1h，70℃温育5min，冰浴2min，短暂离心收集液体。
(7)加入1μl RNase H(2U·μl-1)，37℃温育20min，短暂离心收集液体。
(8)-20℃保存备用或即可进行5’和3’外侧PCR扩增反应。
3.3白沙蒿γ-TMT基因5’cDNA的克隆
外侧PCR反应
在200μl离心管中加入下列反应液：
振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增
巢式PCR反应
取1μl上述PCR产物为模板，加入下列反应液进行巢式PCR
振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增
反应结束后用1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。回收PCR产物并连接至pGM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选以及菌体PCR，将阳性克隆送去测序。
3.4白沙蒿γ-TMT基因3’cDNA的克隆
外侧PCR反应
在200μl离心管中加入下列反应液：
振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增
巢式PCR反应
取1μl上述PCR产物为模板，加入下列反应液进行巢式PCR
振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增
反应结束后用1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。回收PCR产物并连接至pGM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选以及菌体PCR，将阳性克隆送上海生工测序。
经过测序，5’和3’RACE巢式PCR扩增产物分别为356bp和286bp，与前述所得到的白沙蒿γ-TMT基因核心片段都有部分核苷酸重叠，并且在与GeneBank中比对发现扩增出来的片段与其他植物γ-TMT基因5’和3’端具有同源性。因此，扩增得到的5’和3’RACE-PCR产物分别为同一cDNA的5’和3’端。
四、PCR扩增翻译区全长序列
根据已克隆到的白沙蒿γ-TMT基因的5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿γ-TMT基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的5’端分别加入XbaI和SacI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。
在200μl的离心管中加入下列反应液：
振荡离心混匀后，按以下条件进行PCR扩增
反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。将目的片段与克隆载体的连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序，得到780bp全长γ-TMT基因翻译区序列。
Claims (8)
1.白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因，其特征是其基因序列为SEQ 1。
2.权利要求1所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因制备方法，其特征是首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的白沙蒿 -生育酚甲基转移酶基因基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因核心片段核苷酸序列；根据测序得到的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因基因核心片段序列分别设计白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacerTM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因核心片段序列分别设计白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacerTM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；将所得到的三段序列，白沙蒿白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因核心片段核苷酸序列、5’末端核苷酸序列和3’末端核苷酸序列，进行拼接，得到目标基因。
3.权利要求2所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因制备方法，其特征是采用白沙蒿的叶片提取RNA。
4.权利要求2或3所述的制备方法中所用的相关引物，其特征是：
上游引物P1：
5’-AYGAGTCKTCYGGVWTWTGG-3’
下游引物P2：5’-WATCCYTCWATCATCARTGG-3’
P3为：5’-CCTTGCGCTACCCCCGATGCCACACC-3’
P4为：5’-TCAGATATCTCCACAACAGCACCAGG-3’
5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’
5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’
P5为：5’TACCTTCCTGCTTGGTGTTCTACGGC-3’
P6为：5’-TTAGTAATGCCACTGATGATAGAGGG-3’
3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’
3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’
P7：5’-CGTCTAGAATGCATCATGGCTTTTATG-3’
P8：5’-CGGAGCTCTTATTCAGGCTTTTTAC-3’
其中：R＝A or G；Y＝C or T；K＝G or T；V＝A or C or G；W＝A or T。
5.权利要求1所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因在油料作物的转基因工作中的应用。
6.权利要求1所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因在牧草作物的转基因工作中的应用。
7.权利要求1所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因在在除权利要求4或5所述的植物外的植物中的转基因工作中的应用。
8.权利要求1所述的白沙蒿γ-生育酚甲基转移酶基因在在除植物外的其它生物的转基因工作中的应用。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20110413 |