CN102424827B - 微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因(Ms-Δ6-FAD)及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(Ms-Δ6-FAD)基因的序列，以及这种基因序列的制备方法和用途。微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(Ms-Δ6-FAD)基因的制备是用微孔草基因的RNA反转录为cDNA，再根据其它植物的(Ms-Δ6-FAD)基因保守区设计相应的简并引物与巢式引物进行扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(Ms-Δ6-FAD)基因的全长翻译区核苷酸序列；本发明的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(Ms-Δ6-FAD)基因在微孔草冷冻胁迫过程中累积，与其抗冻性相关；利用转基因技术进行的功能验证说明该基因表达可以使烟草叶片和种子中产生γ-亚麻酸。该基因可用应用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的转基因工作中。

Description

微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因(Ms-Δ6-FAD)及用途

技术领域

本发明涉及一种新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(Ms-Δ6-FAD)基因及其制备与用途。

背景技术

γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA)是一种多功能油脂成分。许多研究表明GLA具有多种重要的生理活性作用，它在机体的物质代谢和生理调控上发挥着十分重要的作用：降血脂、抗血栓性心脑血管、预防和治疗高血压、动脉粥样硬化、增强人体的免疫功能，GLA还具有抗革兰氏阴性菌和阳性菌、抗HIV感染、抗肿瘤、抗多种炎症、抗脂质过氧化、抑制溃疡和增强胰岛素和减肥等方面的作用，参见董杰明等“γ-亚麻酸的保健作用”《卫生研究》2003，32(3)：299-301。Δ6-脂肪酸脱氢酶(Δ6-FAD)基因是介导GLA合成的关键酶基因。

发明内容

本发明提供一种取自我国特有物种-微孔草的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因，以及这种基因的制备方法及用途，该基因表达可以使低温胁迫下的微孔草积累γ-亚麻酸，在转基因植物中的表达使其产生了新性状。

微孔草(Microula sikkimensis Hemsl.)系紫草科微孔草属，为二年生草本植物，主要分布于陕西西南部、甘肃、青海、四川西部、云南西北部、西藏藏东和南部，参见：中国科学院中国植物志编辑委员会《中国植物志》北京：科学出版社，1990151-175。

本发明所涉及的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因制备方法是：首先提取微孔草的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的微孔草cDNA为模板扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段核苷酸序列；根据测序得到的Ms-Δ6-FAD基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以微孔草cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以微孔草cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的全长翻译区核苷酸序列。

在P7、P8引物的5’端分别加入Nco I和Bste II酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。

实验表明，冷冻胁迫(2℃)进行的96小时期间，微孔草叶片中γ-亚麻酸含量明显上升，低温可以诱导其积累。构建Ms-Δ6-FAD的表达载体，转染烟草后得到的转基因植物产生了新性状：野生型烟草叶片和种子中无γ-亚麻酸，而转基因烟草其含量分别占总脂肪酸的16.3％和4.8％。

据报道，不饱和脂肪酸的增加与植物抗生物(病原体、植物病原体互做等)和非生物胁迫(低温、干旱、盐、重金属等)密切相关，参见：Robert G.Upchurch“Fattyacid unsaturation，mobilization，and regulation in the response of plants tostress”Biotechnol Lett (2008)30：967-977，因此，微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因有可能在这些过程中发挥作用。

采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下：

P1：5’-TAYAGSAAGCTTGTGTTTGAG-3’

P2：5’-ARTTCTTSGGGAGCGGCTTGG-3’

P3：5’-CGGAAAGACAATTTGCAAACAGAATACC-3’

P4：5’-TACCCAAACAGACTCAAAAAACAAAACC-3’

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’；

P5：5’-TGGTACCCATTGCTTCTTTCTTATTTGC-3’

P6：5’-AATATAATTGTGCATCATTCTCTAAGGC-3’

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’

P7：5’-CTCCCATGGATGGCTGCTAAAATC-3’

P8：5’-GGCGGTCACCTCAGCTAATCTTAACCA-3’

其中：R＝A or G；Y＝C or T；S＝C or G。

本发明所涉及的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因(Ms-Δ6-FAD)的序列为SEQNo：1或SEQ No：10。

本发明所涉及的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因(Ms-Δ6-FAD)可在油料作物的转基因工作中应用，也可在牧草等作物的转基因工作中应用，也可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的转基因工作中应用，可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。

微孔草富含γ-亚麻酸(表1)，参见：高有为，樊铁“微孔草-一种待开发的富含γ-亚麻酸的新油源”。《中国粮油学报》1998 13(2)：22-24。

表1微孔草和其它植物油的γ-亚麻酸的含量比较

油品	月见草油	琉璃苣油	黑穗醋栗油	微孔草油
					种子含油率％	20	30	30	40-45
γ-亚麻酸含量％	8-10	19-25	11-138	8.1

由表可以看出，微孔草种子油中γ-亚麻酸的百分含量与月见草相近，但因其种子含油率高，所以单位公斤种子产γ-亚麻酸高于月见草。微孔草是我国特有的珍稀油料植物，对其加以开发和利用，获得拥有自主知识产权的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因，有着重要的理论和实践意义；其次，由于微孔草具有耐寒，耐旱，喜强光照的特性，使微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因(Ms-Δ6-FAD)的转基因工程中有极佳的应用前景，而且是一种很好的转基因材料。

在后续实施例的载体构建过程中，为了减少PCR扩增错配率，我们采用了高保真Taq进行扩增，得到产物经测序发现比前期得到的1351bp微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因在1322bp处缺失了一个碱基g，因此在后面的基因功能验证中采用的是1344bp的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因全长ORF序列，即序列SEQ No：10。

附图说明：

图1.MsD6D基因开放阅读框扩增琼脂糖凝胶电泳图。图中：M：DNA分子量标准；1-3：阳性克隆PCR产物；4-5：MsD6D基因开放阅读框PCR扩增产物。

用引物P1和P2扩增MsD6D基因的ORF，得到一条清晰的约1300bp的单一亮带，与推测的1353bp一致。将该片段与pMD19-T Simple Vector克隆载体连接后，进行菌落PCR鉴定，结果得到的片段大小与PCR扩增得到的一致。

图2.微孔草pCAMBIA1301-MsD6D植物表达载体构建示意图

将粘性末端pCAMBIA1301载体和MsD6D基因ORF连接，构建表达载体。

图3.pMD-MsD6D和pCAMBIA1301双酶切图，图中：M：DNA分子量标准；1：NcolI和BstEII双酶切质粒pCAMBIA1301；2：NcolI和BstEII双酶切重组质粒pMD-MsD6D。

图4.重组质粒pCAMBIA1301-MsD6D双酶切鉴定，图中：M：DNA分子量标准；1：重组质粒pCAMBIA1301-MsD6D；2：NcolI单酶切；3：BstEII单酶切；4：NcolI和BstEII双酶切质粒pCAMBIA1301-MsD6D。

图5.重组质粒pCAMBIA1301-MsD6D农杆菌GV3101转化PCR检测图，图中：M：DNA分子量标准；1、2、3：阳性克隆PCR产物。

图6转基因烟草的转化和植株再生过程。

图7.质谱测得的微孔草γ-亚麻酸结构式。

具体实施方式

以下提供具体实施方式及相关实验数据：

一、以微孔草为材料提取RNA，反转录为cDNA

微孔草(Microula sikkimensis Hemsl.)块根采自甘南天祝，在人工气候箱中培养，长出植株后取其新鲜叶片作为实验材料。按上海生工(上海生工生物工程技术服务有限公司，上海市松江区车墩工业区香闵路698号，邮编201611)UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行RNA提取。按照宝生物(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，得到cDNA。

本发明经相关实验表明，采用微孔草的叶片提取其RNA较采用其它组织提取RNA更为方便，并且本发明提取的Δ6-FAD基因在叶片中表达，因此在植物抗逆过程中保持膜脂流动性，发挥着更重要的作用。

二、微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段RT-PCR扩增

利用GeneBank中已公布的琉璃苣，蓝蓟，月见草和黑穗醋栗等植物Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计一对简并引物P1、P2。

在200μl PCR管中依次加入下列组分配置PCR反应液：

轻轻混匀，PCR反应条件为：

反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

将目的片段与克隆载体的连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序，得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段，长度为1027bp。

三、微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因5’和3’末端的克隆(5’-RACE和3’-RACE)

3.1微孔草总RNA反转录前处理(按Invitrogen RACE试剂盒操作指南进行)

3.1.1微孔草总RNA脱磷酸基团

脱磷酸基团反应：

(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)50℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：

(1)加入90μl DEPC水、100μl酚∶氯仿(25∶24)，漩涡震荡30s。

(2)20℃下12000rpm离心5min，吸取清(约100μl)转移至新的心管中。

(3)依次加入2μl 10mg·ml^-1Mussel Glycogen、10μl 3mol·L^-1NaAc(pH5.2)和220μl 95％乙醇，颠倒混匀，冰浴10min。

(4)4℃、12000rpm离心20min，弃上清，小心不要弃掉沉淀，加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀。

(5)4℃、12000rpm离心20min，小心吸去乙醇，再次离心弃去残留乙醇。

(6)20℃下干燥沉淀1-2min，加入7μl DEPC水溶解，为下步反应备用。

3.1.2mRNA去除帽子结构

去帽反应：

(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上

RNA沉淀反应：方法同3.1.1。

3.1.3去帽mRNA和RNA oligo连接

连接反应：

(1)在含有0.25μg GeneRacer^TM RNA Oligo的离心管中加入7μl上述反应液，轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(2)65℃温育5min，消除RNA二级结构。

(3)冰浴2min，短暂离心。

(4)依次加入以下试剂：

(5)轻轻混匀，短暂离心。

(6)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：方法同3.1.1。沉淀用10μl DEPC水溶解。

3.2第一链cDNA的合成

(1)在上述获得的10μl ligated RNA中加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)65℃温育5min除去RNA二级结构，冰浴1min，短暂离心收集液体。

(4)于冰上依次加入下列试剂：

(5)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(6)25℃温育5min，50℃温育1h，70℃温育5min，冰浴2min，短暂离心收集液体。

(7)加入1μl RNase H(2U·μl^-1)，37℃温育20min，短暂离心收集液体。

(8)-20℃保存备用或即可进行5’和3’外侧PCR扩增反应。

3.35’末端PCR扩增

根据已测序得到的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段序列分别设计5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对。以3.2中所述获得的微孔草cDNA为模板进行5’外侧和巢式PCR扩增反应。

5’外侧PCR扩增

在200μl PCR管中按下列组分配置PCR反应液：

轻轻混匀，短暂离心，PCR反应体系如下：

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

5’巢式PCR扩增

在200μl PCR管中按下列组分配置PCR反应液：

轻轻混匀，短暂离心，PCR反应体系如下：

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

胶纯化和回收获得的目的基因5’端PCR产物，连接到克隆载体，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序。

3.43’末端PCR扩增

根据已测序得到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段序列分别设计3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对。以3.2中所述获得的微孔草cDNA为模板进行5’外侧和巢式PCR扩增。

3’外侧PCR扩增

在200μl PCR管中依次配置下列PCR反应液：

轻轻混匀后短暂离心，PCR反应条件如下：

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

3’巢式PCR扩增

在200μl PCR管中依次配置下列PCR反应液：

轻轻混匀后短暂离心，PCR反应条件如下：

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

胶纯化和回收获得的目的基因3’端PCR产物，连接到克隆载体，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序。

经过测序，5’和3’RACE巢式PCR扩增产物分别为533bp和437bp，与前述所得到的微孔草Δ6-脂肪酸脱氢酶核心片段都有部分核苷酸重叠，并且在与GeneBank中比对发现扩增出来的片段与其他植物Δ6-脂肪酸脱氢酶基因5’和3’端具有同源性。因此，扩增得到的5’和3’RACE-PCR产物分别为同一cDNA的5’和3’端。

四、PCR扩增翻译区全长序列

根据已克隆到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的5’端分别加入Nco I和Bste II酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。

在200μl PCR管中依次配置下列PCR反应液：

轻轻混匀后短暂离心，PCR反应条件如下：

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

胶纯化和回收获得的目的基因PCR产物，连接到克隆载体，转化至E.coliDH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序。得到1354bp的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因cDNA序列。

五、微孔草D6D基因植物表达载体的构建及在烟草中的转化

5.1实验中涉及的材料、试剂、仪器及培养基

5.1.1植物材料：烟草NC89(中国农业科学院实验室赠送)。

5.1.2菌株及载体：大肠杆菌TOP10感受态细胞，pMD19-T simple vector载体克隆试剂盒购自TaKaRa。农杆菌菌株GV3101，植物表达载体pCAMBIA1301(中国农业科学院实验室赠送)。

5.1.3酶及分子生物学试剂：UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。PrimeScriptTM 1st Strand cDNA SynthesisKit、TaqDNA聚合酶购自TaKaRa。质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。DNA快速纯化/回收试剂盒、6-BA、NAA购自北京鼎国生物技术有限公司。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Fermentas。卡那霉素(Kan)，头孢霉素(Cef)和利福平(Rif)购自Sigma。其它试剂均为国产分析纯。引物合成和序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

5.1.4主要仪器：SW-CJ-1G型单人超净工作台，RXZ智能型人工气候箱，紫外分光光度计(ND-1000)，恒温培养摇床(SUKUN SKY-2102C)。

5.1.5培养基：

YEP培养基：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，调pH至7.0，高压121℃灭菌20min，固体培养基加1.5％琼脂粉。

MS培养基：配方见《实用植物组织培养技术教程》(曹孜义，刘国明1996)

MS分化培养基：MS培养基+6-BA(1.5mg·L-1)+NAA(0.2mg·L-1)+头那霉素(300mg·L-1)+卡那霉素(100mg·L-1)

MS生根培养基：MS培养基+头孢霉素(300mg·L-1)+卡那霉素(100mg·L-1)

5.2具体操作方法

5.2.1植物表达载体的构建示意图(图2)

5.2.2目的片断的回收和纯化

回收步骤四中PCR扩增全长翻译区后得到的产物，方法参照北京鼎国生物技术有限责任公司的DNA快速纯化/回收试剂盒进行。

5.2.3DNA片段与pMD19-T Simple Vector的连接及转化，参照TaKaRapMD19-T Simple Vector试剂盒说明书进行。

5.2.4阳性克隆的筛选、鉴定和序列分析

1)从含有Amp的LB平板上挑取白色单一菌落，转入1.5ml LB(含Amp)液体培养基中，37℃，150rpm/min，振荡培养12-16h左右。

2)吸取2μl菌液作为模板，进行菌体PCR，体系、条件与扩增时相同。

3)反应结果用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

5.2.5pMD-MsD6D和pCAMBIA1301的质粒提取，具体步骤参照北京天根质粒小提试剂盒说明书进行

5.2.6pMD-MsD6D和pCAMBIA1301质粒的酶切回收

将含有目的片段的质粒pMD-MsD6D与质粒pCAMBIA1301分别进行NcolI和BstEII双酶切，二者方法相同，如下：

(1)在200μl离心管中按下列酶切体系加入各试剂。

(2)混合均匀，轻微短暂离心，将液体收集到管底。

(3)37℃温育2h。

(4)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果、回收酶切目的片段。

将阳性克隆pMD-MsD6D和植物表达载体pCAMBIA1301提取质粒后分别用NcolI和BstEII双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示。

5.2.7酶切片段连接

在200μl离心管中按下列酶切体系加入各试剂：

(2)混合均匀，轻微短暂离心。

(3)22℃温育1h。

(4)65℃，10min，使T4DNALigase失活。

(5)吸取10μl转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆。

5.2烟草的遗传转化

5.2.1农杆菌GV3101感受态细胞的制备

1)挑单菌落于2mlYEP培养基(含Rif50mg/ml)中28℃过夜活化。

2)取2ml过夜菌液接于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约0.5左右。

3)5k rpm离心5分钟。

4)在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5)5krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

5.2.2DNA转化农杆菌GV3101

1)在50μl农杆菌感受态细胞中加1ug质粒，冰上放置30分钟。

2)液氮中冷冻5分钟。

3)37℃水浴热激5min。

4)加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr(低速)

5)取出菌液于相应抗生素(100ug/ml Kan和50ug/mlRif)平板上，28℃培养2-3天。

5.2.3含有重组质粒pCAMBIA1301-MsD6D的农杆菌PCR鉴定

挑取YEP平板上的单菌落，接种于5mLYEP液体培养基(含有卡那霉素100μg/mL和利福平50μg/mL)，28℃200rpm培养2～3d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR。利用冻融法，将载体pCAMBIA1301-MsD6D质粒DNA导入农杆菌GV3101感受态细胞，经PCR扩增，凝胶电泳检测，扩增得到的片段的大小与MsD6D基因ORF片段大小一致(图5)。表明目的基因已经重组到农杆菌，获得了农杆菌工程菌。

5.2.4烟草的遗传转化(叶盘法)

5.2.4.1农杆菌培养

1)从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3ml YEB液体培养基中(Str25μg/ml、Rif50μg/ml、Kan 80μg/ml)于恒温摇床上27℃，180rpm摇培过夜至OD₆₀₀为0.6-0.8。

2)摇培过夜的菌液按1％-2％的比例，转入新配置的无抗生素的YEB培养基中，在与上述相同的条件下培养6h左右，OD₆₀₀为0.2-0.5时即可用于转化。

5.2.4.2侵染

于超净工作台上，将菌液倒入无菌的小培养皿中。取不具Kan抗性的烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm²的小块，放入菌液中，浸泡适当时间(一般5-10min)。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

5.2.4.3共培养

将侵染后的烟草叶片接种在不含任何激素和抗生素的MS基本培养基(T1)上，用封口膜封好培养皿，28℃黑暗中培养2-4天。

5.2.4.4选择培养

将黑暗中共培养2-4天的烟草叶片转移到筛选培养基(T2)中，用封口膜封好培养皿，在光照为2,000-10,000lux、25-28℃、16/8hd^-1光暗条件下选择培养。

5.2.4.5生根培养

约2-3周后，待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽并转移到生根培养基(T3)上进行生根培养，5-10天后长出不定根。

5.2.5冷冻胁迫下微孔草及转基因烟草γ-亚麻酸含量测定脂肪酸前处理

5.2.5.1脂肪酸前处理

称取8g(精确至0.1g)待测微孔草，用索氏抽提法提取粗脂肪，随后将粗脂肪和无水乙醚混合液转移至50mL的圆底烧瓶中，于75℃左右的水浴中回收溶剂，稍冷却后置于40℃的真空干燥箱中干燥，用差量法计算粗脂肪质量。再加入4mL 0.5mol/L氢氧化钠-甲醇溶液和少许沸石于烧瓶，在冷凝回流下煮沸至脂肪液滴消失后再持续30min。用移液器从冷凝管顶部加入5mL质量分数为10％～15％的三氟化硼甲醇溶液，继续煮沸3min。将烧瓶从水浴锅中取出，从冷凝管顶部加入约1～3mL正己烷，冷却至室温，加入15mL氯化钠饱和水溶液，振荡后静置5min，继续加氯化钠饱和水溶液使液面至瓶颈部，用胶头滴管取上层液，然后再用正己烷萃取3次，每次加入正己烷2mL，将上层液合并至小锥形瓶中，用少量无水硫酸钠干燥后过滤。之后用GC-MS仪测定脂肪酸组成和含量。

5.2.5.2脂肪酸的检测：

使用美国Agilent公司6890N型气相色谱仪和5975C质谱仪，采用自动进样，每个样品连续进样六次。

色谱条件：采用石英毛细管柱(Agilent DB-FFAP，30.0m×250.0μm×0.5μm，最高温度250℃)进样量为0.2μl；分流比为100∶1；进样口温度为200℃；程序升温：从130℃开始，以15℃/min升至190℃，保持1min，以8℃/min升至230℃保持12分钟；柱流速为1.1ml/min；载气为高纯氦气(99.999％)。

质谱条件：电离源为70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；界面温度为250℃；溶剂延迟为1.5min。

5.2.5.3样品的测定

通过NIST谱图库检索，并配合脂肪酸标准物质比对，进行脂肪酸定性，通过标准曲线进行定量。

5.2.5.4结果

5.2.5.4.1冷冻胁迫下微孔草γ-亚麻酸含量变化

表2冷冻胁迫下微孔草γ-亚麻酸含量变化

从微孔草中测得得到γ-亚麻酸组分，并且发现在冷冻条件(2℃)能够诱导其积累。

5.2.5.4.2对照及转基因烟草叶片和种子中总脂肪酸含量变化

表3对照及转基因烟草叶片和种子中总脂肪酸含量

从表3结果可以看出，MsD6D在烟草中表达使本来不能够产生γ-亚麻酸的烟草获得了一个新性状：γ-亚麻酸在转基因烟草成熟叶片和种子脂肪酸组成中达到16.3％和4.8％。

Claims (1)

1.微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因，其特征是SEQ ID No: 10。

2. 权利要求1所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因制备方法，其特征是将提取的微孔草RNA反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的微孔草cDNA为模板扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段核苷酸序列；根据测序得到的HPT基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’ NP配对，以微孔草cDNA为模板, 进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’ NP配对，以微孔草cDNA为模板, 进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因 5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的全长翻译区核苷酸序列,其中的各引物为：

上游引物P1为：

P1: 5’-TAYAGSAAGCTTGTGTTTGAG-3’

下游引物P2为：

P2: 5’-ARTTCTTSGGGAGCGGCTTGG -3’

P3: 5’ -CGGAAAGACAATTTGCAAACAGAATACC-3’

P4: 5’ -TACCCAAACAGACTCAAAAAACAAAACC-3’

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’；

P5: 5’ -TGGTACCCATTGCTTCTTTCTTATTTGC-3’

P6: 5’-AATATAATTGTGCATCATTCTCTAAGGC-3’

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’

P7: 5’-CTCCCATGGATGGCTGCTAAAATC-3’

P8: 5’-GGCGGTCACCTCAGCTAATCTTAACCA-3’

其中：R=A +G；Y=C+T； S=C+G。

3. 权利要求1所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因在油料作物的转基因工作中的应用。

4. 权利要求1所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因在牧草作物的转基因工作中的应用。

5. 权利要求1所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因在除权利要求4所述的植物外的植物中的转基因工作中的应用。

6. 权利要求1所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因在除植物外的其它生物的转基因工作中的应用。