ES2387101T3 - Método para la producción de ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanoico en plantas útiles transgénicas - Google Patents

Método para la producción de ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanoico en plantas útiles transgénicas Download PDF

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Abstract

Método para la producción de (i) ácido eicosapentanoico o (ii) ácido araquidónico y ácido eicosapentanoico en los tejidos vegetativos de plantas útiles transgénicas con un contenido de por lo menos 4 % en peso referido al contenido total de lípidos de la planta útil transgénica, caracterizado porque en la planta se introducen por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una Δ-6-desaturasa, por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una Δ-6-elongasa y por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una Δ-5-desaturasa donde los ácidos nucleicos son elegidos de entre el grupo consistente en a) Secuencias de ácidos nucleicos con las secuencias representadas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7; b) Secuencia de ácidos nucleicos, la cual se deriva como resultado de los códigos genéticos generados de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8; y c) derivados de las secuencias de ácidos nucleicos representadas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 las cuales codifican para polipéptidos, las cuales en el plano de aminoácidos exhiben una identidad de por lo menos 70 % con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 y tienen una actividad de Δ-6-desaturasa, Δ-6-elongasa, o Δ-5-desaturasa; donde las mencionadas secuencias se expresan en las plantas con ayuda de por lo menos un promotor constitutivo CaMV/35S el cual hace posible la expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos en tejidos vegetativos de plantas, y un terminador

Description

Metodo para la produccion de acido araquidonico y/o acido eicosapentanoico en plantas utiles transgenicas.
La presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico en tejidos vegetativos de plantas utiles transgenicas, en lo cual se introducen acidos nucleicos en la planta, los cuales codifican para polipeptidos con actividad de M-6-desaturasa, M-6-elongasa y A-5desaturasa. De modo ventajoso ademas en las plantas utiles se expresa un gen que codifica para una w-3desaturasa. En otra forma ventajosa de operar del metodo, pueden expresarse en las plantas otras secuencias de acidos nucleicos, que codifican para polipeptidos de la biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos. Para esto son particularmente ventajosas las secuencias de acidos nucleicos, que codifican para una actividad de M-8desaturasa, M-12-desaturasa, M-15-desaturasa, M-4-desaturasa, M-9-elongasa y/o M-5-elongasa.
Los acidos grasos y triacilgliceridos tiene una multiplicidad de aplicaciones en la industria de los alimentos, la nutricion animal, los cosmeticos y el campo farmaceutico. De acuerdo con si se trata de acidos grasos saturados e insaturados o de triacilgliceridos con un elevado contenido de acidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para diferentes aplicaciones. Muchas veces los acidos grasos w-3 insaturados y acidos grasos w-6 insaturados son un componente importante en la alimentacion animal y humana.
Muchas veces los acidos grasos w-3 insaturados de cadena larga como acido eicosapentanoico (= EPA, C20A M5,8,11,14,17) o acido docosahexenoico (= DHA, C22A6M4,7,10,13,16,19) son componentes importantes de la nutricion humana debido a sus diferentes papeles en la salud, que incluyen aspectos como el desarrollo cerebral infantil, el funcionamiento de los ojos, la sintesis de hormonas y otras sustancias semioquimicas, asi como la prevencion de desordenes cardiovasculares, cancer y diabetes (Poulos, A Lipids 30A1-14,1995; Horrocks, LA y Yeo YK Pharmacol Res 40A 211-225, 1999). Por esta razon existe una necesidad de la produccion de acidos grasos de cadena larga poliinsaturados.
Debido a la composicion comun actual de la alimentacion humana es particularmente importante para la nutricion, una adicion de acidos grasos poliinsaturados w-3, los cuales ocurren preferiblemente en aceites de pescado. De este modo, para elevar el valor nutricional se anaden a los alimentos infantiles por ejemplo acidos grasos poliinsaturados como acido docosahexanoico (= DHA, C22A6M4,7,10,13,16,19) o acido eicosapentanoico (= EPA,
C20A5M5,8,11,14,17).
En lo que sigue se denominan los acidos poliinsaturados como PUFA, PUFAs, LCPUFA o LCPUFAs (poliunsaturated tatty acids, PUFA, acidos grasos poliinsaturados; long chain poliunsaturated tatty acids, LC- PUFA, acidos grasos poliinsaturados de cadena larga).
Principalmente, se obtienen los diferentes acidos grasos y trigliceridos a partir de microorganismos como Mortierella o Schizochytrium o a partir de plantas que producen aceite como soja, colza, algas como Crypthecodinium o Faeodactilum y otros, donde por regla general se presentan en forma de sus triacilgliceridos (= trigliceridos = trigliceroles). Ellos pueden ser obtenidos tambien a partir de animales como por ejemplo pescados. Los acidos grasos libres son obtenidos ventajosamente mediante saponificacion. Los acidos grasos de cadena larga con muchas insaturaciones como EPA, acido dihomo-y- linolenico (C20A353M8,11,14) o acido araquidonico (= ARA, C20A4M5,8,11,14) no son sintetizados en plantas oleaginosas como colza, soja, girasol, cartamo. Son fuentes naturales comunes de estos acidos grasos los pescados como arenque, salmon, sardina, gallineta nordica, anguila, carpa, trucha, rodaballo, macarela, lucio o atun o algas.
Dependiendo del proposito de aplicacion se prefieren aceites con acidos grasos saturados o insaturados. De este modo en la nutricion humana se prefieren por ejemplo lipidos con acidos grasos insaturados, especialmente acidos grasos poliinsaturados. A los acidos grasos poliinsaturados w-3 se les atribuye en ello un efecto positivo sobre el nivel de colesterol en la sangre y con ello las posibilidades de prevencion de una enfermedad del corazon. Mediante la adicion de estos acidos grasos w-3 a la alimentacion puede disminuirse claramente el riesgo de una enfermedad de corazon, un ataque de apoplejia o de elevada presion arterial. Tambien, mediante los acidos grasos w-3 puede influirse positivamente en los procesos inflamatorios cronicos especiales en el marco de enfermedades inmunologicas como artritis reumatoide. Por ello, son anadidos a los alimentos dieteticos especiales o encuentran aplicacion en medicamentos.
Los acidos grasos w-3- y w-6 son precursores de hormonas tisulares, los denominados eicosanoides como las prostaglandinas, que se derivan del acido dihomo-y-linolenico, del acido araquidonico y del acido eicosapentanoico, los tromoxanos y leucotrienos, los cuales se derivan del acido araquidonico y el acido eicosapentanoico. Los eicosanoides (denominados serie PG2), que estan formados de acidos grasos w-6 promueven por regla general reacciones de inflamacion mientras que los eicosanoides (denominados serie PG3) de acidos grasos w-3 tienen bajo
o ningun efecto promotor de la inflamacion.
Debido a sus propiedades positivas no han faltado intentos en el pasado para hacer disponibles genes que participan en la sintesis de acidos grasos o bien de trigliceridos, para la produccion en diferentes organismos de aceites con contenido modificado de acidos grasos insaturados. De este modo en la WO 91/13972 y su equivalente en los Estados Unidos se describe una M-9-desaturasa. En WO 93/11245 se reivindica una M-15-desaturasa, enWO 94/11516 se reivindica una 55 M-12-desaturasa. Por ejemplo en EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990A 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990A 200-203 o Huang et al., Lipids 34, 1999A 649-659 se describen otras desaturasas. Por regla general la caracterizacion de desaturasas unidas a la membrana ocurre mediante incorporacion en un organismo adecuado, al cual se le determina a continuacion la actividad enzimatica por medio de analisis de reactantes y productos. Las desaturasas M-6 son descritas en WO 93/06712, US 5,614,393, US5614393, WO 96/21022, WO00/21557 y WO 99/27111 y tambien la aplicacion para la produccion de organismos transgenicos, como en WO98/46763 WO98/46764, WO9846765. En ello se reivindica y describe tambien la expresion de diferentes desaturasas como en WO99/64616 o WO98/46776 y la formacion de acidos grasos poli insaturados.
Los acidos grasos poliinsaturados pueden, de acuerdo a su patron de desaturacion, ser divididos en dos grandes categorias, en acidos grasos w-6- o w-3, los cuales tienen actividades metabolicas y funcionales diferentes. Por ejemplo en WO0159128, WO0012720, WO02077213 y WO0208401 se describe la sintesis de los acidos grasos w6 u w-3 acido araquidonico y EPA por diferentes vias de biosintesis en microorganismos como levaduras.
Como producto de partida para la ruta metabolica w-6 funciona el acido graso acido linoleico (18A2M9,12), mientras que la ruta w-3 transcurre por acido linolenico (18A3M9,12,15). En ello, el acido linolenico es formado mediante actividades de una desaturasa w-3- (Tocher et al. 1998, Prog. Lipid Res. 37, 73-117 ; Domergue et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105-4113).
Los mamiferos y con ello tambien los seres humanos no disponen de ninguna actividad correspondiente de desaturasa (desaturasa M-12 y w-3) y tienen que tomar estos acidos grasos (acidos grasos esenciales) mediante la alimentacion. Mediante la sucesion de reacciones de desaturasa y elongasa se sintetizan entonces de estas etapas los acidos grasos poliinsaturados fisiologicamente importantes, acido araquidonico (= ARA, 20A4M5,8,11,14), un acido graso w-6, y el acido graso w-3 acido eicosapentanoico (= EPA, 20A5M5,8,11,14,17). cComo se describio arriba, la aplicacion de los acidos grasos w-3 muestra en ello el efecto terapeutico en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100-108), inflamaciones (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345-358) y artritis (Cleland y James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305-2307).
Los metodos conocidos hasta ahora para la produccion de acido araquidonico y/o acido eicosapentanoico poseen algunas desventajas. Por regla general, en los metodos ambos acidos grasos son obtenidos como una mezcla. El unico metodo conocido para la produccion de acido araquidonico con bajas proporciones de EPA es un metodo fermentativo fungico. Esta es una fuente de aceites que desde el punto de vista fisiologico de la nutricion es suboptimo puesto que contiene acidos grasos, que por demas no ocurren en la alimentacion humana. Como otras fuentes de acido araquidonico, entran en consideracion lipidos de huevo. No obstante, estos contienen elevadas proporciones de fosfolipidos asi como colesterol, que son mas bien desventajosos para una amplia aplicacion en productos alimenticios.
Las plantas mayores contienen acidos grasos poliinsaturados como acido linoleico (C18A2) y acido linolenico (C18A 3). ARA y/o EPA no ocurren de ninguna manera en aceites de semillas de plantas mayores o lo hacen solo como trazas (E. UccianiA Nouveau Dictionnaire des Huiles Vegetales. Technique & Documentation -Lavoisier, 1995. ISBNA 2-7430-0009-0). Sin embargo, era ventajoso producir LCPUFAs en plantas mayores, preferiblemente en semillas oleosas como colza, lino, girasol y soja, puesto que de este modo pueden obtenerse grandes cantidades de LCPUFAs con un alto valor de calidad para la industria los alimentos, la nutricion animal y para propositos farmaceuticos, con costos convenientes.
Las primeras plantas transgenicas que contienen y expresan genes que codifican para enzimas de la biosintesis de LCPUFA y producen LCPUFAs fueron descritas por primera vez por ejemplo en DE 102 19 203 (metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados en plantas). Sin embargo, estas plantas producen LCPUFAs en cantidades que tienen que ser optimizadas aun mas para un procesamiento de los aceites presentes en las plantas. Wu et al. fueron exitosos en producir en semillas de Brassica juncea hasta 25% de acido araquidonico y hasta 15% de acido eicosapentanoico, referido en cada caso la cantidad total de acidos grasos en la semilla (G. Wu et al., Stepwise engineering to produce high yields of very long-chain poliunsaturated fatty acids en plants, Nature Biotechnology 23, 1013-1017 (2005)).
No obstante, las semillas son inadecuadas como forraje o producto alimenticio. Ademas, en la produccion exclusiva de acidos grasos en las semillas, la mayor parte de las plantas se desecha sin ser utilizada.
De alli que existe todavia una gran necesidad un metodo sencillo para hacer posible un enriquecimiento del producto alimenticio y/o del forraje con estos acidos grasos poliinsaturados, conveniente en costos para la produccion de acido araquidonico y/o acido eicosapentanoico en plantas utiles.
De alli que existio el objetivo de desarrollar un metodo sencillo, economico, conveniente en costos para la produccion de acido araquidonico y/o acido eicosapentanoico en los tejidos vegetativos de plantas utiles, que no tuvieran las desventajas previamente mencionadas. Ademas, tal metodo deberia hacer posible la sintesis de los acidos grasos, de modo barato en casi cualquier cantidad. Aparte de los productos valiosos acido araquidonico y/o acido eicosapentanoico, deberia contener tan bajo como fuera posible otros PUFAs, de modo ventajoso solamente acidos grasos w-3 u w-6, ventajosamente solo acidos grasos w-3.
Este objetivo fue logrado mediante el metodo acorde con la invencion para la produccion de acido eicosapentanoico
o acido araquidonico y acido eicosapentanoico en plantas utiles transgenicas con un contenido de por lo menos 4 % en peso referido al contenido total de lipidos de la planta util transgenica, caracterizado porque incluye las siguientes etapas del metodoA
a) introduccion de por lo menos una secuencia de acidos nucleicos en la planta util, la cual codifica para una M-6 desaturasa como se describe abajo, y
b) introduccion de por lo menos una secuencia de acidos nucleicos en la planta util, la cual codifica para una M-6-elongasa como se describe abajo, y
c) introduccion de por lo menos una secuencia de acidos nucleicos en la planta util, la cual codifica para una M-5-desaturasa como se describe bajo, y
donde las secuencias mencionadas bajo las etapas (a) a (c) se expresan en las plantas con ayuda de por lo menos un promotor constituyente CaMV/35S, el cual hace posible la expresion de dicha secuencia de acidos nucleicos en los tejidos vegetativos de las plantas, y un terminador.
Las secuencias de acidos nucleicos previamente mencionadas, que son empleadas en el metodo acorde con la invencion y que codifican para polipeptidos con actividad de M-6-desaturasa, M-6-elongasa, y M-5-desaturasa, son elegidas de entre el grupo consistente enA
a) una secuencia de acidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5 o SEQ ID NOA 7 o
b) secuencia de acidos nucleicos, que se derivan como resultado del codigo genetico degenerado de las secuencias de aminoacidos representadas en SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6 o SEQ ID NOA 8, y
c) derivados de las secuencias de acidos nucleicos representadas en SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5 o SEQ ID NOA 7, las cuales codifican para polipeptidos, las cuales en nivel de aminoacidos exhiben por lo menos 70% de identidad con SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6 o SEQ ID NOA 8 y tienen una actividad de M-6-desaturasa, M-6-elongasa, o M-5-desaturasa.
En una forma preferida de operar del metodo, se incorpora en las plantas utiles adicionalmente una secuencia de acidos nucleicos, que codifica para una w-3-desaturasa. Esta secuencia de acidos nucleicos que codifican para w3-desaturasa es elegida ventajosamente de entre el grupo consistente enA
a) una secuencia de acidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NOA 9, o
b) secuencia de acidos nucleicos, que se deriva como resultado del codigo genetico degenerado de las secuencias de aminoacidos representadas en SEQ ID NOA 10, o
c) derivados de las secuencias del acidos nucleicos representadas en SEQ ID NOA 9, que codifican para polipeptidos, que exhiben en el nivel de aminoacidos una identidad de por lo menos 60% con SEQ ID NOA 10 y tienen una actividad de w-3-desaturasa.
De modo ventajoso, los acidos grasos poliinsaturados EPA o ARA y EPA producidos en el metodo acorde con la invencion contienen otros LCPUFAS de la serie de acidos grasos w-3- o w-6 con por lo menos dos, ventajosamente tres, cuatro o cinco dobles enlaces. Los acidos grasos producidos en el metodo tienen ventajosamente 18 o 20 atomos de C en la cadena de acido graso, preferiblemente los acidos grasos contienen 20 atomos de carbono en la cadena de acido graso. Ventajosamente los acidos grasos saturados no reaccionan en ningun caso o reaccionan poco, ventajosamente no reaccionan en ningun caso con los acidos nucleicos empleados en el metodo, que codifican para M-6-desaturasas, M-6-elongasas o M-5- desaturasas y/o w-3-desaturasas. Se entiende por poco, que en comparacion con los acidos grasos poliinsaturados, los acidos grasos saturados reaccionan con menos de 5 % de la actividad, ventajosamente menos de 3 %, de modo particular ventajosamente menos de 2 %, muyparticularmente preferido con menos de 1; 0,5; 0,25 o 0,125 %. Estos, aparte de los acidos grasos EPA o ARA y EPA producidos en el metodo pueden ser producidos adicionalmente en el metodo como acidos grasos individuales
o estar presentes en una mezcla de acidos grasos.
De modo ventajoso las previamente mencionadas secuencias de acidos nucleicos, las cuales codifican para M-6desaturasas, M-6-elongasas o M-5-desaturasas y/o w-3-desaturasas, se expresan en combinacion con otros genes del metabolismo de acidos grasos y/o lipidos como por ejemplo secuencias de acidos nucleicos que codifican para polipeptidos con actividad de M-12-desaturasa, M-9-elongasa, M-8- desaturasa, M-5-elongasa y/o M-4-desaturasa.
Los acidos nucleicos empleados en el metodo acorde con la invencion se expresan en tejidos vegetativos (= tejidos somaticos). En el sentido de esta invencion, se entiende por tejido vegetativo que el tejido se caracteriza porque se multiplica por division mitotica. Tal tejido surge tambien mediante propagacion asexual (= apomixis) y multiplicacion. Se habla de multiplicacion cuando aumenta el numero de individuos en generaciones consecutivas. Estos individuos que surgen mediante multiplicacion asexual son ampliamente identicos con sus padres. Son ejemplos de tales tejidos las hojas, flores, raices, tallos, ramas superficiales o subterraneas (chupones, estolones), rizomas, capullos, tuberculos como bulbos o tuberculos ramificados, cebollas, cuerpos de propagacion, brotes de propagacion, bulbillos o turiones. Tales tejidos pueden surgir tambien mediante viviparidad artificial, autentica o inducida por el hombre. Pero tambien las semillas que surgen mediante agamospermia, como son tipicas para asteraceas, poaceas o rosaceas, pertenecen a los tejidos vegetativos en los que tiene lugar ventajosamente la expresion. En una pequena proporcion o en ningun caso se expresan los acidos nucleicos empleados en el metodo acorde con la invencion en los tejidos generativos (tejidos de linea germinal). Son ejemplos de tales tejidos aquellos que surgen por propagacion sexual, es decir division celular meiotica, como por ejemplo semillas que se forman por procesos sexuales. Se entiende por baja proporcion, que en comparacion con los tejidos vegetativos, la expresion medida sobre ARN y/o niveles de proteina es inferior a 5 %, ventajosamente inferior a 3 %, particularmente ventajoso menor de 2 %, muy particularmente preferido menor a 1; 0,5; 0,25 o 0,125 %. En el sentido de esta invencion se entiende por tejido generativo, que el tejido se forma por division meiotica.
Los acidos grasos poliinsaturados producidos en el metodo estan unidos ventajosamente a fosfolipidos y/o triacilgliceridos, pero pueden ocurrir en los organismos tambien como acidos grasos libres o tambien unidos en forma de otros esteres de acidos grasos. En ello, ellos pueden estar presentes como "producto puro" o tambien ventajosamente en forma de mezclas de diferentes acidos grasos o mezclas de diferentes fosfolipidos como fosfatidilglicol, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y/o fosfatidilserina y/o triacilgliceridos, monoacilgliceridos y/o diacilgliceridos. De modo ventajoso los LCPUFAS EPA o ARA y EPA producidos en el metodo estan presentes en la fosfatidilcolina y/o fosfatidiletanolamina y/o en los triacilgliceridos. Los triacilgliceridos pueden contener ademas aun otros acidos grasos como acidos grasos de cadena corta con 4 a 6 atomos de C, acidos grasos de cadena media con 8 a 12 atomos de C o acidos grasos de cadena larga con 14 a 24 atomos de C, preferiblemente ellos contienen acidos grasos de cadena larga, particularmente preferido los acidos grasos de cadena larga son LCPUFAs de acidos grasos C18 o C20.
En el metodo acorde con la invencion se producen ventajosamente esteres de acidos grasos con moleculas de acidos grasos poliinsaturados C18, y/o C20 con por lo menos dos dobles enlaces en el estado de acido graso, ventajosamente con por lo menos tres, cuatro o cinco dobles enlaces en el ester de acido graso, particularmente ventajoso con cuatro o cinco dobles enlaces en el ester de acido graso y conducen ventajosamente a la sintesis de acido linoleico (= LA, C18A2M9,12), acido y-linolenico (= GLA, C18A3M6,9,12), acido estearidonico (= SDA, C18A4 M6,9,12,15), acido dihomo-y-linolenico (= DGLA, 20A3M8,11,14), acido araquidonico (ARA, C20A4M5,8,11,14) o acido eicosapentanoico (EPA, C20A5M5,8,11,14,17) o sus mezclas, preferiblemente EPA o ARA y EPA. De modo muy particularmente preferido se produce el acido graso w-3 EPA.
Los esteres de acidos grasos con moleculas de acidos grasos poliinsaturados C18 y/o C20 pueden ser aislados a partir de las plantas utiles que fueron empleadas para la produccion del ester de acido graso, en forma de un aceite
o lipido, por ejemplo en forma de compuestos como esfingolipidos, fosfogliceridos, lipidos, glicolipidos como glicoesfingolipidos, fosfolipidos como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol o difosfatidilglicerol, monoacilgliceridos, diacilgliceridos, triacilgliceridos u otros esteres de acidos grasos como el ester de acetilCoenzimaA, los cuales contienen los acidos grasos poliinsaturados con por lo menos dos, tres o cuatro, preferiblemente tres o cuatro dobles enlaces, ventajosamente ellos son aislados en forma de sus diacilgliceridos, triacilgliceridos y/o en forma del fosfatidilester, particularmente preferido en la forma de triacilgliceridos, fosfatidilcolina y/o fosfatidilserina. Aparte de estos esteres, los acidos grasos poliinsaturados estan presentes en las plantas tambien como acidos grasos libres o unidos a otros compuestos. Por regla general los diferentes compuestos previamente mencionados (esteres de acidos grasos y acidos grasos libres) estan presentes en los organismos en una distribucion aproximada de 80 a 90 % en peso de trigliceridos, 2 a 5 % en peso de digliceridos, 5 a 10 % en peso de monogliceridos, 1 a 5 % en peso de acidos grasos libres, 2 a 8 % en peso de fosfolipidos, donde la suma de los diferentes compuestos completa hasta 100 % en peso.
En el metodo acorde con la invencion se producen los LCPUFAs producidos con un contenido de por lo menos 4 % en peso, ventajosamente de por lo menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 % en peso, preferiblemente de por lo menos 11, 12, 13, 14 o 15 % en peso, particularmente preferido de por lo menos 16, 17, 18, 19, o 20 % en peso, muy particularmente preferido de por lo menos 25, 30, 35 o 40 % en peso referido a la totalidad de los acidos grasos en la plantas transgenicas. En ello los acidos grasos EPA o ARA y EPA producidos en el metodo acorde con la invencion estan presentes con un contenido de por lo menos 10 % en peso, preferiblemente de por lo menos 11, 12, 13, 14 o 15 % en peso, particularmente preferido de por lo menos 16, 17, 18, 19, o 20 % en peso, muy particularmente preferido de por lo menos 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 % en peso, preferido al maximo de por lo menos 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 % en peso referido a la totalidad de los acidos grasos en los triacilgliceridos y/o fosfatidilgliceridos, ventajosamente en la fosfatidilcolina y/o fosfatidilserina.
Ventajosamente los acidos grasos son producidos en forma unida. Con ayuda de los acidos nucleicos empleados en el metodo acorde con la invencion, ventajosamente se llevan estos acidos grasos insaturados a la posicion sn1, sn2 y/o sn3 de los trigliceridos producidos. De modo ventajoso por lo menos 11 % de los triacilgliceridos tienen una doble sustitucion, es decir estan sustituidos en la posicion sn1 y sn2 o sn2 y sn3. Tambien se pueden verificar triacilgliceridos con tres sustituciones. Puesto que en el metodo acorde con la invencion pasan varias etapas de reaccion de los compuestos de partida acido linoleico (C18A2) o bien acido linolenico (C18A3), los productos finales del metodo como por ejemplo acido eicosapentanoico (EPA) o acido araquidonico (ARA) y acido eicosapentanoico (EPA) no surgen como producto absolutamente puro, existen siempre tambien trazas o cantidades grandes de los precursores en el producto final. Si en las plantas de partida existen por ejemplo tanto acido linoleico como tambien acido linolenico, entonces estan presentes como mezclas los productos finales como EPA o ARA y EPA. Ventajosamente, los precursores no deberian ser superiores a 20 % en peso, preferiblemente no mas de 15 % en peso, particularmente preferido no mas de 10 % en peso, muy particularmente preferido no mas de 5 % en peso, referido a la cantidad de los respectivos productos finales. Ventajosamente en una planta transgenica estan unidos en el metodo acorde con la invencion como producto final solo ARA o EPA o son producidos como acidos libres.
Los esteres de acidos grasos o bien mezclas de esteres de acidos grasos, que fueron producidos segun el metodo acorde con la invencion, contienen ventajosamente 6 a 15 % de acido palmitico, 1 a 6 % de acido estearico; 7 -85 % de acido oleico; 0,5 a 8 % de acido vaccenico, 0,1 a 1 % de acido araquinico, 7 a 25 % de acidos grasos saturados, 8 a 85 % de acidos grasos monoinsaturados y 60 a 85 % de acidos grasos poliinsaturados referido en cada caso a 100 % y sobre el contenido total de acidos grasos de los organismos. Como acidos grasos ventajosamente poliinsaturados estan presentes en los esteres de acidos grasos o bien mezclas de esteres de acidos grasos preferiblemente por lo menos 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 o 1 % referido al contenido total de acidos grasos en acido araquidonico. Ademas, los esteres de acidos grasos o bien mezclas de esteres de acidos grasos, que fueron producidos segun el metodo acorde con la invencion, contienen ventajosamente acidos grasos elegidos de entre el grupo de los acidos grasos acido erucico (acido 13-docosenico), acido esterculinico (acido 9,10-metilen octadec-9-enoico), acido malvalico (acido 8,9-metilen heptadec-8-enoico), acido chaulmogrico (acido ciclo- pentendodecanoico), acido graso furanico (acido 9,12-epoxi-octadeca-9,11-dienoico), acido vernonico (acido 9,10-epoxioctadec12-enoico), acido tarinico (acido 6-octadecinoico), acido 6-nonadecinoico, acido santalbico (acido t11-octadecen-9-inoico), acido 6,9-octadeceninoico, acido pirulico (acido t10-heptadecen-8-inoico), acido crepenico (acido 9-octadecen-12-inoico), acido 13,14-dihidroprofenico, acido octadecen-13-ene-9,11-diinoico, acido petroselico (acido cis-6-octadecenoico), acido 9c,12t-octadecadienico, acido calendulico (acido 8t10t12coctadecatrienico), acido catalpico (acido 9t11t13c-octadecatrienico), acido eleosterico (acido 9c11t13toctadecatrienico), acido jacarico (acido 8c10t12c-octadecatrienico), acido punicico (acido 9c11t13coctadecatrienico), acido parinarico (acido 9c11t13t15c-octadecatetraenico), acido pinolenico (acido todo-cis-5,9,12octadecatrienico), acido labalenico (acido 5,6-octadecadienalenico), acido ricinolico (acido 12-hidroxiacidoleico) y/o acido coriolico (acido 13-hidroxi-9c,11t-octadecadienoico). Por regla general, ventajosamente los acidos grasos previamente mencionados ocurren en los esteres de acidos grasos o bien mezclas de esteres de acidos grasos producidos segun el metodo acorde con la invencion solo en trazas, es decir ellos ocurren, referido a la totalidad de los acidos grasos, en menos de 30 %, preferiblemente menos de 25 %, 24 %, 23 %, 22 % o 21 %, particularmente preferido menos de 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7%, 6 % o 5%, muy particularmente preferido menos de 4 %, 3 %, 2 % o 1 %. En otra forma preferida de operar de la invencion, estos acidos grasos previamente mencionados ocurren, referido a la totalidad de los acidos grasos, en menos de 0,9%; 0,8%; 0,7%; 0,6%; o 0,5%, particularmente preferido menos de 0,4%; 0,3%; 0,2%; 0,1%. De modo ventajoso los esteres de acidos grasos o bien mezclas de esteres de acidos grasos producidos segun el metodo acorde con la invencion contienen menos de 0,1 % referido a la totalidad de acidos grasos y/o no contienen acido butirico, colesterol, acido clupanodonico (= acido docosapentanoico, C22A5M4,8,12,15,21) asi como tampoco acido nisinico (acido tetracosahexanoico, C23A6M3,8,12,15,18,21),
Mediante la secuencia de acidos nucleicos empleada en el metodo acorde con la invencion puede alcanzarse una elevacion de rendimiento en acidos grasos poliinsaturados de por lo menos 50 %, ventajosamente de por lo menos 80 %, de modo particular ventajosamente de por lo menos 100 %, de modo muy particular ventajosamente de por lo menos 150 % , respecto a las plantas utiles no transgenicas, ver ejemplos.
Tambien pueden ilustrarse acidos grasos poliinsaturados quimicamente puros o mezclas de acidos grasos segun el metodo previamente descrito. Para ello se aislan los acidos grasos o mezclas de acidos grasos a partir de las plantas de la manera conocida por ejemplo mediante extraccion, destilacion, cristalizacion, cromatografia o combinaciones de estos metodos. Estos acidos grasos quimicamente puros o mezclas de acidos grasos son ventajosos para aplicaciones en el campo de la industria de los alimentos, la industria los cosmeticos y particularmente la industria farmaceutica.
Para el metodo acorde con la invencion son adecuadas en principio todas las plantas utiles dicotiledoneas o monocotiledoneas. Se entienden por plantas utiles las plantas que sirven para la produccion de alimentos para los humanos y animales, la produccion de estimulantes, fibras y productos farmaceuticos, como cereales como por ejemplo maiz, arroz, trigo, cebada, mijo, avena, centeno, alforfon; como tuberculos por ejemplo mandioca, camote, name etc.; como plantas azucareras como por ejemplo cana de azucar o remolacha azucarera; como plantas leguminosas por ejemplo judias, guisantes, habas etc.; como frutas oleosas y grasas por ejemplo soja, colza, girasol, alazor, lino, camelina etc., por mencionar solo algunas. Las plantas ventajosas son elegidas de entre el grupo de las familias vegetales consistentes en las familias de las Aceraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Arecaceae, Asteraceae, Arecaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Cannaceae, Capri- toliaceae, Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Eutorbiaceae, Fabaceae, Fagaceae, Grossulariaceae, Juglandaceae, Lauraceae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Moraceae, Musaceae, Oleaceae, Oxalidaceae, Papaveraceae, Poaceae, Poligonaceae, Punicaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Sterculiaceae y Valerianaceae.
A modo de ejemplo se mencionan las siguientes plantas elegidas de entre los gruposA anacardiaceas como los generos Pistacia, Mangifera, Anacardium por ejemplo el genero y tipo Pistacia vera [pistacho], Mangiter indica [mango] o Anacardium occidentale [anacardo], asteraceas como los generos Calendula, Carthamus, Centaurea, Cicorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Clavelon, Valeriana por ejemplo los generos y tipos Calendula officinalis [calendula de jardin], Carthamus tinctorius [alazor, cartamo], Centaurea cyanus [aciano], Cicorium intybus [usillo], Cynara scolymus [alcachofa], Helianthus annus [girasol], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integritolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [lechuga], Tagetes lucida, Tagetes erecta o Tagetes tenuitolia [damasquina], apiaceas como el genero Daucus por ejemplo en el genero y tipo Daucus carota [zanahoria], betulaceas como el genero Corilus por ejemplo los generos y tipos Corilus avellana o Corilus colurna [avellana], boraginaceas como el genero Borago por ejemplo el genero y tipo Borago otticinalis [borraja], brassicaceas como los generos Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis por ejemplo los generos y tipos Brassica napus, Brassica rapa ssp. [colza], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispi tolia, Brassica juncea var. toliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [mostaza], Brassica oleracea [remolacha forrajera] o Arabidopsis thaliana, bromeliaceae como los generos Anana, Bromelia (ananas) por ejemplo los generos y tipos Anana comosus, Ananas ananas o Bromelia comosa [Ananas], caricaceas como el genero Carica como el genero y tipo Carica papaya [papaya], cannabaceas como el genero Cannabis como el genero y tipo Cannabis sative [canamo], convolvulaceas como los generos Ipomea, Convolvulus por ejemplo los generos y tipos Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea tastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba o Convolvulus panduratus [patata dulce, camote], quenopodiaceas como el genero Beta como los generos y tipos Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva o Beta vulgaris var. esculenta [remolacha azucarera], cucurbitaceas como el genero Cucurbita por ejemplo los generos y tipos Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo o Cucurbita moschata [calabaza], elaeagnaceas como el genero Elaeagnus por ejemplo el genero y tipo Olea europaea [olivo], ericaceas como el genero Kalmia por ejemplo los generos y tipos Kalmia latitolia, Kalmia angustitolia, Kalmia microphilia, Kalmia politolia, Kalmia occidentatis, Cistus chamaerhodendros o Kalmia lucida [laurel de montana], euforbiaceas como los generos Manihot, Janifa, Jatrofa, Ricinus por ejemplo los generos y tipos Manihot utilissima, Janita manihot, Jatrota manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [yuca] o Ricinus communis [ricino], fabaceas como los generos Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glicine, Dolicos, Fasaolus, soja por ejemplo los generos y tipos Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [arveja], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga tragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium tragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophilla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [arbol de seda], Medicago sativa, Medicago talcata, Medicago varia [Alfalfa] Glicine max Dolicos soja; Glicine gracilis, Glicine hispida, Fasaolus max, Soja hispida o Soja max [soja], geraniaceas como los generos Pelargonium, Cocos, Oleum por ejemplo los generos y tipos Cocos nucitera, Pelargonium grossularioides o Oleum cocois [coco], gramineas como el genero Saccharum por ejemplo el genero y tipo Saccharum otticinarum, juglandaceas como los generos Juglans, Wallia por ejemplo los generos y tipos Juglans regia, Juglans ailanthitolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans calitornica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra o Wallia nigra [nuez], Lauraceae como los generos Persea, Laurus por ejemplo los generos y tipos Laurus nobilis [laurel], Persea americana, Persea gratissima o Persea persea [aguacate], leguminosas como el genero Arachis por ejemplo el genero y tipo Arachis hypogaea [cacahuete], linaceas como los generos Linum, adenolinum por ejemplo los generos y tipos Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustitolium, Linum catharticum, Linum tlavum, Linum granditlorum, Adenolinum
granditlorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense o Linum trigynum [lino], lythrarieas como el genero Punica por ejemplo el genero y tipo Punica granatum [granada], malvaceas como el genero Gossypium por ejemplo los generos y tipos Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum o Gossypium thurberi [algodon], musaceas como el genero Musa por ejemplo los generos y tipos Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [banana], onagraceas como los generos Camissonia, Oenothera por ejemplo los generos y tipos Oenothera biennis o Camissonia brevipes [onagra], palmas como el genero Elacis por ejemplo el genero y tipo Elaeis guineensis [palma de aceite], papaveraceas como el genero Papaver por ejemplo los generos y tipos Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [amapola], pedaliaceas como el genero Sesamum por ejemplo el genero y tipo Sesamum indicum [sesamo], piperaceas como los generos Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia por ejemplo los generos y tipos
Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustitolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrotractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Stettensia elongata [pimienta Cayena], poaceas como los generos Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (maiz), Triticum por ejemplo los generos y tipos Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum disticon Hordeum aegiceras, Hordeum hexasticon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [cebada], Secale cereale [centeno], Avena sativa, Avena tatua, Avena byzantina, Avena tatua var. sativa, Avena hybrida [avena], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum cattrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticillitlorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicumilitaceum [mijo], Oryza sativa, Oryza latitolia [arroz], Zea mays [maiz] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare [trigo], porfiridiaceas como los generos Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia por ejemplo el genero y tipo Porphyridium cruentum, proteaceas como el genero Macadamia por ejemplo el genero y tipo Macadamia intergritolia [macadamia], rubiaceas como el genero Coffea por ejemplo los generos y tipos Cotea spp., Cottea arabica, Cottea canetora o Cottea liberica [cafe], escrofulariaceas como el genero Verbascum por ejemplo los generos y tipos Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densitlorum, Verbascum lagurus, Verbascum longitolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum toenicum, Verbascum pulverulentum o Verbascum thapsus
[candelaria], solanaceas como los generos Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon por ejemplo los generos y tipos Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum trutescens [pimienta], Capsicum annuum [paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorttii, Nicotiana obtusitolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana silvestris [tabaco], Solanum tuberosum [patata], Solanum melongena [berenjena] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyritorme, Solanum integritolium o Solanum lycopersicum [tomate], esterculiaceas como el genero Theobroma por ejemplo el genero y tipo Theobroma cacao [cacao] o teaceas como el genero Camellia por ejemplo el genero y tipo Camellia sinensis [te].
En una forma ventajosa de operar del metodo, se emplean como plantas utiles plantas de frutos oleosos, que contienen grandes cantidades de compuestos lipidos, como cacahuete, colza, canola, girasol, cachumba (Carthamus tinctoria), amapola, mostaza, canamo, ricino, olivo, ajonjoli, calendula, punica, onagra, candelaria, cardo, rosas silvestres, avellana, almendra, macadamia, aguacate, laurel, calabaza, lino, soja, pistacho, borraja, arboles (palma de aceite, coco o nuez) o frutos del campo como maiz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, algodon, mandioca, pimienta, clavelon, plantas solanaceas, como patata, tabaco, berenjena y tomate, del tipo Vicia, arvejas, alfalfa o arbustos (cafe, cacao, te), del tipo Salix pastos perennes y frutos forrajeros del campo. Son plantas acordes con la invencion ventajosas las plantas de frutos oleosos, como cacahuete, colza, canola, girasol, cachumba, amapola, mostaza, canamo, ricino, olivo, calendula, punica, onagra, calabaza, lino, soja, borraja, arboles (palma de aceite, coco). Se prefieren particularmente las plantas ricas en acidos grasos C18A2 y/o C18A3 como girasol, alazor, tabaco, candelaria, ajonjoli, algodon, calabaza, amapola, onagra, nuez, lino, canamo, cardo o alazor. Se prefiere muy particularmente plantas como alazor, girasol, amapola, onagra, nuez, lino o canamo.
Para el metodo descrito acorde con la invencion es ventajoso introducir en las plantas, adicionalmente a los acidos nucleicos introducidos bajo las etapas del metodo (a) a (c) asi como las dado el caso secuencias introducidas de acidos nucleicos que codifican para las w-3-desaturasas, otros acidos nucleicos que codifican para enzimas del metabolismo de acidos grasos o lipidos.
En principio pueden emplearse todos los genes del metabolismo de acidos grasos o lipidos, ventajosamente en combinacion con las secuencias de acidos nucleicos empleadas en el metodo acorde con la invencion, las cuales codifican para las M-6-elongasa(s), M-6-desaturasa(s), M-5-desaturasa(s) y/o M-3-desaturasa(s) [en el sentido de esta inscripcion, deberian incluirse el plural y el singular y reciprocamente]; ventajosamente se emplean genes del metabolismo de acidos grasos o lipidos elegidos de entre el grupo de acil-CoA-dehidrogenasa(s), acilACP[=proteina portadora de acilo]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), acil-transferasa(s) de acidos grasos, acilCoAAlisofosfolipid-aciltransferasas, sintetasa(s) de acidos grasos, hidroxilasa(s) de acidos grasos, acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acil-coenzima A-oxidasa(s), desaturasa(s) de acidos grasos, acetilenasas de acidos grasos,
lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasaa, sintetasas de oxido de aleno, hidroperoxido-liasas o elongasa(s) de acidos grasos en combinacion con las M-6-elongasa, M-6-desaturasa, M-5-desaturasa y/o w-3-desaturasa. Se emplean de modo particularmente preferido genes elegidos de entre el grupo de las M-4-desaturasas, M-8-desaturasas, M-9desaturasas, M-12-desaturasas, M-5-elongasa o M-9-elongasas en combinacion con los genes previamente mencionados para las M-6-elongasa, M-6-desaturasa, M-5-desaturasa y/o w-3-desaturasa, donde pueden emplearse genes individuales o varios genes en combinacion.
La w-3-desaturasa empleada en el metodo acorde con la invencion deberia ventajosamente hacer posible un desplazamiento de la ruta de biosintesis w-6 a la ruta de biosintesis w-3. Esto conduce ventajosamente a un desplazamiento de acidos grasos C18A2 a C18A3. Mediante estas propiedades de la w-3-desaturasa es posible ventajosamente desplazar el espectro de acidos grasos dentro de un organismo, ventajosamente dentro de una planta o un hongo desde los acidos grasos w-6 hasta los acidos grasos w-3. Ademas es ventajoso que la w-3desaturasa transforme una amplia gama de fosfolipidos como fosfatidilcolina (= PC), fosfatidilinositol (= PIS) o fosfatidiletanolamina (= PE). Finalmente en los lipidos neutros (= NL), es decir en los trigliceridos se encuentran tambien los productos de dessaturacion.
Mediante la actividad enzimatica de los acidos nucleicos empleados en el metodo acorde con la invencion, los cuales codifican para polipeptidos con actividad de M-6-elongasa, M-6-desaturasa, M-5-desaturasa, y/o w-3desaturasa, ventajosamente en combinacion con secuencias de acidos nucleicos que codifican para polipeptidos del metabolismo de acidos grasos o lipidos como otros polipeptidos con actividad de M-4-, M-5-, M-6-, M-8-, M-12desaturasa- o M-5-, M-6- o M-9-elongasa, pueden producirse los mas diversos acidos grasos poliinsaturados en el metodo acorde con la invencion. Dependiendo de la eleccion de las plantas utiles empleadas para el metodo acorde con la invencion se producen mezclas de los diferentes acidos grasos poliinsaturados o acidos grasos poliinsaturados individuales como EPA o ARA y EPA en forma libre o unida. De acuerdo a cual mezcla de acidos grasos prevalezca en las plantas de partida (acidos grasos C18A2 o C18A3) surgen entonces acidos grasos que se derivan de acidos grasos C18A2, como GLA, DGLA o ARA o que se derivan de acidos grasos C18A3 como SDA, ETA o EPA. Si como acido graso insaturado esta presente en las plantas empleadas para el metodo, solo acido linoleico (= LA, C18A2M9,12), entonces como productos del metodo puede surgir solo GLA, DGLA y ARA, que pueden estar presentes como acido graso libre o unidos. Si como acido graso insaturado en la planta empleada en el metodo esta solo el acido a linolenico (= ALA, C18A3M9,12,15) por ejemplo como en lino, entonces como producto del metodo pueden surgir solo SDA, ETA y/o EPA, los cuales pueden estar presentes como acido graso libre o unido, como se describio arriba. Mediante modificacion de la actividad de las enzimas M-6-elongasa, M-6-desaturasa, M-5desaturasa y/o w-3-desaturasa empleadas en el metodo y participes de la sintesis, ventajosamente en combinacion con otros genes del metabolismo de lipidos o acidos grasos se producen de manera focalizada en las plantas solo productos individuales. De modo ventajoso se sintetizaron solo EPA o ARA y EPA, dependiendo del acido graso presente en el organismo o bien la planta, el cual sirve como sustancia de partida para la sintesis. Puesto que son cadenas de biosintesis, los respectivos productos finales no estan presentes en el organismo como sustancia pura. En el producto final siempre estan presentes tambien pequenas cantidades de compuestos precursores. Estas pequenas cantidades son inferiores a 20 % en peso, ventajosamente inferiores a 15 % en peso, de modo particularmente ventajoso inferiores a 10 % en peso, muy particularmente ventajoso inferiores a 5, 4, 3, 2 o 1 % en peso, referido al producto final EPA o ARA y EPA.
Aparte de la produccion de los acidos grasos de partida para el metodo acorde con la invencion directamente en la planta, en principio los acidos grasos pueden ser alimentados tambien desde afuera. Por razones de costos se prefiere la produccion en la planta. Los sustratos preferidos de la w-3-desaturasa son el acido linoleico (C18A2M9,12), el acido y-linolenico (C18A3M6,9,12), el acido eicosadienoico (C20A2M11,14), el acido dihomo-y-linolenico (C20A3M8,11,14) y el acido araquidonico (C20A4M5,8,11,14).
Para elevar el rendimiento del metodo descrito para la produccion de aceites y/o trigliceridos con un contenido ventajosamente elevado de acidos grasos poliinsaturados, es ventajoso elevar la cantidad de los productos de partida para la sintesis de acidos grasos, esto puede alcanzarse por ejemplo mediante la introduccion de un acido nucleico en el organismo, el cual codifica para un polipeptido con M-12-desaturasa. Esto es particularmente ventajoso en plantas utiles que contienen acido oleico, como plantas que producen aceite como plantas de la familia de las brassicaceas como del genero Brassica por ejemplo colza; de la familia de las elaeagnaceas como el genero Elaeagnus por ejemplo el genero y tipo Olea europaea o de la familia fabaceas como el genero Glicine por ejemplo el genero y tipo Glicine max, que exhiben un elevado contenido de acido oleico. Puesto que estos organismos exhiben solo un bajo contenido de acido linoleico (Mikoklajczak et al., Journal of the American Oil Chemical Society, 38, 1961, 678 - 681) es ventajoso el empleo de las mencionadas M-12-desaturasas para la produccion del producto de partida acido linoleico.
En el metodo acorde con la invencion, los acidos nucleicos provienen ventajosamente de plantas como algas por ejemplo altas de la familia de las prasinoficeas como de los generos Heteromastix, Mammella, Mantoniella, Micromonas, Nephroselmis, Ostreococcus, Prasinocladus, Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pycnococcus, Pyramimonas, Scherffelia o Tetrasalmis como de los generos y tipos Heteromastix longifillis, Mamiella gilva, Mantoniella squamata, Micromonas pusilla, Nephroselmis olivacea, Nephroselmis pyriformis, Nephroselmis rotunda, Ostreococcus tauri, Ostreococcus sp. Prasinocladus ascus, Prasinocladus lubricus, Pycnococcus provasolii, Pyramimonas amilifera, Pyramimonas disomata, Pyramimonas obovata, Pyramimonas orientalis, Pyramimonas parkeae, Pyramimonas spinifera, Pyramimonas sp., Tetrasalmis apiculata, Tetrasalmis carteriaformis, Tetrasalmis chui, Tetrasalmis convolutae, Tetrasalmis desikacharyi, Tetrasalmis gracilis, Tetrasalmis hazeni, Tetrasalmis impellucida, Tetrasalmis inconspicua, Tetrasalmis levis, Tetrasalmis maculata, Tetrasalmis marina, Tetrasalmis striata, Tetrasalmis subcordiformis, Tetrasalmis suecica, Tetrasalmis tetrabrachia, Tetrasalmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Tetrasalmis verrucosa fo. rubens o Tetrasalmis sp. o de algas de la familia Euglenaceae como de los generos Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalofacus, Khawkinea, Lepocinclis, Facus, Strombomonas o Trachelomonas como el genero y tipo Euglena acus, Euglena geniculata, Euglena gracilis, Euglena mixocilindracea, Euglena rostrifera, Euglena viridis, Colacium stentorium, Trachelomonas cilindrica o Trachelomonas volvocina. Ventajosamente los acidos nucleicos empleados provienen de algas de los generos Euglena, Mantoniella o Ostreococcus.
Otras plantas ventajosas son algas como Isochrysis o Crypthecodinium, algas/diatomeas como Thalassiosira o Faeodactilum, musgos como Physcomitrella o Ceratodon o plantas superiores como las primulaceas como Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens o Osteospermum hyoseroides, microorganismos como hongos como Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor o Mortierella, bacterias como Shewanella, levaduras o animales como nematodos como Caenorhabditis, insectos, sapos, cohombro de mar o pescados. Ventajosamente la secuencia de acidos nucleicos aislada de acuerdo con la invencion proviene de un animal del orden de los vertebrados. Preferiblemente la secuencia de acidos nucleicos proviene de la categoria de los Vertebrata; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae o bien Oncorhynchus o Vertebrata, Amphibia, Anura, Pipidae, Xenopus o Evertebrata como Protocordata, Tunicata, Holothuroidea, Cionidae como Amaroucium constellatum, Botrillus schlosseri, Ciona intestinalis, Molgula citrina, Molgula manhattensis, Perofora viridis o Styela partita. De modo particularmente ventajoso los acidos nucleicos provienen de hongos, animales o de plantas como algas o musgos, preferiblemente del orden de los salmoniformes como de la familia de las Salmonidae como del genero Salmo por ejemplo de los generos y tipos Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta o Salmo trutta fario, de algas como los generos Mantoniella o Ostreococcus o de las diatomeas como los generos Thalassiosira o Faeodactilum o de algas como Crypthecodinium.
Son ventajosas en el metodo acorde con la invencion las secuencias de acidos nucleicos previamente mencionadas
o sus derivados u homologos que codifican para polipeptidos, las cuales aun poseen la actividad enzimatica de la proteina codificada mediante secuencias de acidos nucleicos. Estas secuencias son clonadas individualmente o en combinacion con las secuencias de acidos nucleicos en fragmentos de expresion que codifican para las M-12desaturasa, M-4-desaturasa, M-5-desaturasa, M-6-desaturasa, M-5-elongasa, M-6-elongasa y/o w-3-desaturasa y son empleadas para la introduccion y la expresion en organismos. Estos fragmentos de expresion hacen posible mediante su construccion una sintesis ventajosamente optima de los acidos grasos poliinsaturados producidos en el metodo acorde con la invencion.
Para una forma preferida de operar, el metodo incluye ademas la etapa de la obtencion de una celula o una planta completa que contiene la secuencia de acidos nucleicos empleada en el metodo que codifica para una M-6desaturasa, M-6-elongasa, M-5-desaturasa y/o w-3-desaturasa, donde las celulas y/o la planta util pueden contener aun tambien otras secuencias de acidos nucleicos del metabolismo de lipidos o acidos grasos. Estas secuencias de acidos nucleicos empleada preferiblemente en el metodo son incorporadas ventajosamente para la expresion en por lo menos una estructura de gen y/o un vector como se describe a continuacion, solas o en combinacion con otras secuencias de acidos nucleicos, que codifican para proteinas del metabolismo de acidos grasos o lipidos y finalmente son transformados en la celula o planta. Para otra forma preferida de operar, este metodo incluye ademas la etapa de la obtencion de aceites, lipidos o acidos grasos libres a partir de plantas utiles. Las celulas asi producidas o las plantas utiles asi producidas son ventajosamente una celula de una planta que produce aceite, hortalizas, verduras o plantas ornamentales o la planta en si misma como se explico arriba.
Se entiende por propagacion, por ejemplo en el caso de celulas, tejidos u organos vegetales, el cultivo sobre o en un medio nutritivo o de la totalidad de la planta sobre o bien en un sustrato por ejemplo en hidrocultivos, compostaje en macetas o sobre un suelo cultivable.
En el sentido de la invencion, "transgenico" o bien "recombinante" significa por ejemplo respecto a una secuencia de acido nucleico, una cinta de expresion (= estructura de gen) o un vector que contiene la secuencia de acidos nucleicos empleada en el metodo acorde con la invencion o una planta transformada con la secuencia de acidos nucleicos, cinta de expresion o vector empleados en el metodo acorde con la invencion, todas aquellas construcciones que se realizan mediante metodos de tecnica genetica, en los cuales bien sea
a) la secuencia de acidos nucleicos, o
b) una secuencia de control genetico enlazada funcionalmente con la secuencia de acidos nucleicos, por ejemplo un promotor, o
c) (a) y (b)
no se encuentran en su ambiente genetico natural o fueron modificadas mediante metodos de tecnica genetica, donde a modo de ejemplo la modificacion pueden ser una sustitucion, adicion, borrado, impresion o insercion de uno o varios radicales nucleotido. Ambiente genetico natural significa el lugar cromosomico o bien genomico natural en el organismo de origen o la presencia de una biblioteca genomica. En el caso de una biblioteca genomica, se obtiene preferiblemente por lo menos aun parcialmente el ambiente genetico natural de la secuencia de acidos nucleicos. El ambiente flanquea la secuencia de acidos nucleicos por lo menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de por lo menos 50 bp, preferiblemente por lo menos 500 bp, particularmente preferido por lo menos 1000 bp, muy particularmente preferido por lo menos 5000 bp. Una cinta de expresion que ocurre naturalmente por ejemplo la combinacion que ocurre naturalmente del promotor natural de la secuencia de acidos nucleicos empleada en el metodo acorde con la invencion, la cual codifica para proteinas con la correspondiente actividad de A-6-desaturasa, M-6-elongasa, M-5-desaturasa y/o w-3-desaturasa, ventajosamente en combinacion con secuencias de acidos nucleicos, que codifican para proteinas con actividad de M-12-desaturasa, M-4-desaturasa, M-8desaturasa, M-9-elongasa, y/o M-5-elongasa, es modificada hasta una cinta transgenica de expresion, cuando esta es modificada mediante metodos sinteticos no naturales ("artificiales") como por ejemplo una mutagenizacion. Los metodos correspondientes son descritos por ejemplo US 5,565.350 o WO 00/15815.
En el sentido de la invencion, se entiende por plantas transgenicas, como se menciono previamente, que los acidos nucleicos empleados en el metodo no estan en su posicion natural en el genoma de la planta, en ello pueden expresarse los acidos nucleicos de manera homologa o heterologa. Transgenico significa tambien, como se menciono, que los acido nucleicos acordes con la invencion estan en su sitio natural en el genoma de la planta, que sin embargo la secuencia fue modificada respecto a la secuencia natural y/o que las secuencias reguladoras de la secuencia natural fueron modificadas. Preferiblemente se entiende por transgenico la expresion de los acidos nucleicos empleados en el metodo acorde con la invencion en la posicion no natural en el genoma, es decir esta presente una expresion homologa o preferiblemente heterologa de los acidos nucleicos. Los organismos transgenicos preferidos son plantas utiles como plantas que producen aceite, hortalizas, plantas para ensalada o plantas ornamentales que son elegidas ventajosamente de entre el grupo de las familias de plantas consistentes en las familias de Aceraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Arecaceae, Asteraceae, Arecaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Cannaceae, Capritoliaceae, Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Eutorbiaceae, Fabaceae, Fagaceae, Grossulariaceae, Juglandaceae, Lauraceae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Moraceae, Musaceae, Oleaceae, Oxalidaceae, Papaveraceae, Poaceae, Poligonaceae, Punicaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Sterculiaceae y Valerianaceae.
Como plantas huesped para los acidos nucleicos, la cinta de expresion o el vector empleados en el metodo acorde con la invencion son adecuadas en principio de modo ventajoso todas las plantas utiles que estan en capacidad de sintetizar acidos grasos, en especial acidos grasos insaturados o bien que son adecuadas para la expresion de genes recombinantes. Como ejemplos se mencionan en este lugar plantas como Arabidopsis, asteraceas como Calendula o plantas utiles como soja, cacahuete, ricino, girasol, maiz, algodon, lono, colza, coco, palma de aceite, cartamo (Carthamus tinctorius) o granos de cacao. En otro sitio de esta inscripcion se mencionan otras plantas ventajosas.
Para la produccion de las plantas transgenicas utiles se emplean por lo general microorganismos como huespedes intermedios. Tales celulas huespedes intermedios que pueden ser utilizadas son mencionadas enA Goeddel, Gene Expression TechnologyA Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Son cepas de expresion que pueden ser utilizadas ventajosamente para este proposito por ejemplo aquellas que exhiben una baja actividad de proteasa. Ellas son descritas por ejemplo enA Gottesman, S., Gene Expression TechnologyA Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
Las plantas transgenicas, que contienen acidos grasos poliinsaturados sintetizados en el metodo acorde con la invencion, puede ser mercadeadas ventajosamente de modo directo sin que tengan que aislarse los aceites, lipidos
o acidos grasos. Esta forma de mercadeo es particularmente ventajosa.
Bajo plantas en el metodo acorde con la invencion estan, como se describio arriba, plantas enteras asi como todas las partes de plantas, organos de plantas o partes de plantas como hojas, tallos, semillas, raices, tuberculos, anteras, fibras, cabellos de raiz, palos, embriones, callos, cotiledones, peciolos, material de cosecha, tejidos vegetales, tejidos reproductivos, cultivos de celulas, los cuales se derivan de plantas transgenicas y/o pueden ser empleados para producir las plantas transgenicas. Las semillas incluyen en ello todos las partes de semilla como las cascaras de semilla, celulas de epidermis y celulas de semillas, endospermo o tejidos embrionarios. Los compuestos producidos en el metodo acorde con la invencion pueden ser aislados tambien de las plantas en forma de su aceite, grasa, lipidos y/o acidos grasos libres. Los acidos grasos poliinsaturados producidos mediante este metodo son cosechados mediante cosecha de la planta o las celulas de la planta bien sea del cultivo en el cual ellas crecen o del campo. Esto puede ocurrir mediante compresion de extraccion de las partes de las plantas preferiblemente de las semillas de las plantas. En ello pueden obtenerse mediante compresion los aceites, grasas, lipidos y/o acidos grasos libres mediante el denominado batido en frio o compresion en frio sin suministro de calor. Con ello las partes de las plantas, especialmente las semillas, previamente desmenuzadas, vaporizadas o tostadas, son maceradas facilmente. Las semillas asi tratadas previamente pueden ser comprimidas o extraidas con solventes como hexano caliente. A continuacion, se elimina nuevamente el solvente. De este modo pueden aislarse mas del 96% de los compuestos producidos en el metodo. A continuacion, los productos asi obtenidos son reprocesados, es decir refinados. En ello se eliminan primero por ejemplo los mucilagos de las plantas y materiales turbios. El denominado desgomado puede ocurrir por via enzimatica o por ejemplo quimica/fisicamente mediante adicion de acidos como acido fosforico. A continuacion se eliminan los acidos grasos libres mediante tratamiento con una base por ejemplo, soda caustica. Para la eliminacion de la soda caustica remanente en el producto, el producto obtenido basicamente es lavado con agua y secado. Para eliminar los colorantes aun presentes en el producto, este es sometido a un blanqueamiento por ejemplo con tierra de fuller o carbon activado. Para terminar, el producto es aun desodorizado por ejemplo con vapor de agua.
Preferiblemente los PUFAs o bien LCPUFAs producidos mediante este metodo son moleculas de acidos grasos C18, y/o C20, ventajosamente moleculas de acido graso C20 con por lo menos dos dobles enlaces en la molecula de acido graso, preferiblemente tres, cuatro o cinco dobles enlaces. Estas moleculas de acidos grasos C18 y/o C20 se dejan aislar de la planta en forma de un aceite, lipido o acido graso libre. Las plantas transgenicas adecuadas son por ejemplo las mencionadas previamente.
Los aceites, lipidos o acidos grasos o fracciones de ellos, que han sido producidos mediante el metodo descrito arriba, son empleados para la produccion de piensos para animales, productos alimenticios, cosmeticos o farmaceuticos.
Los aceites, lipidos o acidos grasos asi obtenidos contienen ventajosamente como se describio arriba 6 a 15 % de acido palmitico, 1 a 6 % de acido estearico; 7 -85 % de acido acido oleico; 0,5 a 8 % de acido vaccenico, 0,1 a 1 % de acido araquico, 7 a 25 % de acidos grasos saturados, 8 a 85 % acidos grasos monoinsaturados y 60 a 85 % de acidos grasos poliinsaturados referido en cada caso a 100 % y al contenido total de acidos grasos de la planta. Como acidos grasos poliinsaturados en los esteres de acidos grasos o bien mezclas de esteres de acidos grasos, como fosfatidilester de acido graso o triacilgliceridoester, ventajosamente estan presentes preferiblemente por lo menos 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19 o 20 % en peso referido al contenido total de acido graso, de acido araquidonico y/o por lo menos 20; 21; 22; 23; 24 o 25; ventajosamente por lo menos 26, 27, 28, 29 o 30, de modo particular ventajosamente por lo menos 31, 32, 33, 34, 35, 36; 37; 38; 39 o 40, muy particularmente ventajoso por lo menos 41, 42, 43, 44, 45 % en peso o mas referido al contenido total de acidos grasos, de acido eicosapentanoico. Ademas, los esteres de acidos grasos o bien mezclas de esteres de acidos grasos, que fueron obtenidos mediante el metodo acorde con la invencion, contienen ventajosamente acidos grasos elegidos de entre el grupo de acidos grasos acido erucico (acido 13-docosenico), acido esterculico (acido 9,10- metilenoctadec-9-enoico), acido malvalico (acido 8,9-metilenheptadec-8-enoico), acido chaulmogrico (acido ciclo- pentendodecanoico), acido furanograso (acido 9,12-epoxi-octadeca-9,11-dienoico), acido vernonico (acido 9,10-epoxioctadec-12-enoico), acido tarico (acido 6-octadecinoico), acido 6-nonadecinoico, acido santalbico (acido t11-octadecen-9-inoico), acido 6,9-octadeceninoico, acido pirulico (acido t10-heptadecen-8-inonico), acido crepeninico (acido 9-octadecen-12-inonico), acido 13,14dihidroorofeico, acido octadecen-13-ene-9,11-diinonico, acido petroselenico (acido cis-6-octadecenoico), acido 9c,12t-octadecadienico, acido calendulico (acido 8t10t12c-octadecatrienico), acido catalpico (acido 9t11t13coctadecatrienico), acido eleosterico (acido 9c11t13t-octadecatrienico), acido jacarico (acido 8c10t12coctadecatrienico), acido punicico (acido 9c11 t13c-octadecatrienico), acido parinarico (acido 9c11t13t15coctadecatetraenico), acido pinolenico (acido todo-cis-5,9,12-octadecatrienico), acido labalenico (acido 5,6octadecadienalenico), acido ricinoleico (acido 12-hidroxioleico) y/o acido coriolico (acido 13-hidroxi-9c,11toctadecadienoico). Los mencionados acidos grasos ocurren en los esteres de acidos grasos o bien mezclas de esteres de acidos grasos producidos segun el metodo acorde con la invencion, por regla general ventajosamente solo como trazas, es decir ellos ocurren referido a la totalidad de acidos grasos en menos de 30 %, preferiblemente menos de 25 %, 24 %, 23 %, 22 % o 21 %, particularmente preferido menos de 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7%, 6 % o 5%, muy particularmente preferido menos de 4 %, 3 %, 2 % o 1 %. En otra forma preferida de la invencion estos acidos grasos previamente mencionados ocurren, referido a la totalidad de acidos grasos, en menos de 0,9%; 0,8%; 0,7%; 0,6%; o 0,5%, particularmente preferido menos de 0,4%; 0,3%; 0,2%; 0,1 %. Ventajosamente los esteres de acidos grasos o bien mezclas de esteres de acidos grasos producidos segun el metodo acorde con la invencion contienen menos de 0,1 % referido a la totalidad de acidos grasos y/o no contienen acido buterbutirico, no contienen colesterol, no contienen acido clupanodonico (=acido docosapentenoico, c22A5M4,8,12,15,21) asi como tampoco contienen acido nisinico (acido tetracosahexenico, c23A6M3,8,12,15,18,21). Los aceites, lipidos, acidos grasos o mezclas de acidos grasos obtenidos en el metodo acorde con la invencion pueden ser empleados en la forma conocida por los expertos para la mezcla con otros aceites, lipidos, acidos grasos o mezclas de acidos grasos de origen animal como por ejemplo aceites de pescado. Tambien estos aceites, lipidos, acidos grasos o mezclas de acidos grasos asi producidos, que consisten en componentes vegetales y animales, pueden ser empleados para la produccion de alimentos para animales, productos alimenticios, cosmeticos y farmaceuticos.
Bajo el concepto de "aceite", "lipido" o "grasa" se entienden una mezcla de acidos grasos que contiene acido(s) graso(s) insaturados, saturados, preferiblemente esterificados. Se prefiere que el aceite, lipido o grasa tenga una elevada proporcion de acido(s) graso(s) poliinsaturados libres o ventajosamente esterificados, en particular acido linoleico, acido y-linolenico, acido dihomo-y-linolenico, acido araquidonico, a-acido linolenico, acido estearidonico, acido eicosatetraenico o acido eicosapentanoico. Preferiblemente la proporcion de acidos grasos insaturados esterificados es de aproximadamente 30 %, se prefiere mas una proporcion de 50 %, aun mas preferida es una proporcion de 60 %, 70 %, 80 % o mas. Para la determinacion puede por ejemplo determinarse, por cromatografia de gases, la fraccion de acido graso despues de transformacion, mediante transesterificacion, de estos en los metilesteres. El aceite, lipido o grasa puede contener otros diferentes acidos grasos saturados o insaturados, por ejemplo acido calendulico, acido palmitico, acido palmitoleico, acido estearico, acido oleico etc.. En particular, dependiendo de la planta de partida, la proporcion de los diferentes acidos grasos en el aceite o la grasa puede variar.
Los acidos grasos poliinsaturados producidos por el metodo con, ventajosamente, por lo menos dos, tres, cuatro o cinco, particularmente ventajoso con cuatro o cinco dobles enlaces, son ventajosamente como se describio arriba esteres de acidos grasos, por ejemplo esteres de esfingolipidos, esteres de fosfogliceridos, esteres de lipidos, esteres de glicolipidos, esteres de fosfolipidos, esteres de monoacilglicerina, esteres de diacilglicerina, esteres de triacilglicerina u otros esteres de acidos grasos, preferiblemente son esteres de fosfolipidos y/o esteres de triacilglicerina.
A partir de los esteres de acidos grasos poliinsaturados producidos de este modo en el metodo acorde con la invencion, con ventajosamente por lo menos tres, cuatro o cinco dobles enlaces, se liberan y aislan los acidos grasos poliinsaturados que se obtienen por ejemplo, mediante un tratamiento alcalino por ejemplo con KOH o NaOH acuoso o hidrolisis acida, ventajosamente en presencia de un alcohol como metanol o etanol o mediante una escision enzimatica, por ejemplo mediante una separacion de fases y subsiguiente acidificacion con por ejemplo H2SO4. La liberacion de los acidos grasos puede ocurrir tambien directamente sin el procesamiento previamente descrito.
Los acidos nucleicos empleados en el metodo pueden, despues de ser incorporados en una planta o celulas de planta, bien sea estar en un plasmido separado o ventajosamente estar integrados en el genoma de la celula huesped. Para la integracion en el genoma, la integracion puede ser aleatoria u ocurrir mediante tal recombinacion que el gen nativo es reemplazado por la copia incorporada, con lo cual la produccion del compuesto deseado es controlada por las celulas, o mediante el empleo de un gen en trans, de modo que el gen esta unido funcionalmente con una unidad funcional de expresion, la cual contiene por lo menos una secuencia que garantiza la expresion de un gen y contiene por lo menos una secuencia que garantiza la poliadenilacion de un gen transcrito funcionalmente. Ventajosamente los acidos nucleicos son llevados a cintas de multiexpresion o estructuras para la expresion multiparalela en los organismos, ventajosamente para la expresion de los genes multiparalelos especificos de la semilla en las plantas.
Los musgos y algas son los unicos sistemas conocidos de plantas que producen cantidades considerables de acidos grasos poliinsaturados, como acido araquidonico (ARA) y/o acido eicosapentanoico (EPA) y/o acido docosahexanoico (DHA). Los musgos contienen PUFAs en lipidos de membrana mientras que las algas, organismos emparentados con las algas y algunos hongos tambien acumulan cantidades dignas de mencionarse de PUFAs en la fraccion de triacilglicerol. De alli que las moleculas de acido nucleico que son aisladas a partir de tales cepas, son adecuadas para acumular las PUFAs tambien en la fraccion de triacilglicerol, de modo particularmente ventajoso para el metodo acorde con la invencion y con ello para la modificacion del sistema de produccion de lipido y PUFA en una planta como una planta util como una planta de frutos oleosos, por ejemplo colza, canola, lino, canamo, soja, girasol, borraja. Por eso, ellas pueden ser utilizadas ventajosamente en el metodo acorde con la invencion.
Como sustratos de los acidos nucleicos empleados en el metodo acorde con la invencion, los cuales codifican para polipeptidos con actividad de M-6- desaturasa, M-6-elongasa, M-5-desaturasa y/o w-3-desaturasa, y/o los otros acidos nucleicos empleados como los acidos nucleicos que codifican para polipeptidos del metabolismo de acidos grasos o lipidos elegidos de entre el grupo de acil-CoA-deshidrogenasa(a), acil-ACP[= proteina portadora de acilo]desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), acil-acido graso-transferasa(a), acil-CoAAlisofosfolipid-aciltransferasa(a), acido graso-sintetasa(a), acido graso-hidroxilasa(s), acetil-Coenzima A-carboxilasa(s), acil-Coenzima A-oxidasa(s), acido graso-desaturasa(s), acido graso-acetilenasa(s), lipoxigenasa(s), triacilglicerol-lipasa(s), alenoxidosintetasa(as), hidroperoxido-liasa(s) o acido graso-elongasa(s), son adecuados ventajosamente los acidos grasos C16, C18 o C20. Preferiblemente los acidos grasos transformados como sustrato en el metodo reaccionan en forma de su acil-CoA-ester y/o su fosfolipido-ester.
Para la produccion de los PUFAs de cadena larga acordes con la invencion como los acidos grasos C16 saturados, monoinsaturados y/o acidos grasos C18 poliinsaturados tienen que, dependiente del sustrato, mediante la actividad enzimatica de una desaturasa y/o elongasa ser primero desaturados y/o elongados o solo dessaturados y a continuacion mediante una elongasa ser alargados en por lo menos dos atomos de carbono. Despues de una ronda de elongacion, esta actividad enzimatica conduce bien sea a acidos grasos C18 provenientes de acidos grasos C16
o acidos grasos C20 provenientes de acidos grasos C18, y despues de dos rondas de elongacion a acidos grasos C20 provenientes de acidos grasos C16. La actividad de las desaturasas y elongasas empleadas en el metodo acorde con la invencion conduce preferiblemente a acidos grasos C18 y/o C20 con ventajosamente por lo menos dos dobles enlaces en la molecula de acidos grasos, preferiblemente con tres, cuatro o cinco dobles enlaces, particularmente preferido a acidos grasos C20 con por lo menos cuatro dobles enlaces en la molecula de acido graso. Se prefieren de modo particular como productos del metodo acorde con la invencion acido dihomo-ylinolenico, acido araquidonico y/o acido eicosapentanoico. Los acidos grasos C18 con por lo menos dos dobles enlaces en el acido graso puede ser alargados mediante la actividad enzimatica acorde con la invencion en forma de los acidos grasos libres o en forma de los esteres, como fosfolipidos, glicolipidos, esfingolipidos, fosfogliceridos, monoacilglicerina, diacilglicerina o triacilglicerina.
El lugar preferido de la biosintesis de acidos grasos, aceites, lipidos o grasas en las plantas empleadas ventajosamente es por ejemplo en general las semillas o capas celulares de semillas, de modo que es razonable una expresion especifica de la semilla de los acidos nucleicos empleados en el metodo. Sin embargo, es obvio que la biosintesis de acidos grasos, aceites o lipidos no tiene que ser limitada al tejido de las semillas, sino que puede ocurrir tambien de modo especifico en los tejidos en todas las otras partes de la planta -por ejemplo en las celulas de la epidermis o en los tuberculos. Segun el metodo inventivo, la sintesis tiene lugar en el tejido (somatico).
Mediante el metodo acorde con la invencion pueden elevarse los acidos grasos poliinsaturados producidos en las plantas empleadas en el metodo, en principio por dos maneras. Ventajosamente puede elevarse el conjunto de acidos grasos poliinsaturados libres y/o la proporcion de acidos grasos poliinsaturados esterificados producidos por el metodo. Ventajosamente, mediante el metodo acorde con la invencion se eleva en las plantas transgenicas el conjunto de acidos grasos poliinsaturados esterificados, ventajosamente en forma del fosfatidilester y/o triacilester.
Los acidos grasos obtenidos en el metodo son adecuados tambien como materiales de partida para la sintesis quimica de otros productos de valor. Ellas pueden ser empleados por ejemplo en combinacion o solos para la produccion de productos farmaceuticos, productos alimenticios, forraje para animales o productos cosmeticos.
De modo ventajoso las secuencias de acidos nucleicos empleadas en el metodo, que codifican para polipeptidos con actividad de M-6-desaturasa, son secuencias aisladas de acidos nucleicos elegidas de entre el grupoA
a) una secuencia de acidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NOA 1,
b) secuencias de acidos nucleicos, las cuales se derivan como resultado del codigo genetico degenerado de la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NOA 2, o
c) derivados de la secuencia de acidos nucleicos representada en SEQ ID NOA 1, que codifican para polipeptidos, los cuales en el nivel de aminoacidos exhiben una identidad de por lo menos 70% con SEQ ID NOA 2 y tienen una actividad de M-6-desaturasa.
Las secuencias de acidos nucleicos empleadas ventajosamente en el metodo, que codifican para polipeptidos con actividad de M-6-elongasa, son secuencias aisladas de acidos nucleicos elegidas de entre el grupoA
a) una secuencia de acidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NOA 3 o 7,
b) secuencias de acidos nucleicos, las cuales se derivan como resultado del codigo genetico degenerado de la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NOA 4 o 8, o
c) derivados de la secuencia de acidos nucleicos representada en SEQ ID NOA 3 o 7, que codifican para polipeptidos, los cuales en el nivel de aminoacidos exhiben por lo menos 70% de identidad con SEQ ID NOA 4 o 8 y tienen una actividad de M-6-elongasa.
Las secuencias de acidos nucleicos empleadas ventajosamente en el metodo, las cuales codifican para polipeptidos con actividad de M-5-desaturasa, son secuencias aisladas de acidos nucleicos elegidos de entre el grupoA
a) una secuencia de acidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NOA 5,
b) Secuencias de acidos nucleicos, las cuales se derivan como resultado del codigo genetico degenerado de la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NOA 6, o
c) derivados de la secuencia de acidos nucleicos representada en SEQ ID NOA 5 la cual codifica para polipeptidos, la cual sobre nivel de aminoacidos exhibe una identidad de por lo menos 70% con SEQ ID NOA 6 y tiene una actividad de M-5-desaturasa.
Ventajosamente se emplean en combinacion con los previamente mencionados acidos nucleicos que codifican para M-6-desaturasas, M-6-elongasas y/o M-5-desaturasas, otras secuencias de acidos nucleicos que codifican para polipeptidos con actividad de w-3-desaturasa, son secuencias aisladas de acidos nucleicos elegidos de entre el grupoA
a) una secuencia de acidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NOA 9,
b) secuencias de acidos nucleicos, que se derivan como resultado del codigo genetico degenerado de la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NOA 10, o
c) derivados de la secuencia de acidos nucleicos representada en SEQ ID NOA 9, la cual codifica para polipeptidos que en el nivel de aminoacidos exhibe una identidad de por lo menos 60 % con SEQ ID NOA 10 y tiene una actividad de w-3-desaturasa.
Para la expresion, las secuencias de acidos nucleicos previamente mencionadas son incorporadas ventajosamente en una estructura de gen, donde los acidos nucleicos estan unidos funcionalmente con una o varias senales de regulacion. Adicionalmente pueden estar presentes en la estructura del gen, otros genes de biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos, elegidos de entre el grupo de acil-CoA-deshidrogenasa(a), acil-ACP[= proteina portadora de acilo]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), acil-acido graso-transferasa(s), acilCoAAlisofosfolipid-aciltransferasa(a), acido graso-sintetasa(s), acido graso-hidroxilasa(s), acetil-Coenzima Acarboxilasa(s), acil-Coenzima A-oxidasa(s), acido graso-desaturasa(s), acido graso-acetilenasa(s), lipoxigenasa(s), triacilglicerol-lipasa(s), alenoxido-sintetasa(as), hidroperoxido-liasa(s) o acido graso-elongasa(s). Ventajosamente estan presentes genes adicionales de biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos, elegidos de entre el grupo de las M-4-desaturasa, M-8-desaturasa, M-9-desaturasa, M-12-desaturasa, M-5-elongasa, M-9-elongasa y/o M15-desaturasa.
Ventajosamente todas las secuencias de acidos nucleicos empleadas en el metodo acorde con la invencion descienden de un organismo eucariotico como un hongo, un microorganismo o un animal. Preferiblemente las secuencias de acidos nucleicos descienden del orden Salmoniformes, Xenopus o Ciona, algas como Mantoniella, Crypthecodinium, Euglena o Ostreococcus, hongos como el genero Phytophtora o de diatomeas como el genero Thalassiosira o Faeodactilum.
Las secuencias de acidos nucleicos empleadas en metodo que codifican para proteinas con actividad de w-3desaturasa, M-5-desaturasa, M-6-desaturasa y/o M-6-elongasa, son introducidas ventajosamente solas o preferiblemente en combinacion con una cinta de expresion (= estructura de acido nucleico), la cual hace posible la expresion de los acidos nucleicos en una planta. En la estructura de acido nucleico puede estar presente mas de una secuencia de acidos nucleicos de una actividad enzimatica como por ejemplo una M-12-desaturasa, M-4desaturasa, M-5-desaturasa, M-8-desaturasa, M-6-desaturasa, M-5-elongasa, M-6- elongasa, M-9-elongasa y/u w-3desaturasa.
Para la incorporacion, los acidos nucleicos empleados en el metodo son sometidos ventajosamente a una amplificacion y union, de la manera conocida. Preferiblemente se procede siguiendo el protocolo de la Pfu-ADNpolimerasa o una mezcla de Pfu/Taq-ADN-polimerasa. Los cebadores son elegidos dependiendo de la secuencia que va a ser amplificada. De modo adecuado los cebadores deberian elegirse de manera que el amplificado incluye la misma secuencia codogena desde el codon de inicio hasta el codon de parada. A continuacion de la amplificacion, se analiza de modo conveniente el amplificado. Por ejemplo, el analisis puede ocurrir despues de la separacion electroforetica del gel respecto a la calidad y cantidad. A continuacion puede purificarse el amplificado segun un protocolo estandar (por ejemplo Qiagen). Una alicuota del amplificado purificado esta disponible entonces para la subsiguiente clonacion. Los vectores de clonacion adecuados son conocidos en general por los expertos. Para esto, los vectores que pueden ser replicados en sistemas microbianos pertenecen en particular por consiguiente sobre todo a vectores que garantizan una eficiente clonacion en levaduras y hongos y hacen posible la transformacion estable de las plantas. Son de mencionar en particular diferentes sistemas de vectores binarios y co-integrados adecuados para la transformacion mediada por T-ADN. Tales sistemas de vectores se caracterizan por regla general porque ellos por lo menos incluyen los genes vir necesarios para la transformacion mediada por Agrobacterium asi como las secuencias limitantes de T-ADN (frontera T-ADN). Estos sistemas de vectores incluyen preferiblemente tambien otras regiones reguladoras cis como promotores terminadores y/o marcadores de seleccion, con los cuales pueden identificarse los correspondientes organismos transformados. Mientras en sistemas de vectores co-integrados los genes vir y las secuencias de T-ADN estan dispuestos en el mismo vector, los sistemas binarios se basan en por lo menos dos vectores, de los cuales uno porta gen vir pero ningun T-ADN y un segundo T-ADN sin embargo no porta ningun gen vir. Mediante ello, estos ultimos vectores son relativamente pequenos, faciles de manipular y de replicar tanto en E. Coli como tambien en Agrobacterium. A estos vectores binarios pertenecen vectores de las series pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. De acuerdo con la invencion, se emplean preferiblemente Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV y pCAMBIA. Hellens et al, Trends en Plant Science (2000) 5, 446-451 da un vistazo a vectores binarios y su empleo. Para la preparacion de vectores pueden transformarse en lineales primero los vectores con endonucleasa(s) de restriccion y despues modificarlos enzimaticamentes de manera adecuada. A continuacion se purifica el vector y se emplea una alicuota para la clonacion. En la clonacion, se clona el amplificado cortado enzimaticamente y, en caso de ser necesario, purificado con fragmentos de vectores preparados de modo similar, con el empleo de ligasa. En ello, una determinada estructura de acido nucleico o bien estructura de vector o de plasmido exhibe uno o tambien varios segmentos codogenos de gen. Preferiblemente los segmentos codogenos de gen estan unidos en estos fragmentos de modo funcional con secuencias reguladoras. A las secuencias reguladoras pertenecen en particular secuencias de plantas como los promotores y terminadores arriba descritos. Las estructuras se propagan de modo estable ventajosamente en microorganismos, en particular Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens, bajo condiciones selectivas y de este modo hacen posible una transferencia de ADN heterologo en plantas.
Con la aplicacion ventajosa de vectores de clonacion pueden introducirse los acido nucleicos empleados en el metodo, los acidos nucleicos de la invencion y estructuras de acido nucleicos, en microorganismos y despues ventajosamente en plantas y con ello ser empleados en la transformacion de plantas, como los que son publicados y alli citadosA Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), capitulos 6/7, p. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer en Higher Plants; enA Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, EditorA Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, enA Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, EditorA Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)). Los acidos nucleicos, estructuras de acidos nucleicos y/o vectores empleados en el metodo se emplean con ello para la modificacion por tecnologia de gen de un amplio espectro de plantas, de modo que estas se vuelven mejores y/o mas eficientes productoras de PUFAs.
Mediante la introduccion de un gen de w-3-desaturasa, M-6-desaturasa, M-6-elongasa y M-5-desaturasa en una planta, solo o en combinacion con otros genes, puede elevarse no solo el flujo de biosintesis hasta el producto final, sino que tambien aumenta la mezcla correspondiente de ester de triacilglicerina y/o fosfatidilester o son creados de novo. Asi mismo puede elevarse el numero o actividad de otros genes que en la importacion de nutrientes son necesarios para la biosintesis de uno o varios acidos grasos, aceites, lipidos polares y/o neutros, de modo que se aumenta la concentracion de estos precursores, cofactores o compuestos intermedios dentro de las celulas o dentro del compartimiento de almacenamiento, mediante lo cual se eleva mas la capacidad de las celulas para la produccion de PUFAs, como se describe en lo que sigue. Mediante la optimizacion de la actividad o elevacion del numero de uno o varios genes de w-3-desaturasa-, M-6-desaturasa-, M-6-elongasa- y/o M-5-desaturasa, los cuales participan en la biosintesis de estos compuestos, o mediante eliminacion de la actividad de uno o varios genes que participan en la destruccion de estos compuestos, puede ser posible aumentar el rendimiento, produccion y/o eficiencia en la produccion de moleculas de acidos grasos y lipidos de organismos y ventajosamente plantas.
Las moleculas de acidos nucleicos empleados en el metodo acorde con la invencion codifican para proteinas o partes de estas, donde las proteinas o la proteina individual o parte de ellas contiene una secuencia de aminoacidos que es suficientemente homologa a una secuencia de aminoacidos, que esta representada en las secuencias SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6, SEQ ID NOA 8 o SEQ ID NOA 10, de modo que las proteinas o partes de ellas exhiben aun una actividad de w-3-desaturasa, M-6-desaturasa, M-6-elongasa y M-5desaturasa. Preferiblemente, las proteinas o partes de ellas que es/son codificadas por la/las molecula(s) de acido nucleico tienen aun su/sus actividad(es) enzimatica(s) y la capacidad de participar en el metabolismo de los compuestos necesarios para la construccion de membranas celulares o corpusculos de lipidos en los organismos, ventajosamente en las plantas, o en el transporte de moleculas a traves de estas membranas. Ventajosamente las proteinas codificadas por las moleculas de acidos nucleicos son identicas en por lo menos aproximadamente 70 %, 80 % o 90 % y preferiblemente al maximo por lo menos aproximadamente 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas, a las secuencias de aminoacidos representadas en SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6, SEQ ID NOA 8 o SEQ ID NOA 10. En el sentido de la invencion, se entiende por homologia u homologo, identidad o identico.
La homologia fue calculada sobre la totalidad de la secuencia de aminoacidos o bien de acidos nucleicos. Para la comparacion de diferentes secuencias esta disponible una serie de programas conocidos por los expertos, que se basan en diferentes algoritmos. En ello, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman suministran resultados particularmente confiables. Para la comparacion de secuencias se empleo el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989A 151-153) o el programa Gap y BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], los cuales estan presentes en el paquete de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]. Los valores de homologia de secuencia indicados en porcentaje arriba fueron determinados con el programa GAP sobre la totalidad del rango de secuencia con los siguientes ajustesA altura de brechaA 50, ponderacion de la longitudA 3, coincidencia promedioA 10.000 y discrepancia promedioA 0.000. En caso de que no se indique de otro modo, estos ajustes fueron empleados siempre como ajustes estandar para la comparacion de secuencias.
Se entiende por actividad enzimatica esencial de las w-3-desaturasa, M-6-desaturasa, M-6-elongasa, y M-5desaturasa empleadas en el metodo acorde con la invencion, que ellas exhiben en comparacion, respecto a las proteinas/enzimas codificadas por la secuencia con SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5, SEQ ID NOA 7 o SEQ ID NOA 9 y sus derivados, aun por lo menos una actividad enzimatica de por lo menos 10%, preferiblemente 20 %, particularmente preferido 30 % y muy preferido 40 % y con ello pueden participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la construccion de acidos grasos, ventajosamente esteres de acidos grasos como fosfatidilesteres y/o esteres de triacilgliceridos en una planta o celulas de planta o en el transporte de moleculas a traves de las membranas, donde se alude a cadenas de carbono C18 o C20 en la molecula de acido graso con dobles enlaces en por lo menos dos, ventajosamente tres o cuatro posiciones.
Ventajosamente los acidos nucleicos que pueden ser utilizados en el metodo descienden de bacterias, hongos, diatomeas, animales como Caenorhabditis o Oncorhynchus o plantas como algas o musgos como los generos Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Pytium irregulare, Mantoniella, Ostreococcus, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Borago, Faeodactilum, Crypthecodinium, en especial los generos y tipos Pytium irregulare, Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis, Thalassiosira pseudonona, Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Faeodactilum tricornutum, Caenorhabditis elegans o particularmente ventajoso de Pytium irregulare, Thraustochytrium sp. o Thalassiosira pseudonana.
De modo alternativo pueden emplearse adicionalmente en el metodo acorde con la invencion secuencias de nucleotidos que codifican para una M-12-desaturasa, M-9-elongasa, M-8-desaturasa, M-5-elongasa o M-4-desaturasa. Las secuencias de acidos nucleicos empleadas en el metodo son introducidas ventajosamente en una cinta de expresion la cual hace posible la expresion de los acidos nucleicos en las plantas.
En ello, las secuencias de acidos nucleicos, que codifican para las a-12-desaturasa, w-3-desaturasa, M-9-elongasa, M-6- desaturasa, M-8-desaturasa, M-6-elongasa, M-5-desaturasa, M-5-elongasa o M-4-desaturasa estan enlazadas funcionalmente con una o varias senales de regulacion, de modo ventajoso para la elevacion de la expresion del gen. Estas secuencias reguladoras deberian hacer posible la expresion focalizada de los genes y la expresion de las proteinas. Esto puede significar, dependiendo de la planta, que el gen se expresa y/o sobreexpresa solo despues de la induccion, o que se expresa y/o sobreexpresa inmediatamente. De acuerdo con la invencion se emplean secuencias para la expresion que hacen posible una expresion constitutiva como el CaMV35S-promotor en tantos tejidos de la planta como sea posible. Otros promotores adecuados son CaMV36S-, CaMV35Smas-, nos-, mas-, ubi-, stpt-, lea- o super-promotores. De acuerdo con la invencion, la expresion ocurre en los tejidos vegetativos, como se describio arriba, con ayuda de por lo menos un promotor caMV35S. La estructura del gen puede contener ademas de modo ventajoso tambien una o varias denominadas "secuencias potenciadoras" enlazadas funcionalmente con el promotor, lo cual hace posible una elevada expresion de la secuencia de acidos nucleicos. Tambien en el extremo 3" de las secuencias de ADN pueden insertarse ventajosamente secuencias adicionales como otros elementos reguladores o terminadores, son por ejemplo terminadores ventajosos los terminales virales como el terminador 35S u otros. Las enzimas o bien acidos nucleicos que codifican estas enzimas empleadas en el metodo acorde con la invencion pueden estar presentes en una o varias copias en la cinta de expresion (= estructura del gen). Ventajosamente en la cinta de expresion esta presente en cada caso solo una copia de los genes. Esta estructura del gen o las estructuras de genes pueden ser introducidas en la planta simultaneamente o una despues de otra y ser expresadas conjuntamente en el organismo huesped. En ello puede insertarse la estructura del gen o las estructuras de genes en uno o varios vectores y estar presentes libres en las celulas o tambien insertarse en el genoma. Es ventajoso para la insercion de otros genes en la planta, cuando el gen que va a ser expresado esta presente conjuntamente en una estructura de gen.
Las secuencias o bien factores reguladores pueden en ello, como se describio arriba, influir positivamente y mediante ello elevar preferiblemente la expresion de gen de los genes introducidos. De este modo puede ocurrir de modo ventajoso un fortalecimiento de los elementos reguladores sobre los niveles de transcripcion, en lo cual se emplean fuertes senales de transcripcion como promotores y/o "potenciadores". Aparte de ello tambien es posible un fortalecimiento de la traduccion, en lo cual se mejora por ejemplo la estabilidad del mARN.
En los promotores estan presentes secuencias ventajosas de regulacion para el nuevo metodo, como los promotores de plantas CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o en el promotor ubiquitina o faseolina. De modo ventajoso se emplean en el metodo promotores constitutivos. De acuerdo con la invencion, las secuencias mencionadas se expresan con ayuda de por lo menos un promotor constitutivo CaMV35S. Pero tambien pueden emplearse en el metodo promotores inducibles, como los descritos en EP-A-O 388 186 (inducible por bencilsulfonamida), Plant J. 2, 1992A397-404 (Gatz et al., inducible por tetraciclina), EP-A-O 335 528 (inducible por acido abcisinico) o WO 93/21334 (inducible por etanol o ciclohexenol). Otros promotores adecuados de plantas son el promotor de FBPasa citosolica o el promotor ST-LSI de la patata (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), el promotor fosforibosilpirofosfatamidotransferasa de glicina max (Genbank-Zugangsnr. U87999) o el promotor especifico de nodulos descrito en EP-A-O 249 676. Son promotores particularmente ventajosos los promotores que hacen posible la expresion en tejidos, que son participes en la biosintesis de acidos grasos. Son muy particularmente ventajosos los promotores constitutivos arriba mencionados CaMV35S, CaMV36S, CaMV35Smas, nos, mas, ubi, stpt, lea o el super-promotor.
En principio es posible emplear todos los promotores naturales ventajosamente constitutivos con sus secuencias reguladoras, como los arriba mencionados, para el nuevo metodo. Asi mismo es posible y ventajoso emplear adicionalmente o solos, promotores sinteticos.
Tambien se hace posible la expresion en las plantas mediante un promotor que puede ser inducido quimicamente (ver una revision en Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48A89-108). Los promotores que pueden ser inducidos quimicamente son adecuados en particular, cuando se desea que la expresion de los genes ocurra de una manera temporal especifica. Son ejemplos de tales promotores un promotor que puede ser inducido con acido salicilico (WO 95/19443), un promotor que puede ser inducido con tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397404) y un promotor que puede ser inducido con etanol.
Para asegurar en las plantas transgenicas una integracion estable por varias generaciones de los genes de biosintesis, todos los acidos nucleicos empleados en el metodo que codifican para las w-3-desaturasa, M-6desaturasa, M-6- elongasa o M-5-desaturasa, deberian ser expresados bajo el control de un promotor particular. Ventajosamente, estos pueden ser iguales o diferentes. Se emplean ventajosamente promotores diferentes puesto que motivos de secuencias que se repiten pueden conducir a inestabilidad del T-ADN o bien a eventos de recombinacion. En ello, la cinta de expresion es construida ventajosamente de modo que para la insercion del acido nucleico que va a ser expresado, un promotor sigue una posicion de corte adecuada, esta ventajosamente en un polienlazador a continuacion, dado el caso detras del polienlazador esta un terminador. Esta secuencia se repite muchas veces, preferiblemente tres, cuatro o cinco veces de modo que se ponen juntos hasta cinco genes en una estructura y de este modo pueden ser introducidos para la expresion en la planta transgenica. Ventajosamente, la secuencia se repite hasta cuatro veces. Las secuencias de acidos nucleicos son insertadas para la expresion en la posicion adecuada de corte por ejemplo en el polienlazador detras del promotor. Ventajosamente cada secuencia de acidos nucleicos tiene su promotor particular y dado el caso su terminador particular (ver figura 1). Tambien es posible insertar varias secuencias de acidos nucleicos detras de un promotor y dado el caso de un terminador. En ello, la posicion de insercion o bien la secuencia de los acidos nucleicos insertados en la cinta de expresion no es de importancia decisiva, es decir una secuencia de acidos nucleicos puede ser insertada en la primera o ultima posicion en la cinta, sin que por ello se influya esencialmente en la expresion. En una forma ventajosa de operar pueden emplearse en la cinta de expresion diferentes promotores como por ejemplo los promotores USP, LegB4 o DC3 y diferentes terminadores. De acuerdo con la invencion se emplea por lo menos el promotor CaMV35S (ver figura 1).
Como se describio arriba, la transcripcion de los genes introducidos deberia ventajosamente ser interrumpida mediante terminadores adecuados en extremo 3' de los genes introducidos de biosintesis (detras del codon de parada). Puede emplearse aqui por ejemplo el terminador OCS1. Como tambien para los promotores, entonces deberian emplearse aqui para todo gen, diferentes secuencias de terminador.
Como se describio arriba, la estructura de gen puede incluir tambien otros genes que deberian ser introducidos en los organismos. Es posible y ventajoso introducir y en ello expresar genes reguladores en las plantas huesped, como genes para inductores represores o enzimas que mediante su actividad enzimatica intervienen en la regulacion de uno o varios genes de una ruta de biosintesis. Estos genes pueden ser de origen heterologo u homologo. Ademas en estructuras de acidos nucleicos o bien estructuras de gen pueden estar presentes ventajosamente otros genes de biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos o tambien estos genes pueden estar sobre otra u otras varias estructuras de acido nucleico. Como genes de biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos se emplea ventajosamente un gen elegido de entre el grupo de acil-CoAdeshidrogenasa(a), acil-ACP[= proteina portadora de acilo]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), acil-acido grasotransferasa(s), acil-CoAAlisofosfolipid-aciltransferasa(s), acido graso-sintetasa(s), acido graso-hidroxilasa(s), acetil-Coenzima A-carboxilasa(s), acil-Coenzima A-oxidasa(s), acido graso-desaturasa(s), acido graso-acetilenasa(s), lipoxigenasa(s), triacilglicerol-lipasa(s), alenoxido-sintetasa(s), hidroperoxido-liasa(s) o acido graso-elongasa(s) o sus combinaciones. Son secuencias de acidos nucleicos particularmente ventajosas los genes de biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos elegidos de entre el grupo de las acil- CoAAlisofosfolipid-aciltransferasa, M4-desaturasa, M-8-desatuasa, M-9-desaturasa, a-12-desaturasa, M-5-elongasa y/o M-9-elongasa.
En ello, pueden clonarse los previamente mencionados acidos nucleicos o bien genes en combinacion con otras elongasas y desaturasas en cintas de expresion, como las previamente mencionadas, y emplearse para la transformacion de plantas con ayuda de Agrobacterium.
El concepto de "vector" empleado en esta descripcion significa una molecula de acido nucleico que puede transportar otro acido nucleico al cual esta unida. Un tipo de vector es un "plasmido", el cual representa una cinta circular de ADN de doble cuerda, a la cual pueden estar ligados adicionalmente segmentos de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, donde al genoma viral pueden estar ligados segmentos adicionales de ADN. Determinados vectores pueden replicarse de modo autonomo en una celula huesped en la cual habian sido introducidos (por ejemplo vectores de bacterias originadas en replicacion bacteriana). Otros vectores son integrados ventajosamente mediante introduccion en la celula huesped en el genoma de una celula huesped y mediante ello replicados conjuntamente con el genoma huesped. Ademas, determinados vectores pueden controlar la expresion de los genes con los cuales estan unidos de manera funcional. Estos vectores son definidos aqui como "vectores de expresion". Comunmente los vectores de expresion, que son adecuados para tecnicas de recombinacion de ADN, tienen la forma de plasmidos. En la presente descripcion pueden emplearse "plasmido" y "vector" de madera intercambiable, puesto que el plasmido es la forma mas frecuentemente empleada de vector. Sin embargo la invencion deberia incluir estas otras formas de expresion de vectores, como vectores virales que exhiben funciones similares. Ademas, el concepto de vector deberia incluir tambien otros vectores que son conocidos por los expertos, como fagos, virus, como SV40, CMV, TMV, transposons, elementos IS, fasmidos, fagemidos, cosmidos, ADN lineal
o circular.
Los vectores de expresion recombinante empleados ventajosamente en el metodo incluyen las secuencias de acidos nucleicos empleadas en el metodo o la estructura de gen descrita arriba, en una forma que es adecuada para la expresion de los acidos nucleicos empleados en una celula huesped, lo cual significa que el vector de expresion recombinante incluye una o varias secuencias de regulacion elegida sobre la base de las celulas huesped que va a ser empleada para la expresion, la cual esta unida funcionalmente con la secuencia de acidos nucleicos que va a ser expresada. En un vector recombinante de expresion, "enlazado funcionalmente" significa que la secuencia de nucleotidos de interes esta unida a la(s) secuencia(s) de regulacion de tal modo que es posible la expresion de la secuencia de nucleotidos y que ellos estan unidos uno a otro de modo que ambas secuencias satisfacen la previamente mencionada funcion atribuida a la secuencia (por ejemplo en un sistema en vitro de transcripcion-Itraduccion o en una celula huesped, cuando el vector es introducido en la celula huesped). El concepto "secuencia de regulacion" deberia incluir promotores, potenciadores, y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo senales de poliadenilacion). Estas secuencias de regulacion son descritas por ejemplo en GoeddelA Gene Expression TechnologyA Methods en Enzimology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), o verA Gruber y Crosby, enA Methods en Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, EditorA Glick y Thompson, capitulo 7, 89-108, incluyendo las citas alli dadas. Las secuencias de regulacion incluyen aquellas que modulan la expresion constitutiva de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de celulas huesped, y aquellas que modulan la expresion directa de la secuencia de nucleotidos solo en una determinada celula huesped bajo condiciones determinadas. El experto sabe que la configuracion de los vectores de expresion puede depender de factores, como la eleccion de la celula huesped que va ser transformada, la extension de la expresion de la proteina deseada, etc.
Los vectores recombinantes de expresion empleados pueden ser disenados para la expresion de las secuencias de acidos nucleicos empleadas en el metodo, de modo que ellas pueden ser transformadas en huespedes procarioticos intermedios y despues de la introduccion en las plantas finalmente hacen posible la expresion en estas. Esto es ventajoso, puesto que en aras de la conveniencia frecuentemente las etapas intermedias de la construccion de vectores se realizan en microorganismos. Por ejemplo pueden expresarse los genes de w-3-desaturasa, M-6desaturasa, M-6-elongasa y/o M-5-desaturasa-desaturasa en celulas bacterianas, celulas de insectos (mediante el empleo de vectores de expresion de Baculovirus), celulas de levaduras y otros hongos (ver Romanos, M.A., et al. (1992) "Foreign gene expression in yeastA a review", Yeast 8A423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", enA More Gene Manipulations en Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Editor, S. 396-428A Academic PressA San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, enA Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Editor, pp. 1-28, Cambridge University PressA Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology.1, 3A239-251), ciliados, con vectores segun un metodo de transformacion como se describe en WO 98/01572, asi como preferiblemente en celulas de plantas multicelulares (se ver Schmidt, R. y Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotiledon explants" Plant Cell Rep.A583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, capitulo 6/7, pp.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, enA Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, EditorA Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (y las citas alli planteadas)). Ademas se discuten celulas huesped adecuadas en Goeddel, Gene Expression TechnologyA Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). El vector recombinante de expresion puede de modo alternativo ser transcrito in vitro por ejemplo empleando secuencias de regulacion de promotor de T7 y T7-polimerasa, y ser traducido.
La expresion de las proteinas en procariotas ocurre mayormente con vectores que contienen promotores constitutivos o que pueden ser inducidos, los cuales modulan la expresion de las proteinas de fusion o de no-fusion. Son vectores tipicos de expresion de fusion entre otros pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., y Johnson, K.S. (1988) Gene 67A31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), en los cuales se fusionan en la proteina foco recombinante, glutation-S-transferasa (GST), proteina unida en E a maltosa,
o bien proteina A.
Son ejemplos adecuados de vectores de expresion inducibles de no fusion de E. entre otros pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69A301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression TechnologyA Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresion objetivo del gen del vector pTrc se basa en la transcripcion mediante huesped-ARN-polimerasa de un promotor de fusion hibrido-trp-lac. La expresion objetivo del gen del vector pET 11 d se basa en la transicion de un promotor de fusion T7-gn10-lac, el cual es mediado por una ARN-polimerasa (T7 gn1) viral co-expresada. Esta polimerasa viral es suministrada por el genero huesped BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) de un A-profago residente, el cual alberga un gen T7 gn1 bajo los controles de transcripcion del promotor lacUV 5.
Otros vectores adecuados en organismos procarioticos son conocidos por los expertos, estos vectores estan por ejemplo en E. coli pLG338, pACYC184, la serie pBR como pBR322, la serie pUC como pUC18 o pUC19, la serie M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, Agt11 o pBdCl, en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77
o pAJ667.
En otra forma de operar, el vector de expresion es un vector de expresion de levadura. Ejemplos de vectores para la expresion en las levaduras S. cerevisiae incluyen pYeDesaturasac1 (Baldari et al. (1987) Embo J. 6A229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30A933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54A113-123) asi como pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y metodos para la construccion de vectores que son adecuados para el empleo en otros hongos como los hongos filamentosos, incluyen los que se describen detalladamente enA van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, enA Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Editor, pp. 1-28, Cambridge University PressA Cambridge, o enA More Gene Manipulations en Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, Editor, S. 396-428A Academic PressA San Diego]. Otros vectores adecuados de levaduras son por ejemplo pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23.
De modo alternativo, las secuencias de acidos nucleicos empleadas en el metodo acorde con la invencion pueden expresarse en celulas de insectos mediante el empleo de vectores de expresion de Baculovirus. Los vectores de Baculovirus que estan disponibles para la expresion de proteinas en celulas de insectos cultivados (por ejemplo celulas Sf9), incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol.. 3A2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170A31-39).
Los vectores arriba mencionados ofrecen solo un pequeno vistazo de los posibles vectores adecuados. Otros plasmidos son conocidos por los expertos y son descritos por ejemplo enA Cloning Vectors (Editor Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Otros sistemas adecuados de expresion para celulas procarioticasy eucarioticas, ver en los capitulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., Molecular CloningA A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Tambien pueden expresarse los genes empleados en el metodo en celulas de plantas unicelulares (como algas),ver Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3)A239-251 y la informacion alli citada, y celulas de plantas de plantas superiores (por ejemplo Spermatophytas, como frutos del campo). Ejemplos de vectores de expresion de plantas incluyen aquellos que estan detalladamente descritos enA Becker, D., Kemper, E., Schell, J., y Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20A1195-1197; y Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12A8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; enA Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, EditorA Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
Una cinta de expresion vegetal contiene preferiblemente secuencias de regulacion que pueden controlar la expresion de gen en celulas vegetales y estan unidas funcionalmente de modo que cada secuencia puede satisfacer su funcion, como terminacion de la transcripcion, por ejemplo senales de poliadenilacion. Las senales preferidas de poliadenilacion son las que descienden de Agrobacterium tumefaciens-T-ADN, como el gen 3 del plasmido de Ti conocido como Octopinsynthasa, pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) o equivalentes funcionales de ellos, pero tambien son adecuados todos los otros terminadores funcionalmente activos en vegetales.
Puesto que muy frecuentemente la expresion de genes vegetales no se limita a los niveles de transcripcion, una cinta de expresion vegetal contiene preferiblemente otras secuencias unidas funcionalmente, como potenciadores de traduccion, por ejemplo la secuencia Overdrive, la cual contiene la secuencia conductora 5' no traducida del virus de mosaico de tabaco, la cual eleva la relacion proteina/ARN (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15A8693-8711).
Como se describio arriba, la expresion de genes vegetales tiene que estar unida funcionalmente con un promotor adecuado, el cual ejecuta la expresion del gen de modo puntual especifico para las celulas o los tejidos. Son promotores que pueden ser utilizados ventajosamente los promotores constitutivos (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), como los que descienden de virus vegetales como 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (ver tambien US 5352605 y WO 84/02913) o promotores vegetales como los descritos en US 4,962,028 de la pequena subunidad de la Rubisco.
Otras secuencias preferidas para el empleo para la union funcional en cintas vegetales de expresion de gen son las secuencias con objetivo, las cuales son necesarias para el control del producto de gen en su correspondiente compartimiento celular (ver una revision en Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 y las citas alli planteadas), por ejemplo en las vacuolas, los nucleos celulares, todo tipo de plastidos, como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, las mitocondrias, el reticulo endoplasmatico, cuerpos de aceite, peroxisomas y otros compartimientos de las celulas vegetales.
Tambien son promotores adecuados los promotores que reaccionan en condiciones de tension biotica o abiotica, por ejemplo el promotor de gen PRP1 inducido por patogenos (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), el promotor hsp80 que puede ser inducido por calor, de tomate (US 5,187,267), el promotor de alfa-amilasa que puede ser inducido por el frio, de la patata (WO 96/12814) o el promotor pinll que puede ser inducido por heridas (EP-A-0 375 091).
En particular puede desearse la expresion multiparalela de las w-3-desaturasas, M-6- desaturasas, M-6-elongasas y/o M-5-desaturasas empleadas en el metodo. La introduccion de tales cintas de expresion puede ocurrir mediante una transformacion simultanea de varias estructuras individuales de expresion o preferiblemente mediante combinacion de varias cintas de expresion sobre una estructura. Tambien pueden transformarse varios vectores con en cada caso varias cintas de expresion y ser transferidos a la celula huesped.
Asimismo, son particularmente adecuados los promotores que causan la expresion especifica de plastidios, puesto que los plastidios son el compartimiento en el cual se sintetizan el precursor asi como algunos productos finales de la biosintesis de lipidos. Promotores adecuados, como el promotor viral de ARN-polimerasa, son descritos en WO 95/16783 y WO 97/06250, y el promotor clpP-Promotor de Arabidopsis es descrito en WO 99/46394.
El vector de ADN es introducido en celulas procarioticas o eucarioticas mediante tecnicas comunes de transformacion o transfeccion. Los conceptos "transformacion" y "transfeccion", conjugacion y transduccion, como se emplean aqui, deberian incluir una multiplicidad de metodos conocidos en el estado de la tecnica para la introduccion de acidos nucleicos extranos (por ejemplo ADN) en una celula huesped, incluyendo co-precipitacion con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfeccion mediada con DEAE-dextran, lipofeccion, competencia natural, transferencia mediada quimicamente, electroevaporacion o bombardeo con particulas. En Sambrook et al. (Molecular CloningA A Laboratory Manual., 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio, como Methods in Molecular Biology, 1995, vol. 44, Agrobacterium protocols, editorA Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey se encuentra metodos adecuados para la transformacion o transfeccion de celulas huesped, incluyendo celulas vegetales.
Como se emplea aqui, el concepto "acido nucleico (molecula)", incluye en una forma ventajosa de operar ademas de la secuencia no traducida localizada en el extremo 3' y el extremo 5' del rango de gen que codificaA por lo menos 500, preferiblemente 200, particularmente preferido 100 nucleotidos de la secuencia aguas arriba del extremo 5' del rango que codifica y por lo menos 100, preferiblemente 50, particularmente preferido 20 nucleotidos de la secuencia aguas abajo del extremo 3' del rango de gen que codifica. Una molecula de acido nucleico "aislada" esta separada de otras moleculas de acidos nucleicos, los cuales estan presentes en las fuentes naturales de acidos nucleicos. Un acido nucleico "aislado" no tiene preferiblemente ninguna secuencia que flanquee de modo natural el acido nucleico en el ADN genomico del organismo del cual desciende el acido nucleico (por ejemplo secuencias que se encuentran en los extremos 5' y 3' del acido nucleico). En diferentes formas de operar la molecula de w-3desaturasa, M-6-desaturasa, M-6-elongasa o M-5-desaturasa aislada empleada en el metodo puede por ejemplo contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb en las secuencias de nucleotidos, las cuales flanquean de modo natural la molecula de acido nucleico en el ADN genomico de la celula de la cual desciende el acido nucleico.
Las moleculas de acidos nucleicos empleadas el metodo puede ser aisladas mediante el empleo de tecnicas estandar de biologia molecular y de la informacion de secuencias aqui suministrada. Tambien puede identificarse con ayuda de algoritmos de comparacion por ejemplo una secuencia homologa o rangos de secuencia homologa conservada en ADN o planos de aminoacidos. Estos pueden ser empleados como sondas de hibridacion asi como tecnicas estandar de hibridacion (como se describe por ejemplo en Sambrook et al., Molecular CloningA A Laboratory Manual. 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) para el aislamiento de otras secuencias de acidos nucleicos utiles en el metodo. Ademas, mediante reaccion de cadena de polimerasa se aislan las moleculas de acidos nucleicos empleadas en el metodo donde se emplean cebadores de oligonucleotido los cuales se basan en esta secuencia o parte de ella (por ejemplo puede aislarse una molecula de acido nucleico que incluye la secuencia total o una parte de ella, mediante reaccion de cadena de polimerasa empleando el cebador de oligonucleotido, el cual habia sido construido a base de esta misma secuencia). Por ejemplo se aisla mARN de celulas (por ejemplo mediante el metodo de extraccion de tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18A5294-5299) y se produce cADN por medio de transcriptasa reversa (por ejemplo transcriptasa reversa de Moloney-MLV, obtenible de Gibco/BRL, Bethesda, MD,
o transcriptasa reversa de AMV, obtenible de Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL). Se construyen cebadores sinteticos de oligonucleotidos para la amplificacion por medio de reacciones de cadena de polimerasa a base de una de las secuencias mostradas en SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5, SEQ ID NOA 7 o SEQ ID NOA 9 o con ayuda de las secuencias de aminoacidos representadas en SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6, SEQ ID NOA 8 o SEQ ID NOA 10. Puede amplificarse un acido nucleico acorde con la invencion mediante el empleo de cADN o alternativamente de ADN genomico como matriz y cebadores adecuados de oligonucleotidos segun tecnicas estandar de amplificacion PCR. El acido nucleico asi amplificado puede ser clonado en un vector adecuado y ser caracterizado por medio de analisis de secuencia de ADN. Pueden producirse oligonucleotidos, que corresponden a una secuencia de desaturasa-nucleotido, mediante metodos estandar de sintesis, por ejemplo con un aparato automatico de sintesis de ADN.
Homologos de las secuencias empleadas de acidos nucleicos de la w-3-desaturasa, M-6-desaturasa, M-6-elongasa,
o M-5-desaturasa con la secuencia SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5, SEQ ID NOA 7 o SEQ ID NOA 9 significa por ejemplo variantes de alelos con por lo menos aproximadamente 70 % u 80 %, 90 % o 95 % y aun mas fuertemente preferido por lo menos aproximadamente 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 o mas de identidad o bien de homologia a una secuencia de nucleotidos mostrada en SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5, SEQ ID NOA 7 o SEQ ID NOA 9 o sus homologos, derivados o analogos o partes de ellos. Ademas son moleculas aisladas de acido nucleico de una secuencia de nucleotido, las cuales hibridan en una de las secuencias de nucleotidos mostradas en SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5, SEQ ID NOA 7 o SEQ ID NOA 9, una parte de ellas por ejemplo bajo condiciones rigurosas. En ello, segun la invencion se entiende por una parte que se emplean por lo menos 25 pares de bases (= bp), 50 bp, 75 bp, 100 bp, 125 bp o 150 bp, preferiblemente por lo menos 175 bp, 200 bp, 225 bp, 250 bp, 275 bp o 300 bp, particularmente preferido 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp o mas pares de bases para la hibridacion. Tambien puede emplearse ventajosamente la totalidad de la secuencia. Las variantes de alelos incluyen en particular variantes funcionales, que se obtienen mediante borrado, insercion o sustitucion de nucleotidos de las secuencias representadas en SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5, SEQ ID NOA 7 o SEQ ID NOA 9, donde el proposito es que se mantenga la actividad enzimatica para la insercion de uno o varios genes, de las proteinas sintetizadas provenientes de ellas. Proteinas que aun poseen la actividad enzimatica de la w-3-desaturasa, M-6-desaturasa, M-6-elongasa o M-5desaturasa es decir cuya actividad no es esencialmente reducida, significa proteinas con por lo menos 10 %, preferiblemente 20 %, particularmente preferido 30 %, muy particularmente preferido 40 % de la actividad enzimatica original, comparada con la proteina codificada mediante SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6, SEQ ID NOA 8 o SEQ ID NOA 10. La homologia fue calculada sobre la totalidad del rango de la secuencia de aminoacidos o bien de acidos nucleicos. Para la comparacion de diferentes secuencias existen disponibles para el experto una serie de programas que se basan en diferentes algoritmos. En ello, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman suministran resultados particularmente confiables. Para la comparacion de secuencias se empleo el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989A 151-153) o los programas Gap y BestFit [Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], los cuales estan contenidos en el paquete de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]. Los valores de homologia de secuencia indicados en porcentaje arriba fueron determinados con el programa GAP sobre la totalidad del rango de secuencia con los siguientes ajustesA altura de brechaA 50, ponderacion de longitudA 3, coincidencia promedioA
10.000 y discrepancia promedioA 0.000, los cuales en caso de que no se indique de otro modo fueron empleados siempre como ajustes estandar para la comparacion de secuencias.
La sintesis de lipidos se subdivide en dos pasosA la sintesis de acidos grasos y su union al sn-glicerina-3- fosfato asi como la adicion o modificacion de un grupo polar de cabeza como el radical fosfatidilo. Los lipidos comunes que se emplean en las membranas incluyen fosfolipidos, glicolipidos, esfingolipidos y fosfogliceridos. La sintesis de acidos grasos comienza con la transformacion de acetil-CoA en malonil-CoA mediante la acetil-CoA-carboxilasa o en acetil-ACP mediante la acetiltransacilasa. Despues de una reaccion de condensacion, estas dos moleculas de productos forman conjuntamente acetoacetil-ACP, el cual es transformado mediante una serie de reacciones de condensacion, reduccion y deshidratacion de modo que se obtiene una molecula de acido graso saturado con la longitud deseada de cadena. La produccion de los acidos grasos insaturados a partir de esas moleculas es catalizada por desaturasas especificas, y concretamente bien sea de manera aerobia por medio de oxigeno molecular o por via anaerobia (respecto a la sintesis de acidos grasos en microorganismos ver F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli y Salmonella. ASM PressA Washington, D.C., pp. 612-636 y las citas alli contenidas; Lengeler et al. (editor) (1999) Biology of Procaryotes. ThiemeA Stuttgart, Nueva York, y las citas alli contenidas, asi como Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57A522-542 y las citas alli contenidas). Los acidos grasos asi obtenidos ligados a fosfolipidos tienen que a continuacion ser convertidos nuevamente para las otras elongaciones a partir de los fosfolipidos en el conjunto de acido graso CoA-ester. Esto lo hacen posible las acil-CoAAlisofosfolipidaciltransferasas. Ademas, estas enzimas pueden transferir los acidos grasos prolongados nuevamente de los esteres CoA a los fosfolipidos. Esta sucesion de reacciones puede, dado el caso, ser poli- recorridos.
Son precursores para la biosintesis de PUFA por ejemplo acido oleico, acido linoleico y acido linolenico. Estos acidos grasos de C18 carbonos tienen que ser alargados hasta los acidos grasos C20, con lo cual se obtienen ARA y EPA. Con ayuda de las desaturasas empleadas en el metodo como las w-3-, M-6- y M-6-desaturasas y/o M-6elongasas pueden producirse acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico y a continuacion ser empleados para diferentes propositos en aplicaciones de productos alimenticios, forrajes, cosmeticos o farmaceuticos. Con las mencionadas enzimas pueden producirse acidos grasos C20 con por lo menos dos, ventajosamente por lo menos tres, cuatro o cinco dobles enlaces en la molecula de acido graso, preferiblemente acidos grasos C20 con ventajosamente cuatro o cinco dobles enlaces en la molecula de acido graso. La dessaturacion puede ocurrir antes o despues de la elongacion del correspondiente acido graso. De alli que los productos de actividades de desaturasa y de las posibles dessaturacion y elongacion adicionales conducen a PUFAs preferidos con grados elevados de dessaturacion en acidos grasos como acido y-linolenico, acido dihomoy-linolenico, acido araquidonico, acido estearidonico, acido eicosatetraenoico o acido eicosapentanoico. Son sustratos de las desaturasas y elongasas empleadas en el metodo acorde con la invencion, acidos grasos C16 o C18 como por ejemplo acido linoleico, acido y-linolenico, acido a-linolenico, acido dihomo-y-linolenico, acido eicosatetraenoico o acido estearidonico. Son sustratos preferidos acido oleico, acido linoleico, acido y- linolenico y/o acido a- linolenico. Los acidos grasos C20 sintetizados con por lo menos dos, tres, cuatro o cinco dobles enlaces en el acido graso surgen en el metodo acorde con la invencion en forma de acidos grasos libres o ventajosamente en forma de su ester por ejemplo en forma de sus gliceridos o fosfolipidos.
Bajo el concepto "glicerido" se entiende una glicerina esterificada con uno, dos o tres radicales acido carboxilico (mono-, di- o triglicerido). Se entiende por "glicerido" tambien una mezcla de diferentes gliceridos. Ventajosamente un glicerido es un triglicerido. El glicerido o la mezcla de gliceridos puede contener otras adiciones, por ejemplo acidos grasos libres, antioxidantes, proteinas, hidratos de carbono, vitaminas y/u otras sustancias.
En el sentido del metodo de la invencion, se entiende ademas por un "glicerido" a derivados que se derivan de glicerina. Entre ellos se cuentan, aparte de los arriba descritos gliceridos de acidos grasos, tambien glicerofosfolipidos y gliceroglicolipidos. Se mencionan aqui a modo de ejemplo preferiblemente los glicerofosfolipidos como lecitina (fosfatidilcolina), cardiolipina, fosfatidilglicerina, fosfatidilserina y alquilacilglicerofosfolipidos.
Ademas los acidos grasos tienen que a continuacion ser transportados a diferentes lugares de modificacion e incorporados en el ventajoso lipido reservorio de triacilglicerina. Otra etapa importante de la sintesis de lipidos es la transferencia de acidos grasos a los grupos polares de cabeza, por ejemplo mediante glicerina-acido grasoaciltransferasa (ver Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5)A161-166).
En los siguientes articulos incluyendo las citas alli detalladasA Kinney, 1997, Genetic Engeneering, editorA JK Setlow, 19A149-166; Ohlrogge y Browse, 1995, Plant Cell 7A957-970; Shanklin y Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49A611-641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, Hrsgb.A JK Setlow, 18A111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31A397-417; Guhnemann-Schafer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256A181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34A267-342; Stymne et al., 1993, enA Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, editor.A Murata y Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1)A1-16 se ven publicaciones sobre la biosintesis de acidos grasos vegetales, dessaturacion, el metabolismo de lipidos y el transporte por membranas de compuestos que contienen grasas, la betaoxidacion, modificacion de acidos grasos y co-factores, almacenamiento y ensamblaje de triacilglicerina.
Los PUFAs producidos en el metodo incluyen un grupo de moleculas que los animales superiores no pueden sintetizar y con ello tienen que incorporar o que los animales superiores no pueden producir por si mismos de manera suficiente y con ello tienen que incorporar de modo adicional, mientras que ellos son sintetizados facilmente por otros organismos como bacterias, por ejemplo los felinos no pueden sintetizar acido araquidonico.
En el sentido de la invencion se entiende por fosfolipidos fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerina y/o fosfatidilinositol, ventajosamente fosfatidilcolina y/o fosfatidilserina. En el campo de los expertos los conceptos de produccion y productividad son conocidos e incluyen la productividad dentro de una celula vegetal o un vegetal, es decir el contenido en acidos grasos deseados producidos en el metodo referido al contenido de todos los acidos grasos en estas celulas o vegetales. El concepto de eficiencia en la produccion incluye el tiempo que es necesario para alcanzar una determinada cantidad de produccion (por ejemplo cuanto tiempo requiere la celula para llegar a una determinada tasa de rendimiento en un producto quimico). Los conceptos biosintesis o ruta de biosintesis son conocidos en el campo de los expertos e incluyen la sintesis de un compuesto, preferiblemente un compuesto organico, por una celula a partir de compuestos intermedios, por ejemplo en un proceso de varias etapas y fuertemente regulado. Los conceptos degradacion o ruta de degradacion son conocidos en el campo de los expertos e incluyen la escision de un compuesto, preferiblemente un compuesto organico, en productos de degradacion mediante una celula (dicho generalmente, moleculas mas pequenos o menos complejas) por ejemplo en un proceso de varias etapas y fuertemente regulado. El concepto metabolismo es conocido en el campo de los expertos e incluye la totalidad de reacciones bioquimicas que tienen lugar en un organismo. El metabolismo de un determinado compuesto (por ejemplo el metabolismo de un acido graso) incluye entonces la totalidad de las rutas de biosintesis, modificacion y degradacion de este compuesto en la celula, que conciernen a este compuesto.
Para el metodo acorde con la invencion, ventajosamente pueden aislarse moleculas de acidos nucleicos sobre la base de su homologia con los aqui manifestados acidos nucleicos de w-3-desaturasa, M-6-desaturasa, M-5desaturasa, y/o M-6-elongasa, empleando las secuencias o una parte de ellas, sondas de hibridacion segun tecnicas estandar de hibridacion, bajo condiciones rigurosas de hibridacion. En ello, pueden emplearse por ejemplo moleculas aisladas de acido nucleico, que tienen una longitud de por lo menos 15 nucleotidos y que bajo condiciones rigurosas hibridan con las moleculas de acido nucleico que incluyen una secuencia de nucleotidos de las SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5, SEQ ID NOA 7 o SEQ ID NOA 9. Pueden emplearse tambien acidos nucleicos con por lo menos 25, 50, 100, 250 o mas nucleotidos. El concepto "hibridado bajo condiciones rigurosas", como se emplea aqui, deberia describir condiciones de hibridacion y lavado, bajo las cuales permanecen comunmente hibridadas de modo conjunto secuencias de nucleotidos, que son conjuntamente homologas en por lo menos 60 %. Las condiciones son preferiblemente tales que las secuencias que son conjuntamente homologas en por lo menos aproximadamente 65 %, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 70 % y aun mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 75 % o mas, permanecen usualmente hibridadas de modo conjunto. Estas condiciones rigurosas son conocidas por los expertos y se encuentran en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.. Un ejemplo preferido, no limitante para condiciones rigurosas de hibridacion son hibridaciones en 6 x de cloruro de sodio/citrato de sodio (sodium chloridelsodiumcitrate = SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por una o varias etapas de lavado en 0,2 x SSC, 0,1 % SDS a 50 a 65°C. Es conocido por el experto que estas condiciones de hibridacion se diferencian dependiendo del tipo de acido nucleico y, cuando por ejemplo esta presente un solvente organico, respecto a la temperatura y concentracion del tampon. La temperatura se diferencia por ejemplo bajo "condiciones estandar de hibridacion " dependiendo del tipo de acido nucleico entre 42°C y 58°C en tampon acuoso con una concentracion de 0,1 a 5 x SSC (pH 7,2). En caso de que en el tampon arriba mencionados se presente un solvente organico, por ejemplo formamida al 50 %, bajo condiciones estandar, la temperatura es de aproximadamente 42°C. Preferiblemente las condiciones de hibridacion para ADNAADN-hibrido son por ejemplo 0,1 x SSC y 20°C a 45°C, preferiblemente entre 30°C y 45°C. Preferiblemente las condiciones de hibridacion para ADNAARN hibrido son por ejemplo 0,1 x SSC y 30°C a 55°C, preferiblemente entre 45°C y 55°C. Las temperaturas de hibridacion previamente mencionadas estan determinadas por ejemplo para un acido nucleico con aproximadamente una longitud de 100 bp (= pares de bases) y un contenido G + C de 50 % en ausencia de formamida. Los expertos conocen como pueden determinarse las condiciones necesarias de hibridacion mediante los libros de texto, como se menciono previamente o a partir de los siguientes libros Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames y Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids HybridizationA A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular BiologyA A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Para la determinacion de la homologia porcentual (= identidad) de dos secuencias de aminoacidos (por ejemplo una de las secuencias de las SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6, SEQ ID NOA 8 o SEQ ID NOA 10) o de dos acidos nucleicos (por ejemplo SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5, SEQ ID NOA 7 o SEQ ID NOA 9) se describen las secuencias con el proposito de la optima comparacion entre ellas (por ejemplo pueden insertarse brechas en la secuencia de una proteina o un acido nucleico, para generar una optima alineacion con las otras proteinas o los otros acidos nucleicos). Se comparan entonces los radicales aminoacidos con nucleotidos en las correspondientes posiciones de aminoacidos o posiciones de nucleotidos. Cuando se ocupa una posicion en una secuencia mediante el mismo radical aminoacido o el mismo nucleotido que la posicion correspondiente en la otra secuencia, entonces las moleculas son homologas en esta posicion (es decir homologia de aminoacidos o de acidos nucleicos, como se emplea aqui, corresponde a "identidad" de aminoacidos o de acidos nucleicos). La homologia porcentual entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas, que son comunes a las secuencias (es decir % de homologia = numero de posiciones identicas /numero total de las posiciones x 100). Con ello, los conceptos de homologia e identidad deben ser considerados como sinonimos. Los programas o bien los algoritmos empleados son como se describio arriba.
Puede generarse una molecula aislada de acido nucleico que codifica para una w-3-desaturasa, M-6-desaturasa, M5-desaturasa y M-6-elongasa empleada en el metodo, que es homologa a una secuencia de proteina de las SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6, SEQ ID NOA 8 o SEQ ID NOA 10, mediante la introduccion de una o varias sustituciones, adiciones o borrados de nucleotidos en una secuencia de nucleotidos de las SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5, SEQ ID NOA 7 o SEQ ID NOA 9, de modo que se introducen una o varias sustituciones, adiciones o borrados de aminoacidos en la proteina codificada. Pueden introducirse mutaciones en una de las secuencias de las SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5, SEQ ID NOA 7 o SEQ ID NOA 9 mediante tecnicas estandar como mutagenesis especifica de posicion y mutagenesis mediada por PCR. Se producen preferiblemente sustituciones conservantes de aminoacidos en uno o varios de los previamente dichos radicales de aminoacidos esenciales. En una "sustitucion conservadora de aminoacidos " se intercambia el radical aminoacido por un radical aminoacido con una cadena lateral similar. En el ambito de los expertos se han definido familias de radicales aminoacidos con cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo acido asparaginico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Un radical aminoacido no esencial dicho previamente en una w-3-desaturasa, M-6-desaturasa, M-5-desaturasa o M-6-elongasa es intercambiado con ello preferiblemente por otro radical aminoacido de la misma familia de cadena lateral. De modo alternativo, en otra forma de operar pueden introducirse las mutaciones en caso de azar sobre la totalidad o una parte de la secuencia que codifica w-3-desaturasa, M-6-desaturasa, M-5-desaturasa o M-6-elongasa, por ejemplo mediante mutagenesis de saturacion, y los mutantes resultantes pueden ser examinados segun la actividad aqui descrita de w-3desaturasa-, M-6-desaturasa-, M-5-desaturasa-o M-6-elongasa, para identificar mutantes que han retenido la actividad de w-3-desaturasa-, M-6-desaturasa-, M-5-desaturasa-o M-6-elongasa. Despues de la mutagenesis, la proteina codificada puede ser expresada de modo recombinante, y puede determinarse la actividad de la proteina por ejemplo mediante el empleo de las pruebas aqui descritas.
Esta invencion es ilustrada adicionalmente mediante los ejemplos siguientes, los cuales no debian ser entendidos como limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1:metodos generales de clonaci6n:
Los metodos de clonacion como por ejemplo escisiones de restriccion, electroforesis en gel de agarosa, purificacion de fragmentos de ADN, transferencia de acidos nucleicos sobre nitrocelulosa y membranas de nylon, union de fragmentos de ADN, transformacion de celulas de Escherichia coli, cultivo de bacterias y el analisis de secuencia de ADN recombinante fueron ejecutados como se describe en Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory PressA ISBN 0-87969-309-6).
Ejemplo 2:analisis de secuencia de ADN recombinante:
Esta secuenciacion de moleculas de ADN recombinante ocurrio con un secuenciador de fluorescencia de laser de ADN de la compania ABI segun el metodo de Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 54635467). Se hizo la secuenciacion de los fragmentos resultantes de una reaccion en cadena de polimerasa en la estructura que iba a ser expresada, para evitar errores de polimerasa y se revisaron.
Ejemplo 3: Clonaci6n deplasmidosde expresi6n para la expresi6n enplantas
Para la transformacion de vegetales se generaron vectores de transformacion a base de pGPTV-35S, un plasmido a base de pBIN19-35S (Bevan M. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucl. Acids Res. 18A203). Para ello se combinaron en un vector pUC una cinta de expresion consistente en el elemento promotor CaMV35S (SEQ ID NOA 11) asi como el terminador 35S (SEQ ID NOA 12; Franck,A., Guilley,H., Jonard,G., Richards, K. and Hirth,L. (1980) Nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus DNA Cell 21 (1), 285-294). Para ello se empleo el promotor sobre el punto de interseccion de restriccion SalI/XbaI y terminador sobre la BamHI/SmaI. En ello, sobre el terminador se adhirio un polienlazador con la posicion de corte XhoI ("union triple"). El plasmido pUC19-35S que se formo fue empleado para la clonacion de genes de PUFA. Se insertaron de modo paralelo los marcos abiertos de lectura de las secuencias d6Des(Pir, SEQ ID NOA 1), d5Des(Tc, SEQ ID NOA 5) y d6Elo(Tc, SEQ ID NOA 3) sobre EcoRV en vectores pUC19-35S. Los plasmidos pUC-D6, pUC-D5, pUC-E6(Tc) que surgieron fueron empleados para la construccion del vector binario pGPTV-35S D6D5E6(Tc). Para ello se hizo la digestion del vector pGPTV con la enzima SalI, el plasmido pUC-D6 con SalI/XhoI y se ligaron los fragmentos correctos. Al plasmido pGPTV-D6 que surgio se le hizo a continuacion digestion con SalI, el plasmido pUC-D5 con SalI/XhoI y se ligaron los fragmentos correctos. Se hizo entonces digestion una vez al plasmido pGPTV-D6-D5 que surgio con SalI, el plasmido pUC-E6(Tc) se logo con SalI/XhoI y los fragmentos correctos. De estas etapas secuenciales de clonacion surgio un vector binario pGPTV-D6D5E6 (Tc), el cual fue empleado para la transformacion.
En otra forma de operar, en lugar de la secuencia d6Elo(Tc) se empleo la secuencia de d6Elo(Tp) [SEQ ID NOA 7] en el vector pUC19-35S. El plasmido pUC- E6(Tp) que surgio se empleo para la produccion del vector pGPTV35S D6D5E6(Tp) binario.
En otra forma de operar se clono el marco abierto de lectura de law3Des(Pi, SEQ ID NOA 9) en pUC19-35S. El plasmido pUC-w3Pi que surgio fue transferido sobre SalI/XhoI en los vectores binarios pGPTV-D6D5E6(Tc) y pGPTV-D6D5E6(Tp). Los vectores pGPTV-D6D5E5(Tc)w3Pi y pGPTV-D6D5E5(Tp)w3Pi que surgieron fueron empleados para la transformacion vegetal.
La Fig. 1 da un vistazo de las estructuras construidas.
Todos los vectores binarios fueron transformados en celulas de E. coli DH5a (Invitrogen) de acuerdo con los datos del productor. Se identificaron clones positivos mediante PCR y se aislo ADN de plasmido (Qiagen Dneasy).
Combinacion del fragmento de PCR (50 1-L)A
5,00 1-L patron de cADN
5,00 1-L 10x tampon (Advantage-Polimerasa)+ MgCl2 25mM
5,00 1-L dNTP 2mM
1,25 1-L de cada cebador (10 pmol/1-L)
0,50 1-l Advantage-Polimerasa
Se empleo la Advantage-Polimerasa de Clontech.
Los vectores examinados fueron entonces transformados mediante electroevaporacion en Agrobacterium tumefaciens GC3101 y se colocaron en placas de agar con 2% de medio YEB + canamicina. Se eligieron las celulas tolerantes a la canamicina y fueron empleadas para la transformacion de Brassica juncea y Arabidopsis thaliana o bien pueden ser empleadas para la transformacion de otros tipos de plantas.
Ejempl 4: generaci6n de plantas transgenicas
a) generacion de plantas transgenicas de colza (Brasscia juncea, modificada segun Radke et al., Transformation and regeneration of Brassica rapa using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 11, 499-505, 1992).
Para la generacion de plantas transgenicas de colza se transforman vectores binarios como los pasmidos/vectores binarios generados bajo el ejemplo 3, en Agrobacterium tumetaciens GC3101 (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Para la transformacion de plantas de colza (Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Alemania), se emplea una dilucion 1A50 de un cultivo de una noche de una colonia de agrobacterias transformadas positivamente en medio Murashige-Skoog Medium (Murashige y Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) con 3 % de sacarosa (medio 3MS). Se incubaron peciolos o hipocotiledones recientemente germinados de plantas esteriles de colza (de a aproximadamente 1 cm2) en una placa de Petri con una dilucion 1A50 de agrobacterias por 5-10 minutos. Sigue una co-incubacion de 3 dias en la oscuridad a 25°C sobre medio 3MS con 0,8 % de Bacto-Agar. Se continuo el cultivo despues de 3 dias con 16 horas de luz/8 horas de oscuridad y se continuo con cadencia semanal en medio MS con Claforan 500 mg/l (cefotaxime-sodio), canamicina 50 mg/l, bencilaminopurina (BAP) 20 microM y glucosa 1,6 g/l. Se trasladaron los brotes que crecieron sobre medio MS con 2 % de sacarosa, Claforan 250 mg/l y 0,8 % de bacto-agar. Si despues de tres semanas no se formo ninguna raiz, entonces se anadia como hormona de crecimiento acido 2-indolbutirico al medio, para la generacion de raices.
Se obtuvieron brotes regenerados sobre medio 2MS con canamicina y claforan, despues de la aparicion de raices se transfirieron a tierra y se retiraron despues de cultivo por dos semanas en una camara climatizada o en invernadero, se dejo florecer, se cosecharon las semillas maduras y se investigo la expresion de los genes de desaturasa o bien elongasa por medio de analisis de lipidos como se describe por ejemplo en Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566.
b) produccion de plantas transgenicas de lino
Puede generarse la produccion de plantas transgenicas de lino por ejemplo segun el metodo de Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6)A456-465, por medio de bombardeo con particulas. Las transformaciones mediadas por agrobacterias pueden ser producidas por ejemplo segun Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13A 282-285
o segun Drexler et al. (2003), Mol. Breeding 11, 149-158.
Ejemplo 5: extracci6n de lipido de hojas de Brassicaj uncea y Arabidopsisjthaliana
Las consecuencias de modificaciones geneticas en plantas, hongos, algas, ciliados o en la produccion de un compuesto deseado (como un acido graso) pueden ser determinadas mediante el examen de los microorganismos modificados o las plantas modificadas bajo condiciones adecuadas (como se describio previamente) y la investigacion del medio y/o los componentes celulares sobre la produccion elevada de producto deseado (es decir de lipidos o un acido graso). Estas tecnicas de analisis son conocidas por los expertos e incluyen espectroscopia, cromatografia de capa delgada, metodos de coloracion de diferente tipo, metodos enzimaticos y microbiologicos asi como cromatografia analitica, como cromatografia liquida de alto desempeno (por ejemplo ver Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol A2, pp 89-90 y pp 443-613 VCHA Weinheim (1985); Fallon A., et. al. (1987)
"Applications of HPLC in Biochemistry" enA Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol. 3, capitulo IIIA "Product recovery and purification", pp. 469-714, VCHA Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) BioseparationsA downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., y Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., y Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, enA Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3; capitulo 11, pp. 1-27, VCHA Weinheim; y Decow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Aparte de los metodos arriba mencionados, se extraen lipidos de plantas a partir de materiales vegetales como se describe en Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22)A 12935-12940, y Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152A141-145. El analisis cualitativo y cuantitativo de lipidos o acidos grasos es descrito en Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/ScotlandA Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide -Ayr, ScotlandA Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, OxfordA Pergamon Press, 1 (1952) -16 (1977) u.d.T.A Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Un ejemplo es el analisis de acidos grasos (abreviaturasA FAME, metilester de acidos grasos; GC-MS, cromatografia liquida-gaseosa espectrometria de masas; TAG, triacilglicerina; TLC, cromatografia de capa delgada).
Puede obtenerse la evidencia inequivoca de la presencia de productos de acidos grasos por medio de analisis de organismos recombinantes segun metodos estandar de analisisA GC, GC-MS o TLC, como describe repetidamente Christie y las citas de literatura alli mostradas (1997, enA Advances on Lipid Methodology, cuarta edicionA Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren, Lipide 33A343-353).
El material que va a ser analizado puede ser desintegrado mediante tratamiento con ultrasonido, molienda en el molino de vidrio, nitrogeno liquido y molienda o mediante otros metodos aplicables. Despues de la ruptura, el material tiene que ser sometido a centrifugacion. Se suspende nuevamente el sedimento en agua destilada, se calienta por 10 min a 100°C, se enfria con hielo y se somete nuevamente a centrifugacion, seguida de extraccion en acido sulfurico 0,5 M en metanol con dimetoxipropano 2 % por 1 hora a 90°C, lo cual conduce a productos oleosos y lipidos hidrolizados, los cuales generan lipidos transmetilados. Estos metilesteres de acidos grasos son extraidos con eter de petroleo y finalmente sometidos a un analisis de GC empleando una columna capilar (Chrompack, WCOT silica fundida, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0,32 mm) a un gradiente de temperatura entre 170°C y 240°C por 20 min y 5 min a 240°C. La identidad de los metilesteres de acidos grasos obtenidos tiene que ser definida empleando estandares que pueden ser obtenidos a partir de fuentes comerciales (d.h. Sigma).
Para el analisis de plantas transgenicas de Brassica juncea o bien Arabidopsis thaliana se homogeneizo el material vegetal primero mecanicamente mediante morteros, para hacer factible una extraccion. Despues se calento por 10 min a 100°C y despues del enfriamiento sobre hielo se dejo sedimentar nuevamente. Se hidrolizo el sedimento celular con acido sulfurico metanolico 1 M y dimetoxipropano 2 % por 1 h a 90°C y los lipidos fueron transmetilados. Los metilesteres de acidos grasos (FAME) resultantes fueron extraidos en eter de petroleo. Se analizaron los FAME extraidos mediante cromatografia liquida-gaseosa con una columna capilar (Chrompack, WCOT silica fundida, CPWax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) y un gradiente de temperatura de 170°C a 240°C en 20 min y 5 min a 240°C. Se confirmo la identidad de los metilesteres de acidos grasos mediante comparacion con los correspondientes estandares de FAME (Sigma). Puede analizarse adicionalmente la identidad y la posicion de los dobles enlaces mediante formacion quimica adecuada de derivados de la mezcla de FAME por ejemplo hasta dar derivados de 4,4dimetoxioxazolina (Christie, 1998) por medio de GC-MS.
Analisis del material de las hojas de plantas transgenica de Brasscia juncea con la estructura pGPTV-D6D5E6(Tc)A
Se investigaron plantas, que fueron transformadas como en el ejemplo 4 con el plasmido pGPTV-D6D5E6(Tc), buscando acidos grasos modificados. Como material de partida se emplearon hojas, a las cuales se les sometio a extraccion y analisis por cromatografia de gases de modo correspondiente como se describio arriba.
En ello, en las plantas transgenicas se muestra la aparicion de nuevos acidos grasos (Tab. 1, comparacion con los controles). Al final de la descripcion se reproduce nuevamente la tabla 1. El analisis de numerosas lineas transgenicas independientes mostro que en el material de las hojas, mediante la actividad de los genes empleados, surgen los acidos grasos DGLA (y18A3), SDA (18A4), DGLA (20A3d8,11,14), AA (20A4) y EPA (20A5). Estos acidos grasos no estan presentes en las plantas no transformadas ("controles"). El acido araquidonico (AA) y acido eicosapentanoico (EPA) representan en ello acidos grasos valiosos para la nutricion humana. De estos dos acidos grasos valiosos estan presentes hasta 8,9% o bien 4,8%.
EPA representa un acido graso particularmente valioso. Por esta razon se ejecutaron aproximaciones para elevar el contenido de EPA. Una primera aproximacion fue el empleo de una w3-desaturasa especifica para ARA, la cual transforma ARA hasta dar EPA. En otra aproximacion se probo el empleo de una elongasa 18A4 especifica en combinacion con la w-desaturasa.
Analisis de material de hojas de plantas transgenicas de Brasscia juncea con la estructura pGPTVD6D5E6(Tc)w3PiA
Se investigaron plantas, que fueron transformadas como en el ejemplo 4 con el plasmido pGPTV-D6D5E6(Tc)w3Pi, buscando acidos grasos modificados. Como material de partida se emplearon hojas, a las cuales se les sometio a extraccion y analisis por cromatografia de gases del modo correspondiente como se describio arriba.
En ello, en las plantas transgenicas se pudo mostrar la aparicion de nuevos acidos grasos (Tab. 2, comparacion con los controles). Al final de la descripcion se reproduce nuevamente la tabla 2. El analisis de numerosas lineas transgenicas independientes mostro que en el material de las hojas, mediante la actividad de los genes empleados, surgen los acidos grasos GLA (y18A3), SDA (18A4), 20A4d8,11,14,17 y EPA (20A5). Estos acidos grasos no estan presentes en las plantas no transformadas ("controles"). El acido eicosapentanoico (EPA) representa en ello un acido graso valioso para la nutricion humana. De estos dos acidos grasos valiosos estan presentes hasta 12,5%. En ello, el empleo adicional de w3Pi reduce claramente el contenido AA y desplaza la reaccion en la direccion del producto valioso EPA.
Analisis del material de hojas de plantas transgenicas de Brasscia juncea, estructura pGPTV-D6D5E6(Tp) w3PiA
Se investigaron plantas, que fueron transformadas como en el ejemplo 4 con el plasmido pGPTV-D6D5E6(Tp)w3Pi, buscando acidos grasos modificados. Como material de partida se emplearon hojas, a las cuales se les sometio a extraccion y analisis por cromatografia de gases de modo correspondiente como se describio arriba.
En ello, en las plantas transgenicas se pudo mostrar la aparicion de nuevos acidos grasos (Tab. 3, comparacion con los controles). Al final de la descripcion se reproduce nuevamente la tabla 3. El analisis de numerosas lineas transgenicas independientes mostro que en el material de las hojas, mediante la actividad de los genes empleados, surgen los acidos grasos GLA (y18A3), SDA (18A4), 20A4d8,11,14,17 y EPA (20A5). Estos acidos grasos no estan presentes en las plantas no transformadas ("controles"). El acido eicosapentanoico (EPA) representa en ello un acido graso valioso para la nutricion humana. De estos dos acidos grasos valiosos estan presentes hasta 14,7 %. En ello, el empleo adicional de w3Pi reduce claramente el contenido ARA y desplaza la reaccion en la direccion del producto valioso EPA. En comparacion con la estructura pGPTV-D6D5E6(Tc)w3Pi pudieron alcanzarse contenidos mayores de EPA (20A5).
En ello, pudo mostrarse que la sintesis de los acidos grasos valiosos EPA (20A5) tiene lugar preferiblemente en hojas (Tab. 4). En los otros organos de las plantas como semillas, tallos y flores son evidentes solo pequenas cantidades de EPA y los precursores.
En otra operacion se investigo si los acidos grasos valiosos EPA se concentraban en una determinada clase de lipidos o bien determinadas clases de lipidos. Para ello se extrajeron de las hojas la totalidad de los lipidos como se describe arriba y se separaron entonces en lipidos neutros y polares por medio de una columna Silikat PrepSep (Fisher Scientific, USA). La fraccion neutra de lipidos fue separada en otra etapa por medio de cromatografia de capa delgada (G-25, Machery-Nagel) de los triacilgliceridos (hexano/dietileter/acido acetico 70A30A1, vol/vol/vol). Se separaron alicuotas de la fraccion de lipido polar con cloroformo/metanol/amoniaco (65/A25A4, vol/vol/vol/, galactolipidos) o bien con cloroformo/metanol/amoniaco/agua (70A30A4A1, vol/vol/vol/vol, fosfolipidos). Las clases individuales de lipidos fueron identificadas bajo luz UV, despues de atomizarlas con solucion de primulina (0,05% en 80% de acetona, Sigma) y rasparlas de la placa de capa de delgada y transmetilarlas para el analisis de cromatografia de gases, como se describio ampliamente arriba.
La tabla 5 muestra los resultados de este analisis en diferentes clases de lipidos. La tabla 5 es representada al final de la descripcion. En ello se establecio una clara concentracion de EPA en TAG, la fraccion de aceite. Ademas pudo observarse en la fraccion polar una acumulacion de fosfatidilcolina (PC) asi como de fosfatidilserina.
Tabla 1A Analisis por cromatografia de gases de los acidos grasos de material de hojas de plantas de Brassica juncea, las cuales fueron transformadas con el plasmido pGPTV-D6D5E6(Tc). La medicion muestra la fraccion porcentual de los acidos grasos individuales en las diferentes lineas transgenicas
Acidos grasos
16:0 16:1 16:3 18:0 18.1 (n-9) 18:1 (n-11) 18:2 18:3 (GLA) 18:3 (ALA) 18:4 (SDA) DGLA ARA EPA
Controles PGPTV-D6D5E6 (Tc)
11.2 1.8 13.2 1.4 0.6 0.8 6.4 0.0 55.9 0.0 0.0 0.0 0.0
C23-1
13.5 1.4 10.8 2.5 1.5 1.2 6.8 9.1 31.2 7.1 0.3 2.4 1.7
C23-2
15.3 1.7 11.8 3.0 2.1 1.1 4.1 5.2 21.9 4.0 2.1 8.8 4.8
C23.3
14.7 1.4 11.4 2.5 1.5 0.9 6.1 10.4 26.5 7.4 0.4 2,8 1.8
C23-4
13.0 2.0 13.8 1.8 0.5 1.1 5.6 6.2 39.3 5.5 0.3 1.8 1.3
C23-5
18.9 2.8 10.4 3.2 1.9 1.5 4.2 6.0 18.9 3.4 1.7 8.9 4.2
C23-6
13.6 1.8 11.7 2.3 1.2 1.3 8.1 9.1 33.1 5.8 0.3 1.3 0.9
C23.7
14.5 1.2 10.8 3.1 1.7 1.3 7.8 9.7 27.4 6.0 0.5 3.3 2.2
C23-9
15.2 1.9 12.9 2.4 1.3 1.3 3.8 6.8 25.6 4.5 1.3 8.4 4.8
Tabla 2A analisis por cromatografia de gases de los acidos grasos de material de hojas de plantas de Brassica juncea, que fueron transformadas con el plasmidopGPTV-D6D5E6(Tc)w3Pi. La medicion muestra la fraccion porcentual de los acidos grasos individuales en los controles no transgenicos (Wt) y las diferentes
lineas transgenicas.
�cidosgrasos
16A0 16A1 16A2 16A3 18A0 18.1 (n9) 18A1 (n- 11) 18A2 LA 18A3 (GLA) 18A3 (ALA) 18A4 (SDA) HGLA20A3 c8,11,14 ARA 20A4 c8.1.14.17 EPA
peso
12.73 2.14 0.49 14.34 1.07 0.93 0.70 11.79 - 52.28 - - n.d. - -
11-3
15.69 1.18 0.80 13.69 1.97 2.83 0.61 3.86 6.68 24.01 7.24 - n.d 1.91 12.48
11-5
13.51 1.67 0.59 14.23 1.49 1.41 0.75 5.01 5.53 34.04 5.74 - n.d 1.32 9.21
11-13
12.46 1.47 0.60 14.06 1.27 1.41 0.80 6.97 3.77 37.82 4.82 - n.d 0.63 8.25
Tabla 3A analisis por cromatografia de gases de los acidos grasos de material de hojas de plantas de Brassica juncea, que fueron transformados con el plasmido pGPTV-D6D5E6(Tp)w3Pi. Se muestra la fraccion porcentual de los acidos grasos individuales en los controles no transgenicos (Wt) y las diferenteslineas transgenicas.
�cidograso
16A0 16A1 16A2 16A3 18A0 18.1 (n-9) 18A1 (n11) 18A2 LA 18A3 (GLA) 18A3 (ALA) 18A4 (SDA) HGLA20A3 c8,11,14 ARA 20A4 EPAc8,1,14,17 EPA
peso
12,73 2,14 0,49 14,34 1,07 0,93 0,70 11,79 - - - - - -- -
10-6
15,04 1,32 0,68 11,15 1,70 2,20 0,63 4,00 4,95 25,47 4,38 0,59 0,28 4,35 14,74
10-10
11,53 1,49 0,66 16,71 1,07 1,59 0,60 4,10 5,62 31,15 5,63 nd nd 2,62 12,25
10-11
15,42 1,63 0,56 14,45 1,63 1,88 0,71 4,08 6,08 27,34 5,37 nd nd 2,08 13,75
10-13
13,26 1,53 0,56 12,91 2,42 1,84 0,88 4,85 5,43 30,49 4,23 nd nd 3,37 13,68
10-14
14,92 1,55 1,13 12,72 1,88 1,46 0,68 4,76 5,19 30,23 4,24 0,46 0,27 2,68 12,78
Tabla 4A analisis de diferentes organos de plantas de lineas no transgenicas y transgenicas (pGPTV-D6D5E6 (Tp)w3Pi. Los acidos grasos son indicados en fracciones porcentuales
Acidos grasos (% peso)
Semillas Hojas Tallos Flores
WT
35S WT 35S WT 35S WT 35S
16:3
- 14.34 13.59 2.31 4.18 2.35 1.76
18:1 (n9)
33.22 45.43 0.93 1.97 1.54 3.84 1.26 1.51
LA
45.17 30.34 11.79 4.36 21.60 15.88 14.31 13.18
GLA (18:3, d6,9,12)
0.55 5.45 1.14 0.86
ALA (18:3, d9,12,15)
9.66 10.61 53.28 28.94 46.04 43.36 36.72 36.10
SDA (18:4, d6,9,12,15)
0.13 4.77 1.52 0.52
ARA (20:4 d5,8,11,14)
0.10 0.28
EPA (20:5, d5,8,11,14,17)
0.10 13.44 0.79 0.72
EquivalentesA
5 El experto reconoce o puede evidenciar cuantos equivalentes de las formas de operar especificas acordes con la invencion aqui descritas, con los que emplea solamente experimentos de rutina. Estos equivalentes deberian incluirse en las reivindicaciones.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> BASF Plant Science GmbH 10 <120> Metodo para la produccion de acido araquidonico y/o acido eicosapentanoico en plantas transgenicas utiles
<130> PF56991
<140> 20050640
<141> 2005-08-08
<160> 12 15 <170> Version 3.1 de la patente
<210> 1
<211> 1380
<212> ADN
<213> Pythium irregulare 20 <220>
<221> CDS
<222> (1)..(1380)
<223> Delta-6-desaturasa
<400> 1
<210> 2
<211> 459
<212> PRT
<213> Pythium irregulare
<400> 2
<210> 3
<211> 831
<212> ADN 5 <213> Traustochytrium sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(831)
<223> Delta-6-elongasa 10 <400> 3
<210> 4
<211> 276
<212> PRT
<213> Traustochytrium sp.
<400> 4
<210> 5
<211> 1320
<212> ADN
<213> Traustochytrium sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1320)
<223> Delta-5-Desaturasa
<400> 5
<210> 6
<211> 439
<212> PRT
<213> Traustochytrium sp.
<400> 6
<210> 7
<211> 819
<212> ADN
<213> Talassiosira pseudonana
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(819)
<223> Delta-6-Elongasa
<400> 7
<210> 8
<211> 272
<212> PRT
<213> Talassiosira pseudonana
<400> 8
<210> 9
<211> 1086
212> ADN 5 <213> Phytophthora infestans
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1086)
<223> Omega-3-Desaturasa
<400> 9
<210> 10
<211> 361
<212> PRT
<213> Phytophthora infestans
<400> 10
<21O> 11
<211> 755
<212> ADN
<213> 35S-Virus
<220>
<221> promotor
<222> (1)..(755)
<223>
<400> 11
<210> 12 5 <211> 211
<212> ADN
<213> 35S-Virus
<220>
<221> terminador 10 <222> (1)..(211)
<223>
<400> 12

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Metodo para la produccion de
    (i)
    acido eicosapentanoico o
    (ii)
    acido araquidonico y acido eicosapentanoico
    en los tejidos vegetativos de plantas utiles transgenicas con un contenido de por lo menos 4 % en peso referido al contenido total de lipidos de la planta util transgenica, caracterizado porque en la planta se introducen por lo menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica para una M-6-desaturasa, por lo menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica para una M-6-elongasa y por lo menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica para una M-5-desaturasa donde los acidos nucleicos son elegidos de entre el grupo consistente en
    a) Secuencias de acidos nucleicos con las secuencias representadas en SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5 o SEQ ID NOA 7;
    b) Secuencia de acidos nucleicos, la cual se deriva como resultado de los codigos geneticos generados de las secuencias de aminoacidos representadas en SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6 o SEQ ID NOA 8; y
    c) derivados de las secuencias de acidos nucleicos representadas en SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5 o SEQ ID NOA 7 las cuales codifican para polipeptidos, las cuales en el plano de aminoacidos exhiben una identidad de por lo menos 70 % con SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6 o SEQ ID NOA 8 y tienen una actividad de M-6-desaturasa, M-6-elongasa, o M-5-desaturasa;
    donde las mencionadas secuencias se expresan en las plantas con ayuda de por lo menos un promotor constitutivo CaMV/35S el cual hace posible la expresion de dichas secuencias de acidos nucleicos en tejidos vegetativos de plantas, y un terminador.
  2. 2.
    Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque adicionalmente se incorpora en las plantas utiles una secuencia de acidos nucleicos la cual codifica para una w-3-desaturasa.
  3. 3.
    Metodo segun la reivindicacion 2, caracterizado porque la secuencia de acidos nucleicos que codifica para polipeptidos con actividad de w-3-desaturasa, es elegida de entre el grupo consistente en
    a) una secuencia de acidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NOA 9, o
    b) secuencias de acidos nucleicos, las cuales como resultado del codigo genetico degenerativo se derivan de las secuencias de aminoacidos representadas en SEQ ID NOA 10 o
    c) derivados de las secuencias de acidos nucleicos representadas en SEQ ID NOA 9 que codifican para polipeptidos, las cuales a nivel de aminoacidos exhiben una identidad de por lo menos 60 % con SEQ ID NOA 10 y tienen una actividad de w-3-desaturasa.
  4. 4.
    Metodo segun las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico estan presentes en las plantas utiles, preferiblemente unidos como esteres en fosfolipidos o triacilgliceridos.
  5. 5.
    Metodo segun la reivindicacion 4, caracterizado porque el acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico estan presentes predominantemente unidos como esteres a los fosfolipidos y donde el acido araquidonico o acido eicosapentanoico estan presentes en los esteres de fosfolipidos con un contenido de por lo menos 10 % en peso referido a la totalidad de los lipidos.
  6. 6.
    Metodo segun la reivindicacion 4, caracterizado porque el acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico estan presentes predominantemente unidos como esteres a los triacilgliceridos y donde el acido araquidonico o acido eicosapentanoico estan presentes en los esteres de triacilgliceridos con un contenido de por lo menos 10 % en peso referido a la totalidad de lipidos.
  7. 7.
    Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque las plantas utiles son una planta productora de aceite, una hortaliza, verdura o planta ornamental.
  8. 8.
    Metodo segun la reivindicacion 7, caracterizado porque las plantas utiles son elegidas de entre las familias de plantas consistentes en familias de las Aceraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Arecaceae, pritoliaceae, Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Eu-torbiaceae, Fabaceae, Fagaceae, Grossulariaceae, Juglandaceae, Lauraceae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Moraceae,
    5 Musaceae, Oleaceae, Oxalidaceae, Papaveraceae, Poaceae, Poligonaceae, Punicaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Sterculiaceae y Valerianaceae.
  9. 9.
    Metodo segun las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado porque el acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico son aislados de las plantas utiles en forma de sus aceites, lipidos o acidos grasos libres.
  10. 10.
    Metodo segun las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en las plantas utiles se introducen
    10 adicionalmente otros genes de biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos, elegidos de entre el grupo de acil-CoA-dehidrogenasa(s), acil-ACP[=proteina portadora de acilo]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), aciltransferasa(s) de acidos grasos, acil-CoAAlisofosfolipid-aciltransferasas, sintetasa(s) de acidos grasos, hidroxilasa(s) de acidos grasos, acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acil-coenzima A-oxidasa(s), desaturasa(s) de acidos grasos, acetilenasas de acidos grasos, lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasas, sintetasas de oxido de aleno, hidroperoxido
    15 liasas o elongasa(s) de acidos grasos.
  11. 11. Metodo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque los genes adicionales de biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos son elegidos de entre el grupo de las M-4-desaturasa, M-5-desaturasa, M-6-desaturasa, M8-desaturasa, M-9-desaturasa, M-12-desaturasa, M-6-elongasa o M-9-elongasa.
    Figura 1: Vectores empleados para la transformaci6n de plantas
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