UA122770C2 - Ліпід, що містить докозапентаєнову кислоту - Google Patents

Abstract

Винахід належить до екстрагованого рослинного ліпіду або мікробного ліпіду, що містить докозапентаєнову кислоту, і способів одержання екстрагованого ліпіду.

Description

(54) ЛІПІД, ЩО МІСТИТЬ ДОКОЗАПЕНТАЄНОВУ КИСЛОТУ (57) Реферат:

Винахід належить до екстрагованого рослинного ліпіду або мікробного ліпіду, що містить докозапентаєнову кислоту, і способів одержання екстрагованого ліпіду.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

Цей винахід відноситься до ліпіду, що містить докозапентаєнову кислоту, одержані із рослинних клітин або мікробних клітин, і способів одержання та застосування ліпіду.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Довголанцюгові омега-3 поліненасичені жирні кислоти (ДЛ-ПНЖК) на сьогоднішній день широко визнані як важливі сполуки для здоров'я людини і тварин. Вказані жирні кислоти можуть бути одержані з харчових джерел або шляхом перетворення лінолевої (ЛК, 18:26) або а- ліноленової (АЛК, 18:3003) жирних кислот, обидві з яких розглядаються як незамінні жирні кислоти в раціоні людини. Хоча людина і багато інших хребетних тварин можуть перетворювати

ЛК або АЛК, одержані з рослинних джерел, на С22, вони здійснюють таке перетворення з дуже низькою швидкістю. Крім того, більшості сучасних суспільств властиве незбалансоване харчування, в якому щонайменше 90 95 поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) складають об жирні кислоти, замість співвідношення 4:1 або менше для 0б:03 жирних кислот, яке вважається ідеальним (Тгацїмеїй, 2001). Безпосереднім харчовим джерелом ДЛ-ПНЖК, наприклад, ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК, 20:5053), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і докозагексаєнової кислоти (ДГК, 22:603) для людини, в основному, є риба або риб'ячий жир. Таким чином, медичні працівники рекомендують регулярно включати рибу до раціону людини, що містить значні рівні

ДЛ-ПНЖК. Все частіше ДЛ-ПНЖК, одержані з риб'ячого жиру, вводять, наприклад, в харчові продукти і дитяче харчування. Однак за рахунок зменшення глобального і національного вилову риби, необхідні альтернативні джерела вказаних жирів, що проявляють позитивний вплив на здоров'я.

Квіткові рослини, на противагу тваринам, не володіють здатністю синтезувати поліненасичені жирні кислоти з довжиною ланцюга більше 18 атомів вуглецю. Зокрема, культивовані і садові рослини разом з іншими покритонасінними не мають ферментів, необхідних для синтезу 03 жирних кислот з довшим ланцюгом, наприклад, ЕПК, докозапентаєнової кислоти (ДПК, 22:53) і ДГК, одержаних з АЛК. Важливою метою в біотехнології рослин, таким чином, є створення культивованих рослин, що продукують значні кількості ДЛ-ПНЖК, таким чином забезпечуючи альтернативне джерело цих сполук.

Шляхи біосинтезу ДЛА-ПНЖК

Біосинтез ДЛ-ПНЖК в організмах, таких як мікроводорості, мохи і гриби, звичайно відбувається як серія реакцій кисень-залежної десатурації і елонгації (Фіг. 1). Найпоширеніший шлях одержання ЕПК у вказаних організмах включає АДб-десатурацію, Дб-елонгацію і Д5Ь- десатурацію (має назву шляху Лб-десатурації), тоді як в менш поширеному шляху використовується ЛОУ-елонгація, ДЛ8-десатурація і Д5-десатурація (має назву шляху Дое- десатурації). Вказані послідовні реакції десатурації і елонгації можуть починатися із субстрату 0б жирної кислоти ЛК, схематично проілюстрованого у верхній лівій частині Фіг. 1 (06) або субстрату 03 АЛК до ЕПК, проілюстрованого на нижній правій частині Фіг. 1 (03). Якщо початкова Дб-десатурація здійснюється на субстраті 06 ЛК, продукт серії із трьох ферментів

ДЛ-ПНЖК буде 06 жирною арахідоновою кислотою (АРК). Організми, які синтезують ДЛ-ПНЖК, можуть перетворювати 06 жирні кислоти на 03 жирні кислоти з використанням 03-десатурази, що проілюстровано як стадія А17-десатурази на Фіг. 1, для перетворення арахідонової кислоти (АРК, 20:406) на ЕПК. Деякі члени родини о3-десатурази можуть впливати на різні субстрати, що варіюють від ЛК до АРК. Рослинні 0З3-десатурази часто специфічно каталізують А15- десатурацію ЛК до АЛК, тоді як грибкові і дріжджові 3-десатурази можуть бути специфічними по відношенню до А17-десатурації АРК до ЕПК (Регеїга еї аї., 2004а; 7апк еї аї., 2005). Деякі звіти наводять на думку про те, що можуть існувати неспецифічні 03-десатурази, здатні перетворювати широкий спектр об субстратів на відповідні 03 продукти (2Папо еї аї., 2008).

Перетворення ЕПК на ДГК в таких організмах відбувається шляхом Д5-елонгації ЕПК з утворенням ДПК, після чого слідує Д4-десатурація з утворенням ДГК (Фіг. 1). І навпаки, ссавці використовують так званий шлях "Шпрехера", в якому ДПК перетворюється на ДГК в ході трьох окремих реакцій, незалежних від Д4-десатурази (Зргеспег еї аї., 1995).

Фронт-енд десатурази, загалом знайдені в рослинах, мохах, мікроводоростях і нижчих тваринах, наприклад, Саепогпабраїйїіх еіеєдап5, в основному приймають субстрати жирних кислот, естерифікованих в положенні 5п-2 фосфатидилхолінового (ФХ) субстрату. Вказані десатурази, таким чином, відомі як ацил-ФХ, зв'язані з ліпідом, фронт-енд десатурази (Ботегдиеєе еї аї., 2003). | навпаки, фронт-енд десатурази вищих тварин загалом приймають субстрати ацил-КоА, де жирнокислотний субстрат зв'язаний з КоА замість ФХ (Юотегоце еї аї., 2005). Відомо, що деякі десатурази мікроводоростей і одна рослинна десатураза використовують жирнокислотні субстрати, естерифіковані до КоА (Табл. 2).

Кожна реакція елонгації ПНЖК складається з чотирьох стадій, що каталізуються багатокомпонентним білковим комплексом: спочатку, реакція конденсації приводить до додавання модуля 2С з малоніл-КоОА до жирної кислоти, результатом чого є утворення рД- кетоацильної проміжної сполуки. Далі вона відновлюється НАДФ-Н, з подальшою дегідратацією і утворенням єноїльної проміжної сполуки. Вкінці ця проміжна сполука повторно відновлюється з утворенням подовженої жирної кислоти. Загалом, вважається, що стадія конденсації в числі вказаних чотирьох реакцій є специфічною для субстрату, а інші стадії -- ні. На практиці це означає, що природний апарат елонгації рослини здатний до елонгації ПНЖК, за умови, що введений конденсаційний фермент (звичайно під назвою «елонгаза»), специфічний по відношенню до ПНЖК, хоча ефективність природного апарату елонгації рослини з точки зору елонгації неприродних субстратів ПНЖК може бути низькою. У 2007 році була опублікована інформація щодо ідентифікації та опису циклу елонгації дегідратази дріжджів (Оепіс і Ууеіє5тап, 2007).

Десатурація ПНЖК в рослинах, мохах і мікроводоростях природним чином відбувається на жирнокислотних субстратах, в основному, в пулі ацил-ФХ, тоді як елонгація відбувається на субстратах в пулі ацил-КоА. Перенесення жирних кислот від молекул ацил-ФХ до носія КоА здійснюється фосфоліпазами (ФЛА), тоді як перенесення жирних кислот ацил-КоА до носія ФХ здійснюється лізофосфатидил-холін ацилтрансферазами (ЛФХАТ) (5іпоп еї аї., 2005).

Сконструйоване продукування ДЛ-ПНЖК

Велика частина метаболічного конструювання ДЛ-ПНЖК здійснювалася з використанням аеробного шляху Дб-десатурація/елонгація. Про біосинтез у-ліноленової кислоти (ГЛК, 18:306) в тютюні з використанням Аб-десатурази із ціанобактерії Зупеспосувіїх вперше повідомлялося в 1996 році (Кедау ї Тпотав, 1996). Пізніше, ГЛК була одержана в культивованих рослинах, таких як сафлор (73 95 ГЛК в олії з насіння; УМО 2006/127789). Продукування ДЛ-ПНЖК, наприклад,

ЕПК ї ДГК, включає складніше конструювання за рахунок збільшення кількості залучених стадій десатурації та елонгації. Про продукування ЕПК в наземній рослині вперше повідомлялося ОС) еї а!. (2004), які ввели гени, що кодують Ле9-елонгазу з Ізоспгузіз даІрапа, Ав-десатуразу з Еидієпа дгасіїї і А5-десатуразу з МогііегеПа аїІріпа в Агабідорзіз з одержанням до З 95 ЕПК. Ця робота була продовжена АбБбаді еї аї. (2004), які повідомляли про продукування до 0,8 95 ЕПК в насінні

Зо льону з використанням генів, що кодують Дб-десатуразу і Дб-елонгазу з РпузсоптіїгеПа раїепз і д5-десатуразу з Рпаєодасіуйт ісогпишт.

Перший звіт про одержання ДДЛ-ДГК у УМО 04/017467, в якій розкрито продукування З 9о

ДГК у зародках сої, але не насінні, шляхом введення генів, що кодують АДб-десатуразу заргоїєдпіа даісіїпа, АДб-десатуразу МогіегеПйа аїріпа, А5-десатуразу МогііегейМйа аїріпа, да- десатуразу ЗаргоїІеодпіа адісіїпа, А17-десатуразу ЗаргоЇІедпіа аїісіїпа, Аб-елонгазу МогііегеїІа аІріпа та Д5-елонгазу Раміома Ішїпегі. Максимальний рівень ЕПК в ембріонах, які також продукують

ДГК, становив 19,6 95, вказуючи на низьку ефективність перетворення ЕПК на ДГК (М/О 2004/071467). Це відкриття було подобнім до опублікованого Кобегі еї аІ. (2005), де вихід перетворення ЕПК на ДГК був низьким, з продукуванням З 95 ЕПК і 0,5 95 ДГК в Агабідаорвів з використанням Д5Б/б-десатурази Вапіо гегіо, Аб-елонгази Саєепогпарай5 еІєдапв та Д5-елонгази і

Дда-десатурази Раміома заїїпа. Крім того, в 2005 році УМи єї аІ. опублікували повідомлення щодо продукування 25 95 АРК, 15 95 ЕПК і 1,5 95 ДГК у Вгазвзіса |ипсеа з використанням лЛб-десатурази

РуїШішт ітедиіаге, Д5-десатурази ТПгаивіоспуїгій, Дб-елонгази РПузсотійгеПйа раїеп5, А12- десатурази Саїепаціа опйісіпаї5, Д5-елонгази ТПгаизіоспуїгій, А17-десатурази Рпуорпїпога іптезіап5, елонгази ДДЦ-ПНЖК Опсогпупсиз тукКіз5, Л4-десатурази Тигаивіоспуйній ії ЛФХАТ

Тигаивіоспуїтій (Уи еї аіІ., 2005). Короткий опис зусиль з одержання врожаю насіння олійних культур, яке синтезує 03 ДЛ-ПНЖК, наведений у Мепедаз-Саїегоп еї а. (2010) ії Киї2-І оре? еї аї. (2012). Як вказано Еці-І оре; еї аї. (2012), на дату публікації результати з одержання ДГК у трансгенних рослинах навіть віддалено не нагадують рівнів, що спостерігаються в риб'ячому жирі. Пізніше, Реїгіе єї а! (2012) повідомляли про продукування близько 15 95 ДГК в насінні

Агарідорзів ІПаїйапа, та у М/О2013/185184 повідомлялося про продукування деяких олій з насіння, що містили від 7 96 до 20 95 ДГК. Однак, не існує повідомлень щодо продукування рослинних олій, які містили б більше 20 95 ДГК.

Не існує повідомлень щодо продукування ДПК у рекомбінантних клітинах із значущими рівнями без супутнього продукування ДГК. Насправді, авторам даного винаходу невідомо про будь-яку опубліковану навідну думку або ідею продукування ДПК у рекомбінантних клітинах без продукування ДГК.

Таким чином, залишається потреба в ефективнішому продукуванні ДЛ-ПНЖК в рекомбінантних клітинах, зокрема ДПК у насінні рослин олійних культур. 60 КОРОТКИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ

Деякі організми продукують масло із вмістом ДПК більш ніж 1-2 95 і, таким чином, існують обмежені можливості продукування ДПК у великих масштабах в природних джерелах, якщо вони взагалі існують. Авторами даного винаходу ідентифіковані способи і рослини для продукування ліпіду з набагато вищими рівнями ДПК, ніж у природних джерелах.

В першому аспекті винаходу пропонується екстрагований ліпід, переважно екстрагований рослинний ліпід або екстрагований мікробний ліпід, що містить жирні кислот в естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозапентаєнову кислоту (ДПК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), і, при цьому, рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 7 95 до 35 95. У варіантах реалізації даного аспекту, рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить близько 7 95, близько 8 905, близько 9 95, близько 10 95, близько 12 95, близько 15 95, близько 18 95, близько 20 95, близько 22 95, близько 24 95, близько 26 95, близько 28 95, близько 30 95, від близько 7 95 до близько 28 до, від близько 7 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до 35 95, від близько 10 95 до близько 30 до, від близько 10 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до близько 22 95, від близько 14 95 до 35 до, від близько 16 95 до 35 95, від близько 16 95 до близько 30 95, від близько 16 95 до близько 25 до або від близько 16 95 до близько 22 95.

У варіанті реалізації згаданого вище аспекту ДГК присутня на рівні менш ніж 2 95 або менш ніж 0,5 95 від загального вмісту жирних кислот екстрагованого ліпіду і, більш переважно, відсутня у загальному вмісті жирних кислот ліпіду.

В іншому аспекті винаходу пропонується екстрагований ліпід, переважно екстрагований рослинний ліпід або екстрагований мікробний ліпід, що містить жирні кислоти у естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають докозапентаєнову кислоту (ДПК), ії, при цьому, щонайменше 35 95 ДПК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковані в положенні 5п-2 ТАГ. У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід додатково має одну або більше або всі ознаками з (ї) він містить жирні кислоти, включаючи олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні

Зо кислоти, які включають са-ліноленову кислоту (АЛК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), (її) щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 45 95, щонайменше близько 48 95, від 35 95 до близько 60 95 або від 35 95 до близько 50 95 ДГК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковані в положенні 51-2 ТАГ, і (ії) рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1 95 до 35 95, або від близько 7

Фо до 35 95 або від близько 20,1 95 до 35 95. У варіантах реалізації даного аспекту рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить близько 7 95, близько 8 905, близько 9 95, близько 10 95, близько 12 95, близько 15 95, близько 18 95, близько 20 95, близько 22 9, близько 24 95, близько 26 95, близько 28 95, близько 30 95, від близько 7 95 до близько 28

Фо, від близько 7 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до 35 95, від близько 10 95 до близько 30 до, від близько 10 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до близько 22 95, від близько 14 95 до 35 до, від близько 16 95 до 35 95, від близько 16 95 до близько 30 95, від близько 16 95 до близько 25

Фо або від близько 16 95 до близько 22 95. У переважних варіантах реалізації винаходу екстрагований ліпід володіє ознаками (Її) і (ії), (І) (ії) або (ії) і (ії), переважніше, все з (Її), (ії) і (ії).

Переважно, екстрагований ліпід додатково характеризується рівнем пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, що становить від близько 2 95 до 16 95, і, при цьому, рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, якщо вона присутня, становить менше 1 95.

Варіанти реалізації кожного із описаних вище аспектів детальніше розкриті нижче. Як буде зрозуміло кваліфікованому фахівцю, будь-які з ознак описаного варіанта реалізації винаходу, які є ширшими за відповідної ознаки у згаданому вище аспекті, не застосовуються до даного аспекту.

У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід володіє однією або більше із наступних ознак: ї) рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 2 95 до 18 905, від близько 2 95 до 16 95, від близько 2 95 до 15 95 або від близько З 95 до близько 10 95, і) рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 6 95, менше З 95, менше 2 95, менше 1 95 або близько 0,1 95,

ії) рівень олеїнової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1 95 до близько 30 95, від близько З 95 до близько 30 95, від близько 6 95 до близько 30 905, від 1 95 до близько 20 95, від близько 30 95 до близько 60 95, від близько 45 905 до близько 60 95, близько 30 95 або від близько 15 95 до близько 30 905, їм) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 35 905, від близько 4 95 до близько 20 95, від близько 4 95 до близько 17 95 або від близько 5 95 до 10 95, м) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 40 95, від близько 7 9о до близько 40 95, від близько

10 95 до близько 35 95, від близько 20 95 до близько 35 95, від близько 4 95 до близько 16 95 або від близько 2 95 до близько 16 905, мі) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж близько 4 95, менше, ніж близько З 95, менше, ніж близько 2 95, менше, ніж близько 1 95, менше, ніж близько 0,5 905, від 0,05 95 до близько 7 905, від 0,05 95 до близько 4 95, від 0,05 95 до близько З 95 або від 0,05 95 до близько 2 95,

мії) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж близько 10 95, менше, ніж близько 8 95, менше, ніж близько 7 95, менше, ніж близько 6 95, менше, ніж близько 4 95, менше, ніж близько З 95, від близько 0,05 95 до близько 7 95, від близько 0,05 95 до близько 6 95, від близько 0,05 95 до близько 4 95, від близько

0,05 95 до близько З 95, від близько 0,05 95 до близько 10 95, або від 0,05 95 до близько 2 95,

мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж близько 6 95, менше, ніж близько 5 95, менше, ніж близько 4 95, менше, ніж близько 1 95, менше, ніж близько 0,5 905, від 0,05 95 до близько 6 95, від 0,05 95 до близько 5 905, від 0,05 95 до близько 4 95, від 0,05 95 до близько З 95 або від 0,05 95 до близько 2 95,

їх) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТРрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 95, менше, ніж 2 95, менше, ніж близько 1 95, від 0,05 95 до 4 95, від 0,05 95 до З 95 або від 0,05 95 до близько 2 95 або від 0,05 95 до близько 1 95,

х) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 15 95 менше, ніж 4 956, менше, ніж близько З 95, менше, ніж близько 2 95, від 0,05 95 до 10 905, від 0,05 95 до 5 95, від 0,05 95 до З 95 або від 0,05 95 до 2 95,

хі) ліпід містить Фб-докозапентаєнову кислоту (22:5245710,и13и16) серед жирних кислот, що містяться в ньому,

хії) ліпід містить менше 0,1 95 0б-докозапентаєнової кислоти (22:5А710и1316) серед жирних кислот, що містяться в ньому,

хіїї) ліпід містить менше 0,1 95 однієї або більш або всіх із СДК, ЕПК і ЕТК серед жирних кислот, що містяться в ньому, хім) рівень загальних насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 25 95, від близько 4 95 до близько 20 до, від близько 6 95 до близько 20 95 або від близько 6 95 до близько 12 905,

хм) рівень загальних мононенасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 40 95, від близько 4 95 до близько 35 до, від близько 8 95 до близько 25 905, від 8 95 до близько 22 905, від близько 15 95 до близько 40 95 або від близько 15 95 до близько 35 95,

хмі) рівень загальних поліненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20 95 до близько 75 95, від близько 30 95 до близько 75 95, від близько 50 95 до близько 75 95, близько 60 905, близько 65 95, близько 70 95, близько 75 до або від близько 60 95 до близько 75 9б,

хмії) рівень загальних 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 35 95 до близько 50 95, від близько 20 95 до близько 35 95, від близько 6 95 до 20 95, менше, ніж 20 95, менше, ніж близько 16 95, менше, ніж близько 10 95, від близько 1 95 до близько 16 95, від близько 2 95 до близько 10 95 або від близько 4 95 до близько 10 95,

хмії) рівень нових ф0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж близько 10 95, менше, ніж близько 8 95, менше, ніж близько 6 95, менше, ніж 4 95, від близько 1 95 до близько 20 95, від близько 1 95 до близько 10 905, від 0,5 95 до близько 8 95 або від близько 0,5 95 до 4 95,

хіх) рівень загальних 003 жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого 60 ліпіду становить від 36 95 до близько 65 95, від 36 95 до близько 70 95, від близько 40 95 до близько 60 95, від близько 30 95 до близько 60 905, від близько 35 95 до близько 60 905, від 40 95 до близько 65 95, від близько 30 95 до близько 65 95, від близько 35 95 до близько 65 95, близько 35 до, близько 40 95, близько 45 95, близько 50 95, близько 55 95, близько 60 95, близько 65 95 або близько 70 95, хх) рівень нових 0)! жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 21 95 до близько 45 95, від 21 95 до близько 45 905, від близько 23 95 до близько 35 до, від близько 25 95 до близько 35 95, від близько 27 95 до близько 35 95, близько 23 95, близько 25 95, близько 27 95, близько 30 95, близько 34 95, близько 40 95 або близько 45 95, ххі) співвідношення загальних б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1,0 до близько 3,0, від близько 0,1 до близько 1, від близько 0,1 до близько 0,5, менше, ніж близько 0,50, менше, ніж близько 0,40, менше, ніж близько 0,30, менше, ніж близько 0,20, менше, ніж близько 0,15, близько 1,0, близько 0,1, від близько 0,1 до близько 0,4 або близько 0,2, ххії) співвідношення нових 0б жирних кислот : нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1,0 до близько 3,0, від близько 0,02 до близько 0,1, від близько 0,1 до близько 1, від близько 0,1 до близько 1, від близько 0,1 до близько 0,5, менше, ніж близько 0,50, менше, ніж близько 0,40, менше, ніж близько 0,30, менше, ніж близько 0,20, менше, ніж близько 0,15, близько 0,1, близько 0,2 або близько 1,0, ххіїї) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією Д12-десатурази щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 905, щонайменше близько 80 95, від близько 60 95 до близько 98 95, від близько 70 95 до близько 95 до або від близько 75 95 до близько 90 9б, ххім) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на СДК під дією Дб-десатурази щонайменше близько 30 95, щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 50 95, щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, від близько 30 95 до близько 70 95, від близько 35 95 до близько 60 95 або від близько 50 95 до близько 70 905, ххм) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення СДК на кислоту

ЕТК під дією Дб-елонгази щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 75 95, від близько 60 95 до близько 95 905, від близько 70 95 до близько 88 95 або від

Зо близько 75 95 до близько 85 95, ххмі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕТК на ЕПК під дією Д5-десатурази щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 75 95, від близько 60 95 до близько 99 905, від близько 70 95 до близько 99 95 або від близько 75 95 до близько 98 95, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 85 95, щонайменше близько 90 95, від близько 50 95 до близько 99 95 або від близько 85 95 до близько 99 95, від близько 50 95 до близько 95 95 або від близько 85 95 до близько 95 95, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДПК щонайменше близько 10 95, щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 965, щонайменше близько 25 95, близько 20 95, близько 25 95, близько 30 95, від близько 10 905 до близько 50 95, від близько 10 95 до близько 30 95, від близько 10 95 до близько 25 95 або від близько 20 95 до близько 30 905, ххіх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДПК щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 22 95, щонайменше близько 25 95, щонайменше близько 30 95, щонайменше близько 40 95, близько 25 до, близько 30 95, близько 35 95, близько 40 95, близько 45 95, близько 50 95, від близько 15 95 до близько 50 95, від близько 20 95 до близько 40 95 або від близько 20 95 до близько 30 905, ххх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДПК

БО щонайменше близько 17 956, щонайменше близько 22 95, щонайменше близько 24 95, щонайменше близько 30 95, близько 30 95, близько 35 95, близько 40 95, близько 45 95, близько 95, близько 55 95, близько 60 95, від близько 22 956 до близько 70 95, від близько 17 95 до близько 55 95, від близько 22 95 до близько 40 95 або від близько 24 95 до близько 40 9б5, хххі) загальні жирні кислоти у екстрагованому ліпіді містять менш ніж 1,5 96 С20:1, менш ніж 1 95 С20:1 або близько 1 95 С20:1, хххії) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) у ліпіді становить щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, щонайменше 95 95, від близько 70 95 до близько 99 95 або від близько 90 95 до близько 99 905, хххії) ліпід містить диацилгліцерол (ДАГ), причому ДАГ переважно містить ДПК,

хххім) ліпід містить менш ніж близько 10 95, менш ніж близько 5 95, менш ніж близько 1 95 або від близько 0,001 95 до близько 5 95 вільних (неестерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду, або по суті не містить їх, хххм) щонайменше 70 95, щонайменше 72 95 або щонайменше 80 95 естерифікованої ДПК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, хххмї) найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДПК, у ліпіді є ДПК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), ліпід, що містить три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:18), і хххмії) рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить близько 7 95, близько 8 95, близько 9 95, близько 10 95, близько 12 905, близько 15 95, близько 18 до, близько 20 95, близько 22 95, близько 24 95, близько 26 95, близько 28 95, близько 31 95, від близько 7 95 до близько 31 95, від близько 7 906 до близько 28 95, від близько 10 95 до 35 95, від близько 10 95 до близько 30 95, від близько 10 95 до близько 25 905, від близько 10 95 до близько 22 9Уо, від близько 14 95 до 35 95, від близько 16 95 до 35 95, від близько 16 95 до близько 30 905, від близько 16 95 до близько 25 95, або від близько 16 95 до близько 22 95, причому рівень ДГК необов'язково становить менш ніж 0,5 95 від загального вмісту жирних кислот екстрагованого ліпіду.

В іншому варіанті реалізації екстрагований ліпід володіє однією або більше із наступних ознак: ї) рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 2 95 до 15 905, і) рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить близько 0,1 95, ії) рівень олеїнової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 1 95 до 30 95, їм) рівень лінолевої кислоти (ЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 4 95 до 20 905, м) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 4 95 до 40 905, мі) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 0,05 90 до 7 95, мії) рівень стеаридонової кислоти (СДК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 0,05 95 до 10 95, мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить менш ніж 6 95, їх) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕтрК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить менш ніж 4 95, х) екстрагований рослинний ліпід містить менш ніж 0,1 956 0б-докозапентаєнової кислоти (22:5Д4,7,10,13,16) серед жирних кислот, що містяться в ньому, хі) рівень нових 0б жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить менш ніж 10 905, хії) співвідношення загального вмісту 06 жирних кислот: загального вмісту 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 1,0 до 3,0 або від 0,1 до 1, хії) співвідношення нових б жирних кислот : нових 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 1,0 до 3,0, від 0,02 до 0,1 або від 0,1 до 1, хім) склад жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДПК щонайменше 10 95, хм) склад жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДПК щонайменше 15 95, хмі) склад жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДПК щонайменше 17 965, хмії) загальні жирні кислоти у екстрагованому рослинному ліпіді містять менш ніж 1,5 95

С2071, і хмії) вміст триацилгліцеролів (ТАГ) екстрагованого рослинного ліпіду становить щонайменше 70 905, і може характеризуватися однією або більше із наступних ознак хіх) екстрагований рослинний ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ),, який містить ДПК, хх) екстрагований рослинний ліпід містить менш ніж 10 95 вільних (неетерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду або по суті не містить їх,

ххі) щонайменше 70 95 ДПК, естерифікованої у формі ТАГ, знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, ххії) найбільш розповсюджені ДПК-вмісні види ТАГ в екстрагованому рослинному ліпіді являють собою ДПК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), і ххії) екстрагований рослинний ліпід містить три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:18).

У варіанті реалізації рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 0,05 95 до 10 95.

У подальшому варіанті реалізації рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить менш ніж 2 95, переважно менш ніж 1 95 або від 0,1

Фо до 2 95, більш переважно, вона не визначається. Переважно, рослина або її частина, така як насіння, або мікробна клітина не містить полінуклеотиду, що кодує Д4-десатуразу, або не містить поліпептиду Л4-десатурази. В іншому варіанті реалізації екстрагований ліпід знаходиться у формі олії, причому ліпід складає щонайменше близько 90 95, щонайменше близько 95 95, щонайменше близько 98 95 або від близько 95 95 до близько 98 95 мас. олії.

Переважно, екстрагований ліпід є ліпідом з олії насіння виду Вгаззіса або ліпідом 3 олії насіння Сатеїнпа заїїма.

У переважному варіанті реалізації першого аспекту винаходу вище ліпід або олія, переважно олія з насіння, більш переважно, олія з насіння виду Вгаб5іса або олія з насіння

Сатвеїйна заїїма, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень ДПК становить від близько 7 90 до 30 95 або від 7 95 до 35 95, рівень пальмітинової кислоти становить від близько 2 95 до близько 16 95, рівень міристинової кислоти становить менш ніж 1 95, рівень олеїнової кислоти становить від 1 95 до близько 30 95, рівень ЛК становить від близько 4 95 до близько 35 95, АЛК присутня, рівень загальних насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 25 до, співвідношення загального вмісту 0б жирних кислот : загального вмісту Фф3 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 0,05 до близько 3,0, і вміст триацилгліцеролів (ТАГ), у ліпіді становить щонайменше близько 70 95, і необов'язково ліпід по суті не містить від холестерину, та/або ліпід містить три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15). Більш переважно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, додатково має одну або більше або всі із наступних

Зо ознак: щонайменше 70 95 ДПК естерифіковано у положенні 5п-1 або 5-3 триацилгліцеролу (ТАГ), АЛК присутня на рівні від 4 95 до 40 95 від загального вмісту жирних кислот, ГЛК присутня та/або рівень ГЛК становить менш ніж 4 95 від загального вмісту жирних кислот, рівень СДК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень ЕТК становить менш ніж близько 4 95, рівень ЕПК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень загальних мононенасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 35 до, рівень загальних поліненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20 95 до близько 75 95, співвідношення нових (006 жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 0,03 до близько 3,0, переважно менш ніж близько 0,50, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією А12-десатурази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення СДК на ЕТК кислоту під дією Дб- елонгази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5- елонгази від близько 50 95 до близько 95 95, і ефективності перетворення олеїнової кислоти на

ДПК щонайменше близько 10 95. Найбільш переважно, щонайменше 81 95 ДПК естерифіковано у положенні 5п-1 або 5п-3 триацилгліцеролу (ТАГ).

В іншому переважному варіанті реалізації описаного вище другого аспекту винаходу, ліпід або олія, переважно олія з насіння, більш переважно, олія з насіння виду Вгазвзіса або олія з насіння Сатеїїпа заїїма, що містить ДПК, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень пальмітинової кислоти становить від близько 2 95 до близько 16 95, рівень міристинової кислоти становить менш ніж 1 95, рівень олеїнової кислоти становить від близько 1 95 до близько 30 95, рівень ЛК становить від близько 4 95 до близько 35

Уо, АЛК присутня, загальний рівень насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 25 95, співвідношення загального вмісту б жирних кислот : загального вмісту 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 0,05 до близько 3,0, вміст триацилгліцеролів (ТАГ, ліпіду становить щонайменше близько 70 95, і необов'язково ліпід містить три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15), причому щонайменше 35 95 ДПК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано в положенні 5п-2 ТАГ. Більш переважно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, додатково має одну або більше або всі із наступних ознак: АЛК присутня на рівні від 4 бо Фо до 40 95 від загального вмісту жирних кислот, ГЛК присутня, та/або рівень ГЛК становить менш ніж 4 95 від загального вмісту жирних кислот, рівень СДК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень ЕТК становить менш ніж близько 4 95, рівень ЕПК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень загальних мононенасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 35 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20 95 до близько 75 95, співвідношення нових б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 0,03 до близько 3,0, переважно менш ніж близько 0,50, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією А12-десатурази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення СДК на кислоту ЕТК під дією Дб-елонгази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази від близько 50 95 до близько 95 95, ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДПК щонайменше близько 10 95.

В контексті екстрагованого ліпіду або олії за винаходом, у варіанті реалізації винаходу рівень ДПК у екстрагованому ліпіді або олії не підвищений або є істотною мірою таким же, як рівень ДПК в ліпіді або олії частини рослини або мікроба до екстракції. Іншими словами, після екстракції не проводилося процедур для підвищення рівня ДПК у ліпіді або олії відносно інших жирних кислот. Як буде очевидно, ліпід або олія в подальшому можуть бути оброблені фракціонуванням або іншими методами, з метою модифікації складу жирних кислот.

У іншому переважному варіанті реалізації ліпід або олія, переважно олія з насіння і, більш переважно, олія з насіння Вгазвіса, така як гірчична олія або рапсова олія або олія з насіння С. займа, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень

ДПК становить від близько 7 95 до 35 95, рівень пальмітинової кислоти становить від близько 2

Фо до близько 16 95, рівень міристинової кислоти становить менш ніж близько 6 95 і переважно менш ніж 1 95, рівень олеїнової кислоти становить від близько 1 95 до близько 30 95, рівень ЛК становить від близько 4 95 до близько 35 95, АЛК присутня, рівень СДК становить від близько 0,05 95 до близько 10 95, рівень ЕТК становить менш ніж близько 6 95, рівень ЕПК становить від близько 0,05 95 до близько 10 95. ДГК визначається або, переважно, не визначається в ліпіді або олії. Переважно, ДГК, якщо вона присутня, присутня на рівні не більше ніж 2 95 або не більше ніж 0,5 95 від загального вмісту жирних кислот в ліпіді або олії і, більш переважно, відсутня у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії. Необов'язково, ліпід по суті не містить холестерину та/або ліпід містить три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15). Більш переважно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, додатково має одну або більше або всі із наступних ознак: щонайменше 70 95 ДПК естерифіковано в положенні 5п-1 або 5п-3 триацилгліцеролу (ТАГ), АЛК присутня на рівні від 4 95 до 40 95 від загального вмісту жирних кислот, ГЛК присутня та/або рівень ГЛК становить менш ніж 4 95 від загального вмісту жирних кислот, рівень СДК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень ЕТК становить менш ніж близько 4 95, рівень ЕПК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень загальних ненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 35 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20 95 до близько 75 95, співвідношення нових 0б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 0,03 до близько 3,0, переважно менш ніж близько 0,50, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією А12-десатурази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення СДК на ЕТК кислоту під дією Аб-елонгази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази від близько 50 95 до близько 95 95 та ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДПК щонайменше близько 10 95. У варіанті реалізації щонайменше 81 95 ДПК естерифіковано у положенні 5п-1 або 5п-3 триацилгліцеролу (ТАГ). Як альтернатива, щонайменше 35 95 ДПК, естерифікованої у формі ТАГ, естерифіковано у положенні 5п-2 ТАГ.

В подальшому варіанті реалізації екстрагований ліпід за винаходом додатково містить один або більше стеролів, переважно рослинних стеролів.

В іншому варіанті реалізації екстрагований ліпід знаходиться у формі олії і містить менш ніж близько 10 мг стеролів/г олії, менш ніж близько 7 мг стеролів/г олії, від близько 1,5 мг до близько 10 мг стеролів/г олії або від близько 1,5 мг до близько 7 мг стеролів/г олії.

Приклади стеролів, які можуть бути присутні у екстрагованому ліпіді, включають, не обов'язково обмежуючись ними, один або більше або всі з наступного: кампестрол/24- метилхолестерин, Д5-стигмастерол, ебурикол, ДВ-ситостерол/24-етилхолестерин, /-(Д5- авенастерол/ізофукостеролі ПА7-стигмастерол/стигмаст-7-ен-3р-ол і Д7-авенастерол.

У варіанті реалізації вид рослини є одним із наведених у Табл. 11, наприклад, рапс, і рівень стеролів є близько таким же, як наведений у Табл. 11 для даного конкретного виду рослин.

Види рослин можуть являти собою В. парив, гірчицю (В. |ппсеа) або б. заїма і містять рівень стеролів, близький до знайденого в екстрагованій олії гірчиці дикого типу В. парив, гірчиці або б. займа, відповідно.

У варіанті реалізації екстрагований рослинний ліпід містить один або більше або всі з кампаостеролу/24-метилхолестерину, д5-стигмастеролу, ебуриколу, В-ситостеролу/24- етилхолестерину, Д5-авенастеролу/зофукостеролу, Д7-стигмастеролу/стигмаст-7-ен-Зр-олу і д7-авенастеролу, або містить рівень стеролів, по суті такий же, як в олії рапсу дикого типу.

У варіанті реалізації екстрагований ліпід містить рівень стеролів, по суті такий же, як в олії рапсу, гірчичній олії або олії С. займа дикого типу.

У варіанті реалізації екстрагований ліпід містить менш ніж близько 0,5 мг холестерину/г олії, менш ніж близько 0,25 мг холестерину/г олії, від близько 0 мг до близько 0,5 мг холестерину/г олії або від близько 0 мг до близько 0,25 мг холестерину/г олії або по суті не містить холестерину.

У подальшому варіанті реалізації ліпід є олію, переважно олію з олійної культури. Приклади таких олій включають, без обмеження, олію виду Вгаз55іса, наприклад, олію рапсу або олію гірчиці, олію сзо55урішт Ппігешщит, олію Гіпит изнасвзвітит, олію виду НеїЇапіпив5, олію Сагпатив

Мпеїогій5, олію СіІусіпе тах, олію 7еа тау»х, олію Агарідорзі5 (паІапа, олію Богопит брісоог, олію зогопит мцідаге, олію Амепа заїїма, олію виду ТиоїЇїШт, олію ЕІаевзіб5 диїпеепі5, олію Місопбапа

Брепіпатіапа, олію Ногдешт миідаге, олію Гиріпи5 апдивбійоїйш5, олію Огуа заїїма, олію Огуа дЧіабегтіта, олію Сатеїйпа з5аїїма, олію Статбре абузвіпіса, олію Мізсапіпих5 х дідапіви5 або олію

Мібсапійи5 5іпепзіх5. Більш переважно, олія являє собою олію виду Вгазвзіса, олію Сатвіїпа займа або олію Сіусіпе тах (сої). У варіанті реалізації ліпід містить або являє собою олію виду

Вгаззіса, таку як олія Вгаззіса пари5 або олія Вгаз5зіса |їнпсєа, олія Со55урішт Нітвшит, олія

Мпит ивзйаїіззітит, олія виду Неїапіпи5, олія Санпатив іпсіогій5, олія Сіусіпе тах, олія 7еа тауз, олія ЕІаевіз диіпеепів, олія Місоїапа репінатіапа,, олія І иріпи5 апдивійоїїШв5, олія Сатеїїпа займа, олія Статре абрузвзіпіса, олія Мізсапіпиз х дідапівиє або олія Мізсапіпив5 віпепвів. В подальшому варіанті реалізації олія являє собою олію рапсу, олію гірчиці (В. |шпсеєа), олію сої

Зо (СІусіпе тах), олію Сатеїйпа займа або олію Агабрідорзі5 Інайапа. В альтернативному варіанті реалізації олія являє собою рослинну олію, крім олії А. (йаійапа та/або крім олії б. займа. У варіанті реалізації рослинна олія є олією, окрім олії б. тах (сої). У варіанті реалізації олія була одержана з рослини, вирощеної у стандартних умовах, наприклад, як описано у Прикладі 1, або з рослини, вирощеної в полі або в теплиці із стандартними умовами.

В подальшому аспекті даного винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду або мікробного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, переважно насіння Вгаззіса або насіння Сатеїпа заїїма, або мікробних клітин, що містять ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти в естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), Ф3 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозапентаєнову кислоту (ДПК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень ДПК в загальному вмісті жирних кислот ліпіду з частини рослини або мікробних клітин становить від близько 795 до 3595, і і) екстракцію ліпіду з частини рослини або мікробних клітин, причому рівень ДПК в загальному змісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 795 до 3595. У варіанті реалізації винаходу рівень ДПК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 795 до 2095 або від 20,195 до 3595. У варіанті реалізації винаходу рівень ДПК становить від 7 95 до 20 95 або від 20,1 95 до 30 95, переважно від 20,1 95 до 35 95, більш переважно, від 30 95 до 35 95. У варіанті реалізації винаходу рівень

ДПК в загальному змісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 8 95 до 20 95 або від 10 95 до 20 95, переважно від 11 95 до 20 95 або від 12 95 до 20 95.

У варіанті реалізації описаного вище аспекту винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду або мікробного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, переважно насіння Вгаззіса, насіння С. заїїма, або мікробних клітин, що містять ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, склад жирних кислот ліпіду включає олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, Фб жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозапентаєнову кислоту (ДПК), і одну або більше із стеаридонової кислоти бо (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що (Її)

рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 9о до 30 90 або від 7 95 до 35 95, переважно від 30 95 до 35 90, (ії) рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 16 Об, (ії) рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 696, переважно менш ніж 1 90, (ім) рівень олеїнової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 95 до ЗО 905, (м) рівень лінолевої кислоти (ЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 35 905, (мі) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40

Фо, (мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕтрК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 4 90, (мії) загальний рівень насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 25 905, (їх) співвідношення загального вмісту б жирних кислот : загального вмісту 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 0,05 і 1, (х) вміст триацилгліцеролів (ТАГ), ліпіду становить щонайменше 70 95, і (хі) щонайменше 70 95 ДПК, естерифікованої у формі ТАГ, знаходиться у положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, і і) екстракцію ліпіду із частини рослини, причому рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 7 95 до 30 95 або від 7 95 до 35 95, переважно від 30 95 до 35 95. Переважно, щонайменше 81 95 або щонайменше 90 95 ДПК, естерифікованої у формі ТАГ, знаходиться у положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ.

В іншому аспекті даного винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого ліпіду, який включає стадії: ї) одержання клітин, що містять ліпід, переважно частини рослини, що містить клітини, або мікробних клітин, більш переважно, насіння Вгазвзіса або насіння С. заїїма, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти включають докозапентаєнову кислоту (ДПК), притому, що щонайменше 35 95 ДПК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано у положенні 51-2 ТАГ, їі і) екстракцію ліпіду із клітин, причому щонайменше 35 95 ДПК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ),, у

Зо загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, естерифіковано у положенні 51-2 ТАГ. У варіанті реалізації екстрагований ліпід, одержаний за способом, додатково характеризується одним або більше або всіма із наступного: (ї) він містить жирні кислоти, що включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, ф0б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і необов'язково одну або більш із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), (її) щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 45 95, щонайменше близько 48 95, від 35 95 до близько 60 95 або від 35 95 до близько 50 95, ДПК, естерифіковано у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано у положенні 51-2 ТАГ, і (ії) рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1 95 до 35 95 або від близько 7

Фо до 35 95 або від близько 20,1 95 до 35 95. У варіантах реалізації даного аспекту рівень ДПК та/або ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить близько 7 95, близько 8 95, близько 9 95, близько 10 905, близько 12 95, близько 15 95, близько 18 95, близько 20 до, близько 22 95, близько 24 95, близько 26 905, близько 28 95, близько 30 95, від близько 7 95 до близько 28 95, від близько 7 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до 35 95, від близько 10 95 до близько 30 95, від близько 10 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до близько 22 95, від близько 14 95 до 35 95, від близько 16 95 до 35 95, від близько 16 95 до близько 30 95, від близько 16 95 до близько 25 95, або від близько 16 95 до близько 22 95. У переважних варіантах реалізації екстрагований ліпід характеризується (і) і (ії), (і) і (ії) або (ії) і (ії), більш переважно, всіма із (Її), (ії) і (ії). Переважно, екстрагований ліпід додатково характеризується рівнем пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, який становить від близько 2 95 до 16 до, причому рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, якщо вона присутня, становить менш ніж 1 95.

У варіанті реалізації згаданого вище аспекту винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого ліпіду, який включає стадії: ї) одержання клітин, що містять ліпід, переважно частини рослини, що містить клітини, або мікробних клітин, більш переважно, насіння Вгазв5іса або насіння С. заїїма, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти включають докозапентаєнову кислоту (ДПК) і додатково включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 0б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які бо включають а-ліноленову кислоту (АЛК), і одну або більш із стеаридонової кислоти (СДК),

ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), причому (ї) рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2

Фо до 16 905, (ії) рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 1 9б, (ії) рівень олеїнової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 90 до 30 905, (ім) рівень лінолевої кислоти (ЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 35 90, (м) рівень с-ліноленової кислоти (АЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40 95, (м) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕтрК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 9б5; (мії) рівень загальних насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 25

Фо, (мії) співвідношення загальних 0б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 0,05 до близько 1 95, (їх) вміст триацилгліцеролу (ТАГ, у ліпіді становить щонайменше близько 70 905, і (х) щонайменше 35 95

ДПК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано в положенні 51-2 ТАГ, і і) екстракцію ліпіду із частини рослини, причому щонайменше 35 95 ДПК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ),, в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, естерифіковано у положенні 5п-2 ТАГ.

Стадія одержання частини рослини або мікробних клітин може включати збирання врожаю частин рослини, переважно насіння, із рослин, що утворюють частини рослини, виділення мікробних клітин із культур таких клітин або одержання частин рослини або мікробних клітин шляхом придбання у виробника або постачальника, або шляхом імпорту. Спосіб може включати стадію визначення складу жирних кислот ліпіду у зразку частин рослини або мікробних клітин або екстрагованого ліпіду.

У переважному варіанті реалізації екстрагований ліпід, одержаний за способом у відповідності до винаходу, володіє, якщо це доречно, однією або більше ознак, визначених у даному описі, наприклад, як визначено вище для перших двох аспектів.

Варіанти реалізації розкритих вище аспектів винаходу більш детально описані нижче.

Кваліфікованому фахівцю буде зрозуміло, що жодна із ознак, описаних у варіантах реалізації винаходу, які Є ширшими за відповідну ознаку у згаданому вище аспекті, не застосовується до

Зо цього аспекту.

У варіанті реалізації частина рослини є насінням, переважно насінням олійної культури.

Приклади такого насіння включають, без обмеження, насіння виду Вгаз5іса, бо55урішт пігешит,

Сіпит изйнабззітит, виду Неїїапіпи5, Сагіпатив іпсіогіиб5, Сіусіпе тах, 2еа тауз, Агарідорвів

Інаійапа, богупит бБісоїог, богуйит миЇдаге, Амепа займа, виду ТгоЇйшт, ЕІаевзі5 диіпеепів,

Місоїйапа репіпатіапа, Ногаєит миїЇдаге, ІГиріпиє апдивійоїїи5, Огуга заїїма, Огуга діабеттіта,

Сатеїймпа займа або Статре абруззіпіса, переважно насіння виду Вгаззіса, насіння С. займа або насіння Сх. тах (сої), більш переважно, насіння Вгаз5іса паривх, В. |ипсеа або С. заїїма. У варіанті реалізації частина рослини є насінням, переважно олійної культури, такої як вид Вгазвзіса, наприклад, Вгаззіса пари5 або Вгаззіса |нпсєа, Соз55зуріит ПНігзшіит, І іпит и5Наїйввітит, вид

Неїїапіпих, Саннатизв іпсіогпив, Сіусіпе тах, 7єа тауз, ЕІаєзіз диіпеєпів, Місоїапа репінатіапа,

Гиріпиз апдивійоїйше, Сатеїїпа 5айма або Статбре абузхвзіпіса, переважно насінням Вгазвзіса парих, В |шпсеа або С. заїїма. У варіанті реалізації насіння являє собою насіння рапсу, насіння гірчиці, насіння сої, насіння Сатеїйнпа займа або насіння Агарідорвзів (Ппаійапа. В альтернативному варіанті реалізації насіння є насінням, окрім насіння А. ІПпаїїапа та/або окрім С. заїїма. У варіанті реалізації насіння є насінням, окрім насіння сої. У варіанті реалізації частина рослини є насінням виду Вгаззіса. Частина рослини переважно являє собою насіння виду Вгазвзіса або насіння Сатвеїпа заїїма. У варіанті реалізації насіння було одержане від рослини, вирощеної у стандартних умовах, наприклад, як описано у Прикладі 1, або від рослини, вирощеної в полі або в теплиці із стандартними умовами.

В іншому варіанті реалізації насіння містить щонайменше близько 18 мг, щонайменше близько 22 мг, щонайменше близько 26 мг, від близько 18 мг до близько 100 мг, від близько 22 мг до близько 70 мг, близько 80 мг, від близько 30 мг до близько 80 мг, або від близько 24 мг до близько 50 мг ДПК на грам насіння.

У подальшому варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, містить екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів: ї) ю3-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А15-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А12-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, їм) Д12-десатураза, 03-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, 60 Ддб-елонгаза і Д5-елонгаза,

м) о3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) А15-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) Д12-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) Д12-десатураза, 03-десатураза та/або Л15-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, до9-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині частини рослини.

У подальшому варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, або рекомбінантні клітини, такі як мікробні клітини, містять екзогенні полінуклеотиди, що кодують один з наступних наборів ферментів; її Ф03-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5- елонгаза, ії) А12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) Д12-десатураза, ю03-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза,

Ддб-елонгаза і Д5-елонгаза, їм) Ф3-десатураза та/або Л15-десатураза, Д8в-десатураза, Д5-десатураза, ЛУ9-елонгаза і Д5- елонгаза, м) А12-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) Д12-десатураза, ю3-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, до9-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більш промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині частини рослини або клітинах.

У варіанті реалізації, якщо частина рослини або клітина містить ліпід, що містить жирні кислоти у естерифікованій формі, причому жирні кислоти містять докозапентаєнову кислоту (ДПК) та/або докозагексаєнову кислоту (ДГК), причому щонайменше 35 95 ДПК та/або ДГК (якщо вона присутня), естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано у положенні 5п-2 ТАГ, то частина рослини, така як насіння, або рекомбінантні клітини, такі як мікробні клітини, містить екзогенний полінуклеотид, що кодує 1-ацил-гліцерол-3- фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), і, при цьому, полінуклеотид функціонально пов'язаний з

Зо одним або більше промоторами, що здатні керувати експресією полінуклеотиду у клітині частини рослини або клітинах. У подальшому варіанті реалізації клітина містить екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів; і) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Ф3-десатураза, Дб-десатураза, Д5- десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, її) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), А15-десатураза, Аб-десатураза, д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), А12-десатураза, Аб-десатураза, д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, їм) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д12-десатураза, о3-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, м) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), о3-десатураза, Ав-десатураза, Д5- десатураза, ДЛ9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д15-десатураза, А8в-десатураза, д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), А12-десатураза, Ав-десатураза, д5-десатураза, Д9-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, мії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), АЛ12-десатураза, о3-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л9-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині. Переважно, ЛФААТ може використовувати поліненасичений С22 жирний ацил-КоА субстрат, такий як ДПК-КоА.

Переважно, рослина або її частина, така як насіння, або мікробна клітина не містить полінуклеотиду, що кодує Д4-десатуразу, або не містить поліпептиду А4-десатурази.

У варіанті реалізації А12-десатураза додатково володіє 03-десатуразною та/або А15- десатуразною активністю, тобто види активності забезпечуються єдиним поліпептидом. Як альтернатива, ДЛ12-десатураза не володіє 03-десатуразною активністю і не володіє А15- десатуразною активністю, тобто Д12-десатураза є окремим поліпептидом від поліпептиду, що володіє 03-десатуразною та/або ДЛ15-десатуразною активністю.

Ще в одному варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, або рекомбінантні клітини, 60 такі як мікробні клітини, володіють одним або більше або всіма із наступних ознак:

ї) ДІ2-десатураза перетворює олеїнову кислоту на лінолеву кислоту в одній або більш клітин частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, від близько 60 95 до близько 95 95, від близько 70 95 до близько 90 95 або від близько 75 95 до близько 85 905, ї) Ф3-десатураза перетворює б жирні кислоти на 03 жирні кислоти в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 65 95, щонайменше близько 75 9565, щонайменше близько 85 95, від близько 65 95 до близько 95 до, від близько 75 95 до близько 91 95 або від близько 80 95 до близько 91 95, ії) Де-десатураза перетворює АЛК на СДК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 30

Фо, щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 50 95, щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, від близько 30 95 до близько 70 95, від близько 35 95 до близько 60

Фо або від близько 50 95 до близько 70 95, їм) Де-десатураза перетворює лінолеву кислоту на у-ліноленову кислоту в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю менш ніж близько 5 95, менш ніж близько 2,5 95, менш ніж близько 1 95, від близько 0,1 95 до близько 5 95, від близько 0,5 95 до близько 2,5 95 або від близько 0,5 95 до близько 1 905, м) Дбе-елонгаза перетворює СДК на ЕТК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70

Фо, щонайменше близько 75 95, від близько 60 95 до близько 95 95, від близько 70 95 до близько 80 95 або від близько 75 95 до близько 80 905, мі) Д5-десатураза перетворює ЕТК на ЕПК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70

Фо, щонайменше близько 75 956, щонайменше близько 80 956, щонайменше близько 90 95, від близько 60 95 до близько 95 95, від близько 70 95 до близько 95 95 або від близько 75 95 до близько 95 95, мії) А5-елонгаза перетворює ЕПК на ДПК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 85

Фо, щонайменше близько 90 95, від близько 50 95 до близько 90 95 або від близько 85 95 до

Зо близько 95 95, їх)ефективність перетворення олеїнової кислоти на ДПК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах становить щонайменше близько 10 95, щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 956, щонайменше близько 25 95, близько 20 95, близько 25 90, близько 30 95, від близько 10 95 до близько 50 95, від близько 10 95 до близько 30 95, від близько 10 95 до близько 25 95 або від близько 20 95 до близько 30 95, х) ефективність перетворення ЛК на ДПК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах становить щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 22 95, щонайменше близько 25 965, щонайменше близько 30 95, близько 25 до, близько 30 905, близько 35 95, від близько 15 95 до близько 50 95, від близько 20 95 до близько 40 95 або від близько 20 95 до близько 30 95, хі) ефективність перетворення АЛК на ДПК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах становить щонайменше близько 17 95, щонайменше близько 22 965, щонайменше близько 24 95, щонайменше близько 30 95, близько 30 95, близько 35 95, близько 40 95, від близько 17 95 до близько 55 95, від близько 22 95 до близько 35 95 або від близько 24 95 до близько 35 95, хі) одна або більше клітин частини рослини або рекомбінантних клітин містять щонайменше близько на 25 95, щонайменше близько на 30 95, від близько 25 95 до близько 40 95 або від близько 27,5 95 до близько 37,5 95, більше жирних кислот м/3, ніж відповідні клітини без екзогенних полінуклеотидів, хії) Де-десатураза переважно зменшує ступінь насиченості а-ліноленової кислоти (АЛК) відносно лінолевої кислоти (ЛК), хії) Де елонгаза додатково володіє активністю дУ-елонгази, хім) ДІ2-десатураза додатково володіє активністю А15-десатурази, хм) Де-десатураза додатково володіє активністю Ав8-десатурази, хмі) Ав-десатураза додатково володіє активністю Дб-десатурази або не володіє активністю

Ддоб-десатурази, хмії) Д15-десатураза додатково володіє активністю 03-десатурази по відношенню до ГЛК, хмії) ю03-десатураза додатково володіє активністю А15-десатурази по відношенню до ЛК, хіх) Ф3-десатураза зменшує ступінь насиченості ЛК та/або ГЛК,

хх) ф3-десатураза переважно зменшує ступінь насиченості ГЛК відносно ЛК, ххі) одна або більше або всі десатурази, переважно Аб-десатураза та/або А5-десатураза, володіють більш високою активністю по відношенню до субстрату ацил-КоА, ніж до відповідного субстрату ацил-фосфатидилхоліну (ацил-ФХ), ххії) До-десатураза володіє вищою Дб-десатуразною активністю по відношенню до АЛК, ніж

ЛК як жирно кислотного субстрату, ххії) Дб-десатураза володіє більш високою Дб-десатуразною активністю по відношенню

АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххім) Аб-десатураза володіє щонайменше у 2 рази вищою Дб-десатуразною активністю, щонайменше в 3 рази більш високою активністю, щонайменше в 4 рази більш високою активністю або щонайменше в 5 разів більш високою активністю по відношенню до АЛК як субстрату, в порівнянні з ЛК; ххм) Дб-десатураза володіє більш високою активністю по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххмі) Аб-десатураза володіє щонайменше у 5 разів вищою Лб-десатуразною активністю або щонайменше у 10 разів вищою активністю по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххмії) десатураза являє собою фронт-енд десатуразу, ххмії) Дб-десатураза не володіє Д5-десатуразною активністю, що піддавалася б виявленню, по відношенню до ЕТК.

Ще в одному варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, або рекомбінантна клітина, така як мікробні клітини, володіє одним або більше або всіма із наступних ознак: ї) Д12-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 4, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну

ЗЕО ІЮ МО: 4, ії) ю3-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 6, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну

ЗЕОІО МО: 6, ії) Дб-десатураза містить послідовність амінокислоту, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 9, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну

ЗЕОІЮО МО: 9, їм) Де-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 16, її біологічно активний фрагмент, такий як ЗЕО ІЮ МО: 17, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну ЗЕО ІО МО: 16 та/або 5ЕО ІЮО МО: 17, м) д5-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в ЗЕБЕО ІЮ МО: 20, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну

ЗЕО І МО: 20, мі) дД5-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕБО ІЮ МО: 25, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну

ЗЕО І МО: 25.

У варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, або рекомбінантні клітини, такі як мікробні клітини, додатково містить(ять) екзогенний полінуклеотид, що кодує діацилгліцеролацилтрансферазу (ДГАТ), моноацилгліцеролацилтрансферазу (МГАТ), гліцерол-

З-фосфатацилтрансферазу (ГФАТ), 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФКАТ), переважно ЛФКАТ, яка може використовувати поліненасичений жирний ацил-КоА субстрат С22, такий як ДПК-КоА, ацил-КоА : лізофосфатидилхолінацилтрансферазу (ЛФХАТ), фосфоліпазу Аг (РЛК»), фосфоліпазу с (РГС), фосфоліпазу р (РІО), СсДдпП- холіндіаацилгліцеролхолінфосфотрансферазу (ХФТ), фосфатидилхоліндіацилгліцеролацилтрансферазу (ФДАТ), фосфатидилхолін : діацилгліцеролхолінфосфотрансферазу (ФДХТ), ацил-КоА синтетазу (АКС) або комбінацію двох або більше із вказаних ферментів.

У іншому варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, або рекомбінантні клітини, такі як мікробні клітини, додатково містить(ять) введену мутацію або екзогенний полінуклеотид, який у клітині частини рослини негативно регулює продукування та/або активність ендогенного ферменту, вибраного з числа ЕАЕТ, ДГАТ, МГАТ, ГФАТ, ЛФКАТ, ЛФХАТ, РЛК2, РІ С, РІбБ, ХФТ,

ФДАТ, тіоестерази, наприклад, ЕАТВ або 012-десатурази, або комбінації двох або більше із бо вказаних ферментів.

У подальшому варіанті реалізації щонайменше один або переважно всі промотори є специфічними для насіння промоторами. У варіанті реалізації щонайменше один або всі промотори одержані із гена біосинтезу або акумуляції олії, такого як ген, що кодує олеозин, або із генів зберігання білка у насінні, таких як ген, що кодує конлінін.

В іншому варіанті реалізації промотор(и), що спрямовує(ють) експресію екзогенних полінуклеотидів, які кодують 2 Д5-елонгазу, ініціює експресію полінуклеотидів у насінні рослини, що розвивається, або рекомбінантних клітинах, таких як мікробні клітини, перед або досягає піку експресії перед промотором(ами), що спрямовує(ють) експресію екзогенних полінуклеотидів, які кодують ДІ12-десатуразу і о3-десатуразу.

У подальшому варіанті реалізації екзогенні полінуклеотиди ковалентно сполучені в молекулу ДНК, переважно молекулу Т-ДНК, інтегровану до геному клітин частини рослини або рекомбінантних клітин, таких як мікробні клітини, причому кількість таких молекул ДНК, інтегрованих до геному клітин частини рослини або рекомбінантних клітин, переважно становить не більш однієї, двох або трьох, або становить дві або три.

Ще в одному варіанті реалізації частина рослини містить щонайменше два різних екзогенних полінуклеотиди, кожен з яких кодує Лб-десатуразу з такою ж або іншою послідовністю амінокислот.

У подальшому варіанті реалізації загальний вміст олії у частині рослини, що містить екзогенні полінуклеотиди, становить щонайменше близько 40 95, або щонайменше близько 50

Фо, щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 96, щонайменше близько 70 95, від близько 50 95 до близько 80 95 або від близько 80 95 до близько 100 95 від загального вмісту олії у відповідній частині рослини, у якій відсутні екзогенні полінуклеотиди. У подальшому варіанті реалізації маса насіння, що містить екзогенні полінуклеотиди, становить щонайменше близько 40 95, меншій мірі близько 50 95, меншій мірі близько 60 95, меншій мірі близько 70 95, від близько 50 95 до близько 80 95 або від близько 80 95 до 100 95 від маси відповідного насіння, що не містить екзогенних полінуклеотидів.

У іншому варіанті реалізації ліпід знаходиться у формі олії, переважно олії з насіння олійної культури, причому щонайменше близько 90 95, або щонайменше близько 95 95, щонайменше близько 98 95 або від близько 95 95 до близько 98 95 мас. ліпіду складають триацилгліцероли.

Зо У подальшому варіанті реалізації спосіб додатково включає обробку ліпіду з метою підвищення рівня ДПК як відсотка від загального вмісту жирних кислот. Наприклад, обробка включає гідроліз естерифікованих жирних кислот з утворенням вільних жирних кислот або переестерифікацію. Наприклад, ліпід, такий як олія рапсу, може бути підданий обробці з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові естери, наприклад, метилові або етилові естери, які в подальшому можуть бути фракціоновані із збагаченням ліпіду або олії ДПК. У варіантах реалізації склад жирних кислот ліпіду після такої обробки включає щонайменше 40 95, щонайменше 50 95, щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 80 95 або щонайменше 90 95 ДПК. У варіанті реалізації винаходу рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду після обробки становить менш ніж 2,0 95 або менш ніж 0,5 95, переважно вона не визначається в ліпіді.

Крім того, пропонується ліпід або олія, що містить ліпід, такий як вільні жирні кислоти або алкілові естери, одержані із застосуванням способу за винаходом.

У іншому аспекті даного винаходу розкривається спосіб одержання метилових або етилових естерів поліненасичених жирних кислот, який включає введення триацилгліцеролів у реакцію з метанолом або етанолом, у екстрагованому рослинному ліпіді або в ході процесу екстракції, відповідно, причому екстрагований рослинний ліпід містить естерифіковані жирні кислоти у формі ТАГ, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а- ліноленову кислоту (АЛК), і докозапентаєнову кислоту (ДПК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 7 95 до 35 95, переважно від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 95, переважно від 30 95 до 35 95, з одержанням в такий спосіб метилових або етилових естерів поліненасиченних жирних кислот.

У іншому аспекті даного винаходу пропонується спосіб одержання метилових або етилових естерів докозапентаєнової кислоти (ДПК), який включає введення триацилгліцеролів (ТАГ) у реакцію з метанолом або етанолом, в екстрагованому рослинному ліпіді або в ході процесу екстракції, відповідно, причому екстрагований рослинний ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти включають докозапентаєнову кислоту (ДПК), бо причому щонайменше 35 95 ДПК та/або ДГК, естерифікованої у формі ТАГ, естерифіковано у положенні 5п-2 ТАГ, з одержанням в такий спосіб метилових або етилових естерів поліненасичених жирних кислот.

У переважному варіанті реалізації ліпід, який використовується у способі у відповідності до описаних вище двох аспектів, володіє однією або більш ознак, визначених у даному описі в контексті екстрагованого ліпіду або олії за винаходом.

У іншому аспекті даного винаходу розкривається олійна рослина або її частина, така як насіння, переважно рослина Вгазвіса або рослина С. заїїма, що містить у насінні, або мікробна клітина, що містить: а) ліпід, що містить жирні кислоти в естерифікованій формі, та б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів: її А12-десатураза, ю3-десатураза та/"або А15-десатураза, Аб-десатураза, А5-десатураза,

Ддб-елонгаза і Д5-елонгаза, або ії) Д12-десатураза, ю3-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8в-десатураза, Д5-десатураза, до-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) ю3-десатураза та/або Д15-десатураза, Аб-десатураза, А5-десатураза, Аб-елонгаза і Д5- елонгаза, або їм) Ф3-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8в-десатураза, Д5-десатураза, ЛУ9-елонгаза і Д5- елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше специфічними для насіння промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у насінні рослини, що розвивається, або з одним або більше промоторів, здатних спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів у мікробній клітині, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК) і необов'язково у-ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК) і докозапентаєнову кислоту (ДПК) і необов'язково ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) та/або ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), притому, що рівень

ДПК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду насіння або мікробної клітини становить від 7 90 до 35 95. У переважному варіанті реалізації даного аспекту ДГК присутній на рівні менш ніж 2 905 або менш ніж 0,5 95 від загального вмісту жирних кислот ліпіду насіння і екстрагованого ліпіду і,

Зо більш переважно, не визначається у загальному вмісті жирних кислот ліпідів.

У іншому аспекті даного винаходу пропонується клітина, переважно клітина в або із рослини, такої як рослина олійної культури, або її частини, такої як насіння, або рослина олійної культури або її частина, переважно рослина Вгаззіса або рослина С. заїїма, або мікробна клітина, що містить: а) жирні кислоти у естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають докозапентаєнову кислоту (ДПК), і, при цьому, щонайменше 35 95 ДПК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано у положенні 51-2 ТАГ, їі б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів; і) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Ф3-десатураза, Дб-десатураза, Д5- десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, її) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д15-десатураза, Аб-десатураза, д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), А12-десатураза, Аб-десатураза, д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, їм) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д12-десатураза, о3-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, м) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), ю03-десатураза, Ав-десатураза, Д5- десатураза, ДЛ9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д15-десатураза, А8в-десатураза, д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), А12-десатураза, Ав-десатураза, д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), АЛ12-десатураза, о3-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л9-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині. Переважно, ЛФААТ може використовувати поліненасичений жирний ацил-КоА субстрат С22, такий як ДПК-КоА, і рівень

ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1 95 до 35 905 або від близько 7 95 до 35 95 або від близько 20,1 95 до 35 95. У варіантах реалізації 60 щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 45 95, щонайменше близько 48 95, від 35 95 до близько 60 95, або від 35 95 до близько 50 956 ДПК та/або ДГК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано у положенні 5п-2 ТАГ.

У переважних варіантах реалізації кожного із згаданих вище двох аспектів винаходу, А15- десатураза є грибковою Д15-десатуразою, і о3-десатураза є грибковою 03-десатуразою.

У переважному варіанті реалізації рослина олійної культури, мікробна клітина або клітина за винаходом володіє, якщо це доречно, однією або більш ознак, визначених у даному описі, наприклад, як визначено вище для екстрагованого рослинного ліпіду, екстрагованого мікробного ліпіду або способу їх одержання.

Приклади рослин олійної культури включають, без обмеження, вид Вгаззіса, Соззурійт пігвшійт, Гіпит ивійаїйввітит, вид Неїїапійи5, Сапнатив іпсіопйие, Сіусіпе тах, 7єеа таув,

Агарідорвзів ІНаїапа, богупит бісоіог, Зогудпит мицідагє, Амепа б5заїїма, вид ТгітоЇйчт, ЕПІаевів диіпеепіб, Місойапа Бепіпатіапа, Ногдешт уцїдаге, ІГиріпиє апдивійоїйше, Огула заїїма, Огуга діабетіта, Сатеїїпа займа або Статре абруззіпіса. У варіанті реалізації рослина олійної культури є рослиною виду Вгаззіса, рослиною б. займа або рослиною б. тах (соя). У варіанті реалізації олійна рослина є рослиною рапсу, В. |ппсеа, Сіусіпе тах, Сатеїїпа займа або

Агарідорзіє Шаїйапа. В альтернативному варіанті реалізації рослина олійної культури є рослиною, окрім А. ІПаіапа та/або окрім С. заїїма. У варіанті реалізації рослина олійної культури є рослиною, окрім с. тах (сої). Переважно рослина являє собою рослину виду Вгаззіса або

Сатеїйна заїїма. У варіанті реалізації рослина олійної культури знаходиться у полі або була вирощена у полі або була вирощена в теплиці у стандартних умовах, наприклад, як описано у

Прикладі 1.

У варіанті реалізації винаходу одна або більше десатураз здатні використовувати субстрат ацил-КоА. У переважному варіанті реалізації винаходу одна або більш з Дб-десатурази, Д5- десатурази і Дв-десатурази, якщо вони присутні, здатні використовувати субстрат ацил-КоА, переважно кожна з ї) Аб-десатурази і А5-десатурази або ії) А5-десатурази і Ав-десатурази здатна використовувати субстрат ацил-КоА. У варіанті реалізації винаходу ДЛ12-десатураза та/або (003-десатураза здатні використовувати субстрат ацил-КоА. Субстрат ацил-КоА переважно являє собою АЛК-КоА для Дб-десатурази, ЕТК-КоОА для Д5-десатурази, ЕТрК-КоА для Д8-десатурази, олеїл-КоА для Л12-десатурази, або один або більше з ЛК-КоА, ГЛК-КоА або

АРК-КОА для о03-десатурази.

У варіанті реалізації винаходу зріле, зібране в процесі збору урожаю насіння рослини містить ДПК в кількості щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння, близько 80 мг на грам насіння або від близько 30 мг до близько 80 мг на грам насіння.

У подальшому аспекті цього винаходу розкривається рослина Вгаз5іса парив, В. |Їнпсєа або

Сатеїймпа займа, яка здатна давати насіння, що містить ДПК, причому зібране в процесі збору урожаю, зріле насіння рослини містить ДПК в кількості щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння, близько 80 мг на грам насіння або від близько 30 мг до близько 80 мг на грам насіння.

В іншому аспекті цього винаходу розкривається клітина рослини за винаходом, що містить екзогенні полінуклеотиди, розкриті в даному описі.

Також розкрита частина рослини, переважно насіння, яка володіє однією або більше з наступних ознак: ї) одержана з рослини за винаходом, ії) містить ліпід, розкритий в цьому документі, ії) може використовуватися в способі за винаходом,

Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається зріле, зібране в процесі збору урожаю насіння Вгабзіса пари, В. їипсеа або Сатеїмнпа заїїма, що містить ДПК, із вмістом вологи від близько 4 95 до близько 15 95 мас., переважно від близько б 95 до близько 8 95 мас. або від близько 4 95 до близько 8 95 мас., більш переважно від близько 4 95 до близько б 95 мас., причому вміст ДПК в насінні становить щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння, близько 80 мг на грам насіння або від близько 30 мг до близько 800 мг на грам насіння.

У варіанті реалізації винаходу розкрита клітина за винаходом, трансгенний організм за винаходом, рослина олійної культури за винаходом, рослина Вгаззіса паривх, В. |Їнпсеа або

Сатвеїйнпа заїма за винаходом, частина рослини за винаходом або насіння за винаходом, які можуть застосовуватися для одержання екстрагованого ліпіду, що володіє одним або більш або всіма ознаками, визначеними в цьому документі.

Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання рослини або клітини за винаходом, які можуть застосовуватися для одержання екстрагованого ліпіду за винаходом, причому спосіб включає: а) аналіз рівня ДПК у ліпіді, продукованому однією або більше частинами рослини, такими як насіння, або рекомбінантними клітинами, такими як мікробні клітини, від декількох рослин або рекомбінантних клітин, таких як мікробні клітини, причому кожна рослина або рекомбінантна клітина, така як мікробна клітина, містить один або більше екзогенних полінуклеотидів, що кодують один із наступних наборів ферментів; ї) ю3-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А15-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А12-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, їм) А12-десатураза, 03-десатураза або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб- елонгаза і Д5-елонгаза, м) о3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) А15-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) Д12-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) Д12-десатураза, о3-десатураза або Л15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, До- елонгаза і Д5-елонгаза, або їх) Ф3-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, х) А15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, хі) А12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині частини рослини або рекомбінантній клітині, і

Зо б) ідентифікацію із множини рослин або рекомбінантних клітин рослини або рекомбінантної клітини, які можуть застосовуватися для одержання екстрагованого рослинного ліпіду або клітинного ліпіду за винаходу в одній або більше їх частин, і в) необов'язково, одержання потомства рослин або рекомбінантних клітин від ідентифікованої рослини або рекомбінантної клітини, або їх насіння.

У варіанті реалізації рослина або рекомбінантна клітина додатково містить екзогенний полінуклеотид, що кодує ЛФААТ, як визначено у даному описі.

Переважно, рослина-нащадок належить щонайменше до другого або третього покоління відносно ідентифікованої рослини, і переважно є гомозиготною по одному або більше полінуклеотидах. Більш переважно, один або більш полінуклеотидів присутні у рослині-нащадку тільки в одному інсерційному локусі. Таким чином, у винаході пропонується спосіб, який може застосовуватися як спосіб скринінгу для ідентифікації рослини або її насіння з числа багатьох трансформованих рослин або насінин кандидатів, причому ідентифікована рослина або її рослина-нащадок продукує ліпід за винаходом, переважно у насінні. Таку рослина або рослину- нащадок або її насіння відбирають, якщо вона продукує ліпід за винаходом, зокрема із вказаним рівнем ДПК, або не відбирають, якщо вона не продукує ліпіду за винаходом.

У варіанті реалізації екзогенні полінуклеотиди, що присутні у клітині, такій як мікробна клітина, або рослині або її частині, як визначено у даному описі, стають стабільно інтегрованими до геному клітини, рослини або частини рослини, такої як насіння. Переважно, екзогенний(і) полінуклеотид(и) стають стабільно інтегрованими до геному клітини, рослини або частини рослини, такої як насіння, в одному локусі в геномі, і переважно є гомозиготними по інсерції. Більш переважно, рослина, частина рослини або насіння додатково характеризується тим, що в ньому відсутні екзогенні полінуклеотиди, окрім однієї або більше молекул Т-ДНК.

Таким чином, жодних екзогенних векторних послідовностей не інтегровано до геному, окрім послідовностей Т-ДНК.

У варіанті реалізації, перед стадією а) спосіб включає введення одного або більше екзогенних полінуклеотидів в одну або більше клітин рослини.

Додатково пропонується рослина, одержана із застосуванням способу за винаходом, і насіння такої рослини.

У варіанті реалізації рослина за винаходом володіє як чоловічою, так їі жіночою бо фертильністю, переважно з рівнями як чоловічої, так і жіночої фертильності, що складають щонайменше 70 95 відносно відповідної рослини дикого типу, або переважно є такими ж. У варіанті реалізації пилок, що продукується рослиною за винаходом або рослиною, одержаною із насіння за винаходом, є на 90-100 95 життєздатним за даними фарбування фарбником для визначення життєздатності. Наприклад, життєздатність пилку можна оцінити, як описано у

Прикладі 1.

В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання насіння, який включає: а) вирощування рослини за винаходом або рослини, яка утворює частину, розкриту в цьому документі, переважно в полі як частини популяції розміром щонайменше 1000 або 2000 або 3000 таких рослин або на площі щонайменше 1 гектар або 2 гектари або З гектари, насаджених із стандартною щільністю насадження, б) збір урожаю насіння з рослини або рослин, і в) необов'язково, екстракцію ліпіду з насіння, переважно з одержанням олії із загальним виходом ДПК щонайменше 60 кг або 70 кг або 80 кг ДПК на гектар.

У варіанті реалізації винаходу рослина, клітина рослини, частина рослини або насіння за винаходом володіє однією або більше з наступних ознак: ї) олія є такою, як розкрито в цьому документі, ії) частина рослини або насіння можуть застосовуватися в способі за винаходом.

Наприклад, насіння може застосовуватися для одержання рослини за винаходом. Рослина може бути вирощена в полі або в теплиці із стандартними умовами, наприклад, як описано у

Прикладі 1.

У подальшому аспекті цього винаходу розкривається ліпід або олія, продуковані або одержані із застосуванням способу за винаходом, із клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгаззіса,

Вгаззіса парих, В. |нпсєа, С. тах або Сатеїїпа займа за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом або рослини, клітини рослини, частини рослини або насіння за винаходом. Переважно, ліпід або олію очищують для видалення забруднюючих речовин, таких як нуклеїнова кислота (ДНК та/або РНК), білок та/або вуглевод, або пігментів, таких як хлорофіл. Крім того, ліпід або олія можуть бути очищені з метою збільшення вмісту ТАГ, наприклад, шляхом видалення вільних жирних кислот (ВЖК) або фосфоліпіду.

Зо У варіанті реалізації винаходу ліпід або олія одержані екстракцією олії з олійної культури.

Приклади олії з олійних культур включають, без обмеження, олію рапсу (Вгаззіса парих, підвид

Вгаззіса гара), олію гірчиці (Вгаззіса |нпсеа), іншу олію виду Вгаззіса, соняшникову олію (Неїїапіпив аппив), льняну олію (І іпит изнагіббвітит), соєву олію (Сіусіпе тах), сафлорову олію (Сапнатизвз ііпсіогіиз), кукурудзяну олію (7еа тауз), олію тютюну (Місоїапа іабасит), арахісове масло (Агаспі5 пуродаєа), пальмову олію, бавовняну олію (Со55урішт піг5шит), кокосове масло (Сосов писіїега), олію авокадо (Регхеа атегісапа), оливкову олію (ОіІеа еигораєа), олію кеш'ю (Апасагадішт оссідепіаіє), олію макадамії (Масадатіа іпіегагіоїйа), мигдальну олію (Ргипив5 атудаа|шв) або олію насіння Агарідорвіз (Агабідорзвів ІНаїїапа).

У варіанті реалізації клітина (рекомбінантна клітина) за винаходом або використовувана у відповідності до винаходу, є мікробною клітиною, такою як клітина, придатна для ферментації, переважно масляниста мікробна клітина, здатна акумулювати триацилгліцероли до рівня щонайменше 25 95 в перерахунку на масу. Переважними процесами ферментації є анаеробні процеси ферментації, як добре відомі з рівня техніка. Придатні ферментуючі клітини, звичайно мікроорганізми, здатні ферментувати, тобто, перетворювати цукри, такі як глюкоза або мальтоза, прямо або непрямо, на бажані жирні кислоти. Приклади ферментуючих мікроорганізмів включають грибкові організми, такі як дріжджі. В даному описі «дріжджі» включають види Засспаготусе5, Засспаготусев сегемізіае, засспаготусев сагірбегдепвів5, види

Сапаїйда, види Кіимеготусев5, види Ріспіа, види Напзепиціа, види Тгісподепта, І іротусез «агкеу і переважно Маїгтом/а Ііроїуїіса.

У подальшому аспекті цього винаходу розкривається жирна кислота, продукована або одержана із застосуванням способу за винаходом, з клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгаззіса,

Вгаззіса парих, В. |нпсєа, С. тах або Сатеїїпа займа за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, або рослини, клітини рослини, частини рослини або насіння за винаходом. Переважно жирна кислота являє собою ДПК. Жирна кислота може знаходитися в суміші жирних кислот, склад жирних кислот у якій є таким, як розкрито в цьому документі, або суміш може бути збагачена таким чином, щоб жирна кислота, переважно ДПК, становила щонайменше 40 95 або щонайменше 90 95 від вмісту жирних кислот в суміші. У варіанті реалізації винаходу жирна кислота є неестерифікованою. Як альтернатива, жирна кислота є естерифікованою із застосуванням, наприклад, метильної, етильної, пропільної або бутильної групи.

Додатково розкривається шрот, одержаний із насіння за винаходом або одержаний із рослини за винаходом. Переважний шрот включає, не обмежуючись цим, шрот Вгавзіса пари»,

В. їнпсеа, Сатеїїпа займа або СіІусіпе тах. У варіанті реалізації шрот містить екзогенний|(і) полінуклеотид(и) та/або генетичні конструкції, як розкрито у даному документі. У переважному варіанті реалізації в шроті залишається частина ліпіду або олії, продукованого у насінні, з якого одержаний шрот, але на низькому рівні (наприклад, менш ніж 2 95 мас.) після екстракції більшої частини ліпіду або олії. Шрот може застосовуватися як корм для тварин або як інгредієнт у виробництві харчових продуктів.

В іншому аспекті цього винаходу розкривається композиція, що містить один або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгаззіса, Вгаззіса парив, В. нпсєа, Сіусіпе тах або Сатеїїпа заїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом або шроту за винаходом. У варіантах реалізації винаходу композиція містить носій, придатний для фармацевтичного, харчового або сільськогосподарського застосування, сполуки для обробки насіння, добриво, інший харчовий продукт або поживний інгредієнт, або додатковий білок або вітаміни.

Також розкриті продукти харчування (корми), косметика або хімічні речовини, що містять одне або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, клітини за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгаззіса, Вгаззіса парив, В. |нпсєа, Спусіпе тах або Сатеїїпа заїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, насіння за винаходом, шрот за винаходом або композиції за винаходом.

Переважним продуктом харчування є дитяча суміш, що містить ліпід або олію за винаходом.

В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання продукту харчування, переважно дитячої суміші, який включає змішування одного або більше ліпідів, або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, клітини за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгазвіса, Вгаз5іса пари», В. їипсеа, СіІусіпе тах або Сатеїнпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, шроту за винаходом або композиції за винаходом, щонайменше із ще одним поживним інгредієнтом.

Спосіб може включати стадії змішування, термічної обробки, випічки, екструдування, емульгації або іншої обробки продукту харчування або пакування продукту харчування або аналізу вмісту ліпіду або олії у продукті харчування.

В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб лікування або попередження стану, при якому ПНЖК, переважно ДПК, здійснюють сприятливу дію, причому вказаний спосіб включає введення суб'єкту одного або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду

Вгаззіса, Вгаззіса пари, В. |нпсеа, Сіусіпе тах або Сатеїйпа займа за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, шроту за винаходом, композиції за винаходом або корму за винаходом. У переважному варіанті реалізації ПНЖК вводять у формі фармацевтичної композиції, що містить етиловий естер ПНЖК. Суб'єкт може бути людиною або твариною.

Приклади станів, при яких ПНЖК здійснюють сприятливу дію, включають, без обмеження, підвищені рівні тригліцеролів у сироватці, підвищені рівні холестерину у сироватці, наприклад, підвищені рівні ЛЛНП холестерину, серцеву аритмію, ангіопластику, запалення, астму, псоріаз, остеопороз, камені в нирках, СНІД, множинний склероз, ревматоїдний артрит, хворобу Крона, шизофренію, рак, плодовий алкогольний синдром, синдром гіперактивності і дефіциту уваги, муковісцидоз, фенілкетонурію, уніполярну депресію, агресивну ворожість, адренолейкодистрофію, захворювання коронарних судин серця, гіпертензію, діабет, ожиріння, хворобу Альцгеймера, хронічне обструктивне захворювання легенів, виразковий коліт, рестеноз після ангіопластики, екзему, гіпертонію, агрегацію тромбоцитів, шлунково-кишкову кровотечу, ендометріоз, передменструальний синдром, міалгічний енцефаломієліт, хронічну втомленість після вірусних інфекцій або захворювання очей.

Також розкрите застосування одного або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної 60 кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгазвзіса, Вгазвзіса парив, В. |їнпсєа, Сіусіпе тах або Сатеїнпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, шроту за винаходом, композиції за винаходом або харчових продуктів (корму) за винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування або попередження стану, при якому ПНЖК, переважно ДПК, здійснюють сприятливу дію.

Одержання лікарського засобу може включати змішування олії за винаходом з фармацевтично прийнятним носієм, з метою лікування стану, розкритого в цьому документі.

Спосіб може включати, по-перше, очищення та/"або переестерифікацію олії та/або фракціонування олії, з метою підвищення рівня ДПК. У конкретному варіанті реалізації винаходу спосіб включає обробку ліпіду або олії, наприклад, олії рапсу, з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові естери, наприклад, метилові або етилові естери. Подальша обробка, наприклад, фракціонування або дистиляція, може застосовуватися для збагачення ліпіду або олії ДПК. У переважному варіанті реалізації винаходу лікарський засіб містить етилові естери

ДПК. У ще більш переважному варіанті реалізації винаходу рівень етилових естерів ДПК в лікарському засобі становить від 30 95 до 50 95. Лікарський засіб може додатково містити етилові естери ЕПК, наприклад, від 30 95 до 50 95 або щонайменше 80 95 або щонайменше 85 95 або щонайменше 90 95 або щонайменше 95 95 від загального вмісту жирних кислот в лікарському засобі. Такі лікарські засоби придатні для введення суб'єктам-людям або тваринам при лікуванні медичних станів, як розкрито в цьому документі.

В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб торгівлі насінням, який включає одержання насіння за винаходом і торгівлі одержаним насінням з одержанням грошової вигоди.

У варіанті реалізації винаходу одержання насіння включає культивацію рослин за винаходом та/або збір урожаю насіння з рослин.

В іншому варіанті реалізації винаходу одержання насіння додатково включає вміщення насіння до ємності та/або зберігання насіння.

У подальшому варіанті реалізації винаходу одержання насіння додатково включає перевезення насіння в інше місце.

Зо Ще в одному варіанті реалізації винаходу спосіб додатково включає перевезення насіння в інше місце після продажу насіння.

У подальшому варіанті реалізації винаходу торгівля здійснюється з використанням електронних засобів, наприклад, комп'ютера.

Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання бункерів з насінням, який включає: а) валкування, рядкове компостування та/або жнива наземних частин рослин, що містять насіння за винаходом, б) молотьбу та/або віяння частин рослин, з відокремленням насіння від залишку частин рослини, і в) просівання та/або сортування насіння, відокремленого на стадії б), і завантаження просіяного та/або сортованого насіння в бункери, з одержанням в такий спосіб бункерів із насінням.

У варіанті реалізації винаходу, якщо це доречно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, за винаходом або придатні у відповідності до винаходу, містять близько такі рівні жиру, як розкрито в Таблицях у розділі Прикладів.

Будь-який варіант реалізації в цьому документі слід інтерпретувати як застосовний, з відповідними поправками, до будь-якого іншого варіанту, якщо конкретно не вказано інше.

Контекст цього винаходу не повинен обмежуватись конкретними варіантами, розкритими в цьому документі, які наведені тільки з метою ілюстрації. Функціонально еквівалентні продукти, композиції і способи очевидно знаходяться в межах обсягу винаходу, розкритого в цьому документі.

В цьому документі, якщо конкретно не вказано інше або з контексту очевидно не слідує інше, посилання на єдину стадію, композицію речовини, групу стадій або групу композицій речовини повинно бути інтерпретоване як включаюче однину і множину (тобто, одну або більше) таких стадій, композицій речовини, груп стадій або груп композицій речовини.

Винахід додатково розкритий за допомогою наступних необмежуючих Прикладів, з посиланням на додані графічні матеріали.

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

Фігура 1. Аеробні шляхи біосинтезу ДПК.

Фігура 2. Карта ділянки вставки Т-ДНК від лівої до правої меж руР3416-5А7. ПМ позначає праву межу; ЛМ, ліва межа; ТЕР, ділянка термінатора транскрипції/поліаденілування; ПРО, промотор; кодуючі ділянки показані над стрілками, промотори і термінатори -- під стрілками.

Місри-АбО, дб-десатураза Місготопа5 ризійа; Ругсо-ДбЕ, Дб-елонгаза Ругатітопав5 согаайа;

Рамза-А5БО, Д5-десатураза Раміома заїїпа; Рісра-ю30, Ф3-десатураза Ріспіа разіогіз; Рамза-А40О, да десатураза Р. заїїпа; І асКкІ-А120, А12-десатураза І аспапсеа Кіпумегі; Ругсо-А5ЗЕ, Д5-елонгаза

Ругатітопаз согдаїа. НОС позначає ділянку термінатора транскрипції/поліаденілування нопалінсинтетази Адгорасієегішт ішптеїасіеп5; ЕР1, укорочений промотор напіну Вгазвзіса парив;

ЕАЕЇ, промотор Агарідорзів Іпнаіапа ЕАЕ1; Лектин, ділянка термінатора транскрипції/поліаденілування лектину (зІусіпе тах; Спії і Спі?2 позначає промотор або термінатор конлініну 1 або конлініну 2 Гіпит изнаїізбзітит. ДПМ позначає ділянку прикріплення до матриксу КБ7 з Місойапа їарасит.

Фігура 3. (А) Основна структура фітостерину з кільцем і нумерацією бічного ланцюга. (В)

Хімічні структури деяких фітостеринів.

Фігура 4. Карта ділянки вставки Т-ДНК між лівою и правою межами рОРЗ662. ПМ позначає праву межу; ЛМ, ліва межа; ТЕР, ділянка термінатора транскрипції/поліаденілування, ПРО, промотор; кодуючі ділянки вказані над стрілками, промотори і термінатори -- під стрілками.

Місри-АбО, Містотопаз ризійа Дб-десатураза; Ругсо-АбЕ, Ругатітопа5 согдаїа Дб-елонгаза;

Рамза-Д5О, Раміома заїїпа Д5-десатураза; Рісра-ю30, Ріснпіа равіюгів ю3-десатураза; І аскІі-А120,

І аспапсеа КіІсумегі А12-десатураза; Ругсо-Д5Е, Ругатітопавз согааїа Д5-елонгаза. НОС позначає ділянку термінатора транскрипції/поліаденілування нопалінсинтетази Адгобасієтцт штегасіепв5;

ЕРІ, вкорочений промотор напіну; Вгаззіса пари5 ЕАЕТ, промотор ЕБАЕТ1 Агабрідорзів ШНаїапа;

Лектин, ділянка термінатора транскрипції/поліаденілування лектину Сіусіпе тах; Спії позначає промотор або термінатор конлініну 1 І іпит и5йайззітит. ДПМ позначає ділянку приєднання до матриксу КБЬ7 Місоїапа їабасит.

КЛЮЧ ДО ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ЗЕО ІО МО: 1 -- послідовність нуклеотидів руР3416-САТ7.

ЗЕО ІО МО: 2 -- послідовність нуклеотидів роА7-тос В.

ЗЕБЕО І0О МО: 3 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А12-

Зо десатурази І аспапсеа Кіпумегі в рослинах.

ЗЕО ІЮ МО: 4-- Д12-десатураза І аспапсеа Кіпумегі.

ЗЕО ІО МО: 5-- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Ф3-десатурази

Ріспіа разіогі5 в рослинах.

ЗЕО ІЮ МО: 6 -- Ф3-десатураза Ріспіа равіогів.

ЗЕО І МО: 7 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Аб-десатуразу Місготопах ризШа.

ЗЕО ІЮ МО: 8 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-десатурази

Місготопах ризхіМйа в рослинах.

ЗЕО І МО: 9-- ДАб-десатураза Місготопах ризійа.

ЗЕБЕО ІЮ МО: 10 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Дб-десатуразу О5ігеососси5

Іосітаїгіпив.

ЗЕБЕО 10 МО: 11 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Дб- десатурази О5ігеососсиз Іссітагіпи5 в рослинах.

ЗЕО ІЮ МО: 12 -- Дб-десатураза О5ігеососсиз Іссітагіпив.

ЗЕО ІО МО: 13 -- Аб-десатураза О5ігеососсиз їацгі.

ЗЕО ІО МО: 14 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Аб-елонгазу Ругатітопах согаага.

ЗЕО ІО МО: 15 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-елонгази

Ругатітопазх согааїа в рослинах (вкорочена на 3' кінці і кодуюча функціональну елонгазу).

ЗЕО ІЮ МО: 16 -- Аб-елонгаза Ругатітопах согдаїйа.

ЗЕО І МО: 17 - вкорочена Аб-елонгаза Ругатітопах согааа.

ЗЕО ІЮ МО: 18 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-десатуразу Раміоома заїіпа.

ЗЕБЕО 10 МО: 19 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії д5- десатурази Раміома заїїпа в рослинах.

ЗЕО ІЮ МО: 20 -- А5-десатураза Раміома заїїпа.

ЗЕО ІО МО: 21 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-десатуразу Ругатітопах согааа.

ЗЕО ІЮ МО: 22 -- Д5-десатураза Ругатітопах согдаца.

ЗЕО ІЮ МО: 23 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-елонгазу Ругатітопах согаага.

ЗЕО І МО: 24 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А5-елонгази

Ругатітопазх согааїа в рослинах.

ЗЕО ІЮ МО: 25 -- Д5-елонгаза Ругатітопах согдаїйа. бо ЗЕО ІЮ МО: 26 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Л4-десатуразу Раміоома заїіпа.

ЗЕБЕО І0О МО: 27 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії да4- десатурази Раміома заїїпа в рослинах.

ЗЕО ІЮ МО: 28 -- Д4-десатураза Раміома заїїпа.

ЗЕО ІЮ МО: 29 -- Д9У-елонгаза Ізоспгузі5 даіІбапа.

ЗЕО І МО: 30 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії ЛУ-елонгази

Етійапіа пихіеуї в рослинах.

ЗЕО ІЮ МО: 31 -- Д9У-елонгаза Етіїїапіа пихіеуії.

ЗЕО ІЮ МО 32 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Ле9-елонгазу Раміома ріпдиі5.

ЗЕО ІЮ МО 33 -- Д9У-елонгаза Раміома ріпдиів.

ЗЕО ІЮ МО 34 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Ле9-елонгазу Раміома заїїпа.

ЗЕО ІЮ МО 35 -- Д9-елонгаза Раміома заїїпа.

ЗЕО ІЮ МО 36 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А8-десатуразу Раміома заїпа.

ЗЕО ІЮ МО 37 -- Ав-десатураза Раміома заїїпа.

ЗЕО ІЮ МО 38 -- вірусний супресор М2.

ЗЕО ІЮ МО 39 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор М2.

ЗЕО ІЮ МО 40 -- ЛФКАТ2 Агарідорвів ІНаїіапа.

ЗЕО ІЮО МО 41 -- ЛФКАТ І ітпапінез аїра.

ЗЕО ІЮ МО 42 -- ЛФКАТ Засспаготусез сегемівіає.

ЗЕО ІЮ МО 43 -- ЛФКАТ Містотопаз ризвіїа.

ЗЕО ІЮ МО 44 -- ЛФКАТ МопієгеїІа аїріпа.

ЗЕО ІЮ МО 45 - ЛФКАТ Вгассіза парив.

ЗЕО ІЮ МО 46 -- ЛФКАТ Вгавзвіса парив.

ЗЕО ІЮ МО 47 -- 03 десатураза Рпуїюоріннога іптевіапв.

ЗЕО ІЮ МО 48 -- 03 десатураза ТпаїІаввіовзіга реецдопапа.

ЗЕО ІЮ МО 49 -- 03 десатураза РуїШйіит ігедшаге.

ЗЕО ІЮ МО 50-58 -- Олігонуклеотидні праймери/зонди.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Загальні способи і визначення

Якщо конкретно не визначено інше, всі технічні і наукові терміни, використані в цьому документі, слід розуміти, як маючі таке ж значення, якого завжди надає їм середній фахівець в даній галузі техніки (наприклад, в культивуванні клітин, молекулярній генетиці, синтезі жирних кислот, трансгенних рослинах, рекомбінантних клітинах, хімії білка і біохімії).

Якщо не вказано інше, білок, культура клітин та імунологічні методи, що використовуються в цьому винаході, являють собою стандартні способи, добре відомі фахівцям з рівня техніки. Такі методики описані і пояснені в літературних джерелах, наприклад, -. Регбраї, А Ргасіїса! сзціде 10

МоїІесшіаг Сіопіпо, дхопп Уміеу апа 5оп5 (1984), 9. затьгоок еї аї., МоїІесшаг СіІопіпо: А І арогагогу

Мапиаї, СоїЯ 5ргіпуд Нагроиг І арогафогу Рге5з (1989), Т.А. Вгом/п (редактор), Еззепіа! Моїесшіаг

Віоіоду: А РгасіїсаІ! Арргоасі, Моїштев 1 апа 2, ІК. Ргез55 (1991), О.М. Сіомег апа В.О. Натев (редактори), ОМА Сіопіпд: А Ргасіїса! Арргоасі, Моїште5 1-4, ІВ Ргез55 (1995 і 1996), Е.М.

А!йзибреї еї аІ. (редактори), Сиггепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, Сгеепе Риб. Аззосіа(ез апа

УМПеу-Іпіегзсіепсе (1988, включаючи всі видання до сьогоднішнього дня), Ей Нагіомж апа Рамід

І апе (редактори), Апііродіе5: А І арогаїогу Мапиаї, Соїй 5ргіпд Нагбоиг І абогаїогу, (1988) і У.Е.

Соїїдап еї аїІ. (редактори), Ситепі Ргоїосої5 іп Іттипоіоду, допйп УмМієу 5 5оп5 (включаючи всі видання до сьогоднішнього дня).

Термін «та/або», наприклад, «Х та/або У» слід розуміти, як такий, що позначає будь-яке з «Х і У» або «Х або У», і його слід інтерпретувати як явно підтримуючий обидва значення або будь- яке із значень.

В цьому документі термін «близько», якщо не вказано протилежне, позначає х/- 10 95, більш переважно ч-/- 5 95, більш переважно ч«/- 1 95 від наведеного значення.

В цьому документі слово «включають» або його варіації, наприклад, «включає» або «який включає» слід розуміти, як таке, що позначає включення заявленого елементу, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, але не виключення будь-якого іншого елементу, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій.

Деякі визначення

В цьому документі терміни «екстрагований рослинний ліпід» і «виділений рослинний ліпід» позначають ліпідну композицію, що виділена, наприклад, шляхом подрібнення, з рослини або її частини, такої як насіння. Екстрагований ліпід може являти собою відносно неочищену композицію, одержану, наприклад, шляхом подрібнення насіння рослини, або більш очищену композицію, з якої більшість, якщо не всі з одного або більше або кожного із води, нуклеїнових бо кислот, білків і вуглеводів, що походять з рослинного матеріалу, видалені. Нижче розкриті приклади способів очищення. У варіанті реалізації винаходу екстрагований або виділений рослинний ліпід містить щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 956, щонайменше близько 90 95, або щонайменше близько 95 мас./ 95 мас. ліпіду в композиції. Ліпід може бути твердим або рідким за кімнатної температури, якщо він є рідиною, то має назву олії. У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід за винаходом не змішується з іншим ліпідом, наприклад, ДПК, продукованою іншим джерелом (наприклад, ДПК з риб'ячого жиру). У варіанті реалізації винаходу після екстракції одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДПК, пальмітинова кислота : ДПК, лінолева кислота : ДПК, і загальні б жирні кислоти : загальні 003 жирні кислоти, істотною мірою не змінюються (наприклад, не більш, ніж 10 95 або 5 95 змін), в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. В іншому варіанті реалізації винаходу екстрагований рослинний ліпід не обробляється процедурою, такою як гідрогенізація або фракціонування, яка може змінити одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДПК, пальмітинова кислота : ДПК, лінолева кислота : ДПК їі загальні 0б жирні кислоти : загальні 03 жирні кислоти, в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині Якщо екстрагований рослинний ліпід за винаходом міститься в олії, олія може додатково містити молекули, що не є жирними кислотами, наприклад, стероли.

В цьому документі терміни «екстрагована рослинна олія (масло)» і «виділена рослинна олія (масло)» позначають речовину або композицію, що містить екстрагований рослинний ліпід або виділений рослинний ліпід, що є рідким за кімнатної температури. Олію одержують з рослини або її частини, наприклад, насіння. Екстрагована або виділена олія може являти собою відносно неочищену композицію, одержану, наприклад, шляхом подрібнення насіння рослини, або більш очищену композицію, з якої більшість, якщо не всі, з одного або більше або кожного із води, нуклеїнових кислот, білків і вуглеводів, що походять з рослинного матеріалу, видалені.

Композиція може містити інші компоненти, що можуть бути ліпідними або неліпідними. У варіанті реалізації винаходу олійна композиція містить щонайменше близько 60 об, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, або щонайменше близько 95 95 мас./мас. екстрагованого рослинного ліпіду. У варіанті реалізації винаходу екстрагована олія за винаходом не змішується з іншим маслом, таким як ДПК,

Зо продукована іншим джерелом (наприклад, ДПК з риб'ячого жиру). У варіанті реалізації винаходу, після екстракції одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДПК, пальмітинова кислота : ДПК, лінолева кислота: ДПК ії загальні б жирні кислоти : загальні 03 жирні кислоти істотно не змінюються (наприклад, не більше, ніж 10 95 або 5 95 змін), в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. В іншому варіанті реалізації винаходу екстраговану олію рослини не обробляють процедурою, такою як гідрогенізація або фракціонування, яка може змінювати одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДПК, пальмітинова кислота : ДПК, лінолева кислота : ДПК і загальні б жирні кислоти : загальні 003 жирні кислоти, в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині.

Екстрагована рослинна олія за винаходом може містити молекули, що не є жирними кислотами, наприклад, стероли.

У даному описі такі терміни, як «екстрагований мікробний ліпід» або «екстрагована мікробна олія» мають значення, аналогічне відповідним термінам «екстрагований рослинний ліпід» і «екстрагована рослинна олія», відповідно, причому основна відмінність полягає у джерелі ліпіду або олії.

В цьому документі «олія (масло)» являє собою композицію, що містить в основному ліпід і є рідкою за кімнатної температури. Наприклад, олія за винаходом переважно містить щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95 або щонайменше 90 95 мас. ліпіду.

Як правило, очищена олія містить щонайменше 90 95 мас. триацилгліцеролів (ТАГ), від вмісту ліпіду в олії. Мінорні компоненти олії, такі як діацилгліцероли (ДАГ,, вільні жирні кислоти (ВЖК), фосфоліпід і стероли, можуть бути присутніми, як розкрито в цьому документі.

В цьому документі термін «жирна кислота» позначає карбонову кислоту (або органічну кислоту), часто з довгим аліфатичним хвостом, насиченим або ненасиченим. Зазвичай жирні кислоти містять ланцюг вуглець-вуглецевих зв'язків завдовжки щонайменше 8 атомів вуглецю, більш переважно завдовжки щонайменше 12 атомів вуглецю. Переважні жирні кислоти за винаходом містять вуглецеві ланцюги завдовжки 18-22 атомів вуглецю (жирні кислоти С18, С20,

С22), більш переважно 20-22 атоми вуглецю (С20, С22) і, найбільш переважно, 22 атоми вуглецю (С22). Більшість жирних кислот, що зустрічаються в природі, містить парну кількість атомів вуглецю, оскільки в їх біосинтезі приймає участь ацетат, що містить два атоми вуглецю.

Жирні кислоти можуть бути у вільному стані (неестерифіковані) або в естерифікованій формі, бо наприклад, як частина тригліцеролу, діацилгліцеролу, моноацилгліцеролу, зв'язки з адил-КоА

(тіоестер) або іншої форми зв'язку. Жирна кислота може бути естерифікованою як фосфоліпід, наприклад, форми фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, фосфатидилгліцеролу, фосфатидилінозитолу або дифосфатидилгліцеролу. У варіанті реалізації жирна кислота естерифікована метильною або етильною групою, наприклад, метиловий або етиловий естер ПНЖК С20 або С22. Переважними жирними кислотами є метилові або етилові естери ЕПК або ДПК або ЕПК, ДПК і ДГК або ЕПК і ДПК. «Насичені жирні кислоти» не містять подвійних зв'язків або інших функціональних груп уздовж ланцюга. Термін «насичений» позначає водень, з тим, що всі атоми вуглецю (окрім групи карбонової кислоти |-СООНІ) містять максимально можливу кількість водню. Іншими словами, омега (0)) кінець містить З атоми водню (СНЗ-), і кожен атом вуглецю в межах ланцюга містить 2 атоми водню (-СН2-). «Ненасичені жирні кислоти» за формою подібні до насичених жирних кислот, за винятком того, що одна або більше алкенових функціональних груп присутні вздовж ланцюга, причому кожен алкен замінює одинарний зв'язок «-СН2-СН2г-» частини ланцюга подвійним зв'язком «-

СнН-СН-» (тобто, вуглець приєднаний подвійним зв'язком до іншого атома вуглецю). Два наступні атоми вуглецю в ланцюгу, які приєднані до кожної із сторін подвійного зв'язку, можуть бути присутніми в цис або транс конфігурації, переважно у цис конфігурації. У варіанті реалізації склад жирних кислот ліпіду або олії за винаходом включає менш ніж 1 96 жирних кислот, що містять подвійні вуглець-вуглецеві зв'язки у транс конфігурації (транс жирні кислоти).

В цьому документі термін «мононенасичена жирна кислота» позначає жирну кислоту, що містить щонайменше 12 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу, і лише одну алкенову групу (подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок) в ланцюгу. В цьому документі терміни «поліненасичена жирна кислота» або «ПНЖК» позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 12 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу і щонайменше дві алкенові групи (подвійні вуглець-вуглецеві зв'язки).

В цьому документі терміни «довголанцюгова поліненасичена жирна кислота» і «ДЛ-ПНЖК» позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 20 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу і щонайменше два подвійні вуглець-вуглецевих зв'язки, і таким чином включають ДДЛ-ПНЖК. В цьому документі терміни «поліненасичена жирна кислота з дуже довгим ланцюгом» і «ДДЛ-

Зо ПНЖК» позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 22 атоми вуглецю у вуглецевому ланцюгу і щонайменше три подвійні вуглець-вуглецевих зв'язки. Звичайно, кількість атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу жирних кислот відноситься до нерозгалуженого вуглецевого ланцюга. Якщо вуглецевий ланцюг розгалужений, кількість атомів вуглецю виключає атоми вуглецю бічних груп. В одному варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена 35 жирна кислота являє собою 03 жирну кислоту, тобто, містить десатурацію (подвійний вуглець- вуглецевий зв'язок) в положенні третього вуглець-вуглецевого зв'язку від метильного кінця жирної кислоти. В іншому варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота є 0б жирною кислотою, тобто, містить десатурацію (подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок) в положенні шостого вуглець-вуглецевого зв'язку від метильного кінця жирної кислоти. 40 В іншому варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота вибрана з групи, що складається з: арахідонової кислоти (АРК, 20:4А5,8,11,14; 06), ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК, 20:4Д8,11,14,17, 03), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК, 20:5Д5,8,11,14,17; 03), докозапентаєнової кислоти (ДПК, 22:5А47,10,13,16,19, 03) або докозагексаєнової кислоти (ДГК, 22:6Л4,7,10,13,16,19, 03). Крім того, ДЛА-ПНЖК можуть являти собою дигомо-у-лінолеву кислоту 45 (ДГЛК) або ейкозатриєнову кислоту (ЕТрК, 20:3А11,14,17, Ф3). Буде очевидно, що ДЛ-ПНЖК, одержана у відповідності до винаходу, може бути сумішшю будь-яких або всіх згаданих вище сполук, і може містити іншу ДЛ-ПНЖК або похідні будь-якої з наведених ДЛ-ПНЖК. У переважному варіанті реалізації 03 жирні кислоти являють собою щонайменше ДПК або ДПК і

ДГК або ЕПК, ДПК і ДГК, або ЕПК і ДПК. Наприклад, ДГК присутня на рівні від 30,1 95 до 35 95 від 50 складу загальних жирних кислот. У варіанті реалізації ДПК присутня на рівні від близько 7 95 до 95 або 35 95, і ДГК присутня або відсутня, або, якщо вона присутня, то присутня на рівні менш ніж 2,0 95, переважно менш ніж 1,0 95, більш переважно, менш ніж 0,5 95 від загального складу жирних кислот у композиції і, найбільш переважно, відсутня або не піддається виявленню. Це може забезпечуватися відсутністю активності Д4-десатурази у клітині. У варіанті реалізації рівень ДПК перевищує ЕПК, більш переважно перевищує рівень кожної з ЕПК і ДГК, найбільш переважно перевищує сумарний рівень ЕПК і ДГК. У даному варіанті реалізації ДГК може бути відсутня або, якщо вона присутня, то присутня на рівні менш ніж 0,5 95 від складу загальних жирних кислот.

Додатково, в цьому документі терміни «довголанцюгова поліненасичена жирна кислота» і 60 «поліненасичена жирна кислота з дуже довгим ланцюгом» позначають жирну кислоту, що знаходиться у вільному стані (неестерифіковану) або в естерифікованій формі, наприклад, як частина тригліцеролу, діацилгліцеролу, моноацилгліцеролу, зв'язки з ацил-КоА (тіоестер) або іншої форми зв'язку. У тригліцеролі, ДЛ-ПНЖК або ДДЛ-ПНЖК, такі як ДПК, можуть бути естерифіковані у положеннях 5п-1/3 або 5п-2, або тригліцерол може містити дві або три ацильних групи, вибрані із адильних груп ДЛ-ПНЖК і ОДЛ-ПНЖК. Наприклад, тригліцерол може містити ДПК як в 5п-1, так і в 5п-3 положеннях. Жирна кислота може бути естерифікованою як фосфоліпід, наприклад, форми фосфатидилхоліну (ФХ), фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, фосфатидилгліцеролу, фосфатидилінозитолу або дифосфатидилгліцеролу. Тому, ДЛ-ПНЖК може бути присутньою як суміш форм в ліпіді клітини або очищеній олії або ліпіді, екстрагованих з клітин, тканин або організмів. У переважних варіантах реалізації винаходу розкривається олія, що містить щонайменше 75 95 або щонайменше 85 95 триацилгліцеролів, причому решта представлена іншими формами ліпіду, такими як згадані вище, у яких присутні щонайменше вказані триацилгліцероли, що містять ДЛ-

ПНЖК. В подальшому олія може бути додатково очищена або оброблена, наприклад гідролізом із сильною основою, з метою вивільнення вільних жирних кислот, або дистиляцією, тощо.

В цьому документі вираз «загальні б жирні кислоти» або «загальний вміст 0б жирних кислот» або подібний позначає суму всіх 006 жирних кислот, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену як відсоток від загального вмісту жирних кислот.

Вказані б жирні кислоти включають ( за наявності) ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК ї ю0б-ДПК, але виключають будь-які 003 жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти. Все 0б жирні кислоти, присутні в рослинах, насінні, ліпіді або оліях за винаходом, входять до класу поліненасичених жирних кислот (ПНЖК).

В цьому документі вираз «нові б жирні кислоти» або «вміст нових 0б жирних кислот» або подібний позначає суму всіх 0б жирних кислот, за винятком ЛК, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.

Такі нові 06 жирні кислоти є жирними кислотами, продукованими в клітинах, рослинах, частинах рослини і насінні за винаходом шляхом експресії генетичних конструкцій (екзогенні полінуклеотиди), введених в клітини, і включають (за наявності) ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК ї об-ДПК, але виключають ЛК і будь-які 03 жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти. Характерний загальний вміст 0б жирних кислот і вміст нових 0б жирних кислот визначається за перетворенням жирних кислот у зразку на МЕЖК і результатами аналізу ГХ, як розкрито в

Прикладі 1.

В цьому документі вираз «загальні 003 жирні кислоти» або «загальний вміст 03 жирних кислот» або подібний позначає суму всіх 003 жирних кислот, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.

Такі 03 жирні кислоти включають (якщо вони присутні) АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК, і виключають будь-які б жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти. Все б жирні кислоти, присутні в рослинах, насінні, ліпіді або оліях за винаходом, входять до класу поліненасиченних жирних кислот (ПНЖК).

В цьому документі вираз «нові 03 жирні кислоти» або «вміст нових 003 жирних кислот» або подібний позначає суму всіх 003 жирних кислот, за винятком АЛК, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.

Такі нові 03 жирні кислоти є 003 жирними кислотами, продукованими в клітинах, рослинах, частинах рослин і насінні за винаходом шляхом експресії генетичних конструкцій (екзогенні полінуклеотиди), введених в клітини, і включають (якщо вони присутні) СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК,

ДПК і ДГК, але виключають АЛК і будь-які б жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти.

Характерний загальний вміст 03 жирних кислот і вміст нових 03 жирних кислот визначається за перетворенням жирних кислот у зразку на МЕЖК і результатами аналізу ГХ, як розкрито в

Прикладі 1.

Як буде зрозуміле кваліфікованому фахівцю, термін «одержання частини рослини» як стадія у способі за винаходом може включати одержання однієї або більше частин рослини для застосування у способі. Одержання частини рослини включає збирання врожаю частини рослини із рослини, наприклад, за допомогою комбайна, або придбання частини рослини або одержання частини рослини від постачальника. В іншому прикладі, одержання частини рослини може бути придбанням рослини у будь-кого іншого, хто зібрав урожай частини рослини.

Білки десатураза, елонгаза і ацилтрансфераза та гени, що кодують їх, які можуть застосовуватися у відповідності до винаходу, є будь-якими з відомих в рівні техніки або їх гомологами або похідними. Приклади таких генів і розмір кодованих білків наведені в Табл. 1.

Ферменти десатурази, для яких продемонстровано участь в біосинтезі ДЛ-ПНЖК, всі належать

Б до групи так званих «фронт-енд» десатураз. Переважними білками або комбінаціями білків є кодовані генетичними конструкціями, запропонованими в даному описі як БЗЕО ІЮ МО: 1 і 2.

У даному документі термін «фрон-енд десатураза» позначає члена класу ферментів, який вводить подвійний зв'язок між карбоксильною групою і вже наявною ненасиченою частиною ацильного ланцюга ліпідів, причому він структурно характеризується присутністю М-кінцевого домену цитохром 65, разом з типовим доменом десатурази жирних кислот, який містить три високою мірою консервативних гістидинових бокси (Маріег еї а!ї., 1997).

Активність будь-якої з елонгаз або десатураз для застосування у винаході може бути протестована шляхом експресії гена, що кодує фермент, у клітині, такій як, наприклад, рослинна клітина, або переважно у соматичних ембріонах або трансгенних рослинах, і визначення наявності у клітини підвищеної здатності до продукування ДЛ-ПНЖК, в порівнянні з порівнянною клітиною, ембріоном або рослиною, у яких фермент не експресується.

В одному варіанті реалізації винаходу одна або більш десатураз та/або елонгаз для застосування у винаході, можуть бути виділені з мікроводоростей, тобто їх амінокислотна послідовність є ідентичною поліпептиду, що може бути виділений з мікроводоростей.

Хоча деякі ферменти конкретно описані в цьому документі як «біфункціональні», відсутність такого терміну не обов'язково означає, що конкретний фермент не володіє іншою активністю, окрім конкретно визначеної.

Таблиця 1

Клоновані гени, що беруть участь в біосинтезі ДЛА-ПНЖК

Фермент Тип Номери Розмір Посилання організму доступу |білка (ак) да- . с. .

Ецдієпа адгасіїїв АУ2г78558 Меуєг вї а!., 2003 0 |ІВодорості | Раміома ІшіїПегії АУЗ332747 Топоп ві а!., 2003 1 Пвосігувів даірапа ААМ33631 Регеїга в! а!., 20046 11111011 |Рамомавайна ///// ААМ1ТБ136 пом егаі., 2007

ААМ75707

Траустохітри- | Тпгайвіоспуїйнит ААМ75708 дієві ацшеит ААМ75709 515 Отсутствуют

ААМ75710

Тпигаймвіоспуїніиит 5р. . дЬ- . . Спо єї а!., 19996

Міснає!5оп еї аї.,

Саєпотарайїйів АРГ11440, 19986р;

Нематода еіедапо ММ 069350 447 Уане апа Вгом/зе, 19996

Міснає!5оп еї аї.,

Гриби Мопіегеїа аіІріпа АгРО67654 446 /|1998а;

Кпиїгоп еї а!., 1998 1 ТРуїйіцт ітедшаге АЕ419297 Нопа віа!., 2002а дівсоїдент 77717117 |Зароївопіаадієїта. | | 470 |М/О02081668 . . Рпаеодасу шт Ротегоие еї аї., 00 ІВодорості | Тнгайвіоспуйит зр. | АР489588 Оїи ві а!., 2001 ашеит 77771111 | Івосптувівдаірала.// | -: | 442 |МО0г2081668

Тип Номери Розмір обериснт | орквму | Вия | доступу Юілюсаю Посилання

Мох Магспата АУ5В83465 Каїкама е! а!., 2004 роїтутогріа дб- . . Сно єї а!., 1999а; 11101771 |Мивтизсшив // |ММ 019699, 444 /Споеїаї. 19994 вівдапз 00 ІРослини /// |Вогадо ойісіпа!е5 079010 Зауапома ві а!., 1997

Еспішт АХО55117 Сагсіа-Магою еї аї.,

АХУО55118 2002 17111111 |Рбтшахмай ГТ АМ23а127 зЗауапома віа!., 2003 1 ТАпетопле ІємеїйЇІвї АР536525 | 446 |М/Ніпвеу ві а!., 2003 11111111 Ф0ДМохи | Сегаюдопригригтєив ГАШ250735 зрепіпа еї аї., 2000

Магспапна АУ583463 Каїкама е! а!., 2004 роїтутогріа 1 ТРіпувзсотійнеїа раїєп5 | САА110ОЗ3 сіїКе еї а!., 1998

Ниапа сеї а!., 1999;

Гриби Мопіеєгеїа аіІріпа АР110510 457 зЗакКигавдапі еї аї.,

АвОг20032 1999 1 ТРуїйіцт ітедшаге АгЕ419296 Нопа віа!., 2002а 1 ЇМисог сіїсіпеПоїдез | АВО52086 МОВІ" 11111171 |видАпігорих///// |АУз2гог88 папа еї а!., 2004 11111771 |Баргоієдпіадієїна, | 11453 |МУ/О0гов1668 . . Рпаєдастут Ротегоие еї аї., 11111111 |Бактерї |БСупеспосувів//// | 11421 Неддау еї а!., 1993 ашеит

Біфункціона- льна Д5Б/Ддб- Бапіо гетпіо АРЗ309556 444 |Набвііпоз єї а!., 2001 десатураза

С20 дВ- . а маїїїв апа Вгомузе, 0 |Рослини ///- |Вогадо ойісіпа!є5 АДО43277 Орепіпа еї а!., 2001 0 |Мохи 00/00 ІРпузсотійеїа раїєп5. | АЕ428243 7апк еї а!., 2002 роїтутогріа 11111111 |Водорості |Рамомаїшнегі" | 50! |мОоз3078639 1 ІТвгаивіоснутит АХ9О51565 МО 03093482 вид бод АХ214454 УГО 0159128

Тпгаймвіоспуїнит

ПНЖК- . . Ї еопага єї а!., 20006р; 11177111 |Вайовпомедісєнв // |ЇАВО71985 Іпадакі еї а!., 2002 17711111 |Вайовпомедісив" АВО71986 Іпадакі еї а!., 2002 17111111 |Мовтивсшив//// ЇАР170907 Тугаїк еї а!., 2000 11711111 |Мивтивзсшив /// ГАРТ70908 Тугаїк еї а!., 2000 11111111 Ф|Риба |Оапіотейо | АЕБЗ32782 (|291 (282) Адараєїа)!., 2004 17111111 |Оапіотейо" | ММ 199532 266 Повіаї. 2003 , Саєпотарайїйів АррОї! єї а!., 1998 ашеит тн | віть шен ГА оте організму доступу |білка (ак) 11111017 |Рамомаішней" | | 320 |М0о3078639..ЙШ-ХЖ 11111101 |Ейдіепадгасів///// | 000 | 258 |МОовлевг9 11111101 |Ругатітопавсоюавю | | 268 |МО2010/057246 11111110 ІвидРамомасСсМрРА5У ААУЗІЄЗО| 277 |Регеігаеіа)., 20045 11111101 |Рамомавайна |ААМТ5135| 302 |Норепеїа),2009 фено оо рин зе юн роеидопапа 11111111. |Риба |Опсотупспив туківв |ІСАМБ58б2| 295 )/|М/006/008099 Ж ре ще фен, зе фоюоюнньяь роїтутогріа " перулумли. порі. піт.пій.дом/ "7" Функція не доведена/не продемонстрована

Десатурази

В цьому документі термін «десатураза» позначає фермент, що здатний вводити подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок до ацильної групи жирнокислотного субстрату, який звичайно знаходиться в естерифікованій формі, наприклад, естери ацил-КоА. Ацильна група може бути естерифікована до фосфоліпіду, наприклад, фосфатидилхолін (ФХ), або до білка-носія ацилу (БНА), або, в переважному варіанті реалізації винаходу, до КоА. Десатурази загалом можуть бути розділені на три групи, відповідно. В одному варіанті реалізації винаходу десатураза являє собою фронт-енд десатуразу.

В цьому документі «А4-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації із введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 4-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Щонайменше «Д4-десатураза» здатна перетворювати ДПК на ДГК. Переважно, «Д4--десатураза» здатна перетворювати ДПК-КоА на

ДГК-КоА, тобто, вона є ацил-КоА десатуразою. У варіанті реалізації «Д4-десатураза» здатна перетворювати ДПК, естерифіковану в положенні 5п-2 ФХ на ДГК-ФХ. Переважно д4- десатураза володіє більш високою активністю по відношенню до ДПК-КоА, ніж по відношенню до ДПК-ФХ. Стадія десатурації з утворенням ДГК з ДПК каталізується Д4-десатуразою в організмах, що не відносяться до ссавців, і ген, що кодує даний фермент, виділений із виду прісноводних найпростіших Ешдіепа дгасіїї5 і морських видів Тпгаиз(оспуїгічшт (Ом еї аї., 2001;

Меуег еї аЇ., 2003). В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Да4- десатурази відповідає представленій в ЗЕО ІЮ МО: 28, або Д4-десатуразі виду Тпгаизіоспуїгічт, її біологічно активному фрагменту або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній ЗЕО ІЮ МО: 28. У варіанті реалізації рослина, частина рослини (така як насіння) або клітина за винаходом або застосовувані у відповідності до винаходу, що продукують високі рівні

ДПК, наприклад, ДПК становить від 5 956 до 35 905 від загального вмісту жирних кислот, що екстрагуються, не містять гена, що кодував би функціональну Л4-десатуразу.

В цьому документі «Д5-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 5-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. У варіанті реалізації жирнокислотний субстрат являє собою ЕТК, і фермент продукує ЕПК. Переважно, «А5-десатураза» здатна

Зо перетворювати ЕТК-КоА на ЕПК-КоА, тобто є ацил-КоА десатуразою. У варіанті реалізації «Д5- десатураза» здатна трансформувати ЕТК, естерифіковану у положенні 5п-2 ФХ. Переважно

Д5-десатураза володіє більш високою активністю по відношенню до ЕТК-КоА, ніж по відношенню до ЕТК-ПК. Приклади «А5-десатураз» наведені у Киї?-І оре? еї аї. (2012) і Реїпіє єї а. (2010а), а також у Табл. 1 цього документу. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Д5-десатурази відповідає представленій в ЗЕО ІЮО МО: 20, її біологічно активному фрагменту або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній 5ЕО ІЮ МО: 20. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Д5Б- десатурази відповідає представленій ЗЕО ІЮ МО: 22, її біологічно активному фрагменту, або послідовності амінокислот, щонайменше на 53 95 ідентичній 5ЕО ІО МО: 32. В іншому варіанті реалізації винаходу А5-десатураза одержана з виду Тпгаизіоспуйішт або Етіййапіа пихіеуї.

В цьому документі «Дб-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, із введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 6-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. У варіанті реалізації жирнокислотний субстрат являє собою АЛК, і фермент продукує СДК. Переважно, «Дб-десатураза» здатна перетворювати АЛК-КоА на СДК-КоА, тобто є ацил-КоОА десатуразою. У варіанті реалізації «Дб- десатураза» здатна перетворювати АЛК, естерифіковану в положенні 5п-2 ФХ. Переважно, Дб- десатураза володіє більш високою активністю по відношенню до АЛК-КоОА, ніж по відношенню до АЛК-ФХ. Крім того, Аб-десатураза може володіти активністю Д5-десатурази, і при цьому носити назву А5Б/Аб біфункціональної десатурази, за умови, що вона володіє більш високою активністю Дб-десатурази відносно АЛК, ніж активністю Д5-десатурази відносно ЕТК. Приклади

Аб-десатураз наведені у Виї?-І оре? еї аї. (2012) і Реїгіє еї а. (2010а), а також в Табл. 1 цього документу. Переважні Аб-десатурази одержані з Місготопаз ризійа, Руїйпішт ітедшіаге або

Овігеососсивз їашгії.

У варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза додатково характеризується наявністю щонайменше двох, переважно всіх трьох і переважно в рослинній клітині, з наступного: ії) вища активність Лб-десатурази по відношенню до а-ліноленової кислоти (АЛК, 18:349,12,15, 03), ніж по відношенню до лінолевої кислоти (ЛК, 18:2/А9,12, б) як жирнокислотного субстрату; ії) вища активність Дб-десатурази по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної в положенні 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату; іїії) активність Д8-десатурази по відношенню до ЕТрК. Приклади таких Аб-десатураз наведені в

Табл. 2.

У варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза володіє вищою активністю по відношенню до 03 субстрату, ніж по відношенню до відповідного 0б субстрату, і володіє активністю по відношенню до АЛК з утворенням октадекатетраєнової кислоти (стеаридонова кислота, СДК, 18:4А6,9,12,15, 03), з ефективністю щонайменше 30 95, більш переважно щонайменше 40 95, або найбільш переважно щонайменше 50 95, при експресії з екзогенного полінуклеотиду в рекомбінантній клітині, такій як рослинна клітина, або щонайменше 35 95 при експресії в дріжджовій клітині. В одному варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза володіє вищою активністю, наприклад, щонайменше близько в 2 рази вищою активністю Дб-десатурази по відношенню до АЛК, ніж по відношенню до ЛК як жирнокислотного субстрату. В іншому варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза володіє вищою активністю, наприклад, щонайменше близько

Зо в 5 разів вищою активністю Аб-десатурази або щонайменше в 10 разів вищою активністю по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної в положенні 50п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату. В іншому варіанті реалізації винаходу, Дб- десатураза володіє активністю по відношенню до обох жирнокислотних субстратів -- АЛК-КоА і

АЛК, приєднаних в положенні 5п-2 ФХ.

Таблиця 2

Десатурази, які продемонстрували активність на субстраті ацил-КоА

Фермент Тип Номери Розмір Посилання організму доступу білка (ак) . МапіопієЇїа Нойтант ев аї.,

Реїне вї аї.,

Містотопаз ривіїїа | ЕЕНЬ8637 2010а (ЗЕО ІЮ

МО: 13 . МапіопієЇїа Нойтант ев аї.,

Руїпійт Хие єї аї., 2012;

Гриби . Хие єї аї., 2012;

ШИ (ооміцет) гитогит ГМУЗ622131 Зб жмоОг008/054565

Зо

В одному варіанті реалізації винаходу Аб-десатураза не володіє активністю Д5-десатурази по відношенню до ЕТК, яка могла би бути виявлена. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Дб-десатурази представлена 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 19 або ЗЕО

ІО МО: 20, їх біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 77 У5 ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 16, ЗЕО ІЮ МО: 19 або 5ЕО ІО МО: 20. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Дб-десатурази представлена 5ЕО ІЮ МО: 19 або 5ЕО ІЮ

МО: 20, їх біологічно активним фрагментом або послідовністю амінокислот, щонайменше на 67

Фо ідентичною одній або обом з 5ЕО ІЮ МО:19 або 5ЕО ІЮО МО: 20. Крім того, ДАб-десатураза може володіти активністю д8-десатурази.

В цьому документі «Д8-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 8-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Щонайменше Д8-десатураза здатна перетворювати ЕТрК на ЕТК. Переважно, «Ав-десатураза» здатна перетворювати ЕТрК-КоА на

ЕТК-КоА, тобто є ацил-КоА десатуразою. У варіанті реалізації «Д8-десатураза» здатна перетворювати ЕТрК, естерифіковану в положенні 5п-2 ФХ. Переважно О8-десатураза володіє більш високою активністю по відношенню до ЕТрК-КоА, ніж по відношенню до ЗТРК-ПК. Крім того, ДАв-десатураза може володіти активністю Д8-десатурази, і при цьому носити назву Дб/Д8 біфункціональної десатурази, за умови, що вона володіє більш високою активністю Дв8- десатурази по відношенню до ЕТрК, ніж активністю Дб-десатурази по відношенню АЛК.

Приклади А8-десатураз наведені у Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Д8-десатурази відповідає представленій ЗЕО ІЮ МО: 37, її біологічно активним фрагментом або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній ЗЕО ІЮ МО: 37.

В цьому документі «0ш3З-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вугллецевого зв'язку в положенні 3-ого вуглець-вуглецевого зв'язку від метилового кінця жирнокислотного субстрату. Таким чином, Ф3-десатураза може перетворювати ЛК на АЛК і ГЛК на СДК (всі С18 жирні кислоти), або ДГЛК на ЕТК та/або АРК на

ЗПК (020 жирні кислоти). Деякі 03-десатурази (група І) володіють активністю тільки на С18 субстратах, таких як рослинні і ціанобактеріальні 03-десатурази. Такі о3-десатурази також є

Д15-десатуразами. Інші 3-десатурази виявляють активність на субстратах С20 без активності

Зо (група Ії) або з деякою активністю (група Ії) на субстратах С18. Такі о3-десатурази також є А17- десатуразами. Переважними о03-десатуразами є група Ії типу, яка перетворює ЛК на АЛК, ГЛК на СДК, ДГЛК на ЗТК і АРК на ЗПК, наприклад, Ріспіа равіогі5 03-десатураза (ЗЕО ІЮО МО: 6).

Приклади о3-десатураз включають описані Регеїга еї аїІ. (2004а) (03-десатураза ЗаргоІедпіа дісіїпа, група ІІ), Ногідиспі еї аї. (1998), Вегрегісп еї аї. (1998) і 5руспайа еї аї. (1997) (03- десатураза С. еІедап5, група І). В переважному варіанті реалізації винаходу 03-десатураза являє собою грибкову 03-десатуразу. В цьому документі «грибкова 03-десатураза» позначає 0шЗ3-десатуразу, одержану з грибкового джерела, в тому числі, ооміцетного джерела, або її варіант з послідовністю амінокислот, щонайменше на 95 95 ідентичною їй. Гени, що кодують численні 03-десатурази, виділені з грибкових джерел, таких як, наприклад, Рпуїорпїйога іптезіап5 (номер доступу САУЗОВ87О, УМО2005083053; 5ЕО ІЮО МО: 47), заргоієедпіа дісіїпа (номер доступу ААК20444, Регеїга еї аіІ., 2004а і патент США Мо 7211656), Руїпішт ігедшаге (МУО2008022963, Група ІІ; 5ЕБО ІО МО: 49), МогіегейПа аїріпа (ЗаКигадапі еї аї., 2005; номер доступу ВАБУО1495; М/О2006019192), Тпаїіазвзіозіга роенцдопапа (Агтрги5і еї аї.,, 2004; номер доступу ХР 002291057; ММО2005012316, 5ЕО ІО МО: 48), І аспапсеа Кішпумегі (також відомий як засспаготусез Кішсумегі; Оишга еї аї., 2004; номер доступу АВ118663). Хиє еї аї. (2012) описує Ф3- десатурази з ооміцетів Руїйішт арпапідеппайт, Рпуорпїйога 5оідае і Рпуоріїнога гатогит, здатні ефективно перетворювати жирнокислотні субстрати 06 на відповідні 003 жирні кислоти, з перевагою у відношенні субстратів С20, тобто ті, що володіють вираженішою активністю Д17- десатурази порівняно з активністю Д15-десатурази. Такі ферменти не володіють активністю д12-десатурази, але здатні використовувати жирні кислоти в ацил-КоА і фосфоліпідній фракції як субстрати.

У більш переважному варіанті реалізації винаходу грибкова 03-десатураза являє собою 03- десатуразу/л15-десатуразу Ріспіа разіогі5 (також відома як КотадаїаєїІа равіогі5) (7Напо еї аї., 2008; номер доступу ЕР116884; 5ЕО ІО МО: 6) або поліпептид, який щонайменше на 95 95 ідентичний їй.

У варіанті реалізації винаходу 03З-десатураза здатна здійснювати щонайменше одне з наступних перетворень: АРК на ЕПК, ДГЛК на ЕТК, ГЛК на СДК, АРК на ЕПК і ДГЛК на ЕТК, АРК на ЕПК і ГЛК на СДК, або всі три з них.

В одному варіанті реалізації винаходу 03-десатураза володіє активністю А17-десатурази по бо відношенню до жирної кислоти С20, яка містить щонайменше три подвійних вуглець-вуглецевих зв'язки, переважно АРК. В іншому варіанті реалізації винаходу 03-десатураза володіє активністю ДІ15-десатурази по відношенню до жирної кислоти С18, яка містить три подвійних вуглець-вуглецевих зв'язки, переважно ГЛК. Переважно обидва види активності присутні.

В цьому документі «А12-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 12-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Звичайно АЛ12-десатурази перетворюють олеоїл-фосфатидилхолін або олеоїл-КоА на лінолеоїл-фосфатидилхолін (18:1-

ФХ) або лінолеоїл-КоА (18:1-КоА), відповідно. Підклас, що використовує пов'язаний з ФХ субстрат, називають фосфоліпід-залежними Д12-десатуразами, другий підклас -- ацил-Код- залежними А12-десатуразами. Рослинні і грибкові А12-десатурази звичайно відносяться до першого підкласу, тоді як тваринні А12-десатурази відносяться до другого підкласу, наприклад,

Дд12-десатурази, кодовані генами, які клоновані з комах 2Ппоци еї аїЇ. (2008). Численні інші послідовності А1Т2-десатурази можуть бути легко ідентифіковані шляхом пошуку в базах даних послідовностей.

В цьому документі «А15-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 15-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Численні гени, що кодують А15- десатурази, клоновані з рослинних і грибкових видів. Наприклад, в 55952544 розкриті нуклеїнові кислоти, що кодують рослинні А15-десатурази (ЕАОЗ). Ці ферменти містить мотиви амінокислот, які були характерними для рослинних А15-десатураз. У УМО200114538 розкритий ген, що кодує БАЮЗ сої. Численні інші послідовності ДТ5-десатурази можуть бути легко ідентифіковані шляхом пошуку в базах даних послідовностей.

В цьому документі «А17-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 17-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Крім того, А17-десатураза розцінюється як 03-десатураза, якщо вона діє на субстрат С20, з введенням десатурації в положенні зв'язку 003.

У переважному варіанті реалізації винаходу Д12-десатураза та/або Д15-десатураза являє собою грибкову Д12-десатуразу або грибкову Д15-десатуразу. В цьому документі «грибкова

Зо Д12-десатураза» або «грибкова Д15-десатураза» позначає Д12-десатуразу або Д15-десатуразу, одержану з грибкового джерела, зокрема, ооміцетного джерела, або її варіант, послідовність амінокислот якого є щонайменше на 95 95 ідентичною їй. Гени, що кодують численні десатурази, виділені з грибкових джерел. У 05 7211656 розкрита Л12-десатураза із ЗаргоІедпіа аісіпа. У М/О2009016202 розкриті грибкові десатурази з Неїобаеїййа горивіа, І ассагіа бБісоїпог,

Гоша дідапієа, Місгтосоїєн5 сПпіпопоріазієїх, Мопозіда Бгемісоїй5, МусозрпаєгейМа Піепвів,

МусозраеєгеМйа дгатіпісоїа, Маедієга дгибеп, Месійа Паєтайюсосса, Метаїйозівйа месіеєпвів,

Рпусотусез ріаКезієвапив, Тгісподепта гевії, Рпузсотіїнеїйа раїєпв, Розійа ріасепіа, ЗеіадіпеПа тоеїПепаогнії і Місгодоспішт пімаіе. У М/О2005/012316 розкрита А12-десатураза з Тпаїазвіовіга рхешйдопапа та інших грибів. У ММО2003/099216 розкриті гени, кодуючі грибкові Д12-десатурази і д15-десатурази, виділені з Меигозрога сгазза, Азрегуйи5 підшапз, Воїгуїй5 сіпегеа і МогіієгеПМа аіІріпа. У УМО2007133425 розкриті грибкові А15 десатурази, виділені з: Засспаготусез Кішйуметгі,

Мопієегеїа аїріпа, А5регуйШивє підшап5, Мешйгозрога стазза, Ризагпйт дгатіпеагит, Ризагйт топіїйопте і Мадпаройне дгізеа. Переважна Л12 десатураза виділена з РНуїорнпіпога 5оі|ає (Виі2-І оре? ві аї., 2012).

Іншим підкласом грибкових А12-десатураз і грибкових АТ5-десатураз є біфункціональні грибкові Д12/А15-десатурази. Гени, що кодують їх, клоновані з Ризагішт топоїїйогте (номер доступу 0О272516, ЮОатиде еї аї., 2006), Асапіпатоебра сазіеПапії (номер доступу ЕБО17656,

Зауапома вї аї!., 2006), РеКкіпзи5 таїгіпив (М/О2007042510), Сіамісер5 ритригеа (номер доступу

ЕР5З36898, Меезаруоадізик єї а!., 2007) і Соргіпи5 сіпегеи5 (номер доступу АЕ269266, 2Папо еї аї.,

БО 2007).

В іншому варіанті реалізації винаходу (03-десатураза володіє щонайменше деякою активністю, переважно більшою активністю, по відношенню до субстрату ацил-КоА, ніж до субстрату відповідного ацил-ФХ. В цьому документі «відповідний субстрат ацил-ФХ» позначає естерифікований жирною кислотою в положенні 5п-2 фосфатидилхолін (ФХ), в якому жирна кислота є такою ж жирною кислотою, як в субстраті ацил-КоА. Наприклад, субстрат ацил-КоА може бути АРК-КОА, і тоді відповідний субстрат ацил-ФХ являє собою 5п-2 АРК-ФХ. У варіанті реалізації винаходу активність щонайменше вдвічі вища. Переважно о03-десатураза володіє щонайменше деякою активністю по відношенню до субстрату ацил-КоА і відповідного субстрату ацил-ФХ, і володіє активністю по відношенню до субстратів С18 і С20. Приклади таких 03- 60 десатураз відомі серед клонованих грибкових десатураз, наведених вище.

В іншому варіанті реалізації винаходу о3-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену ЗЕО ІЮ МО: 6, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, яка є щонайменше на 60 95 ідентичною 5ЕО ІЮО МО: 6, переважно є щонайменше на 90 95 або щонайменше на 95 95 ідентичною ЗЕО ІЮ МО: 6.

Ще в одному варіанті реалізації винаходу десатураза для використання в цьому винаході володіє вищою активністю по відношенню до субстрату ацил-КоА, ніж відповідного субстрату ацил-ФХ. В іншому варіанті реалізації винаходу десатураза для використання в цьому винаході володіє вищою активністю по відношенню до субстрату ацил-ФХ, ніж відповідного субстрату ацил-КоА, але володіє деякою активністю по відношенню до обох субстратів. Як окреслено вище, «відповідний субстрат ацил-ФХ» позначає естерифікований жирною кислотою в положенні 5п-2 фосфатидилхолін (ФХ), в якому жирна кислота є такою ж, як жирна кислота в субстраті ацил-КоА. У варіанті реалізації винаходу вища активність означає щонайменше вдвічі вищу активність. У варіанті реалізації винаходу десатураза являє собою Д5- або Дб-десатуразу, або 03-десатуразу, приклади яких розкриті, без обмеження, в Табл. 2. З метою тестування того, на який субстрат діє десатураза, а саме, на субстрат ацил-КоА або ацил-ФХ, можуть бути проведені аналізи на дріжджових клітинах, як описано в ЮОотегопце еї аї. (2003) ії (2005). Крім того, здатність десатурази діяти на субстрат ацил-КоА може передбачатися, якщо елонгаза, яка експресується разом з десатуразою, демонструє ефективність ферментного перетворення в рослинних клітинах щонайменше близько 90 95, якщо елонгаза каталізує елонгацію продукту десатурази. Базуючись на цьому, Д5-десатураза і Л4-десатурази, що експресуються із конструкта СА7 (див. Приклад 2, Фіг. 2 ії 5ЕО ІО МО: 1) та їх варіанти (Приклад 3) здатні до десатурації відповідних ацил-КоА субстратів, ЕТК-КоА і ДПК-КоА.

Елонгази

Біохімічні докази наводять на думку про те, що елонгація жирної кислоти складається з 4-х стадій: конденсація, відновлення, дегідратація і друге відновлення. В контексті цього винаходу, «елонгаза» позначає поліпептид, що каталізує стадію конденсації в присутності інших членів комплексу елонгації, у відповідних фізіологічних умовах. Показано, що гетерологічна або гомологічна експресія в клітині тільки конденсуючого компоненту («елонгаза») комплексу елонгації білка потрібна для елонгації відповідного ацильного ланцюга. Тому, введена елонгаза

Зо може успішно рекрутувати відновлювальну і дегідратувальну активність з трансгенного хазяїна, з метою здійснення успішної елонгації ацилу. Вважається, що за специфічність реакції елонгації щодо довжини ланцюга і ступеня десатурації жирнокислотних субстратів відповідає компонент конденсації. Крім того, вважається, що цей компонент є обмежуючим швидкість в реакції елонгації.

В цьому документі «Аб-елонгаза» щонайменше здатна перетворювати ЕПК на ДПК.

Приклади Д5-елонгаз включають розкриті у УУО2005/103253. В одному варіанті реалізації винаходу Д5-елонгаза володіє активністю по відношенню до ЕПК з утворенням ДПК із ефективністю щонайменше 60 95, більш переважно щонайменше 65 95, білош переважно щонайменше 70 95 або найбільш переважно щонайменше 80 95 або 90 95. В додатковому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот А5-елонгази представлена 5ЕО ІЮ МО: 25, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 47 95 ідентичною 5ЕО ІО МО: 25. У подальшому варіанті реалізації винаходу Аб-елонгаза походить з

О5ігеососсиз їацгії або О5ігеососси5 Іюшсітагіпи5 (052010/088776).

В цьому документі «Дб-елонгаза» щонайменше здатна перетворювати СДК на ЕТК.

Приклади Аб-елонгаз включають наведені в Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену 5ЕО ІЮО МО: 16, її біологічно активний фрагмент (наприклад, фрагмент, розкритий як 5ЕО ІЮ МО: 17), або послідовність амінокислот, щонайменше на 55 95 ідентичну одній або обом з 5ЕО ІЮ МО: 16 або 5ЕО ІО МО: 17. У варіанті реалізації винаходу Аб-елонгаза одержана з Рпузсоптійгеїйа раїеп5 (7апК еї аІ., 2002; номер доступу АЕ428243) або Таїіазвіовіга рхоейдопапа (Еипі-І оре? єї аї., 2012).

В цьому документі «ЛУ-елонгаза» щонайменше здатна перетворювати АЛК на ЕТРрК.

Приклади Де9-елонгаз включають наведені в Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ДУ-елонгази представлена ЗЕО ІЮ МО: 29, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичною ЗЕО ІО МО: 29.

В іншому варіанті реалізації ДУ-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в

ЗЕО ІО МО: 31, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 81 95 ідентичну 5ЕО ІО МО: 31. У іншому варіанті реалізації ДУ-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 33, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 9о ідентичну 5ЕО ІЮО МО: 33. В іншому варіанті реалізації 60 винаходу послідовність амінокислот ДУ-елонгази представлена 5ЕО ІЮ МО: 35, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 81 95 ідентичною 5ЕО

ІО МО: 35. У подальшому варіанті реалізації винаходу Л9-елонгаза володіє вищою активністю по відношенню до 06 субстрату, ніж відповідного 003 субстрату, або навпаки.

В цьому документі термін «володіє вищою активністю по відношенню до субстрату об, ніж відповідного субстрату 003» позначає відносну активність ферменту по відношенню до субстратів, яка відрізняється за активністю 03 десатурази. Переважно субстрат 06 являє собою

ЛК, і субстрат 03 являє собою АЛК.

Елонгаза з активністю Дб-елонгази і ДУ-елонгази щонайменше здатна (ї) перетворювати

СДК на ЕТК і (ії) перетворювати АЛК на ЕТрК, а також володіє вищою активністю Дб-елонгази, ніж активністю ДУ-елонгази. В одному варіанті реалізації винаходу елонгаза володіє ефективністю перетворення СДК з утворенням ЕТК, яка становить щонайменше 50 95, більш переважно щонайменше 60 95, та/або ефективністю перетворення АЛК з утворенням ЕТрК, яка становить щонайменше б 95 або більш переважно щонайменше 9 95. В іншому варіанті реалізації винаходу елонгаза володіє активністю Дб-елонгази, щонайменше близько в 6,5 раз перевищуючою активність ДУ-елонгази. У подальшому варіанті реалізації винаходу елонгаза не володіє активністю Д5-елонгази, яка могла би бути виявлена.

Інші ферменти

Трансгени, введені до рекомбінантної клітини, такої як мікробна клітина, або трансгенної рослини або її частини, можуть додатково кодувати ЛФААТ. В цьому документі термін «І-ацил- гліцерол-З3-фосфат ацилтрансфераза» (ЛФКАТ), що також має назву ацилтрансферази лізофосфатидинової кислоти або ацил-КоА-лізофосфатидат-ацилтрансферази, позначає білок, який ацилює 5п-1-ацил-гліцерол-З-фосфат 5п-1 (3-3-Р в положенні 5п-2, з утворенням фосфатидної кислоти (ФК). Таким чином, термін «активність І-ацил-гліцерол-З3-фосфат ацилтрансферази» позначає ацилування (5п-1 (3-3-Р) в положенні 5п-2, з утворенням ФК (ЄС 2.3.1.51). Переважними ЛФКАТ є такі, що можуть використовувати поліненасичений С22 ацил-

КоА як субстрат, для перенесення поліненасиченої групи ацилу С22 в положення 5п-2 ЛФК, з утворенням ФК. У варіанті реалізації поліненасичений С22 ацил-КоА є ДПК-КоА. Приклади таких

ЛФКАТ наведені в Прикладі 6 і можуть бути протестовані, як розкрито в цьому документі. У варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ЛФКАТ, придатна у відповідності до

Зо винаходу, представлена будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 40-46, її біологічно активним фрагментом або послідовністю амінокислот, щонайменше на 40 95 ідентичною будь-якій із зЗЕО ІЮ МО: 40-46. У іншому варіанті реалізації ЛФААТ не містить послідовності амінокислот, представленої в будь- якій із БЕО ІО МО: 44. У переважному варіанті реалізації ЛФААТ, придатна у відповідності до винаходу, яка може використовувати поліненасичений жирний ацил-КоА субстрат С22, переважно ДПК-КаоА, містить послідовність амінокислот, представлену в будь-якій із ЗЕО ІЮ МО: 41, 42 і 44, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 40

Чо ідентичну будь-якій одній або більше із БЕО ІЮО МО: 41, 42 і 44. У переважному варіанті реалізації ЛФААТ, придатна у відповідності до винаходу, яка може використовувати поліненасичений жирний ацил-КоА субстрат С22, переважно ДПК-КоА, містить послідовність амінокислот, представлену будь-якою із ЗЕО ІО МО: 41 або 42, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 40 95 ідентичну будь-який однієї або більше із

ЗЕО ІЮО МО: 41 і 42. У варіанті реалізації винаходу ЛФААТ переважно являє собою ЛФААТ

МопіегеїІа аїІріпа, послідовність амінокислот якої представлена як ЗЕО ІЮ МО: 44, або іншу

ЛФААТ, що здатна використовувати ДПК-КоА як субстрат для перенесення ДПК у ЛФХ, з утворенням ФК, що містить ДПК у положенні 5п-2.

Трансгени, введені до рекомбінантної клітини, трансгенна рослина або її частина, можуть додатково кодувати ДГАТ. В цьому документі термін «діацилгліцерол ацилтрансфераза» (ЄС 2.3.1.20; ДГАТ), позначає білок, який переносить жирну групу ацилу з ацил-КоОА до діацилгліцерольного субстрату, з утворенням триацилгліцеролу. Тому, термін «активність діацилгліцерол ацилтрансферази» позначає перенесення ацил-КоА до діацилгліцеролу, з утворенням триацилгліцеролу. Існує три відомих види ДГАТ, позначені як ДГАТІ, ДГАТ?З2 і

ДГАТЗ, відповідно. Поліпептиди ДГАТІ звичайно містять 10 трансмембранних доменів, ДГАТ2 звичайно містять 2 трансмембранних домени, тоді як ДГАТЗ звичайно є розчинним. Приклади поліпептидів ДГАТІ включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТІ з АзрегойШив Тштідашве (номер доступу ХР 755172), Агарідорзів ІНаійапа (САВ44774), Вісіпив соттипів (ААНІ11479),

Метісіа їогаї (АВСО94472), Метопіа даіатепвзіз (АВМ21945, АВМ21946), Епопутив аїайв (ААУЗ31083), Саєпогпнараїй5 єієдапе (ААЕ82410), Вайив пог/едісиз (МР 445889), Ното зарієп5 (МР 036211), а також їх варіанти та/або мутанти. Приклади поліпептидів ДГАТ2 включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТЗО з Агабрідорзіз Іпайапа (номер доступу МР 566952), Кісіпи5 бо соттипіз (ААМ16324), Метісіа їогаїї (АВС94474), Мопіегейа гатаппіапа (ААК84179), Ното зарієпе (096РО7, О58НТ5), Во іїаштиз (070М08), Мив5 тивсшци5 (ААК84175), Місготопав5

ССМРІ1545, а також їх варіанти та/або мутанти. Приклади поліпептидів ДГАТЗ3 включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТЗ з арахісу (Агаспіх пуродаєа, запа, еї а!., 2006), а також їх варіанти та/або мутанти.

Поліпептиди/пептиди

Терміни «поліпептид» і «білок» загалом використовуються рівнозначно.

Поліпептид або клас поліпептидів може бути визначений за ступенем ідентичності (90 ідентичності) його послідовності амінокислот референтній послідовності амінокислот, або за більшим 595 ідентичності одній референтній послідовності амінокислот, ніж іншій. 9 ідентичності поліпептиду референтній послідовність амінокислот звичайно визначається за аналізом САР (Меедіетанп ії УУсп5сй, 1970; програма ССС) з параметрами штрафу на відкриття проміжку - 5 і штрафу на подовження проміжку - 0,3. Довжина послідовності запиту становить щонайменше амінокислот, і аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 15 амінокислот. Більш переважно довжина послідовності запиту становить 15 щонайменше 50 амінокислот, і аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 50 амінокислот. Більш переважно довжина послідовності запиту становить щонайменше 100 амінокислот, і аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 100 амінокислот. Навіть переважніше довжина послідовності запиту становить щонайменше 250 амінокислот, і аналіз ЗАР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 250 амінокислот. Навіть білош Переважно аналіз

САР вирівнює дві послідовності протягом їх повної довжини. Поліпептид або клас поліпептидів може володіти такою ж ферментною активністю або іншою активністю або не володіти активністю референтного поліпептиду. Переважно поліпептид володіє ферментною активністю на рівні щонайменше 10 95, щонайменше 50 95, щонайменше 75 95 або щонайменше 90 95 від активності референтного поліпептиду. «Біологічно активний фрагмент» є частиною поліпептиду, визначеного в цьому документі, яка зберігає певну активність повнорозмірного референтного поліпептиду, наприклад, володіючою активністю десатурази та/або елонгази або іншою ферментною активністю.

Біологічно активні фрагменти в цьому документі виключають повнорозмірний поліпептид.

Зо Біологічно активні фрагменти можуть бути частиною будь-якого розміру, до тих пір, поки вони зберігають певну активність. Переважно біологічно активний фрагмент зберігає щонайменше 10

Фо, щонайменше 50 9565, щонайменше 75 95 або щонайменше 90 95 активності повнорозмірного білка.

Щодо певного поліпептиду або ферменту, необхідно розуміти, що 95 ідентичності, перевищуючий розкриті в цьому документі, включає переважні варіанти. Таким чином, якщо це доречно, у світлі мінімального 95 ідентичності, Переважно щоб поліпептид/фермент містив послідовність амінокислот, яка є щонайменше на 60 95, більш переважно щонайменше на 65 95, більш переважно щонайменше на 70 95, більш переважно щонайменше на 75 95, більш переважно щонайменше на 76 95, більш переважно щонайменше на 80 95, більш переважно щонайменше на 85 95, більш переважно щонайменше на 90 95, більш переважно щонайменше на 91 95, більш переважно щонайменше на 92 95, більш переважно щонайменше на 93 95, більш переважно щонайменше на 94 95, більш переважно щонайменше на 95 95, більш переважно щонайменше на 96 95, більш переважно щонайменше на 97 95, більш переважно щонайменше на 98 95, більш переважно щонайменше на 99 95, більш переважно щонайменше на 99,1 95, більш переважно щонайменше на 99,2 95, більш переважно щонайменше на 99,3 95, більш переважно щонайменше на 99,4 95, більш переважно щонайменше на 99,5 95, більш переважно щонайменше на 99, 95, більш переважно щонайменше на 99,7 95, більш переважно щонайменше на 99,8 95, і навіть більш переважно щонайменше на 99,9 95 ідентична вказаній у зв'язку з нею 5ЕО ІЮ МО.

Варіанти/мутанти амінокислотної послідовності поліпептидів, розкритих в цьому документі, можуть бути одержані шляхом введення відповідних модифікацій нуклеотидів до нуклеїнової кислоти, розкритої в цьому документі, або синтезу цільового поліпептиду іп мйго. Такі варіанти/мутанти включають, наприклад, делеції, інсерції або заміни залишків в межах послідовності амінокислот. Комбінація делеції, вставки і заміни може бути здійснена таким чином, щоб одержати кінцеву конструкцію, за умови, що кінцевий пептидний продукт володіє бажаною ферментною активністю.

Мутантні (модифіковані) пептиди можуть бути одержані із застосуванням будь-якої методології, відомої з рівня техніки. Наприклад, полінуклеотид, розкритий в цьому документі, може бути оброблений методами мутагенезу іп міго або тасування ДНК, як детально описано бо Нагауата (1998). Скринінг продуктів, які одержують з видозміненої/модифікованої ДНК, може бути з легкістю здійснений із застосуванням способів, розкритих в цьому документі, для визначення того, чи володіють вони, наприклад, десатуразною або елонгазною активністю.

При конструюванні мутантів послідовності амінокислот, місцеположення сайту мутації і природа мутації залежатимуть від характеристики(ик), яку модифікують. Сайти для мутації можуть бути модифіковані індивідуально або посерійно, наприклад, шляхом: (1) заміни спочатку вибраних консервативних амінокислот, а потім більш радикальних замін, в залежності від досягнутих результатів, (2) видалення залишку-мішені, або (3) вставки інших залишків, суміжних з розміщеним сайтом.

Делеції в амінокислотній послідовності загалом варіюють від близько 1 до 15 залишків, переважніше від близько 1 до 10 залишків і звичайно близько від 1 до 5 суміжних залишків.

У мутантах заміни видалений щонайменше один залишок амінокислоти в молекулі поліпептиду, та інший залишок вставлений на його місце. Найцікавіші положення для мутагенезу шляхом заміни включають сайти, що не є консервативними в природних десатуразах або елонгазах. Заміни в таких сайти переважно здійснюються відносно консервативним чином, з метою збереження активності ферменту. Такі консервативні заміни проілюстровані в Табл. З під заголовком «приклади замін».

У переважному варіанті реалізації винаходу мутантний/варіантний поліпептид містить тільки або не більше ніж одну або дві або три або чотири консервативні модифікації амінокислот, в порівнянні з природним поліпептидом. Подробиці консервативних модифікацій амінокислот наведені в Табл. 3. Як буде зрозуміле кваліфікованому фахівцю, такі незначні модифікації можуть в розумних межах бути спрогнозовані як не впливаючі на активність поліпептиду при експресії в рекомбінантній клітині.

Таблиця З

Приклади замін амінокислот

Приклади замін залишок пе() бМешхмараа./////777777771С

Рю(Р) фФу 77777711

Полінуклеотиди

Крім того, у винаході розкриваються та/або застосовуються полінуклеотиди, які можуть бути, наприклад, геном, виділеним полінуклеотидом, химерною генетичною конструкцією, такою як молекула Т-ДНК або химерна ДНК. Це може бути ДНК або РНК геномного або синтетичного походження, двохланцюгова або одноланцюгова, а також комбінована з вуглеводом, ліпідами,

Зо білюом або іншими матеріалами з метою здійснення конкретної активності, розкритої в цьому документі. Термін «полінуклеотид» використовується в цьому документі рівнозначно з терміном «молекула нуклеїнової кислоти».

У варіанті реалізації полінуклеотид є неприродним. Приклади неприродних полінуклеотидів включають, але не обмежуючись цим, мутантні (наприклад, одержані із застосуванням способів, описаних у даному описі), і полінуклеотиди, у яких відкрита рамка зчитування, що кодує білок, функціонально пов'язана із промотором, з яким вона не пов'язана в природі (як, наприклад, у конструкціях, описаних у даному описі).

В цьому документі термін «ген» використовується в найширшому контексті і включає дезоксирибонуклеотидні послідовності, що містять транскрибовану ділянку і, у випадку трансляції, ділянка кодування білка структурного гена, включаючи послідовності, розміщені суміжно з кодуючою ділянкою на 5' і 3' кінцях, на відстані щонайменше близько 2 тисячі пар основ на будь-якому кінці, що беруть участь в експресії гена. В цьому відношенні, ген містить контрольні сигнали, наприклад, промотори, енхансери, сигнали термінації та/або поліаденілування, які в природі асоційовані з даним геном, або гетерологічні контрольні сигнали, і в цьому випадку ген носить назву «Химерного гена». Послідовності, що розміщені на 5 кінці кодуючої білок ділянки, і які присутні на мРНК, позначаються як 5' нетрансльовані послідовності. Послідовності, що розміщені на 3' кінці або нижче по відношенню до кодуючої білок ділянки, і які присутні на мРНК, позначаються як 3' нетрансльовані послідовності. Термін «ген» включає кКДНК і геномні форми гена. Геномна форма або клон гена містить кодуючу ділянку, що може перериватися некодуючими послідовностями під назвою «інтрони» або «проміжні ділянки» або «проміжні послідовності». Інтрони являють собою сегменти гена, транскрибовані в ядерну РНК (гетерогенну ядерну РНК, гяЯРНК). Інтрони можуть містити регуляторні елементи, наприклад, енхансери. Інтрони видаляють або «зрощують» з ядерним або первинним транскриптом; таким чином, інтрони відсутні в транскрипті матричної РНК (МРНК). Функція мРНК в ході трансляції полягає в конкретизації послідовності або порядку амінокислот у виникаючому поліпептиді. Термін «ген» включає синтетичну або злиту молекулу, що кодує повнорозмірні білки або їх частини за винаходом, розкриті в цьому документі, і нуклеотидну послідовність, комплементарну до будь-якої із згаданих вище.

В цьому документі «химерна ДНК» або «химерна генетична конструкція» або подібний вираз позначає будь-яку молекулу ДНК, що не є природною молекулою ДНК в її природному місцеположенні, яка також позначається в цьому документі як «конструкція ДНК». Як правила, химерна ДНК або химерний ген містить регуляторну і транскрибовану або кодуючу білок послідовності, які не знайдені функціонально пов'язаними одна з однією в природі, тобто які є гетерологічними по відношенню одна до одної. Відповідно, химерна ДНК або химерний ген можуть містити регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з різних джерел, або регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з одного джерела, але організовані в інший спосіб, ніж знайдені в природі. «Ендогенний ген» позначає природний ген в його природному положенні в геномі організму.

В цьому документі «молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти», «рекомбінантний полінуклеотид» або їх варіації позначають молекулу нуклеїнової кислоти, що конструюється або модифікується за допомогою технології рекомбінантної ДНК. Терміни «чужорідний полінуклеотид» або «екзогенний полінуклеотид» або «гетерологічний полінуклеотид» і подібні позначають будь-яку нуклеїнову кислоту, що введена в геном клітини за допомогою експериментальних маніпуляцій. Чужорідні або екзогенні гени можуть являти собою гени, вставлені в неприродний організм, природні гени, що введені в нове місцеположення в межах природного хазяїна, або химерні гени. «Трансген» є геном, що введений в геном процедурою трансформації. Терміни «генетично модифікований», «трансгенний» та їх варіації включають введення генів в клітини шляхом трансформації або трансдукції, мутацію генів в клітинах і модифікацію або модуляцію регуляції гена в клітині або організмах, над якими здійснювалися вказані дії, або їх потомстві. «Геномна ділянка» в цьому документі позначає положення в межах геному, в якому трансген або група трансгенів (також позначена в цьому документі як кластер) вставлені в клітину або її предка. Такі ділянки включають тільки нуклеотиди, що введені в результаті втручання людини, наприклад, за способами, розкритими в цьому документі.

Термін «екзогенний» в контексті полінуклеотиду позначає полінуклеотид, присутній в клітині в модифікованій кількості, в порівнянні з його природним станом. В одному варіанті реалізації винаходу клітина є клітиною, що в природі не містять полінуклеотиду. Однак, клітина може бути клітиною, яка містить не ендогенний полінуклеотид, що приводить до зміни рівня продукування кодованого поліпептиду. Екзогенний полінуклеотид за винаходом включає полінуклеотиди, що не відокремлені від інших компонентів трансгенної (рекомбінантної) клітини або неклітинної системи експресії, в якій вони присутні, і полінуклеотиди, продуковані в таких клітинах або неклітинних системах, які в подальшому були очищені щонайменше від деяких інших бо компонентів. Екзогенний полінуклеотид (нуклеїнова кислота) може бути безперервним ланцюгом нуклеотидів, існуючим в природі, або містити дві або більше суміжних нуклеотидних ділянок з різних джерел (природних та/або синтетичних), сполучені таким чином, щоб утворити єдиний полінуклеотид. Звичайно такі химерні полінуклеотиди містять щонайменше відкриту рамку зчитування, що кодує поліпептид за винаходом, функціонально пов'язаний з промотором, придатним для управління транскрипцією відкритої рамки зчитування в цільовій клітині.

Щодо розкритих полінуклеотидів, необхідно розуміти, що вищий 95 ідентичності, ніж розкриті вище, включатиме переважні варіанти. Таким чином, якщо це доречно, у світлі мінімального 90 ідентичності, полінуклеотид переважно містить полінуклеотидну послідовність, яка є щонайменше на 60 95, більш переважно щонайменше на 65 95, більш переважно щонайменше на 70 95, більш переважно щонайменше на 75 95, більш переважно щонайменше на 80 95, більш переважно щонайменше на 85 95, більш переважно щонайменше на 90 95, більш переважно щонайменше на 91 95, більш переважно щонайменше на 92 95, більш переважно щонайменше на 93 95, більш переважно щонайменше на 94 95, більш переважно щонайменше на 95 95, більш переважно щонайменше на 96 95, більш переважно щонайменше на 97 95, більш переважно щонайменше на 98 95, більш переважно щонайменше на 99 95, більш переважно щонайменше на 99,1 95, більш переважно щонайменше на 99,2 95, більш переважно щонайменше на 99,3 95, більш переважно щонайменше на 99,4 95, більш переважно щонайменше на 99,5 95, більш переважно щонайменше на 99,6 95, більш переважно щонайменше на 99,7 95, більш переважно щонайменше на 99,8 95, і навіть більш переважно щонайменше на 99,9 95 ідентичною відповідній вказаній 5ЕО ІЮ МО.

Полінуклеотиди за винаходом можуть містити, в порівнянні з молекулами, що зустрічаються в природі, одну або більше мутацій, що являють собою делеції, вставки або заміни нуклеотидних залишків. Полінуклеотиди, що містять мутації відносно референтної послідовності, можуть бути природними (тобто, виділеними з природного джерела) або синтетичними (наприклад, одержаними в результаті сайт-спрямованого мутагенезу або тасування ДНК з нуклеїнової кислоти, як розкрито вище). Таким чином, очевидно, що полінуклеотиди за винаходом можуть бути одержані з природного джерела або можуть бути рекомбінантними. Переважними полінуклеотидами є такі, що містять кодуючі ділянки, кодон- оптимізовані для трансляції в клітинах рослини, як відомо з рівня техніки.

Зо Рекомбінантні вектори

Рекомбінантна експресія може застосовуватися для одержання рекомбінантних клітин або рослин або частин рослини за винаходом. Один варіант реалізації цього винаходу включає рекомбінантний вектор, який містить щонайменше одну молекулу полінуклеотиду, розкриту в цьому документі, вставлену в будь-який вектор, здатний доставити молекулу полінуклеотиду в клітину-хазяїна. Рекомбінантні вектори включають вектори експресії. Рекомбінантні вектори містять гетерологічні полінуклеотидні послідовності, тобто, полінуклеотидні послідовності, що в природі не знайдені суміжними з молекулами полінуклеотиду, розкритими в цьому документі, які переважно одержані з інших видів, ніж ті, 3 яких одержана(и) молекула(и) полінуклеотиду.

Вектор може являти собою РНК або ДНК, і звичайно є плазмідою. Плазмідні вектори звичайно містять додаткові послідовності нуклеїнових кислот, які забезпечують простоту селекції, ампліфікації і трансформації касети експресії в прокаріотних клітинах, наприклад, одержані з рис вектори, одержані з реК вектори, одержані з рРОЕМ вектори, одержані з роеР вектори, одержані з рВ5 вектори, або переважно бінарні вектори, що містять одну або більш ділянок Т-

ДНК. Додаткові послідовності нуклеїнових кислот включають джерела реплікації для забезпечення автономної реплікації вектора, гени селекційних маркерів, переважно кодуючі резистентність до антибіотика або гербіциду, унікальні множинні сайти клонування, які забезпечують множинні сайти вставки послідовностей нуклеїнових кислот або генів, кодованих в конструкції нуклеїнової кислоти, і послідовності, які підвищують активність трансформації прокаріотних і еукаріотних (особливо рослинних) клітин. Рекомбінантний вектор може містити більш ніж один полінуклеотид, розкритий в цьому документі, наприклад, три, чотири, п'ять або шість полінуклеотидів, розкритих в цьому документі, в комбінації, переважно химерну генетичну конструкцію за винаходом, в якій кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з послідовностями контролю експресії активними в цільовій клітині. Більш ніж один полінуклеотид, розкритий в цьому документі, наприклад, 3, 4, 5 або 6 полінуклеотидів, переважно ковалентно сполучені в єдиному рекомбінантному векторі, переважно в межах єдиної молекули Т-ДНК, яка в подальшому може бути введена як єдина молекула в клітину, з одержанням рекомбінантній клітини за винаходом, і переважно інтегрована в геном рекомбінантної клітини, наприклад, в трансгенній рослині. Таким чином, полінуклеотиди, сполучені у такий спосіб, будуть успадковуватися разом як єдиний генетичний локус у нащадка 60 рекомбінантної клітини або рослини. Рекомбінантний вектор або рослина може містити два або більше таких рекомбінантних векторів, кожен з яких містить декілька полінуклеотидів, наприклад, кожен рекомбінантний вектор містить 3, 4, 5 або 6 полінуклеотидів. «Функціонально пов'язаний» в цьому документі позначає функціональне взаємовідношення між двома або більш сегментами нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК). Як правило, це позначає функціональне взаємовідношення транскрипційного регуляторного елементу (промотору) і транскрибованої послідовності. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю, такою як полінуклеотид, розкритий в цьому документі, якщо він стимулює або модулює транскрипцію кодуючої послідовності у відповідній клітині. Загалом, транскрипційні регуляторні елементи промотору, які функціонально пов'язані з транскрибованою послідовністю, є фізично суміжними з транскрибованою послідовністю, тобто, вони є сіз-діючими. Однак, для деяких транскрипційних регуляторних елементів, таких як енхансери, немає необхідності бути фізично суміжними або розташованими в безпосередній близькості від кодуючих послідовностей, транскрипцію яких вони збільшують.

Якщо присутні декілька промоторів, кожен промотор незалежно може бути таким же або іншим. Переважно, щонайменше З і максимум до б різних промоторних послідовностей застосовуються в рекомбінантному векторі, щоб управляти експресією екзогенних полінуклеотидів.

Крім того, рекомбінантні молекули, наприклад, химерні ДНК або генетичні конструкції, можуть містити: (а) один або більш секреторних сигналів, що кодують сигнальні пептидні послідовності, щоб дозволити експресованому поліпептиду, розкритому в цьому документі, секретуватися з клітини, яка продукує поліпептид, або яка забезпечує локалізацію експресованого поліпептиду, наприклад, для утримання поліпептиду в ендоплазматичному ретикулумі (ЕР) клітини або перенесення в пластиду, та/або (б) химерні послідовності, які приводять до експресії молекул нуклеїнових кислот у вигляді химерних білків. Приклади відповідних сигнальних сегментів включають будь-який сигнальний сегмент, здатний спрямовувати секрецію або локалізацію поліпептиду, розкритого в цьому документі. Додатково, рекомбінантні молекули можуть містити проміжні та/або нетрансльовані послідовності, навколо та/або в межах послідовностей нуклеїнових кислот молекул нуклеїнових кислот, розкритих в цьому документі.

Зо Для спрощення ідентифікації трансформантів, бажано, щоб конструкція нуклеїнової кислоти містила ген селекційного або скринінгового маркера у вигляді або на додаток до чужорідного або екзогенного полінуклеотиду. «Ген маркера» позначає ген, який надає відмінного фенотипу клітинам, що експресують ген маркера, таким чином, що трансформовані клітини відрізняються від клітин, які не містять маркера. Ген селекційного маркера забезпечує ознаку, за якою можна «здійснювати селекцію» на базі резистентності до селекційного агента (наприклад, гербіцид, антибіотик, випромінювання, нагрівання або інший вид обробки, ушкоджуючий нетрансформовані клітини). Ген придатного для скринінгу маркера (або репортерний ген) забезпечує ознаку, за якою можна ідентифікувати, шляхом спостереження або тестування, наприклад, за допомогою «скринінгу» (наприклад, активність рД-глюкуронідази, люциферази, зеленого флуоресцентного білка (ЗФБ) або іншого ферменту, відсутню в нетрансформованих клітинах). Ген маркера і цільова нуклеотидна послідовність не обов'язково повинні бути пов'язаними. Фактично, вибір маркера не є критичним, до тих пір, поки він є функціональним (тобто, селективним) в поєднанні з клітинами вибору, такими як рослинна клітина.

Прикладами селекційних маркерів є маркери, що забезпечують резистентність до антибіотиків, наприклад, резистентність до ампіциліну, еритроміцину, хлорамфеніколу або тетрацикліну, переважно резистентність до канаміцину. Приклади селекційних маркерів для селекції рослин включають, без обмеження, ген пуд, який кодує резистентність до гігроміцину В; ген неоміцин фосфотрансферази (прі), що забезпечує резистентність до канаміцину, паромоміцину, (5418; ген глутатіон-5-трансферази з печінки щурів, що забезпечує резистентність до гербіцидів-похідних глутатіону, наприклад, таких як, розкриті у ЕР 256223; ген глутамінсинтетази, що при надмірній експресії забезпечує резистентність до інгібіторів глутамінсинтетази, таких як фосфінотрицин, наприклад, розкритий у УМО 87/05327, ген ацетилтрансферази із Бігеріотусе5 мігідоспготодепе5, що забезпечує резистентність до селекційного агента фосфінотрицину, наприклад, розкритий у ЕР 275957, ген, що кодує 5- єнолшикімат-3З-фосфат синтазу (ЄШФОС), що забезпечує переносимість М- фосфонометилгліцину, наприклад, розкритий Ніпспеєе еї аї. (1988), або переважно ген Баг, що забезпечує резистентність до біалафосу, наприклад, розкритий у М/О91/02071.

Переважно конструкція нуклеїнової кислоти стабільно інкорпорована в геном клітини, наприклад, рослинної клітини. Відповідно, нуклеїнова кислота може містити відповідні бо елементи, які дозволяють молекулі інкорпоруватися в геном, переважно послідовності правої і лівої меж молекули Т-ДНК, або конструкція розміщена у відповідному векторі, який може бути інкорпорований в хромосому клітини.

Експресія

В цьому документі вектор експресії являє собою вектор ДНК, що здатний трансформувати клітину-хазяїна і здійснювати експресію однієї або більше вказаних молекул полінуклеотиду.

Переважні вектори експресії за даним винаходом можуть керувати експресією гена в дріжджових та/або рослинних клітинах. Вектори експресії, придатні у відповідності до винаходу, містять регуляторні послідовності, наприклад, послідовності для контролю транскрипції, послідовності для контролю трансляції, джерела реплікації та інші регуляторні послідовності, сумісні з рекомбінантною клітиною, які контролюють експресію молекул полінуклеотиду за даним винаходом. Зокрема, полінуклеотиди або вектори, придатні у відповідності до цього винаходу, містять послідовності для контролю транскрипції. Послідовності для контролю транскрипції є послідовностями, які контролюють ініціацію, елонгацію і термінацію транскрипції.

Особливо важливими послідовностями для контролю транскрипції є такі, які контролюють ініціацію транскрипції, наприклад, послідовності промотору та енхансеру. Відповідні послідовності для контролю транскрипції включають будь-яку послідовність для контролю транскрипції, яка може функціонувати щонайменше в одній з рекомбінантних клітин за даним винаходом. Вибір використовуваних регуляторних послідовностей залежить від організму- мішені, такого як рослина, та/або органу-мішені або цільової тканини. Такі регуляторні послідовності можуть бути одержані з будь-якого еукаріотного організму, такого як рослини, або віруси рослин, або можуть бути хімічно синтезовані. Численні такі послідовності для контролю транскрипції відомі фахівцям з рівня техніки. Особливо переважними послідовностями для контролю транскрипції є промотори, що активно спрямовують транскрипцію в рослинах, конститутивно або специфічним для стадії та/або тканини чином, в залежності від використання рослини або її частин.

Ряд векторів, придатних для стабільної трансфекції рослинних клітин або одержання трансгенних рослин, описаний, наприклад, у Рошмеї5 еї аї., Сіопіпуд Месіоге: А І арогагу МапаиаїЇ, 1985, зирр. 1987; М/єіз5расі апа М/еізвбаси, Мейоз Тог Ріапі МоїІесціаг Віоіоду, Асадетіс Ргезв, 1989; і Семп еї аї., Ріапі МоїІесшаг Віоїюду Мапиаї, Кісу/"ег Асадетіс Рибіїєпег5, 1990. Як правила, вектори експресії в рослинах містять, наприклад, один або більше клонованих генів рослини під транскрипційним контролем 5' і 3 регуляторних послідовностей і домінантний селекційний маркер. Додатково, такі вектори експресії в рослинах можуть містити регуляторну ділянку промотору (наприклад, регуляторна ділянка, що контролює індуцибельну або конститутивну, регульовану умовами навколишнього середовища або стадією розвитку, або клітинно- або тканиноспецифічну експресію), старт-сайт ініціації транскрипції, сайт зв'язування з рибосомою, сигнал процесингу РНК, сайт термінації транскрипції та/або сигнал поліаденілування.

Описаний цілий ряд конститутивних промоторів, які активні в клітинах рослини. Придатні промотори для конститутивної експресії в рослинах включають, без обмеження, промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (СамуМм), 355 мозаїчного вірусу ранника шишкуватого (ЕММ) та індуцибельний світлом промотор з маленької субодиниці рибулозо-1,5-біс-фосфат карбоксилази.

З метою експресії у вихідних тканинах рослини, таких як листя, насіння, коріння або стебло, промоторам, використовуваним у відповідності до цього винаходу, переважно властива відносно висока експресія в цих конкретних тканинах. Численні приклади добре відомі з рівня техніки. Крім того, різноманітні промотори рослинних генів, що регулюються у відповідь на екологічні, гормональні, хімічні та/або пов'язані із розвитком сигнали, також можуть використовуватися для експресії генів у клітинах рослини, або може бути переважним використання орган-специфічних промоторів.

В цьому документі термін «промотор, специфічний для насіння» або його варіації позначає промотор, який переважно в порівнянні з іншими тканинами рослини, спрямовує транскрипцію гена в насінні рослини, що розвивається, переважно рослини виду Вгаз5іса, Сатеїїйпа з5аїїма або б. тах. У варіанті реалізації винаходу промотор, специфічний для насіння, експресується щонайменше в 5 разів активніше у насінні рослини, що розвивається, відносно листя та/або стебел рослини, і переважно експресується активніше в ембріоні насіння, що розвивається, в порівнянні з іншими тканинами рослини. Переважно промотор тільки спрямовує експресію цільового гена в насінні, що розвивається, та/або експресія цільового гена у інших частинах рослини, таких як листя, не може бути виявлена нозерн-блотингом та/або ЗТ-ПЛР. Звичайно, промотор контролює експресією генів в процесі росту і розвитку насіння, зокрема, в ході фази бо синтезу і акумуляції запасних речовин в насінні. Такі промотори можуть контролювати експресією гена в суцільному запасному органі рослини або тільки в його частині, наприклад, оболонці насіння або сім'ядолі(ях), переважно в ембріонах, у насінні дводольних рослин або ендоспермі або алейроновому шарі насіння однодольних рослин.

Переважні промотори специфічної для насіння експресії включають: ії) промотори з генів, що кодують ферменти, які беруть участь в біосинтезі жирних кислот та їх акумуляції в насінні, наприклад, десатурази і елонгази жирних кислот, її) промотори з генів, що кодують запасні білки для зберігання в насінні, і ії) промотори з генів, що кодують ферменти, які беруть участь в біосинтезі вуглеводів та їх акумуляції в насінні. Придатними специфічними для насіння промоторами є промотор гена напіну олійної рапсу (05 5608152), промотор ОБР Місіа тара (Вайтіеїп еї аї., 1991), промотор олеозину Агарідорзі5 (МУ098/45461), промотор фазеоліну

РІпазеоїих миїдагіє (05 5504200), промотор Все4 Вгаззіса (М/091/13980) або промотор легуміну

І еВ4 з Місіа тара (Вашитівїп еї аї., 1992), і промотори, які забезпечують специфічну для насіння експресію в однодольних, таких як маїс, ячмінь, пшениця, жито, рис, тощо. Як придатні слід зазначити такі промотори: промотор гена Ірі2 або Іри ячменю (М/095/15389 і ММО95/23230) або промотори, розкриті у УМО99/16890 (промотори з гена гордеїну ячменю, гена глютеліну рису, гена оризину рису, гена проламіну рису, гена гліадину пшениці, гена глютеліну пшениці, гена зеїну маїсу, гена глютеліну вівса, гена казирину сорго, гена секаліну жита). Інші промотори включають розкриті Вгоцп еї аї. (1998), Роїепла еї аї. (2004), 0520070192902 ії 0520030159173. У варіанті реалізації винаходу специфічний для насіння промотор переважно експресується в певних частинах насіння, таких як ембріон, сім'ядоля() або ендосперм. Приклади таких специфічних промоторів включають, без обмеження, промотор ЕР (Еїегеігот еї аї., 1996), промотор легуміну гороху (Регїтіп еї аїЇ., 2000), промотор фітогемаглютиніну боба (Регтіп еї аї., 2000), промотори конлінін 1 і конлінін 2 для генів, що кодують запасні білки 25 льону (Спепд еї а!., 2010), промотор гена ЕАЕЇ1 з Агабрідорзі5 (паіІапа, промотор ВпоІ Р. гена глобулін-подібного білка Вгаззіса пари, промотор І РХК гена пероксиредоксину з Гіпит изнайізвітит. 5 нетрансльована лідерна послідовність може бути одержана з промотору, вибраного для експресії гетерологічної послідовності гена полінуклеотиду за даним винаходом, або переважно є гетерологічною щодо ділянки, яка кодує фермент, що виробляється, і може бути специфічно модифікована, при бажанні, таким чином, щоб збільшити трансляцію мРНК. Огляд оптимізації

Зо експресії трансгенів див. у Ко/іеї еї аі. (1996). Додатково, 5' нетрансльовані ділянки можуть бути одержані з РНК вірусів рослин (серед іншого, вірус мозаїки тютюну, вірус гравіювання тютюну, вірус карликової мозаїчності маїсу, вірус мозаїки люцерни), з відповідних еукаріотних генів, рослинних генів (лідер гена білка а/ю хлорофілу пшениці і маїсу, що зв'язується), або із синтетичної послідовності гена. Даний винахід не обмежується конструкціями, в яких нетрансльована ділянка одержана з 5' нетрансльованої послідовності, супроводжуючої послідовність промотору. Додатково, лідерна послідовність може бути одержана із неспорідненого промотору або кодуючої послідовності. Лідерні послідовності, придатні в контексті цього винаходу, включають лідер Нер70 маїсу (05 5362865 і 05 5859347) і омега- елемент вірусу мозаїки тютюну (ТММ).

Термінація транскрипції забезпечується 3 нетрансльованою послідовністю ДНК, функціонально пов'язаною в химерному векторі з цільовим полінуклеотидом. 3' нетрансльована ділянка рекомбінантної молекули ДНК містить сигнал поліаденілування, функція якого в рослинах полягає у забезпеченні додавання аденілатних нуклеотидів до 3 кінця РНК. 3' нетрансльовані ділянки можуть бути одержані з різноманітних генів, які експресуються в клітинах рослин. У такому випадку звичайно використовуються 3' нетрансльована ділянка нопалінсинтетази, 3' нетрансльована ділянка з маленької субодиниці гена Кибібвсо гороху, 3" нетрансльована ділянка з гена запасного білка 75 насіння сої або гена конлініну льону. Крім того, придатними є 3' транскрибовані, нетрансльовані ділянки, що містять поліаденілатний сигнал індукуючих пухлину (Ті) Адгобасіегішт плазмідних генів.

Технології рекомбінантної ДНК можуть застосовуватися для покращення експресії трансформованої молекули полінуклеотиду, шляхом маніпуляції, наприклад, кількістю копій молекули полінуклеотиду в межах клітини-хазяїна, ефективністю, з якою такі молекули полінуклеотиду транскрибуються, ефективністю, з якою транслюються копії, що утворюються в результаті, та ефективністю посттрансляційних модифікацій. Рекомбінантні методи, придатні для збільшення експресії молекул полінуклеотиду, розкритих в цьому документі, включають, без обмеження, інтеграцію молекули полінуклеотиду в одну або більше хромосом клітини-хазяїна, введення стабілізуючих послідовностей в мРНК, заміни або модифікації сигналів контролю транскрипції (наприклад, промотори, оператори, енхансери), заміни або модифікації сигналів контролю трансляції (наприклад, сайти зв'язування з рибосомою, послідовності Шайна-

Дальгарно), модифікацію молекул полінуклеотиду для відповідності використанню кодонів в клітині-хазяїні і делецію послідовностей, що дестабілізують транскрипти.

Трансгенні рослини

Термін «рослина» в цьому документі як іменник позначає суцільні рослини, але при використанні в ролі прикметника («рослинний») позначає будь-яку субстанцію, в якій присутній, одержану з, що походить із або пов'язану з рослиною, наприклад, органи рослини (такі як листя, стебла, коріння, квіти), одиничні клітини (такі як пилок), насіння, рослинні клітини, тощо. Термін «частина рослини» позначає всі частини рослини, які містять ДНК рослини, зокрема, вегетативні структури, наприклад, листя або стебла, коріння, квіткові органи або структури, пилок, насіння, частини насіння, такі як ембріон, ендосперм, щиток зародка або оболонка насіння, тканину рослини, таку як судинна тканина, клітини і їх потомство, до тих пір, поки частина рослини синтезує ліпід за винаходом. «Трансгенна рослина», «генетично модифікована рослина» або їх варіації позначають рослину, яка містить генетичну конструкцію («трансген»), не знайдену в рослині дикого типу такого ж виду, різновиди або сорти. Трансгенні рослини в контексті цього винаходу включають рослини та їх потомство, генетично модифіковані із застосуванням рекомбінантних методів, що приводить до продукування ліпіду або щонайменше одного поліпептиду, розкритого в цьому документі, у цільовій рослині або органі рослини. Трансгенні клітини рослини і трансгенні частини рослини мають відповідне значення. «Трансген» в цьому документі має звичайне значення для даної галузі біотехнології і містить генетичну послідовність, яка одержана або модифікована технологією рекомбінації ДНК або РНК, і яка введена до клітини рослини.

Трансген може містити генетичні послідовності, одержані з клітини рослини, яка може належати до того ж виду, різновиду або сорту, що і клітина рослини, до якої введений трансген, або до іншого виду, різновиду або сорту, або з клітини, що не є рослинною. Звичайно, трансген вводять до клітини, наприклад, рослинної, шляхом маніпуляції людиною, наприклад, трансформації, причому може застосовуватися будь-який спосіб за рішенням фахівця в цій галузі техніки.

Терміни «насіння» і «зерно» в цьому документі використовуються рівнозначно. «Зерно» позначає зріле зерно, наприклад, зібране в процесі збору врожаю зерно, або зерно, яке ще

Зо знаходиться на рослині, але готове для збору врожаю, а також може позначати насіння після набухання або проростання, згідно контексту. Зріле зерно або насіння звичайно містить вологу в кількості менше, ніж близько 18-20 95, переважно менш ніж 10 95. Вміст вологи в насінні

Вгазвзіса, наприклад, насінні рапсу у зрілому стані звичайно становить близько 4-8 95 або 6-8 95, переважно від близько 4 956 до близько 6 95. «Насіння, що розвивається» в цьому документі позначає насіння до настання зрілості, звичайно знайдене в репродуктивних структурах рослини після запліднення або цвітіння, але може також позначати таке насіння до настання зрілості, яке виділено з рослини.

В цьому документі термін «одержання частини рослини» або «одержання насіння» позначає будь-які засоби для одержання частини рослини або насіння, відповідно, зокрема, збір урожаю частин рослини або насіння з рослин у полі або в закритому просторі, такому як теплиця або камера для росту, або придбання або одержання від постачальника частин рослини або насіння. Стандартні умови росту в теплиці включають денну температуру 22-242С і нічну температуру 16-182С, із природним сонячним світлом. Насіння може бути придатним для насадження, тобто здатним до проростання і утворення рослини-нащадка, або альтернативно, оброблено таким чином, що більше не може прорости, наприклад розколене, шліфоване або змолочене насіння, придатне для застосування при одержанні харчових продуктів або в харчуванні або для екстракції ліпіду за винаходом.

В цьому документі термін «запасаючий орган рослини» позначає частину рослини, що спеціалізується на зберіганні енергії у формі, наприклад, білків, вуглеводів, жирних кислот

БО та/або олій. Прикладами запасаючих органів рослини є насіння, плід, бульбоподібне коріння і бульби. Переважним запасаючим органом рослини є насіння.

Рослини або частини рослин за винаходом або вживані відповідно до винаходу переважно є фенотипово нормальними. В цьому документі термін «фенотипово нормальний» позначає генетично модифіковану рослину або орган рослини, особливо запасаючий орган, такий як насіння, бульбу або плід, не володіючий істотною мірою зниженою здатністю до росту і відтворення, в порівнянні з немодифікованою рослиною або органом рослини. У варіанті реалізації винаходу генетично модифікована рослина або орган рослини, які є фенотипово нормальними, володіють здатністю до росту або відтворення, по суті такою ж, як ізогенна рослина або орган, що не містить вказаного полінуклеотиду. Переважно біомаса, темпи росту, бо швидкість проростання, розмір запасаючого органу, життєздатність пилку, фертильність чоловічих і жіночих рослин, розмір насіння та/або кількість утворених життєздатних зерен становить не менше 90 95 від показників рослини, яка не містить вказаного екзогенного полінуклеотиду, при вирощуванні в ідентичних умовах. Переважно життєздатність пилку рослини за винаходом або рослин, одержаних із насіння за винаходом, становить близько 100

Фо відносно життєздатності пилку відповідної рослини дикого типу. Даний термін не охоплює ознак рослини, що можуть відрізнятися від рослини дикого типу, але при цьому не впливають негативно на повноцінність рослини з точки зору комерційних цілей, наприклад, фенотип балерини листя саджанця.

Рослини, розкриті або включені для використання у практиці цього винаходу, включають однодольні рослини і дводольні рослини. В переважних варіантах реалізації рослини за даним винаходом являють собою урожайні рослини (наприклад, злакові і зернобобові, маїс, пшеницю, картоплю, тапіоку, рис, сорго, просо., маніоку, ячмінь або горох) або інші бобові. Рослини можуть бути вирощені для одержання їстівних коренів, клубенів, листя, стебел, квітів або плоду.

Рослини можуть бути овочевими або декоративними рослинами. Рослини за винаходом або придатні у відповідності до винаходу можуть являти собою: кукурудзу (7еа таув), рапс (Вгаз5іса пари5, підвид Вгазвзіса гара), гірчицю (Вгаз5зіса |псеа), льон (Гіпит изйаїйбзітит), люцерну (Медісадо з5аїїма), рис (Огула заїїма), жито (ЗесаЇе сегаІе), сорго (Зогудпит бБісоїсиг, Зогопит мчІдаге), соняшник (Неїїапіпи5 аппи5), пшеницю (Тгййшт аевіїмит), сою (Сіусіпе тах), тютюн (Місоїйапа їарасит), картоплю (Зоїапит іширего5ит), арахіс (Агаспіє Ппуродаєа), бавовник (Соззурішт Пігзшит), солодку картоплю (Гортоеєа Байашв5»), маніоку (Мапіпої езсшепіа), каву (вид Соїеа), кокосовий горіх (Сосо5 писіїтега), ананас (Апапа сото5зиз), цитрусове дерево (вид

Сіїгиб5), какао (Пеорбгота сасаос), чай (Сатепйа 5епепвіз), банан (вид Миза), авокадо (Регзеа атегісапа), інжир (Ріси5 сазіса), гуаву (Рзідішт диадама), манго (Мапоіїег іпадіса), оливу (Оїєа еигораєа), папайю (Сагіса рарауа), кеш'ю (Апасагаіїшт оссідепіаіє), макадамію (Масадатіа іп'егогію|йа), мигдаль (Ргипи5 атудаа!|ц5), цукровий буряк (Веїа мцІдагі5), овес або ячмінь.

У переважному варіанті реалізації винаходу рослина є покритонасінною рослиною.

У варіанті реалізації винаходу рослина є рослиною олійної культури, переважно урожайною рослиною олійної культури. В цьому документі «рослина олійної культури» є видом рослини, використовуваним для комерційного одержання олій з насіння рослини. Рослина олійної

Зо культури може бути олійним рапсом (наприклад, канола), маїсом, соняшником, соєю, сорго, льоном (насіння льону) або цукровим буряком. Крім того, рослина олійної культури може бути іншими представниками Вгаззіса5, бавовником, арахісом, маком, гірчицею, рициною звичайною, кунжутом, соняшником, сафлором, Сатеїїпа, Сгтатре або рослиною, що дає горіхи. Рослина може продукувати високі рівні олії в плоді, наприклад, олива, олійна пальма або кокосовий горіх. Садовими рослинами, до яких може бути застосований даний винахід, є салат, ендивій або хрестоцвітні овочі, включаючи капусту, броколі або цвітну капусту. Цей винахід може бути застосований до тютюну, гарбузових, моркви, суниці, помідора або перцю.

У ще одному переважному варіанті реалізації винаходу нетрансгенна рослина, використовувана для одержання трансгенної рослини за винаходом, продукує олію, особливо у насінні, яке містить: ї) менше 20 95, менше 10 95 або менше 5 95 жирних кислот 18:2 та/або ії) менше 10 95 або менше 5 95 жирних кислот 18:3.

У переважному варіанті реалізації винаходу трансгенна рослина або її частина є гомозиготною по всіх і кожному гену (екзогенний полінуклеотид), що були введені (трансгену), таким чином, що її потомство не розділяється для бажаного фенотипу. Крім того, трансгенна рослина може бути гетерозиготною по введеному(им) трансгену(ам), переважно однорідно гетерозиготною по трансгену, наприклад, в потомстві ЕТ, яке вирощене з гібридного насіння.

Такі рослини можуть забезпечувати переваги, наприклад, гібридну силу, добре відому з рівня техніки, або можуть застосовуватися у розведенні і зворотному схрещуванні рослин.

Якщо це доречно, трансгенна рослина або її частина можуть містити додаткові трансгени, що кодують ферменти, які беруть участь у продукуванні ДЛ-ПНЖК, такі як, без обмеження, Дб- десатураза, ДЛ9У-елонгаза, Д8-десатураза, Дб-елонгаза, Д5-десатураза, о3З-десатураза, дДь- елонгаза, діацилгліцерол ацилтрансфераза, ЛФКАТ, А17-десатураза, Д1Т5-десатураза та/або

Д12-десатураза. Приклади таких ферментів з одним або більше вказаних видів активності відомі з рівня техніки і включають розкриті в цьому документі. У конкретних прикладах, трансгенна рослина щонайменше містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують: а) Д5-десатуразу, Аб-десатуразу, Д5-елонгазу і Аб-елонгазу, б) Д5-десатуразу, Д8-десатуразу, Д5-елонгазу і ДУ-елонгазу, в) Д5-десатуразу, Аб-десатуразу, Д5-елонгазу, Аб-елонгазу і А15-десатуразу, г) А5-десатуразу, А8-десатуразу, Д5-елонгазу, Л9-елонгазу і Д15-десатуразу, бо д) А5-десатуразу, Аб-десатуразу, А5-елонгазу, Аб-елонгазу і А17-десатуразу, або е) Д5-десатуразу, Ав-десатуразу, Д5-елонгазу, Л9-елонгазу і Д17-десатуразу, ж) Ф3-десатуразу або Д15-десатуразу, Аб-десатуразу, А5-десатуразу, Аб-елонгазу і Д5Ь- елонгазу, 3) ФЗ3-десатуразу або Л15-десатуразу, Ав-десатуразу, А5-десатуразу, ДУ-елонгазу і Д5Б- елонгазу, ї) Д12-десатуразу, ю3-десатуразу або Д15-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб- елонгазу и Д5-елонгазу, й) Д12-десатуразу, 03-десатуразу або Д15-десатуразу, Дв-десатуразу, Д5-десатуразу, До- елонгазу і Д5-елонгазу, кю) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), юЗ-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5- десатуразу, Дб-елонгазу і Д5-елонгазу, л) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), А15-десатуразу, Дб-десатуразу, д5-десатуразу, Аб-елонгазу і Д5-елонгазу, м) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), А12-десатуразу, Дб-десатуразу, д5-десатуразу, Дб-елонгазу і Д5-елонгазу, н) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), А12-десатуразу, 0ш3-десатуразу та/або Д15-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб-елонгазу і Д5-елонгазу, о) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), 03-десатуразу, Дв-десатуразу, Д5- десатуразу, Д9-елонгазу і Д5-елонгазу, п) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Д15-десатуразу, Д8в-десатуразу, д5-десатуразу, ДЛ9-елонгазу і Д5-елонгазу, р) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Д12-десатуразу, Д8в-десатуразу, д5-десатуразу, Л9-елонгазу і А5-елонгазу, або с) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), А12-десатуразу, Фш3-десатуразу та/або А15-десатуразу, Дв-десатуразу, Д5-десатуразу, Л9-елонгазу і А5-елонгазу.

У варіанті реалізації винаходу екзогенні полінуклеотиди кодують набір поліпептидів, що являють собою Дб-десатуразу РуїПпішт ігедціаге, А5-дезатуразу ТНгайзіоснуні або д5Ь- дезатуразу Етійапа пихієуї, Аб-елонгазу РнпузсотіїгеПа раїеп5, А5-елонгазу Тпгаивіоспуїтій або д5-елонгазу О5ігеосссиз Фашгії і о3-десатуразу Рпуїоріннога іптезтап5 або 03-десатуразу Руїтійт ітедшіаге.

У варіанті реалізації винаходу рослини за винаходом вирощені в полі, переважно як популяція розміром щонайменше 1000 або 1000000 або 2000000 рослин, які по суті є однаковими, або на площі щонайменше 1 гектар або 2 гектари. Щільність насадження варіює у відповідності до виду рослини, різновиду рослини, клімату, умов грунту, норм застосування добрив та інших факторів, як відомо з рівня техніки. Наприклад, рапс звичайно вирощують із щільністю насадження 1,2-1,5 млн. рослин на гектар. Урожай рослин збирають, як відомо з рівня техніки, що може включати валкування, рядне компостування та/або жнива плодів рослин, з подальшою молотьбою та/або віянням рослинного матеріалу для відокремлення насіння від решти частин рослини, часто у формі полови. Альтернативно, урожай насіння може бути зібраний з рослин у полі в ході єдиного процесу, а саме, комбайнування.

Трансформація рослин

Трансгенні рослини можуть бути одержані із застосуванням методів, відомих з рівня техніки, таких як загалом описані в А. Зіаїег еї аї!., Ріапі Віотесппоїосду -- Те Сепеїїс Мапіршіайоп ої

Ріапі5, Охіога Опімегейу Ргезз (2003), і Р. Спгізіои апа Н. Кіеєе, Напаброок ої Ріапі Віотесппоіоду, допп ММіеу апа 5опз (2004).

В цьому документі терміни «стабільно трансформуючий», «стабільно трансформований» і їх варіації позначають інтеграцію екзогенних молекул нуклеїнових кислот в геном клітини таким чином, що вони передаються клітинам потомства в процесі поділу клітини, без необхідності в проведенні позитивної селекції щодо їх присутності. Стабільні трансформанти або їх потомство можуть бути відібрані будь-якими засобами, відомими з рівня техніки, такими як саузерн-блоти на хромосомній ДНК або гібридизація геномної ДНК іп 5йи. Переважно, трансформацію рослин здійснюють так, як описано в Прикладах в даному описі.

Опосередковане Адгобрасієтійт перенесення є широко використовуваною системою для введення генів в рослинні клітини, оскільки ДНК може бути введена в клітини в суцільних тканинах рослини або органах рослини або експлантах в культурі тканини, з метою тимчасової експресії або стабільної інтеграції ДНК в геном клітини рослини. Використання опосередкованих

Адгорасієегішт векторів, що інтегруються, для рослин з метою введення ДНК в клітини рослини добре відоме з рівня техніки (див., наприклад, Ш5 5177010, 5 5104310, 05 5004863 або 05 5159135), включаючи методи занурення квіток з використанням Адгобасіегішт або інших бо бактерій, які можуть переносити ДНК в клітини рослини. Ділянка ДНК для перенесення визначається послідовностями межі, причому проміжна ДНК (Т-ДНК) звичайно вставляється до геному рослини. В подальшому, інтеграція Т-ДНК є відносно точним процесом, що приводить до декількох реорганізацій. У тих різновидах рослин, в яких опосередкована Аадгобасіегійт трансформація є ефективною, вона є способом вибору завдяки легкій і визначеній природі перенесення гена. Переважні вектори трансформації Адгобасіегіт здатні до реплікації в Е. соїї, так само, як і Адогобасіегічт, дозволяючи здійснити необхідні маніпуляції, як було описано (Ківе еї аї., в: Ріапі ОМА Іптесійои5 Адепів, Нопп апа зсепеїї, ед5., Зргіпдег-Мепад, Мем МогК, рр. 179-203 (1985)).

Способи прискорення, які можуть застосовуватися, включають, наприклад, балістичну трансфекцію, тощо. Одним із прикладів способу доставки трансформуючих молекул нуклеїнових кислот в клітини рослини є балістична трансфекція. Даний спосіб розглянутий Хапд еї а)., Рапісіє Вотрагатепі Тесппоіоду тог Сепе Тгапвівгї, Охіога Ргез55, Охіога, Епдіапа (1994).

Небіологічні частинки (мікрочастинки) в ньому можуть бути вкриті нуклеїновими кислотами і доставлені в клітини рушійною силою. Приклади частинок включають виготовлені з вольфраму, золота, платини, тощо. Конкретна перевага балістичної трансфекції, на додаток до того, що вона є ефективним засобом відтворюваної трансформації однодольних, є те, що вона не вимагає ані виділення протопластів, ні сприйнятливості до інфекції Адгорасіегійт.

В іншому альтернативному варіанті реалізації винаходу пластиди можуть бути стабільно трансформовані. Способи, розкриті для трансформації пластиди у вищих рослинах, включають доставку за допомогою генної гармати частинки ДНК, що містить селекційний маркер, і націлювання ДНК на геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації (05 5451513, 05 5545818, 005 5877402, 5 5932479 і ММО 99/05265).

Інші способи трансформації клітини можуть також застосовуватися і включають, без обмеження, введення ДНК в рослини прямим перенесенням ДНК в пилок, прямою ін'єкцією ДНК в репродуктивні органи рослини або прямою ін'єкцією ДНК у клітини незрілих ембріонів, з подальшою регідратацією висушених ембріонів.

Регенерація, розвиток і культивування рослин з одинарних трансформантів протопласта рослини або з різноманітних трансформованих експлантів добре відомі з рівня техніки (УУвіззрасі єї аї. У: Меїпоаз ог Ріапі МоїІесшіаг Віоіоду, Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, Саїїї., (1988)).

Зо Така регенерація і процес росту звичайно включають стадії селекції трансформованих клітин, культивування таких індивідуальних клітин через звичайні стадії ембріонального розвитку, зокрема, стадію вкорінення саджанця. Трансгенні ембріони і насіння регенерують в такий же спосіб. Одержані трансгенні укорінені пагони в подальшому висаджують у відповідне середовище для росту рослини, таке як грунт.

Розвиток або регенерація рослин, що містять чужорідний, екзогенний ген, добре відомі з рівня техніки. Переважно регенеровані рослини є такими, що самозапилюються, щоб забезпечити гомозиготні трансгенні рослини. В іншому випадку, пилок, одержаний від регенерованих рослин, схрещують з вирощеними із насіння рослинами важливих з агрономічної точки зору ліній. З другого боку, пилок рослин таких важливих ліній використовується для запилення регенерованих рослин. Трансгенну рослину за даним винаходом, що містить бажану екзогенну нуклеїнову кислоту, культивують із застосуванням способів, добре відомих фахівцю в даній галузі техніки.

Щоб підтвердити присутність трансгенів в трансгенних клітинах і рослинах, може бути здійснена ампліфікація шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або аналіз методом саузерн-блота, із застосуванням способів, відомих фахівцям в дані галузі техніки. Продукти експресії трансгенів можуть бути виявлені будь-яким з численних шляхів, в залежності від природи продукту, що включають вестерн-блот і ферментний аналіз. Як тільки трансгенні рослини одержані, їх можна вирощувати для одержання тканин або частин рослини з бажаним фенотипом. Тканина рослини або частини рослини можуть бути зібрані як урожай, та/або зібране насіння. Насіння може служити джерелом вирощування додаткових рослин з тканинами або частинами, що володіють бажаними характеристиками.

Трансгенна рослина, одержана із застосуванням Адгобасієгійт або інших способів трансформації, звичайно містить єдиний генетичний локус на одній хромосомі. Такі трансгенні рослини можуть носити назву гемізиготних за введеним(ими) геном(ами). Більш переважною є трансгенна рослина, гомозиготна по введеному(им) гену(ам); тобто, трансгенна рослина, яка містить два додаткових гени, по одному гену в однакових локусах на кожній хромосомі з пари хромосом. Гомозиготна трансгенна рослина може бути одержана шляхом самозапліднення гемізиготної трансгенної рослини, пророщування частини одержаного насіння та аналізу одержаних рослин щодо присутності цільового гена.

Крім того, необхідно розуміти, що дві різні трансгенні рослини, що містять два незалежно сегрегуючих екзогенних гени або локуси, можуть бути схрещеними (спареними), з метою одержання потомства, яке містить обидва набори генів або локусів. Самозапліднення відповідного нащадка ЕЇ може давати рослини, гомозиготні по обох екзогенних генах або локусах. Зворотне схрещування з материнською рослиною і знищення нетрансгенної рослини також розглядаються, як вегетативне розведення. Опис інших способів розведення, які звичайно використовуються для різноманітних ознак і врожаю, можна знайти в ЕРенйг, в: Вгеєедіпд

Меїподз їтог Сийімаг Оемеіортепі, УМіїсох у). ед., Атегісап босієїу ої Адгопоту, Мадізоп МУ/ів. (1987).

Підвищення рівнів екзогенної РНК і стабілізована експресія

Супресори сайленсингу

У варіанті реалізації винаходу рослинна клітина, рослина або частина рослини містить екзогенний полінуклеотид, що кодує білок супресора сайленсингу.

Посттранскрипційний сайленсинг гена (ПТСГ) є специфічним для послідовності нуклеотидів механізмом захисту, що може бути націлений як на клітинні, так і на вірусні мРНК з метою їх розкладу. ПТСГ виникає в рослинах або грибах, стабільно або тимчасово трансформованих чужорідною (гетерологічною) або ендогенною ДНК, і приводить до зменшення акумуляції молекул РНК, послідовність яких подібна до введеної нуклеїнової кислоти.

Широко досліджений той факт, що коекспресія супресора сайленсинга із цільовим трансгеном підвищує рівні присутньої в клітині РНК, що транскрибована із трансгену. Хоча це є доведеним фактом для клітин іп міго, значущі побічні ефекти спостерігаються в багатьох дослідженнях коекспресії у суцільних рослинах. Більш конкретно, як описано в Маїогу еї аї. (2002), Спартап еї а!. (2004), Снеп єї а!. (2004), Юипоуєег вї а!. (2004), 7Напа еї а!. (2006), І ем/узеу еї а. (2007) і Мепо еї аїІ. (2008) рослини, що експресують супресори сайленсинга, загалом під контролем конститутивних промоторів, часто є фенотипово аномальними до такої міри, що вони непридатні для комерційного виробництва.

Нещодавно було виявлено, що рівні молекул РНК можуть бути збільшені та/або рівні молекул РНК можуть бути стабілізовані протягом численних поколінь шляхом допомогою обмеження експресії супресора сайленсинга насінням рослини або його частиною

Зо (МО2010/057246). В цьому документі «білок-супресор сайленсинга» або БСС являє собою будь- який поліпептид, який може експресуватися в клітині рослини, що підвищує рівень продукту експресії іншого трансгену в клітині рослини, особливо в подальших поколіннях, одержаних від початково трансформованої рослини. У варіанті реалізації винаходу БСС являє собою вірусний супресор сайленсинга або його мутант. Велика кількість вірусних супресорів сайленсинга відома з рівня техніки і включає, без обмеження, Р19, М2, РЗ8, Ре-Ро і КРУ-РО. У варіанті реалізації винаходу вірусний супресор сайленсинга містить послідовність амінокислот, представлену будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 53-57, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот щонайменше на 50 95 ідентичною будь-якій одній або більше із ЗЕО

ІО МО: 53-57, яка додатково володіє активністю супресора сайленсинга.

В цьому документі терміни «стабілізуючий експресію» «стабільно експресований», «стабілізована експресія» та їх варіації позначають рівень молекули РНК, по суті такий ж або перевищуючий рівень у рослинах-нащадках протягом наступних поколінь, наприклад, щонайменше 3, щонайменше 5 або щонайменше 10 поколінь, в порівнянні з ізогенними рослинами, які не містять екзогенного полінуклеотиду, що кодує супресор сайленсинга. Однак, даний(і) термін(и) не виключає(ють) можливості деякого зниження рівнів молекули РНК в наступних поколіннях, в порівнянні з попереднім поколінням, наприклад, зниження не менше 10

Фо на покоління.

Супресор може бути вибраний з будь-якого джерела, наприклад, рослини, вірусу, ссавця, тощо. Див. ММО2010/057246 щодо переліку вірусів, з яких може бути одержаний супресор і позначення білка (наприклад, В2, Р14, тощо.) або кодуючої ділянки для супресора з кожного конкретного вірусу. Множинні копії супресора можуть бути використані. Різні супресори можуть використовуватися спільно (наприклад, в тандемі).

Молекули РНК

По суті будь-яка молекула РНК, яку бажано екпресувати в насінні рослини, може бути коекспресована із супресором сайленсинга. Кодовані поліпептиди можуть приймати участь в метаболізмі олії, крохмалю, вуглеводів, поживних речовин, тощо, або можуть бути відповідальними за синтез білків, пептидів, жирних кислот, ліпідів, воску, масел, крохмалів, цукру, вуглеводів, смакоароматичних речовин, ароматичних речовин, токсинів, каротиноїдів, гормонів, полімерів, флавоноїдів, запасних білків, фенолових кислот, алкалоїдів, лігніну, танінів, 60 целюлози, глікопротеїнів, гліколіпідів, тощо, переважно біосинтез або збирання ТАГ.

У конкретному прикладі, рослини продукують підвищені рівні ферментів для продукування олії в рослинах, наприклад, видів Вгаз5зіса, таких як канола або соняшника, сафлору, льону, бавовнику, соєвому бобі, Сатеїїйпа або магїгсі.

Рівні продукування ДЛ-ПНЖК

Рівні ДЛА-ПНЖК або комбінацій ДЛ-ПНЖК, що продукуються в рекомбінантній клітині або частині рослини, наприклад, насінні, мають велике значення. Рівні можуть бути виражені, як склад (у відсотках) загальних жирних кислот, які є конкретними ДЛ-ПНЖК або групою споріднених ДЛ-ПНЖК, наприклад, 03 ДЛ-ПНЖК або об ДЛ-ПНЖК, або ДДЛ-ПНЖК, або інші, що може бути визначене за способами, відомими з рівня техніки. Крім того, рівень може бути виражений, як вміст ДЛ-ПНЖК, наприклад як відсоток ДЛ-ПНЖК в сухій масі матеріалу, що містить рекомбінантні клітини, наприклад, відсоток від маси насіння, який представляє ДЛ-

ПНЖК. Необхідно розуміти, що рівень ДЛ-ПНЖК, що продукується в олійній культурі, може бути значно вищим за показниками вмісту ДЛ-ПНЖК, ніж в овочі або насінні, яке не вирощувалося для цілей одержання олії, хоча обидва можуть мати подібний склад ДЛ-ПНЖК і обидва можуть використовуватися як джерела ДЛ-ПНЖК для споживання людиною або твариною.

Рівні ДЛ-ПНЖК можуть бути визначені за будь-яким із способів, відомих у даній галузі техніки. У переважному способі загальний ліпід добувають з клітин, тканин або організмів, і жирну кислоту перетворюють на метилові естери перед аналізом газовою хроматографією (ГХ).

Такі методи розкриті у Прикладі 1. Розташування піку на хроматограмі може використовуватися для ідентифікації кожної конкретної жирної кислоти, і площу кожного піку інтегрують для визначення кількості. В цьому документі, якщо не вказано інше, відсоток конкретної жирної кислоти у зразку визначають, виражаючи площу піку вказаної жирної кислоти як відсоток від загальної площі піків жирних кислот на хроматограмі. По суті, це відповідає масовому відсотку (мас/мас). Ідентичність жирних кислот може бути підтверджена ГХ-МС. Загальні ліпіди можуть бути виділені методами, відомими з рівня технікию, з метою очищення фракцій, наприклад, фракції ТАГ. Наприклад, тонкошарова хроматографія (ТШХ) може бути здійснена в аналітичному масштабі, щоб відокремити ТАГ від інших фракцій ліпіду, таких як ДАГ, ацил-КоА або фосфоліпід, з метою визначення складу жирних кислот конкретно для ТАГ.

В одному варіанті реалізації винаходу загальна сума АРК, ЕПК, ДПК і ДГК в жирних кислотах екстрагованого ліпіду становить від близько 7 95 до близько 25 95 загальних жирних кислот в клітині. У подальшому варіанті реалізації винаходу загальні жирні кислоти в клітині містять менше 1 95 С20:1. У переважних варіантах реалізації екстрагований ТАГ в клітині містить жирні кислоти в кількостях, вказаних у цьому документі. Кожна з можливих комбінацій ознак, що визначають ліпід, розкритий в цьому документі, також включена.

Додатково, рівень продукування ДЛ-ПНЖК в рекомбінантній клітині, рослині або частині рослини, наприклад, насінні, може бути виражений, як відсоток перетворення конкретного жирнокислотного субстрату на один або більше жирнокислотних продуктів, що в цьому документі додатково носить назву «ефективності перетворення» або «ефективності ферменту».

Цей параметр базується на жирнокислотному складі ліпіду, екстрагованого з клітини, рослини, частини рослини або насіння, тобто, кількості утвореної ДЛ-ПНЖК (зокрема іншої ДЛ-ПНЖК, одержаної з неї), вираженому як відсоток від одного або більше жирнокислотних субстратів (зокрема, всіх інших жирних кислот, одержаних із нього). Загальна формула для відсотка перетворення: 100 х (сума відсотків продукту ДЛ-ПНЖК і всіх продуктів, одержаних із нього)/(сума відсотків жирнокислотного субстрату і всіх продуктів, одержаних із нього). Стосовно

ДПК, наприклад, це може бути виражено, як співвідношення рівня ДПК (у вигляді відсотка від загального вмісту жирних кислот в ліпіді) до рівня жирнокислотного субстрату (наприклад ОК,

ЛК, АЛК, СДК, ЕТК або ЕПК) і всіх продуктів, окрім ДПК, одержаних з субстрату. Відсоток перетворення або ефективність перетворення можуть бути виражені для єдиної ферментної стадії біохімічного шляху, а також для частини або всього шляху.

Специфічна ефективність перетворення обчислена в цьому документі за наступними формулами: 1. ОК на ДПК - 100 х (96ДГКАЗДпПК) (сума 95 для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК,

ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 2. ЛК на ДПК - 100 х (96ДГКАДПК)/сума 95 для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТрК,

ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 3. АЛК на ДПК - 100 х (96ДГКя9УДПК)сума 95 для АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 4. ЕПК на ДПК - 100 х (56ДГКАДПК)сума 95 для ЕПК, ДПК і ДГК). 5. ДПК на ДГК (ефективність лЛ4-десатурази) - 100 х ( 96ДГК)/(сума 95 для ДПК і ДГК).

6. Ефективність АІ12-десатурази - 100 х (сума 95 для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК,

ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГКЮ)/сума 95 для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК,

ЕПК, ДПК і ДГК). 7. Ефективність 03З-десатурази - 100 х (сума 95 для АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і

ДГЮХсума 95 ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 8. ОК на АЛК - 100 х (сума 95 для АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГКЮ)/сума 95 для ОК, ЛК,

ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 9. Ефективність Дб-десатурази (на 03 субстраті АЛК) - 100 х (сума 95 для СДК, ЕТК, ЕПК,

ДПК і ДГЮЛ 95 АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 10. Ефективність Аб-елонгази (на 03 субстраті СДК) - 100 х (сума 95 для ЕТК, ЕПК, ДПК і

ДГЮ/ сума 95 для СДК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 11. Ефективність Д5-десатурази (на 03 субстраті ЕТК) - 100 х (сума 95 для ЕПК, ДПК і

ДГЮ/Ссума 95 для ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 12. Ефективність Д5-елонгази (на 03 субстраті ЕПК) - 100 х (сума 95 для ДПК і ДГЮУ(сума 90 для ЕПК, ДПК і ДГК).

Жирнокислотний склад ліпіду, переважно олії з насіння, за винаходом також відрізняється за співвідношенням 06 жирних кислот : 03 жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот, для будь-яких загальних 0б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот або для нових 0б жирних кислот : 003 нових жирних кислот. Терміни загальні 06 жирні кислоти, загальні 03 жирні кислоти, нові фб жирні кислоти і нові 03 жирні кислоти мають значення, визначені в цьому документі.

Співвідношення обчислюють на базі складу жирних кислот у ліпіді, екстрагованому з клітини, рослини, частини рослини або насіння ліпіду, за способом, приклад якого наведений у цьому документі. Більш бажаною є присутність в ліпіді вищого рівня 03 жирних кислот, ніж 0б жирних кислот, і таким чином співвідношення 06:03 менше 1,0 є переважним. Співвідношення 0,0 вказує на повну відсутність певних б жирних кислот; співвідношення 0,03 було досягнуте, як розкрито у Прикладі 6. Такі низькі значення співвідношення можуть бути досягнуті шляхом сполученого використання Дб-десатурази з перевагою по відношенню до субстрату 03, разом з ошЗ3-десатуразою, особливо грибковою с3-десатуразою, такою як 03-десатураза Ріспіа равіогів, приклад якої наведений в цьому документі.

Зо Додатково, вихід ДЛ-ПНЖК на масу насіння може бути обчислений на базі загального вмісту олії в насінні і 95 ДПК в олії. Наприклад, якщо вміст олії в насінні рапсу становить близько 40 95 (мас./мас.), і близько 12 95 від загального вмісту жирних кислот в олії становить ДПК, то вміст

ДПК в насінні становить близько 4,8 95 або близько 48 мг на грам насіння. При вмісті ДПК близько 21 95, насіння рапсу або насіння Сатеїймпа взаїїма містить рівень ДПК близько 84 мг на грам насіння. У цьому винаході таким чином розкриваються рослини Вгаззіса пари», В. )|ипсеа і

Сатеїїпа займа та одержане з них насіння, яке містить щонайменше близько 80 мг або щонайменше близько 84 мг ДПК на грам насіння. Вміст вологи в насінні є стандартним для зібраного в процесі збору урожаю зрілого насіння після сушіння (4-15 95 вологи). У винаході також розкривається спосіб одержання олії, який включає одержання насіння і виділення олії з насіння, застосування олії і способи одержання насіння, включаючи збір урожаю насіння з рослин за винаходом.

Крім того, може бути обчислена кількість ДПК, що продукується на гектар, якщо вихід насіння з гектара відомий або може бути оцінений. Наприклад, урожайність рапсу в Австралії зазвичай близько 2,5 тони насіння на гектар, що при вмісті олії 40 95 дає близько 1000 кг олії.

При вмісті ДПК 20,1 95 в кінцевій олії, це забезпечує близько 200 кг ДПК на гектар. Якщо вміст олії знижується на 50 95, це все ще забезпечує близько 100 кг ДПК на гектар.

Одержані на сьогоднішній день докази свідчать про те, що деякі десатурази, що гетерологічно експресуються в дріжджах або рослинах, володіють відносно низькою активністю в комбінації з деякими елонгазами. Дану ситуацію можна покращити, надаючи десатуразі здатність використовувати форму ацил-КоА жирної кислоти як субстрат у синтезі ДЛ-ПНЖК, і це вважається переважним в рекомбінантних клітинах, особливо у клітинах рослини. Особливо переважна комбінація для ефективного синтезу ДПК являє собою грибкову 03-десатуразу, наприклад, таку як ФЗ-десатураза Ріспіа равіогіз (ЗБЕО ІЮ МО: 6), що є Дб-десатуразою з перевагою по відношенню до 03 ацильних субстратів, наприклад, таку як Аб-десатураза

Місготопаз ризйШа (ЗЕО ІЮ МО: 9) або її варіанти з ідентичністю послідовності амінокислот щонайменше 95 95.

В цьому документі термін «що по суті не містить» означає, що композиція (наприклад, ліпід або олія) містить невелику кількість (наприклад, менше, ніж близько 0,5 95, менше, ніж близько 0,25 956, менше, ніж близько 0,1 95, або менше, ніж близько 0,01 95) або не містить певного бо компоненту. У варіанті реалізації винаходу «такий, що по суті не містить» означає, що компонент неможливо знайти за допомогою шаблонної методики аналізу, наприклад, конкретна жирна кислота (наприклад, 0б-докозапентаєнова кислота) не може бути знайдена за допомогою газової хроматографії, як у загальних рисах розкрито в Прикладі 1

У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід, екстрагована олія, рослина або її частина, така як насіння (за винаходом або застосовуване у процесі/способі за винаходом), продукт харчування або композиція за винаходом не містить всі-цис-6,9,12,15,18- генейкозапентаєнової кислоти (п-3 ГПК).

Одержання олій

Способи, які шаблонно практикуються в цій галузі техніки, можуть застосовуватися для виділення, обробки і аналізу олій, продукованих клітинами, рослинами, насінням, тощо за даним винаходом. Зазвичай насіння рослини термічно обробляють, пресують і екстрагують, щоб продукувати неочищену олію, яку далі гідратують, рафінують, відбілюють і дезодорують.

Загалом методи подрібнення насіння відомі з рівня техніки. Наприклад, насіння олійних культур може бути пом'якшено шляхом зрошування його водою для підвищення вмісту вологи, наприклад, до 8,5 95, і провальцьоване за допомогою гладкого валу із щілинами розміром 0,23-- 0,27 мм. В залежності від виду насіння, перед подрібненням можна не додавати воду.

Застосування нагрівання інактивує ферменти, полегшує подальший розрив клітини, об'єднання олійних крапель, і забезпечує агломерацію частинок білка, причому все це спрощує процес екстракції.

У варіанті реалізації винаходу більшість олії з насіння вивільняється при пропусканні крізь гвинтовий прес. Макуху, що виходить з гвинтового пресу, далі екстрагують, наприклад, гексаном, з використанням колонки із супровідним теплоконтролем. Як альтернатива, неочищена олія, одержана в ході операції пресування, може бути пропущена крізь резервуар для осадження з дротяним дренажним верхом із прорізами, щоб видалити тверді речовини, які потрапляють в олію в ході операції пресування. Освітлена олія може бути пропущена крізь рамний і фільтр-прес для видалення будь-яких тонких механічних включень, що залишилися. За необхідності олія після процесу екстракції може бути об'єднана з освітленою олією, з одержанням змішаної неочищеної олії.

Як тільки розчинник відокремлений від неочищеної олії, пресовані та екстраговані порції

Зо об'єднують і обробляють звичайними процедурами обробки олії. В цьому документі термін «очищений», використовуваний у зв'язку з ліпідом або олією за винаходом, звичайно означає, що екстрагований ліпід або олія пройшли одну або більше стадій обробки, які підвищують ступінь чистоти ліпідного/олійного компоненту. Наприклад, стадія очищення може включати одне або більше або все із групи, що складається з: гідратації, дезодорування, відбілювання, сушіння та/або фракціонування екстрагованого олії. Однак в цьому документі термін «очищений» не включає процесу переестерифікації або іншого процесу, що модифікує склад жирних кислот ліпіду або олії за винаходом для збільшення вмісту ДГК як відсотка від загального вмісту жирних кислот. юІншими словами, склад жирних кислот очищеного ліпіду або олії по суті є таким же, як склад неочищеного ліпіду або олії.

Дегумація

Дегумація є початковою стадією рафінацій олій, і її основна мета полягає у видаленні з олії більшості фосфоліпідів, які можуть бути присутніми в кількості близько 1-2 95 від загального екстрагованого ліпіду. Додавання до неочищеного олії -2 906 води, що звичайно містить фосфорну кислоту, при 70-80 С приводить до відокремлення більшості фосфоліпідів, за наявності залишкових кількостей металів і пігментів. Нерозчинний матеріал, який відокремлюється, в основному є сумішшю фосфоліпідів і триацилгліцеролів, і також відомий як лецитин. Гідратація може здійснюватись шляхом додавання концентрованої фосфорної кислоти до неочищеної олії з насіння, з метою переведення нездатних до гідратації фосфатидів у здатну до гідратації форму та утворення хелатів металів, які присутні в незначних кількостях. Смолу відокремлюють від олії з насіння центрифугуванням.

Лужна рафінація

Лужна рафінація є одним із способів очищення для обробки неочищеного олії, який іноді також називають нейтралізацією. Вона зазвичай слідує за гідратацією і передує відбілюванню.

Після гідратації олія з насіння може бути оброблена додаванням достатньої кількості розчину лугу, щоб відтитрувати всі жирні кислоти і фосфорні кислоти, з подальшим видаленням утвореного мила. Придатні лужні матеріали включають натрію гідроксид, калію гідроксид, натрію карбонат, літію гідроксид, кальцію гідроксид, кальцію карбонат і амонію гідроксид. Цей спосіб, як правило, здійснюють за кімнатної температури, з видаленням фракції вільних жирних кислот. Мило видаляють центрифугуванням або екстракцією мила розчинником , і бо нейтралізовану олію промивають водою. За необхідності, надлишок лугу в олії може бути нейтралізований відповідною кислотою, такою як хлористоводнева кислота або сірчана кислота.

Відбілювання

Відбілювання є способом очищення, за якого олію нагрівають до 90-120 "С, витримуючи за цієї температури протягом 10-30 хвилин у присутності відбілюючої глини (0,2-2,0 95) ії за відсутності кисню, в атмосфері азоту або пари або під вакуумом. Ця стадія обробки олії розроблена таким чином, щоб видаляти небажані пігменти (каротиноїди, хлорофіл, госипол, тощо), причому спосіб додатково видаляє продукти окиснення, залишкові метали, сполуки сірки і залишок мила.

Дезодорування

Дезодорування є обробкою олій і жирів за високої температури (200-260 "С) і низького тиску (0,1-1 мм рт. ст). Зазвичай, це досягається шляхом введення пари в олію з насіння із швидкістю близько 0,1 мл/хвилину/100 мл олії з насіння. Близько через 30 хвилин зрошування олії з насіння охолоджують під вакуумом. Олію з насіння зазвичай подають до скляного контейнеру і пропускають аргон, після чого зберігають за низької температури. Така обробка покращує колір олії з насіння і видаляє більшість летючих речовин або пахучих сполук, включаючи вільні жирні кислоти, що залишилися, моноацилгліцероли і продукти окиснення.

Вінтеризація

Вінтеризація є способом, що іноді застосовується в комерційному виробництві олій з метою розділення олій і жирів на тверді (стеарин) і рідкі (олеїн) фракції шляхом кристалізації за температур, нижчих за температуру навколишнього середовища. Спочатку його застосовували до бавовняної олії, з метою одержання продукту, що не містить твердих речовин. Зазвичай, цей спосіб застосовують для зменшення вмісту насичених жирних кислот в олії.

Переестерифікація

В даному документі «переестерифікація» є способом обміну жирних кислот в межах і між

ТАГ або перенесення жирних кислот на інший спирт, з утворенням естеру. Це може включати первинне вивільнення жирних кислот з ТАГ у формі вільних жирних кислот або пряме одержання естерів жирних кислот, переважно метилових естерів або етилових естерів жирних кислот. В ході реакції переестерифікації ТАГ із спиртом, таким як метанол або етанол, алкільна

Зо група спирту утворює естерний зв'язок із адильними групами (включаючи ДПК) ТАГ. За умови поєднання із способом фракціонування, переестерифікація може застосовуватися для модифікації жирнокислотного складу ліпідів (Магапдопі еї аї.,, 1995). Для переестерифікації можуть використовуватися хімічні (наприклад, каталізовані сильною кислотою або основою) або ферментні препарати, причому останні включають ліпази, що можуть бути специфічними до положення (51п-1/3 або 5п-2 специфічними) жирної кислоти в ТАГ, або з перевагою по відношенню до деяких жирних кислот в порівнянні з іншими (Зрегапга еї аї.,, 2012).

Фракціонування жирних кислот, з метою підвищення концентрації ДЛ-ПНЖК в олії може бути здійснено будь-яким із способів, відомих з рівня техніки, таких як, наприклад, кристалізація виморожуванням, утворення комплексів з використанням сечовини, молекулярна дистиляція, екстракція надкритичною рідиною, протитокова хроматографія і утворення комплексів з іоном срібла. Утворення комплексів із сечовиною є переважним способом унаслідок його простоти та ефективності з точки зору зниження рівня насичених і мононенасичених жирних кислот в олії (Сате? еї аї., 2003). Спочатку, ТАГ в олії розщеплюють на складові жирні кислоти, часто у формі естерів жирних кислот, шляхом гідролізу в умовах каталізу кислотою або основою, внаслідок чого один моль ТАГ реагує щонайменше з З моль спирту (наприклад, етанолу у випадку етилових естерів або метанолу у випадку метилових естерів), причому використовують надлишок спирту, щоб забезпечує розділення алкілових естерів, які утворилися, і гліцерину, який також утворюється, або за допомогою ліпаз. Такі вільні жирні кислоти або естери жирних кислот, що звичайно залишаються в незміненому виді у складі жирних кислот після обробки, в подальшому можуть бути змішані з етанольним розчином сечовини для утворення комплексів.

Насичені і мононенасичені жирні кислоти легко утворюють комплекси із сечовиною, кристалізуються при охолодженні і далі можуть бути видалені фільтрацією. Фракція, що не утворила комплекси із сечовиною, таким чином, збагачується ДЛ-ПНЖК.

Продукти харчування (корми)

Цей винахід включає композиції, які можуть використовуватися як продукти харчування (корми). Для цілей цього винаходу «продукти харчування (корми)» включають будь-який продукт харчування або препарат для споживання людиною або твариною, який при надходженні в організм: (а) служить цілям живлення або утворення тканин або постачання енергією; та/або (б) підтримує, відновлює або сприяє належному харчовому статусу або метаболічній функції. бо Продукти харчування (корми) за винаходом включають харчові суміші для немовлят та/або 5О0 дітей молодшого віку, такі як, наприклад, молочна суміш для дитячого харчування, і шрот за винаходом.

Продукти харчування (корми) за винаходом включають, наприклад, клітину за винаходом, рослину за винаходом, частину рослини за винаходом, насіння за винаходом, екстракт за винаходом, продукт способу за винаходом, продукт процесу ферментації за винаходом, або композицію разом з відповідним(и) носієм(ями). Термін «носій» використовується в найширшому значенні і включає будь-який компонент, який може мати харчове значення або не мати його. Як буде зрозуміло кваліфікованому фахівцю, носій повинен бути придатним для використання (або використовуваним в достатньо низькій концентрації) в продукті харчування (кормі), таким чином, що він не здійснює шкідливого впливу на організм, якій споживає продукт харчування (корм).

Продукт харчування (корм) за цим винаходом включає олію, естер жирної кислоти або жирну кислоту, одержану прямо або непрямо із застосуванням способів, клітин або рослин, розкритих у цьому документі. Додатково композиція може знаходитися в твердій або рідкій формі. Крім того, композиція може містити їстівні мікронутрієнти, білок, вуглеводи, вітаміни та/або мінерали в кількостях, бажаних для конкретного застосування. Кількості цих інгредієнтів варіюватимуть залежно від того, чи призначається композиція для застосування у здорових індивідуумів або для застосування у індивідуумів з особливими потребами, наприклад, індивідуумів, які страждають на метаболічні розлади, тощо.

Приклади придатних носіїв, що мають харчове значення, включають, без обмеження, макронутрієнти, наприклад, їстівні жири, вуглеводи і білки. Приклади таких їстівних жирів включають, без обмеження, кокосове масло, олію бурячника, олію грибів, олію чорної смородини, соєву олію, а також моно- і дигліцероли. Приклади таких вуглеводів включають (без обмеження): глюкозу, їстівну лактозу і гідролізований крохмаль. Додатково, приклади білків, які можуть використовуватися в харчовій композиції за винаходом, включають (без обмеження) білки сої, оброблену електродіалізом сироватку, оброблене електродіалізом збиране молоко, молочну сироватку або гідролізати вказаних білків.

Стосовно вітамінів і мінералів, наступне може бути додане до композицій харчових продуктів (кормів) за цим винаходом: кальцій, фосфор, калій, натрій, хлорид, магній, марганець, залізо, мідь, цинк, селен, йод, вітаміни А, Е, 0, С і вітаміни групи В. Крім того, інші такі вітаміни і мінерали можуть бути додані.

Компоненти, що використовуються в композиціях продукту харчування (корма) за цим винаходом, можуть бути напівочищеними або очищеними. Під напівочищеним або очищеним мається на увазі матеріал, який одержаний шляхом очищення природного матеріалу або синтезу де помо.

Додатково композиція харчового продукту (корми) за даним винаходом може бути додана до їжі навіть в тому випадку, якщо немає необхідності в добавках до раціону. Наприклад, композиція може бути додана до їжі будь-якого типу, зокрема (без обмеження): маргарин, модифіковане масло, сири, молоко, йогурт, шоколад, цукерки, легкі закуски, олії для салатів, олії для приготування їжі, кулінарні жири, м'ясо, риба і напої.

Додатково жирні кислоти, що отримують відповідно за цим винаходом, або клітини-хазяї, трансформовані таким чином, що в них містяться та експресуються цільові гени, можуть використовуватися як харчові добавки для тварин, з метою модифікації складу жирних кислот в тканині, яйці або молоці тварини до необхідного для споживання людиною або твариною.

Приклади таких тварин включають овець, велику рогату худобу, коней, домашніх птахів, наприклад, курей, тощо.

До того ж, продукти харчування (корми) за винаходом можуть використовуватися в аквакультурі, з метою підвищення рівнів жирних кислот в організмі риби або ракоподібних, таких як, наприклад, креветки, для споживання людиною або твариною. Переважно риба є лососем.

Переважні продукти харчування (корми) за винаходом є рослинами, насінням та іншими частинами рослини, такими як листя і стебла, що безпосередньо можуть використовуватися як їжа або корм для людини або тварин. Наприклад, тварини можуть безпосередньо пастися на таких рослинах, вирощуваних в полі, або їм можуть згодовуватися точніше визначені кількості в ході контрольованого годування. Винахід включає застосування таких рослин і частин рослини як їжі для підвищення рівнів ДЛ-ПНЖК в організмі людини і тварин.

У варіанті реалізації винаходу продукт харчування є дитячою сумішшю, що містить ліпід або олію за винаходом. У даному документі «дитяча суміш» позначає не існуючу в природі композицію, яка щонайменше частково задовольняє потребу немовляти у поживних речовинах. «Немовля» позначає суб'єкта-людину віком від моменту народження до не більше ніж одного бо року і включає немовлят із скоректованим віком від 0 до 12 місяців. Вираз «скоректований вік»

означає хронологічний вік немовляти мінус кількість часу, на яку немовля народилося недоношеним. Таким чином, скоректований вік є віком немовляти, неначебто воно народилося доношеним. В даному документі не «існуючий в природі» означає, що продукт не знайдений у природі, але створений втручанням людини. В даному документі дитяча суміш за винаходом виключає чисте грудне молоко людини (Коїеї7Ко еї аї!., 1988) і чисте молоко, продуковане тваринами, хоча дитяча суміш за винаходом може містити компоненти, одержані з молока, такі як молочний білок або гідрокарбони, наприклад, білок сироватки або лактозу. Дитяча суміш за винаходом виключає види м'яса, що зустрічаються в природі, такі як телятина, м'ясо морських котиків, китове м'ясо, або рибу, хоча дитяча суміш за винаходом може містити компоненти з указаних джерел, такі як білки. Дитяча суміш за винаходом завжди містить ліпід, що містить ДПК за винаходом, переважно на рівні від 0,05 95 до близько 0,5 95 мас. від загального вмісту жирних кислот. ДПК може бути присутня у вигляді ТАГ, у вигляді фосфоліпіду або у вигляді неестерифікованої жирної кислоти або їх суміші. Ліпід або олія за винаходом може бути введений до дитячої суміші із застосуванням способів, відомих з рівня техніки. Наприклад, кваліфікований фахівець може з легкістю одержати дитячу суміш за винаходом, загалом із застосуванням способів, описаних у УМО 2008/027991, 0Ш520150157048, 052015094382 і 0О520150148316, у яких ДПК додають на додаток до або замість однієї або більше поліненасичених жирних кислот, описаних у вказаних документах.

В одному прикладі дитяча суміш містить ДПК (тобто, омега-3 ДПК, як описано у даному документі), необов'язково з пробіотиками, особливо полідекстрозою (ПДТ) (і галактоолігосахаридами (ГОС), лактоферин з джерела, що не належить до людського роду, та інші довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти (ДЛ-ПНЖК). У деяких варіантах реалізації винаходу поживний склад додатково містить СДК та/або гама-ліноленову кислоту (ГЛК).. У деяких варіантах реалізації винаходу дитяча суміш містить до 7 г/100 кКал джерела жирів або ліпідів, більш переважно, від близько З г/100 кКал до близько 7 г/100 кКал джерела жирів або ліпідів, причому джерело жирів або ліпідів містить щонайменше близько 0,5 г/100 кКал, і, більш переважно, від близько 1,5 г/100 кКал до близько 7 г/100 кКал джерела білка або еквівалента білка, більш переважно, від близько 1 г/100 кКал до близько 7 г/100 кКал джерела білка або джерела еквівалента білка; і щонайменше близько 5 г/100 кКал гідрокарбону, більш переважно, від близько 5 г до близько 25 г/100 кКал гідрокарбону. Додатково дитяча суміш може містити один або більше або всі із 1) щонайменше близько 10 мг/100 кКал лактоферину, більш переважно, від близько 10 мг/100 кКал до близько 200 мг/100 кКал лактоферину; 2) від близько 0,1 г/100 кКал до близько 1 г/100 кКал пробіотичної композиції, що містить ПДТ і ГОС; їі З) щонайменше близько 5 мг/100 кКал додаткової ДЛ-ПНЖК (тобто, ДЛ-ПНЖК, що не є ДПК), включаючи ДГК, більш переважно, від близько 5 мг/100 кКал до близько 75 мг/100 кКал додаткової ДЛ-ПНЖК, включаючи ДГК.

У варіанті реалізації винаходу співвідношення ДПК:ДГК у загальному вмісті жирних кислот дитячої суміші становить від 1:3 до 2:1. Крім того, може бути присутня ЕПК, але переважно вона відсутня. Якщо вона присутня, то співвідношення ЕПК:ДПК у загальному вмісті жирних кислот переважно становить менш ніж 1:2, більш переважно, менш ніж 1:5. Додатково, АРК може бути відсутня, але переважно вона присутня, і переважно співвідношення АРК:ДПК у загальному вмісті жирних кислот становить від 1:3 до 2:1. Більш переважно, рівні кожної ДЛ-ПНЖК у дитячій суміші є приблизно такими ж, як знайдені в будь-якому грудному молоці людини, якому від природи властиві варіації, в залежності від віку матері, генетичних факторів, вживання з їжею і аліментарного статусу. Наприклад, див. Коїеї2Ко еї а!. (1988). У переважному варіанті реалізації винаходу дитяча суміш не містить рівнів генейкозапентаєнової кислоти (ГПК, 21:53), що піддавалися б виявленню.

Дитяча формула може позначати, наприклад, рідини, порошки, гелі, пасти, тверді речовини, концентрати, суспензії або готові до вживання форми ентеральних сумішей, пероральних сумішей, сумішей для немовлят.

Пробіотіки, що є придатними у відповідності до даного документу, можуть включати полідекстрозу, порошок полідекстрози, лактулозу, лактосахарозу, рафінозу, глюкоолігосахарид, інулін, фруктоолігосахарид, ізомальтоолігосахарид, олігосахариди сої, лактосахарозу, ксилоолігосахарид, хітоолігосахарид, маноолігосахарид, арибіноолігосахарид, сіалілолігосахарид, фукоолігосахарид, галактоолігосахарид і генціоолігосахариди.

Крім того, лактоферин може бути введений до поживного складу у відповідності до даного документу. Лактоферини являють собою одноланцюгові поліпептиди розміром приблизно 80 кДа, що містять 1-4 глікани, в залежності від виду. 3-0 структура лактоферину у різних видів є високою мірою подібною, але не ідентичною. Кожен лактоферин містить дві гомологічні частини, бо під назвою М- і С-долі, що позначає М-кінцеву і С-кінцеву частину молекули, відповідно.

Джерело білка або еквівалента білка може бути будь-яким, яке застосовується у рівні техніки, наприклад, знежирене молоко, білок сироватки, казеїн, соєвий, білок гідролізований білок, амінокислоти і т.п. Джерела білка з коров'ячого молока, придатні у відповідності до даного документу, включають, але не обмежуючись цим, порошок молочного білка, концентрати молочного білка, ізоляти молочного білка, сухі речовини знежиреного молока, знежирене молоко, сухе знежирене молоко, білок сироватки, ізоляти білка сироватки, концентрати білка сироватки, солодку сироватку, кислу сироватку, казеїн, кислий казеїн, казеїнат (наприклад, натрій казеїнат, натрій кальцій казеїнат, кальцій казеїнат) і будь-які їх комбінації.

Придатні джерела гідрокабонів можуть бути будь-якими, які застосовуються в рівні техніки, наприклад, лактоза, глюкоза, фруктоза, сухі речовини кукурудзяного сиропу, мальтодекстрини, сахароза, крохмаль, сухі речовини рисового сиропу і т.п. Кількість гідрокарбонового компоненту у поживному складі становить щонайменше близько 5 г/100 кКал і звичайно може варіювати від близько 5 г до близько 25 г/100 кКал. У деяких варіантах реалізації винаходу кількість гідрокарбону становить від близько 6 г до близько 22 г/100 кКал. У інших варіантах реалізації винаходу кількість гідрокарбону становить від близько 12 г до близько 14 г/100 кКал. У деяких варіантах реалізації винаходу сухі речовини кукурудзяного сиропу є переважними. Крім того, може бути бажаним введення до поживного складу гідролізованих, частково гідролізованих та/або високогідролізованих гідрокарбонів за рахунок їх легкої засвоюваності. Конкретно, гідролізовані гідрокарбони з меншою ймовірністю будуть містити алергенні епітопи.

Необмежуючі приклади гідрокарбонових матеріалів, придатних для застосування у відповідності до даного документу, включають гідролізовані або інтактні, природні або хімічно модифіковані види крохмалю з кукурудзи, тапіоки, рису або картоплі, у воскових або невоскових формах.

Необмежуючі приклади придатних гідрокарбонів включають різні види гідролізованого крохмалю, а саме гідролізований кукурудзяний крохмаль, мальтодекстрин, мальтозу, кукурудзяний сироп, глюкозу, сухі речовини кукурудзяного сиропу, глюкозу та різні інші полімери глюкози і їх комбінації. Необмежуючі приклади інших придатних гідрокарбонів включають ті, які часто називають сахарозою, лактозою, фруктозою, кукурудзяним сиропом з високим вмістом фруктози, незасвоюваними олігосахаридами, наприклад, фруктоолігосахаридами, і їх комбінації.

Зо Крім того, один або більше вітамінів та/"або мінералів переважно можуть бути додані до дитячої суміші в кількостях, достатніх, щоб задовольняти щоденні харчові потреби суб'єкта.

Звичайному фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що потреба у вітамінах і мінералах буде варіювати, наприклад, у відповідності до віку дитини. Крім того, поживний склад необов'язково може містити, але не обмежуючись цим, один або більше із наступних мінералів або їх похідних: бор, кальцій, кальцій ацетат, кальцій глюконат, кальцій хлорид, кальцій лактат, кальцій фосфат, кальцій сульфат, хлорид, хром, хром хлорид, хром піколінат, мідь, мідь сульфат, мідь глюконат, мідь сульфат, флуорид, залізо, залізо карбоніл, залізо (Ії), залізо (І), залізо (ІІ) ортофосфат, тритурація заліза, заліза полісахарид, йодид, йод, магній, магній карбонат, магній гідроксид, магній оксид, магній стеарат, магній сульфат, марганець, молібден, фосфор, калій, калій фосфат, калій йодид, калій хлорид, калій ацетат, селен, сульфур, натрій, натрій докузат, натрій хлорид, натрій селенат, натрій молібдат, цинк, цинк оксид, цинк сульфат і їх суміші.

Необмежуючі приклади похідних мінеральних сполук включають солі, лужні солі, етери (естери) і хелати будь-якої мінеральної сполуки. Мінерали можуть бути додані до поживних складів у формі солей, таких як кальцій фосфат, кальцій гліцерилфосфат, натрій цитрат, калій хлорид, калій фосфат, магній фосфат, залізо (ІЇ) сульфат, магній сульфат, мідь сульфат, марганець сульфат і натрій селенат. Додаткові вітаміни і мінерали можуть бути додані, як відомо з рівня техніки.

У варіанті реалізації винаходу дитяча суміш за винаходом або одержана у відповідності до винаходу, не містить грудного молока людини або тварини або екстракту з нього, що містив би дппк.

В іншому варіанті реалізації винаходу рівень омега-б6 ДПК у загальному вмісті жирних кислот дитячої суміші становить менш ніж 2 95, переважно менш ніж 1 95 або від 0,1 95 до 2 95, більш переважно, вона відсутня.

Композиції

Цей винахід додатково включає композиції, особливо фармацевтичні композиції, що містять одну або більше жирних кислот та/або олій, одержаних із застосуванням способів за винаходом, переважно у формі етилових естерів жирних кислот.

Фармацевтична композиція може містити одну або більше жирних кислот та/або олій, в комбінації із стандартним, відомим, нетоксичним фармацевтично прийнятним носієм, 60 ад'ювантом або розчинником, таким як фосфатно-сольовий буфер, вода, етанол, поліоли,

рослинні олії, зволожуючий агент або емульсія, наприклад, емульсія вода/олія. Композиція може знаходитися в рідкій або твердій формі. Наприклад, композиція може бути у формі пігулки, капсули, рідини для ковтання або порошку, в ін'єкційній формі або у формі мазі або крему для місцевого застосування. Необхідна текучість може підтримуватись, наприклад, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсій і використовування поверхнево- активних речовин. Крім того, може бути бажаним введення ізотонічних агентів, наприклад, цукру, натрію хлориду, тощо. Окрім таких інертних розбавлювачів, композиція може містити ад'юванти, такі як зволожувачі, емульгатори і суспендувальні агенти, підсолоджувачі, смакові добавки та ароматизатори.

Суспензії разом з активними сполуками можуть містити суспендувальні агенти, такі як етоксильовані ізостеарилові спирти, естери сорбіту і поліоксиетилен сорбітану, мікрокристалічну целюлозу, мета-гідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант або суміші цих речовин.

Тверді лікарські форми, такі як таблетки і капсули, можуть бути одержані із застосуванням способів, добре відомих з рівня техніки. Наприклад, жирні кислоти, одержані у відповідності до цього винаходу, можуть бути таблетовані із звичайними основами таблеток, такими як лактоза, сахароза і кукурудзяний крохмаль, у комбінації із зв'язувальними речовинами, такими як акація, кукурудзяний крохмаль або желатин, дезінтегрантами, такими як картопляний крохмаль або альгінова кислота, і змащувальними речовинами, такими як стеаринова кислота або магнію стеарат. Капсули можуть бути одержані шляхом об'єднання вказаних допоміжних речовин в желатиновій капсулі з антиоксидантами і відповідною жирною(ими) кислотою(ами).

Для внутрішньовенного введення, жирні кислоти, одержані у відповідності до цього винаходу, або їх похідні, можуть бути введені в комерційні препарати.

Типові дози конкретної жирної кислоти становлять від 0,1 мг до 20 г, при введенні від 1 до 5 разів на день (до 100 г щоденно), і переважно знаходяться в інтервалі від близько 10 мг до близько 1, 2, 5 або 10 г щодня (у вигляді однієї або декількох доз). Як відомо з рівня техніки, бажано вводити щонайменше близько 300 мг/день жирної кислоти, особливо ДЛ-ПНЖК. Однак необхідно розуміти, що будь-яка кількість жирної кислоти буде корисною для суб'єкта.

Можливі способи введення фармацевтичних композицій за цим винаходом включають,

Зо наприклад, ентеральний (наприклад, пероральний і ректальний) і парентеральний. Наприклад, рідкий препарат може бути введений перорально або ректально. Додатково гомогенна суміш може бути повністю диспергована у воді, попередньо змішаній в стерильних умовах з фізіологічно прийнятними розбавлювачами, консервантами, буферами або пропелентами для одержання спрею або засобу для інгаляцій.

Дози композиції для введення пацієнту можуть бути визначені звичайним фахівцем в цій галузі техніки і залежать від різних факторів, таких як маса тіла пацієнта, вік пацієнта, загальний стан здоров'я пацієнта, анамнез пацієнта, імунний статус пацієнта, тощо.

Додатково композиції за цим винаходом можуть застосовуватися для косметичних цілей.

Вони можуть додаватися до існуючих косметичних композицій таким чином, що утворюється суміш, або жирна кислота, одержана у відповідності до цього винаходу, може використовуватися як єдиний «активний» інгредієнт в косметичній композиції.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Матеріали і способи

Експресія генів в клітинах рослини в системі тимчасової експресії

Екзогенні генетичні конструкції експресують в клітинах рослини в системі тимчасової експресії, як суттєво описано Моїіппеї еї аї. (2003) і УМоса еї аї. (2009).

Аналіз жирних кислот методом газової хроматографії (ГХ)

МЕЖК аналізують методом газової хроматографії за допомогою газового хроматографу

Адііепі ТесппоЇодіеє 7890А ОС (Пало-Альто, Каліфорнія, США), обладнаного колонкою 5ОЕ-

ВРХ7О (70 95 ціанопропіл полісилфенілен-силоксану, внутрішній діаметр 0,25 мм, товщина плівки 0,25 мм) завдовжки 30 м, ПІД (плазмово-іонізаційним детектором), інжектором з розділенням/без розділення, а також серійним аутосемплером та інжектором Адіїепі

Тесппоодіеє 7693. Гелій використовують як газ-носій. Зразки вводять інжекцією в методі з розділенням (співвідношення 50:1) при температурі печі 150 "С. Після інжекції температуру печі підтримують на рівні 150 "С протягом 1 хвилини, далі підвищують до 210 "С із швидкістю

З "С/хвилину, знову підвищують до 240 "С із швидкістю 50 "С/хвилину і остаточно підтримують протягом 1,4 хвилин на рівні 240 "С. Площу піків визначають за допомогою програмного забезпечення Адієпі ТесппоЇодіеє Спетеїайоп (версія Кем 88.04.03 (16), Пало-Альто,

Каліфорнія, США), на базі відповіді відомої кількості зовнішнього стандарту СІ С-411 (МиспескК) і бо внутрішнього стандарту С17:0О-МЕ.

Аналіз ліпідів методом рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (РХ-МС)

Загальні ліпіди екстрагують з ліофілізованого насіння, що розвивається, через 12 днів після цвітіння (дпц) і зрілого насіння після додавання відомої кількості три-С17:0-ТАГ як внутрішнього стандарту для кількісної оцінки. Екстраговані ліпіди розчиняють в 1 мл 10 мМ бутильованого гідрокситолуолу в суміші бутанол/метанол (1:1, об/об) на 5 мг сухого матеріалу і аналізують за допомогою рідинного хроматографу серії Адіїепі 1200 з РХ та іонізацією електророзпиленням за допомогою РХ-МС 64106 з трьома квадрупольними лінзами. Ліпіди хроматографічно розділяють з використанням колонки Азсепіїз Ехрге55 КР-Атіае (50 мм х 2,1 мм, 2,7 мкм, З!иреїсо) в режимі бінарного градієнта із швидкістю потоку 0,2 мл/хвилину. Рухомі фази: А. 10 мМ амонію форміату в суміші НгО/метанол/тетрагідрофуран (50:20:30 об/об/об); В. 10 мМ амонію форміату в суміші

НгО/метанол/гетрагідрофуран (5:20:75, об/об/06). Переліки для моніторингу множинних реакцій (ММР) базуються на наступних основних жирних кислотах: 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 18:4, 20:11, 20:2, 20:3, 20:4, 20:5, 22:4, 22:5, 22:6, з використанням енергії зіткнення 30 В ії фрагментора 60

В. Окремі ТАГ у відповідності до ММР були ідентифіковані на базі амонізованого іона- прекурсора, утвореного в результаті втрати нейтральних частинок 22:6. ТАГ кількісно визначали із застосуванням 10 мкМ тристеарину як зовнішнього стандарту.

Визначення профілю ліпідів за допомогою РХ-МС

Екстраговані загальні ліпіди були проаналізовані із застосуванням РХ серії Адіїепі 1200, сполученого з пристроєм для іонізації електророзпиленням (Адіїепі, Пало-Альто, Каліфорнія,

США). Інжекцію 5 мкл кожного екстракту загальних ліпідів розділяли хроматографічно за допомогою ВЕРХ колонки Азсепіїх Ехрге55 КР-Атіде 50 мм х 2,1 мм, 2,7 мкм (Зідта-Апатси,

Касл-Хіл, Австралія) із застосуванням бінарного градієнта із швидкістю потоку 0,2 мл/хв. Рухомі фази: А. 10 мМ амоній форміату в НгО:метанолі:тетрагідрофурані (50:20:30, об/об/об.); В. 10 мМ амоній форміату в НгО:метанолі:тетрагідрофурані (5:20:75, об/об/об6). Вибрані нейтральні ліпіди (ТАГ ї ДАГ) ії фосфоліпіди (ФЛ, зокрема ФХ, ФЕ, ФІ, ФС, ФА, ФГ) були проаналізовані за допомогою моніторингу множинних реакцій (ММР) із застосуванням енергії зіткнення 30 В і енергії фрагментації 60 В. Нейтральні ліпіди досліджували щодо наступних основних жирних кислот: 16:0 (пальмітинова кислота), 18:0 (стеаринова кислота), 18:1059 (олеїнова кислота, ОК), 18:26 (лінолева кислота, ЛК), 18:3003 (0-ліноленова кислота, АЛК), 18:4003 (стеаридонова кислота, СДК), 20:11, 20:2, 20:3, 20:43, 20:503, 22403, 22:503, 22:603, тоді як фосфоліпіди сканували щодо наявності молекул Стів, Стів, Сго і Сг» з подвійними зв'язками 0-3, 0-4, 0-5, 4-6, відповідно.

Окремі ММР ТАГ були ідентифіковані на базі амонізованого іону-прекурсора та іону продукту, утвореного внаслідок втрати нейтронів 20:1, СДК, ЕПК ії ДГК. ТАГ ї ДАГ кількісно визначали із застосуванням 50 мкМ тристеарину і дистеарину як зовнішніх стандартів. ФЛ кількісно визначали із застосуванням 10 мкМ зовнішніх стандартів ди-18:0-ФХ, ди-17:0-ФА, ди- 17:0-ФЕ, 17:0-17:1-ФГ, ди-18:1-ФІ ї ди-17:0-ФС (Амапії Роїаг Гірід5, Алабастер, Алабама, США).

Для вибраних видів ТАГ, ДАГ і ФЛ проводили подальше підтвердження за допомогою МС/МС 6520 О-ТОБЕ.

Визначення профілю жирних кислот і вмісту олії в насінні

За необхідності визначення вмісту олії в насінні, насіння сушать в ексикаторі протягом 24 годин, і близько 4 мг насіння переносять до скляного флакону місткістю 2 мл, із вкритою

Тефлоном нагвинчувальною кришкою. 0,05 мг тригептадеканоїну, розчиненого в 0,1 мл толуолу, додають у флакон як внутрішній стандарт.

МЕЖК насіння одержують, додаючи 0,7 мл 1 н метанольного НСІ (Зиреїсо) у флакон, що містить матеріал насіння, короткочасно обробляють вихровим перемішуванням та інкубують при 80" С протягом 2 годин. Після охолодження до кімнатної температури, 0,3 мл 0,9 95 (мас/об) розчину Масі ї 0,1 мл гексану додають у флакон і ретельно перемішують протягом 10 хвилин в

НеїдоІри мМіргатах 110. МЕЖК збирають у скляну вставку місткістю 0,3 мл і аналізують методом

ГХ з плазмово-іонізаційним детектором (ПІД), як було згадано раніше.

Площу піку окремого МЕЖК спочатку коректують на базі відповіді у вигляді площі піку відомої кількості таких же МЕЖК, присутніх в комерційному стандарті СІ Сб-411 (МО-СНЕК РЕАЕР,

ІМС., США). І С-411 містить рівні кількості 31 жирної кислоти ( 95 мас.), в інтервалі від С8:0 до

С22:6. У випадку жирних кислот, які відсутні в стандарті, винахідники використовували відповіді у вигляді площі піку найбільш подібного МЕЖК. Наприклад, відповідь у вигляді площі піку МЕЖК 16:149 використовували для 16147, і відповідь МЕЖК С22:6 використовували для С22:5.

Скоректовані значення площі піку використовують для обчислення маси кожного МЕЖК в зразку, в порівнянні з масою внутрішнього стандарту. Олія зберігається в основному у формі

ТАГ, і її масу обчислюють на базі маси МЕЖК. Загальну кількість моль гліцерину визначають 60 шляхом обчислення кількості моль кожного МЕЖК і поділу загальної кількості моль МЕЖК на три. Вміст ТАГ обчислюють як суму гліцерину і жирних ацильних фрагментів, з використанням співвідношення: 9о мас. олії - 100 х ((41 х загальна кількість моль МЕЖК/З) « (загальна кількість грам МЕЖК - (15 х загальна кількість моль МЕЖК)))/грам насіння, де 41 і 15 -- молекулярна маса залишку гліцеролу і метильної групи, відповідно.

Аналіз вмісту стеролів у зразках олії

Зразки близько по 10 мг олії, разом з доданою аліквотою С24:0 монолу як внутрішнього стандарту, обмилюють за допомогою 4 мл 5 95 розчину КОН у 80 95 МеОн і нагрівання до 80 С, витримуючи протягом 2 годин при цій температурі, у вкритій Тефлоном скляній пробірці з нагвинчувальною кришкою. Після охолодження реакційної суміші додають 2 мл води Мійі-О), і стероли екстрагують 2 мл суміші гексан/дихлорметан (4:1, об./06.) при струшуванні і вихровому перемішуванні. Суміш центрифугують, екстракт стеролів витягають і промивають 2 мл води

МІ-С. Далі екстракт стеролів відокремлюють після струшування і центрифугування. Екстракт упарюють в потоку газоподібного азоту, і стероли силілують з використанням 200 мл М,О- бис(триметилсиліл)утрифлуорацетаміду (БСТФА) при нагріванні до 80 "С, витримуючи протягом 2 годин при цій температурі.

Для аналізу стеролів методом ГХ/ГХ-МС, похідні стерол-О-триметилсилілу (стерол-ЮОТМ5І) сушать в потоку газоподібного азоту на термоблоці при 40 "С, ії далі повторно розчиняють у хлороформі або гексані безпосередньо перед аналізом методом ГХ/ГХ-МС. Похідні стерол-

ОТМ5 аналізують газовою хроматографією (ГХ) за допомогою газового хроматографу Адіїепі

Тесппоіодіеє 6890А СС (Пало-Альто, Каліфорнія, США), обладнаного капілярною колонкою з кварцового скла Зиреїсо Едийу 7-1 (15 м х 0,1 мм внутрішній діаметр, товщина плівки 0,1 мкм),

ПІД та інжектором з розщепленням/без розщеплення, а також серійним аутосемплером Адіїепі

ТесппоІодіеє 7683 та інжектором. Як газ-носій використовують гелій. Інжекцію зразків здійснюють в режимі без розщеплення при температурі печі 120 "С. Після інжекції температуру печі підвищують до 270 "С із швидкістю 10 "С/хвилину, і в кінці до 300 "С із швидкістю 5 "С/хвилину. Площу піків визначають за допомогою програмного забезпечення Адійепі

Тесппоїодіе5 Спетецайоп (Пало-Альто, Каліфорнія, США). Результати ГХ містять помилку ж 5

Фо, від значень площі піку окремих компонентів.

Аналізи методом ГХ-мас-спектрометрії (ГХ-МС) здійснюють за допомогою приладів для ГХ-

Зо МС Ріппідап Трегтодиезі СО ії Ріппідап Тпепто ЕїІесігоп Согрогайоп 5С-М5, притому, що обидві системи обладнані інжектором для введення проб безпосередньо на колонку, і програмного забезпечення ТПпептодниеві Хсаїїриг (Остін, Техас, США). Кожний з приладів для ГХ обладнаний капілярною колонкою, полярність якої подібна до розкритої вище. Індивідуальні компоненти ідентифікують, використовуючи дані мас-спектрометрії і порівнюючи дані часу утримування з одержаними для автентичних і лабораторних стандартів. Повну методику холостого аналізу виконують паралельно із серією зразків.

Умови ЗТ-ПЛР

Ампліфікацію методом ПЛР із зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР) звичайно здійснюють з використанням системи ЗТ-ПЛР Зирегзспрі ПШ Опе-5(ер (Іпийгодеп) в об'ємі 25 мкл, з використанням 10 пмоль прямого праймера і 30 пмоль зворотного праймера, Мд5О» до кінцевої концентрації 2,5 мМ, 400 нг загальної РНК з буфером і нуклеотидними компонентами згідно інструкцій виробника. Типові температурні режими були наступними: 1 цикл при температурі "С протягом 30 хвилин для виникнення зворотної транскрипції; потім 1 цикл при температурі 94 7С протягом 2 хвилин, і далі 40 циклів з температурою 94 "С протягом 30 секунд, 527 45 протягом 30 секунд, 70 "С протягом 1 хвилини; потім 1 цикл при температурі 72 "С протягом 2 хвилин перед охолодженням реакційних сумішей до 5 "С.

Визначення кількості копій трансгенів за допомогою цифрової ПЛР

Для визначення кількості копій трансгенів у трансгенній рослині застосовували метод ПЛР, як описано нижче. Крім того, даний метод може бути застосований для визначення того, чи є рослина трансгенною за генетичними конструкціями, описаними у даному описі. Близько квадратного сантиметра листової тканини одержують від кожної індивідуальної рослини і вміщують до колекційної мікропробірки (Оіадеп). Далі зразки сушать виморожуванням протягом 24-48 годин. Для руйнування зразків з метою екстракції ДНК, до кожного висушеного зразка додають кульки з неіржавіючої сталі, і пробірки струшують на лізаторі для тканин Оіадеп. 375 мкл буфера для екстракції (0,1 М Трис-НСЇІ, рН 8, 0,05 М ЕДТА, рн 8, і 1,25 95 ПДВ) додають в кожну пробірку, суміші інкубують при 65 С протягом 1 години, і потім охолоджують перед додаванням в кожну пробірку 187 мкл 6 М амонію ацетату (4 "С) при ретельному перемішуванні.

Далі зразки центрифугують протягом 30 хвилин при 3000 об/хв. Супернатант із кожної пробірки переносять у нові мікропробірки, кожна з яких містить 220 мкл ізопропанолу, для осадження бо ДНК при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. ДНК збирають центрифугуванням пробірок при 3000 об/хв протягом 30 хвилин, гранули ДНК промивають 320 мкл 70 95 етанолу і сушать перед ресуспендуванням ДНК у 225 мкл води. Нерозчинений матеріал гранулюють центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 20 хвилин, і 150 мкл кожного супернатанту переносять на 96-лункові планшети для тривалого зберігання.

Для ефективного і кількісного проведення цифрової ПЛР (даРСК) ДНК розщеплюють рестрикційними ферментами перед проведенням реакцій ампліфікації, щоб гарантувати фізичне розділення декількох копій трансгенів або множинних інсерцій. Таким чином, аліквоти препаратів ДНК розщеплюють за допомогою ЕсоКІ і Ватні, разом узятих, в об'ємі 20 мкл, із застосуванням 10х буфера ЕсокКіІ, 5 мкл ДНК і близько 4 одиниць кожного ферменту на зразок, з інкубацією протягом ночі при 37 "С.

Праймери, використовувані у цих реакціях ПЛР, були сконструйовані із застосуванням програмного забезпечення Ргітег3, щоб підтвердити, що передбачена відсутність взаємодії між праймерами для референтних генів і генів-мішеней, або така взаємодія не створює проблем за використовуваних умов. Референтним геном в аналізі був ген рапсу Нтд (група високої рухливості), присутній в одному екземплярі у геномі рапсу (Ууепо еї а!., 2004). Оскільки рапс є алотетраплоїдом, припускали наявність 4 копій гена Нто, тобто 2 алелів кожного із двох генів, у

Вгаззіса пари5. У реакціях референтного гена застосовували пару праймерів і зонд, що містив подвійну мітку, як указано нижче: Смисловий праймер, Сап11 дсдаадсасаїсдадіса (ЗЕО ІЮ МО: 50); Антисмисловий праймер, Сап1!2 дондадаіддіадсюдадоа (ЗЕБО ІЮО МО: 51); Нтод-РЗ 5-

НехлЛсісіас/2еп/ссадісісасаїдасас/ЗІАВКЕО/-3 (ЗЕО ІЮ МО: 52). Розмір продукту ампліфікації становив 73 пари основ.

У одній реакції ампліфікації гена-мішені, в ході якої виявляли ген селекційного маркеру ФФТ для скринінгу всіх трансгенних рослин, смисловий праймер являв собою Сап17, агасаадсасддіддаюддуа (ЗЕБЕО ІО МО: 53); антисмисловий праймер, Сап18 ддісіаасаддісіаддадда (ЗЕО І МО: 54); зонд, РРТ-РЗ 5-/РАМЛадсааада/геп/дашсаадснссідс/ЗІАВКЕО/-3' (5ЕО ІЮ МО: 55). Розмір даного продукту ампліфікації гена-мішені становив 82 пари основ. У деяких випадках, паралельно проводили другий аналіз гена-мішені, щоб виявити часткові інсерції Т-

ДНК. В ході такого другого аналізу виявляли ділянку гена ДЛб-десатурази за допомогою смислового праймера, Сап23 саадсассдіадіаадададса (ЗЕО ІЮ МО: 56), антисмислового

Зо праймера, Сап24 садасадссідаддачадса (5БО 0 МО: 57); зонда, Обде5-РЗ3 5- /ЕАМИссссасігеп/спаасдаааддаасда/зІАВКЕОУ-3І (ЗЕО ІЮ МО: 58). Розмір даного продукту ампліфікації гена-мішені становив 89 пар основ. У реакціях шаблонно використовували 2 мкл розщеплених препаратів ДНК. Склад реакційної суміші на зразок: референтний смисловий праймер (10 пМ), 1 мкл; референтний антисмисловий праймер (10 пМ), 1 мкл; зонд референтного гена (10 пМ), 0,5 мкл; смисловий праймер гена-мішені (10 пМ), 1 мкл; антисмисловий праймер гена-мішені (10 пМ), 1 мкл; зонд гена-мішені (10 пМ), 0,5 мкл; суміш реактивів даРСЕ, 12,5 мкл; вода 5,5 мкл, в загальному об'ємі 25 мкл.

Далі суміші вміщували до генератора крапельок ОХ100, який ділив кожен зразок на 20000 крапельок у діапазоні нл. Це здійснювали у 8-лункових картриджах до тих пір, поки всі зразки не були оброблені і перенесені на 9б-лунковий ПЛР планшет. Далі планшет опечатували термопластичною проколюваною фольгою за допомогою пристрою для запечатування планшетів. Після цього зразки обробляли з наступними умовами реакції: 95 "С, 10 хвилин, підйом із швидкістю 2,5 "С/с; потім 39 циклів при 94 "С, 30 з підйомом із швидкістю 2,5 "С/с; 61 "С, 1 хвилина, підйом із швидкістю 2,5 "С/с; 98 С, 10 хвилин, з подальшим охолодженням до 1270. Після реакцій ампліфікації ДНК у крапельках, планшети вміщували на пристрій для зчитування крапельок ОХ100, за допомогою якого аналізували кожну крапельку індивідуально із застосуванням двохбарвної системи виявлення (набір для виявлення РАМ або Нех). Цифрові дані ПЛР крапельки розглядали як 1-О графік, на якому кожна крапелька зразка була нанесена на графік інтенсивності флуоресценції, або 2-О графік, на який наносили флуоресценцію (ЕАМ) проти флуоресценції (Нех) для кожної крапельки. За допомогою програмного забезпечення вимірювали кількість позитивних і негативних крапельок для кожного флуорофору (ГАМ або

Нех) у кожному зразку. Далі за допомогою програмного забезпечення апроксимували фракцію позитивних крапельок до алгоритму Пуассона, щоб визначити концентрацію цільової молекули

ДНК в одиницях копій/мкл входження. Варіацію кількості копій обчислювали із застосуванням формули: СММ - (А/В) " МБ, де концентрація А - концентрація гена-мішені, В - концентрація референтного гена, і МБ - 4, кількість копій референтного гена у геномі.

Оцінка життєздатності пилку

Флуоресцеїну діацетат (ФДА) розчиняли в ацетоні у концентрації 2 мг/мл з одержанням запасного розчину. Розведення ФДА готували безпосередньо перед використанням, по краплях додаючи запасний розчин ФДА до 2 мл розчину сахарози (0,5 М) до насичення, на яке вказувала поява стійкої мутності.

Пропідію йодид (ПИ) розчиняли у стерильній дистильованій воді у концентрації 1 мг/мл з одержанням запасного розчину. Безпосередньо перед використанням 100 мкл запасного розчину додавали до 10 мл стерильної дистильованої води з одержанням робочого розчину.

Для перевірки співвідношення життєздатного і нежиттєздатного пилку, запасні розчини ПИ і

ФДА змішували у співвідношенні 2:3.

Рослини рапсу і гірчиці, трансгенні і дикого типу, вирощували у стандартних умовах в теплиці при 22-22 із фотоперіодом 16 годин на добу. Зрілі бутони, що були готові розкритися наступного дня, маркували і збирали наступного ранку у 9-10 годин. Пилок із розкритих квітів фарбували сумішшю ФДА/ПИ та візуалізували за допомогою флуоресцентного мікроскопу І еіса

МАШІ. Використовували емісійний фільтр із пропусканням у довгохвильовій ділянці спектру

СЕР-2 510 нм (пропускання червоного і зеленого світла) із фільтром збудження 480/40 нм для виявлення життєздатного і нежиттєздатного пилку. Нежиттєздатний пилок, який захоплював фарбник ПИ, мав червоний колір під флуоресцентним мікроскопом, тоді як життєздатний пилок при фарбуванні ПИ і ФДА мав яскраво-зелений колір.

Приклад 2. Стабільна експресія трансгенного шляху ДГК в насінні Сатеїнпа заїїма

Бінарний вектор рОРЗ416-СА?7 (див. Фіг. 2 ії 5ЕО ІЮ МО:1) вводять у штам А. іштегасіеп5

АСІ 1, і клітини з культури трансформованої Аагорасієтішт використовують для обробки квітучої рослини С. заїїма, із застосуванням способу занурення квіток для трансформації (І и апа Капод, 2008). Після вирощування і дозрівання рослин, урожай насіння Ті. з оброблених рослин збирають, висівають в грунт, і одержані в результаті рослини обробляють шляхом обприскування гербіцидом ВАБЗТА для селекції трансгенних рослин, що експресують ген селекційного маркера баг на Т-ДНК руР3416-сА?Т7. Рослини Ті, що вижили і є толерантними до гербіциду, вирощують до стану зрілості після того, як їм дають можливість самозапліднення, і збирають урожай насіння То, що утворилося. П'ять трансгенних рослин були одержані, тільки три з них містили повну Т-ДНК.

Ліпід екстрагують з пулу близько 20 насінин кожної з трьох рослин, що містили повну Т-ДНК.

Два з об'єднаних в пул зразків містили дуже низькі, ледве знайдені рівні ДГК, але третій пул зразків містив близько 4,7 95 ДГК. Таким чином, ліпід був витягнутий із 10 індивідуальних насінин Т2 даної рослини, і склад жирних кислот проаналізований методом ГХ. Дані щодо складу жирних кислот індивідуального насіння для даної трансформованої лінії також наведені в Табл. 4. Компільовані дані з профілів (Табл. 4) загального ліпіду насіння наведені в Табл. 5.

ДГК була присутня у шести із 10 індивідуальних насінин. Чотири інші насінини не містили

ДГК і були прийняті як нульові сегреганти, що не містять Т-ДНК, на базі гемізиготності інсерції Т-

ДНК у материнській рослині. Екстрагований ліпід із єдиної насінини з найвищим рівнем ДГК містив 9,0 95 ДГК, тоді як сумарний відсоток для ЕПК, ДПК і ДГК становив 11,4 905.

Таблиця 4

Склад жирних кислот загальних ліпідів насіння з трансгенного насіння Тг Сатвеїіїпа заїїма, трансформованих Т-ДНК з рОуРЗ3416-СА7. Склад жирних кислот наведений для об'єднаної в пул серії (ЕО5.46) насіння і для 10 окремих насінин, ранжируваних (зліва направо) від найвищого до найнижчого рівня ДГК.

Пул 140 | 0 |02 | 02|о01 02|02102|02/|о01|02 02 161 | 02 | 00 ол |о1 0002100 |02/|02|02 02 163 | 03 | 0 00100 00100100 |о00/|о00|о00 00 181 | 108 | 80 80 | 86 8594 /110|102)| 83 | 94 86 18306 | 02 | 14 03 |03 04 |02г/051|00|05|04 06 18403 | 22 | 68 64 | 57 72 | 57 | 41 | 00 | 00 | 00 оо

Пул голі | 04 03030303 03 00 05 0605 | 05 20206 | 08 | 08|09)|08)|06 08 07 13 15 14 | 14 20303 | 06 08080807 08 07 06 0707 | 06 220 | 04 1 051|051|05)|04 050506 060606 20403 | 02 03030304 040500 000000 2211171 171 | 72 | 11 | 05109108 16 | 22 | 19 | 20 20503 | 07 | 13 |16|15| 16 11 17 00 0000 22206 | 01 1 00|00|00|00 000002 0302 | 02 22:406122:3003| 03 02 |03|03|00 03 00 04 060505 240 103 1 031|03|03|00 030004 0404 | 04 241 1031 041|04|03|00 030005 0605 /|05 22503 | 03 | 11 | 12 | 11 | 11 1 09108 00 0000 | 00 22603 | 47 | 90 | 85 | 83 | 83 | 71 | 49 | 00 | 00 | 00 | 00

Таблиця 5

Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для трансгенного насіння, наведеного в

Табл. 5. Обчислення не включають «незначних жирних кислот», включених в Табл. 5.

Е0О5.46

Ск ие || є |на|на| ки | то| не ха з (95 від 36,1 46 45,4 45 482 | 442 | 401 128,91 29,9) 302 | 28,9 загальних Ж

Загальні 06 загальних ЖК) ня Ф3/06 ня Фб/03

Загальні нові 3. ви | лв5 | 18 | 169) 186 | 152 | 12 би (95 від загальних ЖК)

Загальні нові шб . 11 2,2 12 11 1 1 12 1,5 2,3 2 22 ( 9о від загальних ЖК) тео |те ви|ею|ею юю юю | | о ня нових 7,36 8,41 | 15,00 | 15,36 | 18,60 | 15,20 | 10,00 0,05 03/06 ме ооо ми ми ме мою |в ня нових 0,14 012007 10,07 | 0,051 0,07 | 010 22,00 06/03 доти ват. пав вазьтви кв ная навчу пот позу вот от перетворення 8.2 о 15,6 о 15,5 о 15,1 о 15,1 о 12,8 о 10,5 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 01 Зо

ОК на ЕПК дшаюти вите пазли тя ють аачу па поточ вот пот перетворення 6,7 о 12,3 6111 56 6111 ,5 о 11 А о 10,0 о 7,0 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 0,0 Зо

ОК на ДГК

ДИ вет тарт рел ува аа нят воза па перетворення 92 о 172 о 171 о 16,7 о 16,2 о 13,9 6111 4 о 0,0 о 0,0 о 0,0 о 02 Зо

ЛК на ЕПК

ЕО5.46

Ефективність перетворення 7,6 о 13,6 о 12,9 о 12,7 о 12,3 о 10,9 Уо| 7,9 90 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 0,0 Зо

ЛК на ДГК

Ефективність перетворення 15,8 о 24,8 о 24,9 о 242 о 22,8 о 20,6 о 18,5 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 0,3 Зо

АЛК на ЕПК

Ефективність перетворення 13,0 о 19,6 о 18,7 о 18,4 о 17,2 о 16,1 о 122 о 0,0 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо

АЛК на ДГК

Загальні насичені жирні! 17,6 17,8. 17,8 | 17,6 18 17,8. | 181 | 18,2.) 17,7 | 17,68 | 181 кислоти

Загальні мононенасиї 398 155 | 46 | 16,6.) 143) 166 | 16,8 | 18,7 | 193 | 1946 | 18,6 чені жирні кислоти

Загальні поліненасичені! 62,5 664 | 65,6 | 67,7 | 65,6 | 651 63 631 | 62,5) 63,2 жирні кислоти

Загальніс2о | 96 / 93 | 98 | 9,9 | 8 / 89 | 85 | 86 | 11 | 103 ло

Загальніс22 | 54 /103| 10 | 9,7 | 94 | 83 | 57 |06109|07 07

Співвідношен- ня загальні 1,78 0,98 | 1,02. 0,86 | 1,07 | 14,9 |14,33| 12,22 | 14,71| 1443 б20/022

Гомозиготне насіння цієї лінії одержують в поколінні Т4. До 10,3 956 ДГК продукується в події

ЕО5-46-18-110, із середньою величиною 7,3 95 ДГК, спостережуваною для всього покоління Та4.

Наступне покоління (15) було одержане з метою додаткового тестування стабільності продукування ПНЖК впродовж декількох поколінь, особливе ДГК. Знайдено, що спостережувані максимальні рівні ДГК були стабільними у п'ятому поколінні, навіть незважаючи на те, що вміст

ДГК в пулі насіння не стабілізувався до покоління Т4 через присутність численних трансгенних локусів. Додатково, партії насіння Т5 пророщували на середовищах МС іп міо разом із насінням материнської С. заїїма, причому очевидних відмінностей у ефективності або швидкості проростання не спостерігалося. Подальші покоління трансгенної лінії (покоління Т6, 17 і т.д) не виявляли зниження рівня ДГК у насінні. Трансгенні рослини володіли повноцінною чоловічою і жіночою фертильністю, і пилок продемонстрував близько 100 95 життєздатності відносно рослин дикого типу. Аналіз вмісту олії в насінні, що містить різні рівні ДГК, не виявив кореляції між рівнем ДГК і вмістом олії, на протилежність кореляції, спостережуваній для Агарідорвів ІНаїапа.

У декількох подальших трансгенних лініях, вміст ДГК в окремих насінинах від незалежних подій перевищував 12 95. Співвідношення трансгенних : нульових для цих ліній становило близько від 3:1 до 15:1. Аналіз характерних профілів жирних кислот для зразків із найвищим вмістом ДГК від кожної конструкції виявив тільки 1,2-1,4 95 ГЛК за відсутності інших нових 06

РНЖК. І навпаки, було знайдено, що нові 3 ПНЖК (СДК) ю3 ДДЦД-ПНЖК (ЕТК, ЕПК, ДПК, ДГК) акумулюються до 18,5 95 при рівні ДНК 9,6 95 у загальному вмісті жирних кислот. Ступінь Дб- десатурації становив 32 95, і вміст ЕПК становив 0,8 9о від загального вмісту жирних кислот.

Ефективність Д5-десатурації становила 93 95, і ефективність Аб-елонгації становила 60 95. ДГК була знайдена у полярній Фракції ліпідів насіння ліній зА?7.

Було відзначено, що спостережувані співвідношення сегрегації (від «3:11 до «15:1) вказують на те, що один або максимум два трансгенних локуси були необхідними для продукування ДГК у С. займа на рівнях, подібних до рівнів у риб'ячому жирі. Це має важливе значення для простоти розведення трансгенної ознаки, а також для стабільності трансгену.

Гомозиготне насіння висаджують в декілька теплиць, з метою одержання сумарно понад 600

Зо індивідуальні рослини. Олію екстрагують з насіння із застосуванням різноманітних способів, зокрема, апарату Сокслета, екстракції ацетоном і гексаном.

Здійснювали 730 ЯМР аналіз регіоспецифічності для олії насіння трансгенної 3. займа із метою визначення позиційного розподілу 03 ДЛ-ПНЖК у ТАГ. Подія із близько рівним вмістом

ЕПК і ДГК була вибрана для максимізації відповіді на дані жирні кислоти, причому співвідношення 5п-1,3 до 5п-2 було знайдено на рівні 0,75:0,25 для ЕПК і 0,86:0,14 для ДГК, притому, що об'єктивний розподіл повинен був би становити 0,66:0.33. Тобто, 75 95 ЕПК і 86 95

ДГК були розташовані в положенні 5п-1,3 ТАГ. Це показує, що обидві жирні кислоти були переважно локалізовані у положеннях ТАГ б. займа, хоча перевага для ЕПК була виражена слабше, ніж для ДГК. Той факт, що ДГК була переважно знайдена у 5п-1,3, був подібний до результатів, про які раніше повідомлялося для насіння А. ІПаїїапа (Реї/е еї а!., 2012).

Оскільки кількість незалежних трансгенних ліній, одержаних у розкритих вище експериментах із трансформацією, була низькою, подальші трансформації С. вайма були здійснені із застосуванням конструкції мотиву ЗА7-тоаВ (Приклад 3). Одержана більша кількість трансформантів, та ідентифіковані гомозиготні лінії, які продукують ДГК в кількості більше 20,1 95.

Приклад 3. Модифікації Т-ДНК, що кодують шляхи ДГК в насінні рослин

Для покращення рівня продукування ДГК у В. парив, в порівнянні з рівнями, описаними у

УМО2013/185184, бінарні вектори руР3416-СА7-тодА, руРЗ416-Сд7-тоав, руР3416-сА7-тоас, ругР3416-саА7-тодО, руРЗ3416-4А7-тоаЕ і рОР3416-СА7-тоав були сконструйовані, як описано у МО2013/185184, і протестовані на трансгенних рослинах. Ці бінарні вектори є варіантами конструкції руР3416-СА?7 і були сконструйовані з метою подальшого підвищення синтезу ДГК в насінні рослин, особливо шляхом покращення функцій Дб-десатурази і Ддб-елонгази.

Спостерігалася акумуляція СДК в деякому насінні, трансформованому конструкцією бА?7, внаслідок відносно низької ефективності Дб елонгації, в порівнянні з А5-елонгазою, тому, серед інших модифікацій, положення двох генів елонгази було змінене в Т-ДНК.

Дві послідовності, що кодують елонгази у руР3416-СА?7, були поміняні місцями на Т-ДНК, з одержанням рур3416-сА7-тодА першим клонуванням нової касети Аб-елонгази Р. согдага між сайтами ЗБ руоуРЗ3416-СА7, для заміни касети Д5-елонгази Р. согдаїа. Ця конструкція була додатково модифікована шляхом обміну промотору ЕР, який контролює Аб-десатуразу М. ризійа, з промотором конлініну Спі2 (рі иСпі2) щоб одержати рОРЗ416-СА7-тоаВ. Дана модифікація була здійснена з метою збільшення експресії Дб-десатурази, і таким чином ефективності ферменту. Вважається, що промотор Спі2 може давати більш високу експресію трансгену у В. пари, ніж вкорочений промотор напіну.

Зо Одержано 8 трансгенних подій руР3416-сА7-тоаВ А. (Наїйапа і 15 трансгенних подій ругР3416-аА7-тоас А. Іаїїапа. Спостерігається від 3,4 95 до 7,2 95 ДГК в пулі насіння руР3416-

СА?7-тоаВ, і від 0,6 до 4,1 95 ДГК в пулі насіння Т2 руР3416-СА7-тоаб. Деякі з подій руР3416-

СІА7-тоаВ з найвищим рівнем висівають на селекційні середовища, і саджанці, що вижили, відбирають для наступного покоління. Насіння аналізують щодо вмісту ДГК. Оскільки об'єднане в пул насіння Т1 представляє популяції, сегреговані за трансгенами, і включають будь-які нульові сегреганти, очікується, що в гомозиготному насінні рослин-нащадків рівні ДГК будуть вищими, до 30 95 від загального вмісту жирних кислот в олії насіння. Інші модифіковані конструкції використовувалися для трансформації А. Ійаійапа. Хоча одержана тільки невелика кількість трансформованих ліній, жодна з них не давала вищих рівнів ДГК, ніж конструкція тоав.

Конструкцію рОРЗ3416-СА7-тоав додатково застосовували для генерації трансформованих рослин В. пари сорту Озсаг і серії сортових ліній, позначених МХ002, МХО003, МХО005, МХО50,

МХО52 і МХО54. Всього було одержано 1558 трансформованих рослин, включаючи 77 незалежних трансформованих рослин (ТО) для трансформації О5саг, і 1480 незалежних рослин для сортових ліній, включаючи 189 для МХО05, що є лінією із високим вмістом олеїнової кислоти в олії насіння завдяки мутаціям у генах ЕАО2. Інші сортові лінії містили вищі рівні ЛК і АЛК.

Трансгенні рослини, які продемонстрували більше 4 копій Т-ДНК за даними методу цифрової

ПЛР (Приклад 1), були відкинуті; близько 25 95 рослин ТО було відкинуто за даним критерієм.

Близько 53 95 трансгенних рослин ТО містили 1 або 2 копії Т-ДНК за даними методу цифрової

ПЛР, 12 95 містили близько 3 копії, і 24 95 - 4 або більше копій. Урожай насіння (насіння Т1) був зібраний близько із 450 трансгенних ліній після самозапилення, досягнутого шляхом ізолювання рослин мішечками під час цвітіння, щоб уникнути схрещування. Урожай насіння Т1 зібраний із решти трансгенних рослин після дозрівання. Близько 1-2 95 ліній рослин були стерильними з точки зору чоловічої або жіночої фертильності і не давали життєздатного насіння; такі рослини

ТО були відкинуті.

Пули насіння (по 20 насінин Т1 у кожному пулі) тестували щодо рівнів ДГК в пулі олії з насіння, і лінії, які продемонстрували найвищі рівні, відбирали. Зокрема, були відібрані лінії із вмістом ДГК щонайменше 2 95 від загального вмісту жирних кислот в пулі насіння Т1. Близько 15 95 трансгенних ліній було відібрано в такий спосіб; інші 85 95 були відкинуті. Деякі з них були 60 позначені як лінії СТ132-5 (сорт Озсаг), СТ133.15-15, -24, -63, -77, -103, -129 ії -130 (у МХО05).

Відібрані лінії у МХО5О включали СТ136-4, -8, -12, -17, -19, -25, -27, -49 і -51. Забезпечували набухання двадцяти насінин з відібраних ліній, включаючи СТ132.5 і 11 насінин з СТ133.15, і через два дні олію витягають з половини сім'ядолі кожної з індивідуальних насінин. Другу половину сім'ядоль з ембріональними осями утримують і культивують на середовищах, щоб зберегти конкретні лінії нащадків. Склад жирних кислот в олії визначають; дані для СТ132.5 наведені в Табл. 6. Рівень ДГК в 10 із проаналізованих 20 насінин, за даними аналізу методом

ГХ, знаходиться в інтервалі 7-20 95 від загального вмісту жирних кислот. Інші насінини містили менше 7 95 ДГК і могли містити часткову (неповну) копію Т-ДНК із руР3416-СА7-тоав. Схоже, що трансгенна лінія містить множинні вставки трансгену, які були генетично роз'єднані. Насіння трансгенної лінії СТ133.15 продемонструвало рівні ДГК в інтервалі 0-5 95. Насінини без ДГК, ймовірно, були нульовими сегрегантами. Ці дані підтверджують, що конструкція тоав функціонує належним чином для одержання ДГК в насінні рапсу.

Двадцять або 40 індивідуальних насінин (насіння 12), одержаного від кожної з множини рослин ТІ після самозапилення, від відібраних трансформованих ліній, індивідуально тестували щодо складу жирних кислот. Було ідентифіковане насіння, що містить рівні ДГК вище 20 905 (Табл. 7). Два репрезентативних зразки, СТ136-27-18-2 і СТ136-27-18-19, містили 21,2 95 до 22,7

Фо ДГК, відповідно. Загальний вміст 03 жирних кислотних у цих насінинах становив близько 60 до, як відсоток від загального вмісту жирних кислот, і вміст 06 становив менш ніж 10 95. Інші набори по 20 або 40 насінин Т2 від кожної із рослин Т1 тестували щодо складу жирних кислот.

Насіння, що містило до 34,3 95 ДГК, було ідентифіковане, наприклад, серед насіння СТ136-27- 47-25 (Табл. 9). Склад жирних кислот для олії з насіння, одержаної із СТ136-27-47-25, наведений у Табл. 9. Склад жирних кислот включав 34,3 95 ДГК, разом із близько 1,5 95 ДПК, 0,6 зо ЕПК і 0,5 95 ЕТК. Рівень СДК становив близько 7,5 95, АЛК -- близько 21,9 95, і ЛК -- близько 6,9 965. Нові об ПНЖК продемонстрували 1,1 95 ГЛК, за відсутності 0б-С20 або -С22 ДД-ПНЖК, що піддавалися б виявленню. Загальні насичені жирні кислоти: 9,6 95; мононенасичені жирні кислоти, 12,5 90; загальні ПНЖК, 75,2 95; загальні об ПНЖК (включаючи ЛК), 7,2 90; загальні 03

ПНЖК, 66,9 95; співвідношення загального вмісту Фб:03 жирних кислот, 9.3:1; нові 06 : нові 03 жирні кислоти, 37:11. Ефективність кожної із стадій ферментації від олеїнової кислоти до ДГК була такою, як указано нижче: Д12-десатураза, 90 95; Д15/03-десатураза, 89 95; Дб-десатураза, 67 95; Дб-елонгаза, 83 9о; Д5-десатураза, 99 95; Д5-елонгаза, 98 9о; Д4-десатураза, 96 95.

Загальна ефективність перетворення олеїнової кислоти на ДГК становила близько 50 95. Таким чином, було очевидним, що насіння, яке продукує ДГК в діапазоні 20,1-35 95 від загального вмісту жирних кислот в олії насіння, могли би бути ідентифіковані і відібрані, зокрема насіння, що містить від 20,1 95 до 30 95 ДГК або від 30 95 до 35 95 ДГК у загальному вмісті жирних кислот.

Вміст олії у деяких насінинах був зниженим від близько 44 95 у насінні дикого типу до близько 31-39 95 у деяких з продукуючих ДГК насінин, але був подібним до рівнів дикого типу в інших продукуючих ДГК насінинах.

Різноманітні трансформовані лінії рослин, що продукували ДГК на рівнях щонайменше 10 90 у насінні Т2, схрещували і забезпечували самозапилення потомства Е1, щоб одержати потомство Е2, гомозиготнн по множинних інсерціях Т-ДНК. Олію насіння із гомозиготного насіння проаналізували і знайшли, що до ДГК складає 30 95 або 35 95 від загального вмісту жирних кислот в олії з насіння.

ТАГ в олії, одержаній із СТ136-27-18-2 і СТ136-27-18-19, проаналізували регіоспецифічним методом Зб ЯМР щодо позиційного розподілу ДГК у гліцериновій основі молекул ТАГ. ДГК переважно була приєднана у положенні 5п-1,3. Більш ніж 70 95, фактично більш ніж 90 95 ДГК знаходилося у положенні 5п-1,3.

У декількох подальших трансгенних лініях, вміст ДГК в індивідуальному насінні від незалежних подій перевищував 12 95. Співвідношення трансгенних : нульових для цих ліній становило близько 3:1, що відповідало одному трансгенному локусу, або 15:1, що відповідало двом трансгенним локусам. Аналіз характерних профілів жирних кислот для зразків від кожної конструкції із найвищими рівнями ДГК виявив тільки 1,2-1,4 95 ГЛК за відсутності інших нових 0б

ПНЖК, що піддавалися б виявленню. На протилежність цьому, нові 03 ПНЖК (СДК) і 3 ДЛ-

ПНЖК (ЕТК, ЕПК, ДПК, ДГК) акумулювалися до сумарного рівня 25,8 95 для конструкції тодЕ і 21,9 95 для конструкції тод, в порівнянні з 18,5 956 для (зА7-трансформованого насіння. Рівні

ДГК в олії із цього насіння становили 9,6 905, 12,4 95 і 11,5 95, відповідно. Ступінь Дб-десатураціїї був нижчим у СА7-трансформованому насінні, ніж у тоавг- і тодо-трансформованому насінні (32 95 проти 47 95 і 43 90), що приводило до зниження рівня АЛК у насінні тоав їі тоб, в порівнянні з (зА7. юІншою значущою відмінністю була акумуляція ЕПК в насінні тод (3,3 905 проти 0,8 95 у двох інших трансгенних насінинах), і це відображалося у зниженні ступеня АД5Б- бо елонгації, що спостерігався у насінні той (80 9с), в порівнянні із насінням СА? і тоас (93 95 і

94 Фо). Спостерігалося невелике збільшення ступеня Аб-алонгації у цьому насінні (66 95 проти 60

Фо і 61 95), хоча кількість СДК фактично збільшувалася унаслідок дещо активнішої Дб- десатурації. ДГК була знайдена у полярній фракції ліпідів насіння ліній СА?7.

Проаналізований склад жирних кислот у ліпіді насіння Т1 для 70 незалежних трансгенних рослин В. париз сортової лінії МХ54, трансформованої конструкцією тоав Т-ДНК. Знайдено, що одна із цих трансгенних рослин дає насіння, що містить ДПК, але в олії з насіння ДГК відсутня. У насінні Т1 даної лінії (СТ-137-2) продукувалося близько 4 95 ДПК, за відсутності в пулі насіння

Т1 ДГК, що піддавалася б виявленню. Винахідниками було вивчено питання щодо того, чи спричинено це інактивацією гена лЛ4-десатурази у конкретній інсерційній Т-ДНК в результаті спонтанної мутації. Аналіз методом ПЛР і секвенування ДНК показав присутність делеції, що була визначена як видалені нуклеотиди 12988-15317 Т-ДНК мотиву СА7-тоав (5ЕО ІО МО: г).

Видалені нуклеотиди відповідають частині промотору Гіпи5 Спі2, який спрямовує експресію ділянки кодування Д4-десатурази, а також самої по собі ділянки кодування Д4-десатурази, пояснюючи, чому насіння, що є трансформованим Т-ДНК і містить делецію, не продукувало дгк.

Близько 50 насінин Т1 від даної трансгенної лінії проростили, та із кожної проаналізували один котиледон, що з'являвся, щодо складу жирних кислот у залишковій олії. Відібрані саджанці, що демонстрували більш ніж 5 95 ДПК, були вирощені до стану зрілості, і зібраний урожай насіння 12. Склад жирних кислот в пулі насіння проілюстрований у Табл. 8, причому у цих лініях спостерігалося більш ніж 7 95 ДПК. Насіння Т4 було одержане від лінії СТ-137-2 ДПК

В. пари і проаналізоване щодо профілю жирних кислот. До 13 95 ДПК спостерігалося в пулі зразків зрілого насіння.

Олію з насіння, що містила близько 10 95 ДПК, обробляли м'яким лугом для гідролізу жирних кислот.

Інша трансгенна лінія, позначена ВО003-514, демонструвала близько 10-16 95 ДПК у насінні

Т2. Було відібране насіння, що містило 15,8 95 ДПК, 0,2-0,9 90 ДГК і 0,1-2,5 95 ЕПК. Популяція насіння Т2 демонструвала співвідношення сегрегації 1:2:1 для високого вмісту : низького вмісту : відсутності ДПК, вказуючи на присутність одинарного генетичного локусу для продукування

ДПА у вказаній трансгенній лінії.

Зо Олія була екстрагована за допомогою гвинтового преса із зразків насіння, що продукує ДЛ-

ПНЖК, з одержанням в такий спосіб шроту.

Дизайн конструкції

Хоча фокус даного експерименту знаходився на демонстрації продукування ДГК і ДПК у видах олійної культури, відзначені вище результати також були цікавими з точки зору перспективи дизайну конструкції. По-перше, перемикання локалізації ділянки, що кодує Аб- і Д5Б- елонгазу в конструкції тод приводить до передбачуваних модифікацій профілю, коли акумулюється більше ЕПК унаслідок нижчого ступеня Д5-елонгації. Супутнє збільшення ступеня

Ддб-елонгації спостерігалося, але не приводило до нижчих рівнів СДК. Це було результатом підвищення ступеня Лб-десатурації у трансформованому тод насінні, спричиненого додаванням додаткової експресійної касети Дб-десатурази М. ривШа, а також заміною вкороченого промотору напіну (ЕР1) активнішим промотором конлініну2 льону. Дещо менш виражене підвищення ступеня Дб-десатурації, спостережуване у разі конструкта тодс, було спричинене капіталізацією на касеті Д5-елонгазі з високою експресією у СА7. Перемикання положень ділянок, що кодують Дб-десатуразу та А5-елонгазу, приводило до вищого ступеня Дб- десатурації. Активність Д5-елонгази не знижувалася в цьому випадку завдяки заміні промотору

ЕР промотором Спіг.

Ці дані підтверджують, що конструкції тоав, тоаЕ і тодОс є ефективними з точки зору продукування ДГК у насінні Сатеїйнпа, відносно Агарідорзвів і рапсу.

Автори винаходу вважали, що, загалом, ефективність обмежуючої швидкість ферментної активності в біохімічному шляху ДГК може бути вищою в мультикопійних Т-ДНК трансформантах, у порівнянні з однокопійними Т-ДНК трансформантами, або може бути збільшена шляхом інсерції в Т-ДНК декількох генів, що кодують фермент, який може бути обмежуючим в біохімічному шляху. Докази можливої важливості мультикопійних трансформантів спостерігалися у насінні Агарідорзі5з, трансформованому конструкцією СА?7, де подія з найвищим виходом ДГК містила три інсерції Т-ДНК в геномі хазяїна. Декілька генів можуть бути ідентичними, або переважно є різними варіантами, що кодують один і той же поліпептид або знаходяться під контролем різних промоторів з патернами експресії, що перекриваються. Наприклад, підвищена експресія може бути досягнута шляхом експресії декількох ділянок, що кодують Дб-десатуразу, навіть якщо продукується один і той же білок. 60 Наприклад, у руР3416-СА7-тодЕ і руР3416-СА7-тоас, дві версії Аб-десатурази М. ри5Ша були присутні та експресувалися різними промоторами. У кодуючих послідовностях кодони використовувалися по-різному і, таким чином, їх нуклеотидні послідовності були різними, з метою зниження потенціалу сайленсингу або ефектів косупресії але приводили до продукування одного і того ж білка.

Таблиця 6

Склад жирних кислот ліпіду при проростанні трансгенного насіння Т1 В. пари, що містить Т-ДНК із конструкції ЗА7-таав. Ліпіди додатково містили по 0,1-0,3 95 кожної з С16:1, С16:3, С24:0 ї

С24:1, та не містили С20:1А11. - ЕЕ ту ту нк хе ту ге тт ку ек,

Нав : шо ож 5 В нини НН НЕ НИ ІН НН НЕ НН НН Шк НН кН НЕ СКАН -ооо же ок ож ч ж ш 5 шщ З шт Моокж зе зе же зе збе ее і-ї -е Б За - з-е -е Зо ей че - з 5 ВЕ аа 1 та ЗІ ВІР пз Я Бл З8 БО 01 15 03 75 15 0015 БО

ІВ ВІ 37 34 5095 БУ 183 ОА 2365 07 З 11 01 15 ба 36 06 50 07 65

ІЗ пі 53 45 105 235 84 33 311 135 30 05 01 25 06 аа 15 0615 вд

ІЗ ЗІ Зі ЗА ія ЗА БР ВЗ сб РО а ОБ 01 с б 3 15 Б 15 Ба

І? а те дО 1 ЗІ Бо б ов тя хі 05 00 16 б 48 21 0033 ке

Ві 0 33 Бя в 7 03 я 10 355 15 01 03 37 00 30 00 30 00

Таблиця 7

Склад жирних кислот ліпіду у трансгенному насінні Т2 В. пари5, що містить Т-ДНК із конструкції сА7-тоавВ. з ж В - х в в хх Я 505855. 8. Бик

Зразав: я ЖЕ ВЕ ЕЕ Я А Я я й В й вк А 5 5 ЕЕ свзозшня КІ зак за ек зак ча ай май май а ча чай зе за зе зе ож Шо й ШО вт До ї-к стівв мів: | 52 35 я 35 5.7 83 їт5 14 1 051 3 ВА 04 05 15 534 071 013 БО ствеот3ва |: ЗБ зйо я ля ва за 54 бе Ві 13 85 05 38 Мо 595я 54 06 еко стімем-моя | 54 35 зах 3 53 ва За 437 фа 01 57 4 05 14 174 5 68 03 стівватівя | 753 34 зт яд ле вх 303 а Ві ВІ БЕ 15 03 бя4 53 ща 525 03 щшл ствеот3аюя |45 27 М 38 56 вх 2545 59 13 ВІ Вт а 05 Ба 123 ач ба бля 54 стімевм-меа | 50 31 5 За 57 в На ЗЕ 25 01 05 о Вл ві бл яд 55 6 б па стівватіют | 53 31 38 Яд ля ВА Ба 23 ва Вл ВЕ 15 05 65 015 553 52 018 я стівеот33 | 54 27 355 4 67 ве 255 57 їв Ві Ве 13 05 13 155 545 71 04 5 стіввбзтавт | 36 15 меж Зло она вдо 8І 85 1Жж 53 бе Ва ві бі 37 мя БА мм о мя ствеот3вв | 48 34 я 57 ля ва ва 25 Ві Ві бЕ Ф 15 05 68 Я БА 58 01 ЯЗ стівеаниють | їі 32 вх Яї1 Бе о бто ія 13 13 83 05 15 33 ба ЗА 253 РЕ бат та бтіжв-сьтава: | 53 57 7935 зл 68 ва 278 ав бо ві пт 15 БЖ 15 185 557 55 З Єд ствеотажа: | 55 54 а ях За вя за За 11 ВР 15 4 05 52 ма я 35 03 ма стівнямя | 54 33 ще 55 ща бе їх) 37 16 5 16 87 35 13 143 555 55 бі Є

Стізб-отаютю | ха За ла 46 58 04 3 25 2 Ві БЖ 19 пе бло 3 За 55 017 403 ствеот3жав | 50 33 во 34 52 ва 55 ЗЕ ТІ Ва ВЕ ВЕ 05 15 174 3З0я 53 03 У стіхв-тавю | Я 33 вт 42 57 б 37 77 63 Р ба Вт 35 17 337 575 75 63 а ствеотают | 57 59 зл о 4б 5я вх Зя 24 ва вів аб 33 и Ба Мі 6

АРК СК Яові: ДИКО не булі внявлені в жодному їз зржаків. Кри того, зразки містили ЙО СІЮ, близько Й оо жена Ма

СІ бинавко 01-05 2153, віз близько 0. ЄТь де ВЛ СОЮ, бонавке ПА 30, причому деяхі аразжи містили слілюві кілвкості З ПІ СМКІ І СУМ СВІ

АРК (С20:406) і ДПКоб не були виявлені в жодному із зразків. Крім того, зразки містили 0,195 С14:0, близько 0,295 або 0,395 С16:1, близько 0,1-0,395 С16:3, від близько 0,795 до 1,095

С20:0, близько 0,395 С22:0, причому деякі зразки містили слідові кількості (« 0,195) С20:1А13,

С22:303, С24:0 і С241

Таблиця 8

Склад жирних кислот ліпіду у трансгенному насінні Т2 8. пари, трансформованому Т-ДНК із конструкції СА7-тоавВ, з мутацією в гені А4-десатуразь. Ліпіди додатково містили близько 0,190 140, 0,296 16:3, 0,2-0,495 ГЛК, 0,190 20:113, 0,3-0,4905 22:0, а АРК, ОРАоб (22:56), 16:2 12271 не були виявлені. - тв тм з ш ж 8 й й З З 8 5 8 В шт В

ЕЕ 81213331 11851 шо шо -йоож - топом мом а зе за ще м чех ї- хе Хай зе їй з хе тя тора 53 03 37 ЗБя 31 134 254 08 25 08 01 00 11 17 58 во ві 03 Ол юе вх ст-13ті38|53 п 32 44 30 ІЗ 294 пе 25 б 21 00 13 33 б 30 бі 02 01 я о

Стлнм-аІ5о 82 43 МІ 33 112 Зб оз 24 б 01 00 35 20 10 20 БР 01 бі ВЕ бо ят-Бм-к| 57 83 46 233 34 123 325 їй 20 605 01 90 15 13 85 ВО бр обо а те по ст-і3та8е|54 па 38 З за г 03 Во 265 пбя пі бо їа 15 65 30 ві 02 0 ма 03

Таблиця 9

Склад жирних кислот олії з насіння Т2 8. пари, трансформованого Т-ДНК з мотиву СА7-тоавВ. в - «| « ї Е Е ія іч ре ія Не ш ї в гої й в щ ра в

Зразки олії з насіння додатково містили 0,195 С14:0; 0,295 01671; 0,195 С20:30о6; не містили

С22:110222:296; містили 0,195 С24:0 і 0,295 С24:1, 2,695 інших жирних кислот.

Приклад 4. Аналіз ТАГ із трансгенного насіння А. ІПпаїапа, що продукує ДГК

Позиційний розподіл ДГК в ТАГ із трансформованого насіння А. ІПайапа визначали за методом ЯМР. Загальний ліпід екстрагують близько з 200 мг насіння, спочатку роздавлюючи його під шаром гексану, з подальшим перенесенням роздавленого насіння до скляної пробірки, що містить 10 мл гексану. Пробірку нагрівають близько до 55 "С на водяній бані, після чого обробляють вихровим перемішуванням і центрифугують. Гексановий розчин екстрагують, і процедуру повторюють з додатковими порціями 4 х 10 мл. Екстракти об'єднують, упарюють за допомогою роторного випарника, і ТАГ в екстрагованому ліпіді очищують від полярних ліпідів шляхом пропускання крізь коротку колонку з кремнію діоксидом, з використанням 20 мл 7 95 дієтилового етеру в гексані. Позиційний розподіл ацильної групи на очищеному ТАГ визначають кількісно, як було описано раніше (Реїгіє еї аї., 2010аї Б).

Аналіз продемонстрував, що велика частина ДГК в загальній олії з насіння розташована в положеннях 51п-1/3 ТАГ, і невелика кількість знайдена в положенні 51-2. На протилежність цьому, ТАГ з продукуючого АРК насіння продемонстрували, що 50 95 АРК (20:4А58и1115) розташовано в положенні 51п-2 олії трансгенної рапсу, тоді як очікувана величина для випадкового розподілу становить тільки 33 95 (Реїгіє еї аї., 2012).

Додатково, загальний ліпід з трансгенного. насіння А. Ійаїійапа був проаналізований РХ-МС з потрійною квадрупольною лінзою, щоб визначити основні різновиди триацилгліцеролу (ТАГ).

Знайдено, що різновидами ТАГ з найвищим вмістом ДГК є ДГК-18:3-18:3 (ТАГ 58:12; номенклатура не описує позиційного розподілу), і на другому місці знаходиться ДГК-18:3-18:2 (ТАГ 58:11). Три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18) спостерігається в загальній олії з насіння, хоча і з низькими, але знайденими рівнями. Інші основні різновиди ТАГ, що містять ДГК, включали ДГК- 34:3 (ТАГ 56:9), ДГК-36:3 (ТАГ 58:9), ДГК-36:4 (ТАГ 58:10), ДГК-36:7 (ТАГ 58:13) ії ДГК-38:4 (ТАГ 60:10). Ідентичність двох основних ТАГ, що містять ДГК, була додатково підтверджена квадрупольною часопролітною (0- ТОЕ) МС/МС

Приклад 5. Аналіз вмісту і складу стеролів в оліях

Фітостерини з 12 зразків рослинної олії, придбаних із комерційних джерел в Австралії, охарактеризовані за методами ГХ і ГХ-МСО. як похідні О-триметилсилілового етеру (ОТМ5І- етер), як розкрито у Прикладі 1. Стероли ідентифікували за даними утримання, інтерпретацією мас-спектрів і порівнянням з літературними даними та даними мас-спектроскопії лабораторних стандартів. Кількість стеролів визначають з використанням внутрішнього стандарту 5В(Н)- холан-24-олу. Базова структура фітостерину і хімічна структура деяких з ідентифікованих стеролів проілюстровані на фіг. З і в Табл. 10.

Аналізували рослинні олії: кунжуту (Зезатит іпаісит), оливи (ОІеа епгораєа), соняшнику (Неїїапіпи5 аппи5), рицини (Кісіпи5 соттипів), рапсу (Вгаззіса пари), сафлору (Сапнатив

Ппсюгіцв), арахісу (Агаспіз пуродаєа), льону (Гіпит ивіаїіввітит) ї сої (Сіусіпе тах). У порядку зниження по відношенню відносного вмісту, у всіх зразках олії основними фітостеринами були:

В-ситостерол (інтервал 28-55 905 від загального вмісту стеролів), Д5-авенастерол (ізофукостерол) (3-24 95), кампестерол (2-33 95), Д5-стигмастерол (0,7-18 905), Д7-стигмастерол (1-18 95) ї Д7/-авенастерол (0,1-5 90). Були ідентифіковані декілька інших мінорних стеролів: холестерин, брасікастерол, чалінастерол, кампестанол та ебурикол. Додатково, були знайдені чотири С29:2 і два С30:2 стероли, але необхідне подальше дослідження для остаточної ідентифікації цих мінорних компонентів. Крім того, в деяких з олій присутні декілька інших не ідентифікованих стеролів, але через дуже низький їх вміст, мас-спектри не були достатньо інтенсивними, щоб дозволити ідентифікацію їх структури.

Таблиця 10

Назви за ІЮПАК / систематичні назви ідентифікованих стеролів -метилхолестерин 24-метилхолестанол 11119 (|ергост7енЗВол | //// о4сметилхолест-7-ен-ЗвВол...97 -етилхолестерин стигмаст-7-ен-Зр-ол

Зо Вміст стеролів, виражений як мг/г олії, у порядку зменшення кількості був наступним: олія рапсу (6,8 мг/г), кунжутна олія (5,8 мг/г), льняна олія (4,8-5,2 мг/г), олія соняшнику (3,7-4,1 мг/г), арахісове масло (3,2 мг/г), сафлорова олія (3,0 мг/г), соєва олія (3,0 мг/г), оливкова олія (2,4 мг/г), рицинова олія (1,9 мг/г). Склад стеролів у 95 і загальний вміст стеролів наведені у Табл. 11.

Загалом, серед усіх зразків олії з насіння основним фітостерином був рДВ-ситостерол (інтервал 30-57 95 від загального вмісту стеролів). Для олій спостерігався широкий інтервал частки інших основних стеролів: кампестерол (2-17 95), А5-стигмастерол (0,7-18 95), Д5-

авенастерол (4-23 95), Д7-стигмастерол (1-18 95). Олії різних видів містили інший профіль стеролів, причому деякі профілі були досить відмінними. У випадку олії рапсу, вона містило найвищу частку кампестеролу (33,6 95), тоді як зразки інших видів загалом містили нижчі рівні, наприклад, до 17 95 в арахісовій олії. Сафлорова олія містила відносно високу частку Д7- стигмастеролу (18 95), тоді як вміст цього стеролу звичайно був низьким в оліях інших видів, до 9 95 в олії соняшнику. Оскільки вони є характерними для кожного виду, профілі стеролів можуть, таким чином, використовуватися як допоміжні для ідентифікації конкретних овочевих або рослинних олій та перевірки їх непідробленості або підробки іншими оліями.

Порівнювали по два зразки соняшнику і сафлору, у кожному випадку один був одержаний холодним пресуванням насіння і був нерафінованим, тоді як інший не був одержаний холодним пресуванням і був рафінованим. Хоча спостерігалися деякі відмінності, два джерела олії містили подібний склад стеролів і загальний вміст стеролів, наводячи на думку про те, що обробка і рафінування здійснюють незначний вплив на два вказаних параметри. Вміст стеролів серед зразків відрізнявся в З рази і варіював від 1,9 мг/г до 6,8 мг/г. В олії рапсу він був найвищий, а в рициновій олії - найнижчий вміст стеролів.

Приклад 6. Збільшення акумуляції ДГК і ДПК в положенні 5п-2 ТАГ

Автори цього винаходу припускали, що акумуляція ДГК та/(або ДПК в положенні 5п-2 ТАГ може бути збільшена шляхом коекспресії І-ацил-гліцерол-3-фосфат ацилтрансферази (ЛФКАТ) із шляхом біосинтезу ДГК, наприклад, наданим конструкцією (СА або її варіантами.

Переважними ЛФКАТ є такі, які можуть впливати на поліненасичений С22 жирний ацил-КоА як субстрат, переважно ДГК/КОА та/або ДПК/ЖОоА, особливо ті, що можуть використовувати як ДГК-

КоА, так і ДПК-КоОА як субстрати, що приводить до збільшення інсерції поліненасиченого ланцюга С22 в положенні 5п-2 ЛФХ з утворенням ФХ, відносно ендогенного ЛФКАТ.

Цитоплазматичні ферменти ЛФКАТ часто демонструють варіюючі переваги по відношенню до субстрату, особливо, якщо вид синтезує і акумулює в ТАГ незвичайні жирні кислоти.

Продемонстровано, що ЛФКАТ2 з Іітпапіпеб5 аоидіазії може використовувати ерукоїл-КоА (Сб22:1-КоА) як субстрат для синтезу ФК, на протилежність ЛФКАТІ з того ж виду, яка не може утилізувати субстрат С22 (Вгомлп евї аї!., 2002).

Таблиця 11

Вміст і склад стеролів у проаналізованих рослинних оліях

Соня- Са- . Льон

Загальна назва стеролу | Кунжут | Олива Рицина| Рапс Арахіс | (насіння |Соя шик флор льону) холестерин. | 02 | 08 | 02 | 01 1 03|02| 02 | 04 гі браскастерол. | 01 | 00 | 00 | 03 01100| 00 | 02 (00 чалінастерол / 24- метиленхолестрин (075 | 0 1090 |24 02) 09 15 09 кампестерол / 24- кампестанол / 24- птн 15710955 050205 05 02 я

Сг" 7/7 / | 00 | 00 | о | 00 1011051 00 | т2

Аб-стигмастерол.ї | 64 | Тї2 | 74 | 186 10071701 69 | 51 176 невідомий | 05 | 13 | 007 | 08 1 0,7107| 04 | 07 з невідомий | 00 | 13 | 09 | ї2 091 18| 12 | 07 (07 себурикюл. | 16 | 178 | 41 | 75 701 179| 12 | 35 (09

В-ситостерол / д5-авенастерол / зодфусстро. 0109 | 69 | 72 98 |44 79) 53 | 230 59 стритерпеновийспиртї | 00 | 24 | 09 | 00 1 001/716| 00 | 00 (09 стритерпеновийспиртї | 00 | 00 | 0,7 | 00 1 00128| 00 | 00 (00 д7-стигмастерол / спимасттснкавоя | 22 | 7 19929 |09 5 лм | 79 56 (АД7-авенастерол.д | 13 | 01 | 40 | 06 (02/|20| 07 | 04 06

Загальна назва стеролу | Кунжут | Олива Рицина| Рапс Арахіс | (насіння |Соя шик флор льону) вишня зе 2| ке» зі « |е (мг/г олії)

С29:2"позначає стерол С29 із двома подвійними зв'язками.

Розглядалися відомі ЛФКАТ, і багато з них були вибрані для тестування, зокрема, ті, від яких не очікувалося збільшення інкорпорації ДГК в положенні 5п-2, як контроль. Відомі ЛФКАТ включали: ЛФКАТ2: Агабрідорзів (пайапа (5ЕО ІЮ МО: 40, номер доступу АВО48392, Кіт еї аї., 2005), ЛФКАТ Гітпапіпез аіра (5ЕО ІО МО: 41, номер доступу ААС49185, І аззпег еї а!., 1995),

Зіс1р Засспаготусев сегемізіае (ЗЕО ІЮ МО: 42, номер доступу МР 010231, 70и еї аї., 1997),

ЛФКАТ 1 МопієгейПа аїІріпа (5ЕО ІЮ МО: 44, номер доступу АЕЮО33305; 05 7879591) і ЛФКАТ

Вгазвзіса пари5 (ЗЕБЕО ІО МО: 45 ії 5ЕБЕО ІО МО: 46, номери доступу АЮС9У97479 ії АЮС97478, відповідно).

ЛФКАТ2 Агарідорзіз (також позначена як ЛФАТ2) являє собою локалізований в ендоплазматичному ретикулумі фермент, що продемонстрував активність по відношенню до субстратів С1б і С18, однак активність по відношенню до субстратів С20 або С22 не тестувалася (Кіт еї аї., 2005). ЛФКАТаО І ітпапіпе5х анІра продемонструвала вставку ацильного ланцюга С22:1 в положення 5п-2 ФК, хоча здатність використовувати ДГК або ДПК як субстрат не тестувалася (І аззпег еї аіІ., 1995). Вибрана ЛФКАТ 5. сегемізіае ЗІСтр продемонструвала активність у вигляді використання 22:1-КоА на додаток до 18:1-КоА як субстратів, указуючи на широку специфічність по відношенню до субстратів з урахуванням довжини ланцюга (701 еї аї., 1997). Знову, ДГК-КоА, ДПК-КоОА та інші ДЛ-ПНЖК не тестувалися як субстрати. Раніше було продемонстровано, що ЛФКАТ МопієгеїІа володіє активністю по відношенню до жирнокислотних субстратів ЕПК і ДГК в трансгенному Маггоула Іроїміса (05 7879591), але їх активність у рослинних клітинах невідома.

Додаткові ЛФКАТ були ідентифіковані винахідниками. Місготопах ривзійа являє собою мікроводорость, що продукує та акумулює ДГК в олії, хоча позиційний розподіл ДГК на ТАГ у цьому виді не було підтверджено. ЛФКАТ Місготопах ризйШа (ЗЕО ІЮ МО: 43, номер доступу

ХР 002501997) була ідентифікована шляхом пошуку серед геномних послідовностей

Містотопабз ризійа з використанням ЛФКАТ2 Агабрідорзіз як послідовності запиту ВІАЗ5Т.

З'явилися декілька послідовностей-кандидатів, і послідовність ХР. 002501997 була синтезована для тестування до С22 ДЛ-ПНЖК. ЛФКАТ Кісіпи5 соттипі5 була анотована як передбачувана

ЛФКАТ в послідовності геному рицини (Спап еї аї., 2010). Чотири кандидати на ЛФКАТ з геному

Зо рицини були синтезовані і протестовані на неочищених лізатах листя інфільтрованої тканини листа М. репіпатіапа. Розкрита в цьому документі послідовність-кандидат продемонструвала активність ЛФКАТ.

Ряд кандидатів на ЛФКАТ був вирівняний з відомим ЛФКАТ на філогенетичному дереві. Слід зазначити, що передбачувана ЛФКАТ Місготопах не групується з передбачуваними С22

ЛФКАТ, але має дивергуючу послідовність.

Як первинний аналіз різних ЛФКАТ щодо їх здатності використовувати ДГК-КоА та/або ДПК-

КоА як субстрат, одержують химерні генетичні конструкції для конститутивної експресії екзогенних ЛФКАТ в листі М. репіпатіапа, кожна під контролем промотору 355, як розкрито нижче: 355:Агаїп-ЛФАТІ2 (Агарідорзіз ЕК ЛФКАТ); 355:І ітаІ-ЛФКАТ (ЛФКАТ І ітпапінез аїра); 355:5ассе-ЗІСїр (ЛФКАТ 5. сегемізіає); З55:Місри-ЛФКАТ (ЛФКАТ Містотопаз ривійа); 355:МогаІ-ЛФКАТІ (ЛФКАТ МопієегеїІа аїІріпа); 355:Вгапа-І РААТ1І.13 (Вгаззіса пари5 ЛФААТІ1.13); 355:Вгапа-І РААТТІ,5 (Вгаззіса пари5 ЛФААТТІ,5). Конструкції 355:р19, що не містять екзогенної

ЛФКАТ, використовували у експерименті як контроль: його включали до кожної інокуляції М. репіпатіапа. Кожну із вказаних конструкцій вводили за допомогою Адгобасіегішт в листя М.

Бепіпатіапа, як розкрито у Прикладі 1, і через 5 днів після інфільтрації оброблені зони листя вирізували і подрібнювали для одержання лізату листя. Кожен лізат містить екзогенну ЛФКАТ, а також ендогенні ферменти для синтезу ЛФК. Реакційні суміші одержували іп міо, окремо додаючи до лізатів мічені Сб ОК і ДГК. Реакційні суміші інкубують при 25 "С, і рівень інкорпорації мічених С жирних кислот у ФК визначають за методом ТШХ. Обчислювали здатність кожної ЛФКАТ використовувати ДГК відносно АРК і жирних кислот С18. Знайдено, що

ЛФКАТ пінника лугового, МогііегеМПа і засспаготусев5 володіють активністю по відношенню до субстрату ДГК, причому радіомічена ФК виникає у випадку цих, але не інших ЛФКАТ. Активність всіх ЛФКАТ була підтверджена контрольним споживанням олеїнової кислоти.

Для тестування активності ЛФКАТ в насінні, деяку кількість кодуючих білок послідовностей або ЛФКАТ вставляли до бінарного вектору під контролем промотору конлініну (рі исСпіг).

Одержані в результаті генетичні конструкції, що містять химерні гени СпігАга(й-ЛФКАТ (негативний контроль), Спіг:І ітаІ-ЛФКАТ, Сп2:Зассе-5іІс1р, і Спі2МогаІ-ЛФКАТ, відповідно, далі використовують для трансформації рослин А. ІПаїїапа, які утворюють ДГК у насінні, щоб одержати стабільні трансформанти, які експресують ЛФКАТ і трансгенний шлях ДНК у специфічній для насіння формі, щоб протестувати, чи буде збільшуватися інкорпорація ДГК у положенні 5п-2 ТАГ. Крім того, конструкції використовуються для трансформації рослин В. пари і С. займа, які вже містять конструкцію СА? та її варіанти (Приклади 2 і 3), з метою одержання потомства, що несе материнські і ЛФКАТ генетичні конструкції. Протестоване збільшення інкорпорації ДГК та/або ДПК в положенні 5п-2 ТАГ відносно інкорпорації в рослинах без кодуючих ЛФКАТ трансгенів. Вміст олії також підвищується в насінні, особливо у випадку насіння, що продукує вищі рівні ДГК, нейтралізуючи тенденцію, спостережувану в насінні

Агарідорзів, як розкрито у Прикладі 2.

Специфічну для насіння конструкцію рСіп2:Мога-ГРААТІ використовували для трансформації вже трансгенної лінії Агабідорвзіб5 Ійаійапа, що була гомозиготною по Т-ДНК із конструкції СА?7, і насіння якої містило близько 15 95 ДГК у ліпідах насіння (Реїгіє єї аї!., 2012).

Для цього застосовували ген селекційного маркера канаміцину в конструкції ресСіІп2:Мога!-

ІЇ РААТІ, що був відмінний від гена селекційного маркера раг, вже присутнього у трансгенній лінії. Були відібрані трансгенні саджанці, стійкі до канаміцину, і вирощені до стану зрілості в теплиці. Урожай насіння Т2 був зібраний, і склад жирних кислот в загальних ліпідах насіння проаналізований методом ГХ (Табл. 12). Три фенотипи спостерігали серед 33 незалежно трансформованих ліній. У першій групі (6/33 ліній), вміст ДПК істотно підвищувався, до значно вищого рівня, ніж рівень ДГК, до близько 10,6 95 в загальних ліпідах насіння. Це відбувалося за рахунок ДГК, вміст якої був істотно знижений у даній групі ліній. У двох лініях із вказаної першої групи сумарний вміст ДПК «з ДГК був знижений, але не в інших 4 лініях. У другій групі (5/33), рівні

ДПК і ДГК були рівними, із близько таким же сумарним вмістом ДПК -ї- ДГК, як їі в насінні

Зо материнської рослини. У третій групі рівні ДПК ії ДГК були подібними до рівнів у насінні материнських рослин. Одне з можливих пояснень для підвищеного рівня ДПК у першій і другій групах полягає в тому, що ЛФААТ витісняє Д4-десатуразу на субстраті ДПК-КоА і переважно інкорпорує ДПК у ПК і далі в ТАГ, відносно Д4-десатурації. Друге можливе пояснення полягає в тому, що Д4-десатурація частково інгібується.

Збирали насіння рослин Агарідорзіз, трансформованих Т-ДНК конструкцією СА7, що були додатково трансформовані вектором рСіп2:Мога!-І РААТ, і з насіння екстрагували олію. Далі фракцію ТАГ виділяли з екстрагованої олії методами ТШХ і виділяли з пластинки ТШХ.

Одержані зразки ТАГ і зразки олії з насіння до фракціонування аналізували за допомогою розщеплення ліпазою НПі2орих5, щоб визначити позиційний розподіл ДГК. Ліпаза є специфічною відносно ацильних груп, естерифікованих у положенні 5п-ї або 5п-3 ТАГ. Це здійснювали шляхом приготування емульсії кожного зразка ліпіду у 5 95 аравійській камеді, із застосуванням пристрою для обробки ультразвуком, і додаючи розчин ліпази КПігори5 у 0,1 М Трис-НСЇ, рн 7,7, що містив 5 мМ Сасіг, з інкубацією сумішей при 30 "С і безперервному струшуванні.

Реакцію в кожній реакційній суміші зупиняли, додаючи хлороформ : метанол (2/1, об/об) і один об'єм 0,1 М КСІ до кожної суміші. Ліпід екстрагували у хлороформну фракцію, і визначали відносні кількості 5п-2 МАГ, зп-1/3 ФФХ, ДАГ і компонентів ТАГ одержаного ліпіду розділенням на просоченій 2,3 96 борною кислотою пластинці ТШХ із застосуванням гексану/діетилового етеру/оцтової кислоти (50/50/1, об/06б). Смуги ліпідів візуалізували, оббризкуючи 0,01 905 примуліном в ацетоні/воді (80/20, об/об) на пластинці ТШХ з візуалізацією в Уф-світлі. Окремі смуги ліпідів ідентифікували на базі плям ліпідних стандартів, нанесених на таку ж пластинку

ТШХ. ТШХ смуги ліпідів збирали у скляні флакони, і одержували з них метилові естери жирних кислот із застосуванням 1 н метанольної НСІ (Зиреї!со), з інкубацією при 80 "С протягом 2 годин.

Склад жирних кислот індивідуальних ліпідів був проаналізований ГХ.

Даний аналіз продемонстрував, що ДГК у насінні материнських рослин, трансформованих

СА? (лінії 22-2-1-1 і 22-2-38-7), переважно була естерифікована у положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ. навпаки, ліпіди в насінні ММ11 ї ММ15, трансформованому як конструкцією СА?7, так і трансгеном, що кодує ЛФААТ, були збагачені ДГК у 5п-2, причому 35 95 ДГК в одній із ліній і 48 о ДГК у іншій лінії були естерифіковані у положенні 51-22 ТАГ, тобто після розщеплення ліпазою

ДГК була присутня, як 5п-2-МАГ (Табл. 13). Аналогічні результати одержані для насіння В. париє і В. )їипсєа, трансформованого як Т-ДНК із конструкції СА 7-тоавВ, так і геном, що кодує ЛФААТ, і продукуючого ДГК, а також для насіння В. паризг і В. їипсеа, -що продукує ДПК.

Для того, щоб визначити, чи існує перевага ЛФААТ МопієгеЇйа або іншої ЛФААТ відносно

ДПК-КоА або ДГК-КоА, іп міго одержували реакційні суміші, додаючи окремо ""С-мічений-ДПК-

КоА або -ДГК-КоА до лізатів листя М. репіпатіапа, тимчасово експресуючого ЛФААТ-кандидату під контролем конститутивного промотору, як викладено вище. Реакційні суміші інкубували при 2520, і рівні інкорпорації мічених 77; жирних кислот в у ФХ визначали за ТШХ методом аналізу ліпідів. Оцінювали здатність кожної ЛФААТ використовувати ДГК-КоА відносно ДПК-КоА. Гени, що кодують ЛФААТ з доведеною високою ДГК інкорпоруючою активністю ЛФААТ застосовували для одержання трансформованих ДГК-продукуючих рослин рапсу і насіння.

Гени, що кодують ЛФААТ з високою активністю використання ДПК-КоА, застосовували для трансформації ДПК-продукуючих рослин і насіння, щоб збільшити кількість ДПК, естерифікованої у положенні 5п-2 ТАГ.

Таблиця 12

Склад жирних кислот (95 від загальних жирних кислот) трансгенного насіння А. ІПаїїапа, трансформованого конструкцією ЛФААТІТ, а також Т-ДНК із конструкції СА7 для продукування

ДГК. С20:406 у насінні не була виявлена. Крім того, насіння містило 0,3-0,995 С22:0 і 0,4-1,595 б221. що жЖ ОВ БОЯХ ж 1 з 351 в з 05 Ба 15 ЗІ 7451 пя я пе 75 ЗЕ

ТрЖ-З 167 34 вх 44 7д ВЗ 081 їй 45 8 37 Б 13 1 135 моє кЖ-4 па з ах 31 70 03 5 ЗР 47 55 23 10 18 В8 1: ва ма

ЗЕ -в тя зл 135 23 150 пі 5 їх т о Б55 31 14 13 085 пз зв ох

МЕ-Е вк 33 52 55 10 063 2535 15 30 55 ха 18 13: 53 05 ві А

ВгЕ-й ї23 37 5 аб лі 03 53 235 4 55 38 05 16 37 1 а ще

ВМЖ-1 ще 52 85 що 03 ЗУ 16 Я т 25 15 13 053 1 6 їв

ІЖ-14 і Я БЕ ЗБ БО 0 Я І ОК 977 15 15 15 15 п в це кт-ії | 57 35 ях 53 Р 03 МВ 195 40 й: 53 бЕ 05 б 10 жд 1 му | 54 31 135 Зі зає б 258 17 16 113 33 ї1д :4 05 бвб о Зя ій кт-н |:5 365 55 38 З 03 315 30 Я6 55 35 605 іт 5 10 пе т кт-ю | й 33 та 33 Фа 03 3355 18 34 885 32 13 17 15 10 да 5

Таблиця 13

Присутність ДГК в положенні 5п-2 ТАГ або в загальній олій трансгенного насіння А. ІПаїапа, трансформованого геном Спі2:МогаІ-ЛФААТ, а також Т-ДНК із конструкта СА?7, яка демонструє позиційний розподіл ДГК у ТАГ. Крім того, у складі жирних кислот ТАГ і 5п-2 МАГ було присутнє 0-0,495 кожної з 14:20, 16:10131, 16:2, 16:3, 22:0 і 24:0. У насінні не були виявлені С20:306,

С20:4096. - Би пов з з ВІКІ |в ІНКІВ |н|ІнІя ків я зняла Зк ж | ШЕ | Ж | - | зе | зи | а | Ж - | - | | ж | ж | 2 | ше | 5 | | з ат вад 03 57 11 НЯ 63 835 В 57 05 15 23 16 606 0 п пі 02 16 175

Приклад 7. Подальший аналіз трансгенного насіння Сатвеіїпа заїїма

Загальний вміст ліпідів

Насіння С. заїїма, гомозиготне по Т-ДНК із конструкції СА7, що містить ДГК у загальному вмісті жирних кислот, було проаналізоване щодо вмісту складу загальних ліпідів і як вказано нижче. Для насіння виконували дві послідовні стадії екстракції розчинником, спочатку із застосуванням гексану, і потім із застосуванням хлороформу/метанолу. В ході екстракції і аналізу не додавали антиоксидантів. Метод екстракції Сокслета, який звичайно застосовується для виділення ліпідів з насіння шляхом тривалого нагрівання і кип'ятіння із зворотним холодильником суміші ліпіду/розчинника, у даному випадку не застосовувався через потенційне розкладання або окиснення 03 ПНЖК, таких як ДГК.

Гексан застосовували як розчинник для першої екстракції, оскільки він є промисловим стандартом для олійних культур. Крім того, він переважно екстрагує ТАГ-вмісну олію за рахунок своїх сольватувальних властивостей і відносно слабкої солюбілізації полярних ліпідів, особливо при кімнатній температурі. Трансформоване і контрольне насіння Сатеїїпа (130 г і 30 г, відповідно) змочували гексаном і подрібнювали за допомогою електричної агатової ступки і товкача (Кеїзспй Мийіе, Німеччина). Суміші переносили до ділильних лійок і чотири рази екстрагували із застосуванням загального об'єму 800 мл гексану, включаючи статичну екстракцію протягом ночі для третьої екстракції. Для кожної екстракції екстракти фільтрували крізь фільтр з скловолокна СЕС під вакуумом для видалення дрібних частинок, після чого випаровували на ротаційному випарнику при 40 "С під вакуумом. Екстракти об'єднували в пул з одержанням багатих на ТАГ гексанових екстрактів.

Після екстракції гексаном шрот насіння, що залишився, далі екстрагували із застосуванням хлороформу-метанолу (ГМ, 1:11 об/0б) за такою ж методикою, як здійснювали екстракцію гексаном. Далі шрот видаляли фільтрацією, і об'єднані екстракти випаровували на роторному випарнику. Об'єднані в пул неочищені ХМ загального ліпіду далі розчиняли із застосуванням однофазної суміші метанолу-хлороформу-води (2:1:0.8, об/06б/06). Фракції розділяли додаванням хлороформу-води (кінцеве співвідношення розчинників, 1:1:0,9 об/о0б/0б6

Зо метанолу/хлороформу/води). Очищений ліпід у кожному екстракті, розподілений у нижній хлороформній фазі, концентрували із застосуванням роторного випаровування, і одержували

ХМ екстракти, багаті на полярні ліпіди. Вміст ліпіду в кожному із цих екстрактів визначали гравіметрично.

Для аналізу складу жирних кислот, аліквоти гексанових і ХМ екстрактів транс-метилували за способом СпПгібїє еї аі. (1982) з одержанням метилових естерів жирних кислот (МЕЖК), застосовуючи метанол-хлороформ-конц. гідрохлоридну кислоту (З мл, 10:1:1, 80 "С, 2 години).

МЕЖК екстрагували гексаном-хлороформом (4:1, З х 1,8 мл). Крім того, зразки шроту насіння (1-

2 г), що залишився після екстракції гексаном і ХМ, транс-метилували для гравіметричного вимірювання вмісту будь-якого залишкового ліпіду у вигляді МЕЖК. Загальний вміст ліпідів у насінні обчислювали, підсумовуючи вміст ліпідів у гексанових і ХМ екстрактах та вміст МЕЖК у трансметильованому шроті після екстракції розчинниками.

Трансгенне насіння містило дещо меншу кількість загальних ліпідів, на рівні 36,2 95 від маси насіння, в порівнянні з насінням Сатеїїпа займа дикого типу, 40,9 95 від маси насіння. Для насіння, включаючи насіння олійних культур, загальні ліпіди визначали як суму екстрагованого розчинниками ліпіду, одержаного послідовною екстракцією гексаном, а потім хлороформом- метанолом, і залишкового ліпіду, вивільненої трансметилуванням екстрагованого шроту після екстрації розчинниками, як описано для прикладу в даному описі. Такі загальні ліпіди здебільшого складалися із ліпідів, що містять жирні кислоти, таких як триацилгліцероли і полярні ліпіди, і невеликих кількостей ліпідів, що не містять жирних кислот, таких як фітостерини і жирні спирти, що можуть бути присутніми у вільній неестерифікованій формі або можуть бути естерифіковані жирними кислотами. Крім того, будь-які етери стеролів або етери воску і вуглеводні, такі як каротиноїди, наприклад, В-каротин, також входили до ліпіду, що екстрагується розчинниками, якщо вони присутні Вони були включені до загального гравіметричного визначення і були показані в аналізі ТШХ-ПІД (Табл. 14).

Із загальних ліпідів, 31 95-38 95 ліпідів від маси насіння було екстраговано гексаном для трансгенного і контрольного насіння, відповідно, що відповідає 86 95 і 92 95 загальних ліпідів у насінні. За допомогою екстракції ХМ добували ще 4,8 95 і 2,4 95 (від маси насіння), в основному багатий на полярні ліпіди екстракт із трансгенного і контрольного насіння, відповідно.

Залишковий ліпід, що вивільняється трансметилуванням шроту насіння олійної культури, який залишився після екстракції розчинниками, становив 0,3 95 і 0,4 95 від маси насіння, відповідно.

Тобто, перша і друга екстракція розчинниками сумарно добуває 99 95 від загального вмісту ліпідів у насінні (тобто, 36,2 95 або 40,9 95 від маси насіння, що в основному є ліпідом, який містить жирні кислоти, наприклад, тригліцероли і полярні ліпіди, які складаються із гліко- і фосфоліпідів (див. наступний розділ -- аналіз класів ліпідів)).

Аналіз класів ліпідів

Класи ліпідів у огексанових і ХМ екстрактах були проаналізовані тонкошаровою

Зо хроматографією з виявленням за допомогою плазмово-іонізаційного детектора (ТШХ-ПІД;

Іаїобзсап Мак М, Іайоп І арогаїогіє5, Токіо, Японія), із застосуванням гексану/діетилового етеру/льодяної оцтової кислоти (70:10:0,1, об/об/0б) як системи розчинників для проявлення, в поєднанні з кремнію діоксидом Спготагой 5-ІП на кварцових паличках. Придатні калібрувальні криві отримували із застосуванням репрезентативних стандартів, одержаних від Ми-СНек Ргер,

Іпс. (Елізайан, Мінесота, США). Дані обробляли за допомогою програмного забезпечення 5ІС- 48011 (Версія 5І5С: 7.0-Е). Різні види фосфоліпідів розділяли із застосуванням очищеної фосфоліпідної фракції, одержаної після колонкової хроматографії на кремнію діоксиді, з проявленням паличок у хлороформі/метанолі/льодяній оцтовій кислоті/воді (85:17:5:2, об/об/об) перед виявленням за допомогою ПІД.

Для відокремлення ТАГ, гліколіпідних і фосфоліпідних фракцій від ХМ екстрактів застосовували гель кремнію діоксиду 60 (100-200 меш) (0,3-1 г) у короткій скляній колонці або піпетці Пастера, заповненій скловатою, щоб очистити 10 мг очищеного ГМ екстракту ліпідів.

Залишкову фракцію ТАГ у ХМ екстракті елюювали із застосуванням 20 мл 10 95 діетилового етеру в гексані, гліколіпіди елюювали 20 мл ацетону, і фосфоліпіди елюювали у дві стадії, спочатку 10 мл метанолу, і потім 10 мл метанолу-хлороформу-води (5:3:2). Вказана друга елюація збільшує вихід фосфоліпідів. Вихід кожної фракції визначали гравіметрично, і чистоту перевіряли ТШХ-ПІД. Всі екстракції і фракції зберігали у дихлорметані при -20 "С до подальшого аналізу ГХ і ГХ-МО.

Багаті на ТАГ гексанові екстракти від кожного із трансгенного і контрольного насіння містили близько 96 95 ТАГ. ХМ екстракти містили залишкові кількості ТАГ 44 95 ії 13 95 мас. ХМ екстрактів, відповідно, для трансгенного насіння і насіння дикого типу. На протилежність гексановим екстрактам, ХМ екстракти були багаті на полярні ліпіди, а саме фосфоліпіди і гліколіпіди, вміст яких відповідав 50 95 і 76 95 мас. ХМ екстрактів, відповідно, для трансгенного і контрольного насіння (Табл. 14). Основним фосфоліпідом був фосфатидилхолін (ФХ), який складав 70 95-79 95 загальних фосфоліпідів, далі слідував фосфатидилетаноламін (ФЕ, 7 95-13

Фо), при відносно низьких рівнях фосфатидинової кислоти (ФК, 2 95-5 95) і фосфатидилсерину (ФС, « 2 95). Існують процедурні переваги при поданні відповіді на кінцевий Висновок експерта до 7 липня 2015 року.

Склад жирних кислот

Загалом для насіння, що продукує ДГК та/або ДПК, автори винаходу спостерігали склад жирних кислот загальних ліпідів у насінні, за даними прямого трансметилування загальних ліпідів у насінні, подібний до складу ліпідів у фракції ТАГ. Це було результатом того, що більше 90 95 загальних ліпідів, присутніх у насінні, знаходилися у формі ТАГ.

Склад жирних кислот різних класів ліпідів у гексанових і ХМ екстрактах визначали газовою хроматографією (ГХ) і методом ГХ-МС, із застосуванням приладу для ГХ Адіїепі ТГесппоіодієб 6890А (Пало-Альто, Каліфорнія, США), обладнаного капілярною колонкою із плавленого кварцу зиреїсо Едийу"м-1 (15 м х 0,1 мм в.д., товщина плівки 0,1 мкм, Белефонт, Пенсільванія, США),

ПІД, інжектором з розщепленням/без розщеплення, аутосемплером Адіепі Тесппоіодієв серії 76838 та інжектором. Газом-носієм був гелій. Зразки вводили інжекцією у режимі без розщеплення при температурі печі 120 "С. Після інжекції температуру печі підвищували до 270 "С із швидкістю 10 "С/хв, і в кінці до 300 "С із швидкістю 5 "С/хв. Елюйовані сполуки визначали кількісно за допомогою програмного забезпечення Адііїепі ТесппоЇодіез Спетеїайвоп (Пало-Альто, Каліфорнія, США). Результати ГХ містили помилку не більше ніж 2-5 95 площі піку індивідуальних сполук.

Таблиця 14

Склад класу ліпідів ( 9о від загальних ліпідів, одержаний для кожної стадії екстракції) У гексанових і ХМ екстрактах трансгенного і контрольного насіння Сатеїнпа заїїма. ЕС, ЕВ і ГК не розділяли.

ТАГ 77777777 Ї777171171956 | 442 | 9602 2ЮюЮфЮ| з

ВЖК 77777777 177717117109 | 73 | 08 | 14 вт 77777717 Ї17717171717109 7 17771108 | щфлв

МАГ 7 Ї7777117107 | 7 1108 | 62 9 Ф

Скорочення: етери стеролів (ЕС), етери восків (ЕВ), гідрокарбони (ГК), триацилгліцероли (ТАГ), вільні жирні кислоти (ВЖК), не визначено (н/в), стероли (СТ), моноацилгліцероли (МАГ), полярні ліпіди (ПЛ), що складаються з гліколіпідів і фосфоліпідів; " ЕС, ЕВ і ГК із цієї системи елюювалися разом; "" Може містити жирні спирти і діацилгліцероли (ДАГ).

Аналізи методом ГХ-мас-спектрометрії (ГХ-МОС) здійснювали на приладі ГХ-МС із квадрупольними лінзами Ріппідап Тгасе шйга (модель: ТпеппоОицеві Ттасе 050, ТНегто ЕПІесігоп

Согрогаїйоп). Дані обробляли за допомогою програмного забезпечення ТпегтоОцеві Хсаїїриг (Остін, Техас, США). Прилад для ГХ був обладнаний інжектором на колонці і капіляорною колонкою НР-5 ОПйга Адіїйєепі У а М (50 м х 0,32 мм в.д., товщина плівки 0,17 мкм, Ааіепі

Тесппоіодіех, Санта-Клара, Каліфорнія, США) з полярністю, подібною до описаної вище.

Індивідуальні компоненти були ідентифіковані із застосуванням даних мас-спектру і порівнянням часу утримання з одержаним для аутентичних і лабораторних стандартів.

Холостий аналіз за повною методикою проводили паралельно із серією зразків.

Дані складу жирних кислот у різних класах ліпідів в екстрактах наведені у Табл. 15. У ДГК- продукуючому насінні Сатеїпа ДГК розподіляються на основні ліпідні фракції («ТАГ, фосфоліпіди і гліколіпіди) у пропорції, що варіює від 1,6 95 до 6,8 95, із зворотною кореляцією

Зо між частками ДГК ії АЛК. Багатий на ТАГ гексановий екстракт із трансгенного насіння містив 6,8

Фо ДГК ї 41 95 АЛК (Табл. 15). Багатий на полярні ліпіди ХМ екстракт містив 4,2 95 ДГК ї 50 95

АЛК, тобто відносно меншу кількість ДГК і більше АЛК. Залишкові ТАГ з багатого на полярні ліпіди ХМ екстракту містили 6 95 ДГК і 40 95 АЛК. Гліколіпідна фракція, виділена з ЗМ екстракту, містила З 956 ДГК і 39 95 АЛК, і фосфоліпідна фракція містила найнижчий рівень ДГК (1,6 905) і найвищі рівні АЛК (54 95). Трансгенне насіння Сатвеїїпа містило вищі рівні АЛК ї нижчі рівні ЛК (лінолева кислота, 18:206), в порівнянні із контрольним насінням, в основних класах ліпідів (ТАГ, гліколіпіди і фосфоліпіди). Частки АЛК ії ЛК складали: АЛК 39 95-54 95 і ЛК 4 95-9 95 для трансгенного насіння і АЛК 12 95-32 95 і ЛК 20 95-29 95 для контрольного насіння. Відносний рівень ерукової кислоти (22:19) був нижчим у всіх фракціях із трансгенного насіння, ніж в контрольному насінні, наприклад, 1,3 95 проти 2,7 95 у гексанових екстрактах (Табл. 15).

Склад стеролів у насінні

Для визначення вмісту і складу стеролів у екстрагованих ліпідах, зразки, що містять близько мг загальних ліпідів із багатого на ТАГ гексанового екстракту і багатого на полярні ліпіди ХМ екстракту обмилювали із застосуванням 4 мл 5 95 КОН у 80 95 Меон і нагрівали протягом 2 годин при 80 С у вкритій тефлоном скляній пробірці із нагвринчувальною пробкою. Після охолодження реакційних сумішей додавали 2 мл води Міїйї-О, стероли і спирти екстрагували тричі по 2 мл гексану : дихлорметану (4:11, об/0б), струшуючи і перемішуючи вихровим 10 перемішуванням. Суміші центрифугували, і кожен екстракт в органічній фазі промивали 2 мл води МІіШ-С, струшуючи і центрифугуючи. Після відбору верхнього, стерол-вмісного органічного шару, розчинник випаровували за допомогою потоку газоподібного азоту, а стероли і спирти силіліювали із застосуванням 200 мкл біс(триметилсиліл)утрифлуорацетаміду (БСТФА, 5ідта-

Аїйгісп), нагріваючи протягом 2 годин при 80 "С у закупореному ГХ флаконі. В такий спосіб вільні гідроксильні групи перетворювали на їх триметилсилілові етери. Похідні стерол- і спирт-

ОТМ5і сушили в потоці газоподібного азоту на нагрівальному блоці (40 "С) та повторно розчиняли у дихлорметані (ДХМ) безпосередньо перед аналізом ГХ/ГХ-МС, як викладено вище.

Таблиця 15

Склад жирних кислот ( 95 загальних жирних кислот) ліпідних екстрактів і фракції з трансгенного і контрольного насіння С. 5аїїма.

Жирна (ексан! 0 ХМ 11017110 | Шротібексаніо 0/0 ХМ 7/7 | Шрот льні кові льні кові 16ле7| 01 | 02101102 01 02 | о |02|02| - | - | 03 160 | б2 | 128) 68 | 21,3 194) 104 | 67 | 128 7,8 |296113,7| 103 184ю3| 37 | 33 | 34 | 21 129 36 | - | - | - | - 71 - | - 18лшФ9 | 11 | 47 | 96 | 72 28| 81 | 140 | 254 | 13,3 |14,7135,7| 143 20503| 04 | 021 03| - - | 03 | - | - ЇЇ - | - 71 -їЇ - 20403| 04 | 041 04| - 021 03 | - | - | - | - 71 - | - 20206| 07 | 07 | 08106 04 07 | 18 | 08 | 2 | т12| - | 18 20303| 08 | 121 09 | 06 13 05 09 |03| - | - | - | 04 201ю7| 06 | 08/14 | 06 02| 11 | 06 | 06 | 20 | 13 - | 18 200 | 13 | 08/14 | 06 01 14 | 15107 | 20 |14| - | 18 22б03| 68 | 42 | 61 | 30 16 54 | - | - | - | - 71 - | - 22:503| 03 | 11 104 | 06 14| 03 | - | - ЇЇ - | - 1 - | - 221ш9| 13 | 10 118 | 06 01 15 | 27 | 07 | 36 |09| - | 29 220 | 03 | 02/03 | 06 01 07 | 03 | 02 | 07108 - | 08 241ш9| 03 | 04 | 04 | 06 03 06 | 03 | 06 | 007 (091051 10 240 | 01 | 04 102109 04| 11 | 0 | 04 | 05 |14|04| 13 інш" | 04 | 10/10 | 14 05 18 | 03 | 11 | 09 (01. - | и

Скорочення: триацилгліцероли (ТАГ),, гліколіпіди (ГЛ), фосфоліпіди (ФЛ); Загальні: багатий на полярні ліпіди екстракт, що містить ГЛ і ФЛ із ХМ екстракту; ТАГ, ГЛ ї ФЛ розділяли хроматографією на колонці із кремнію діоксидом з ХМ екстрактів; " Сумарний вміст мінорних жирних кислот

Основними стеролами, як у трансгенному, так і в контрольному насінні були 24- етилхолестерин (ситостерол, 43 95-54 95 від загальних стеролів), 24-метилхолестерин

(кампестерол, 20 95-26 95) з нижчими рівнями холестерину (5 95-8 95), брасікастерол (2 95-7 95), ізофукостерол (д5-авенастерол, 4 95-6 95), стигмастерол (0,5 95-3 95), холест-7-ен-З3р-ол, (0,2

Фо-0,5 Уо), 24-метилхолестанол (кампестанол, 0,4 95-1 90) і 24-дегідрохолестерин (0,5 У6-2 95) (Табл. 16). Ці дев'ять стеролів відповідають за 86 95-95 95 загальних стеролів, тоді як решта компонентів, що є стеролами, ідентифікована тільки частково за кількістю атомів вуглецю і подвійних зв'язків. Загальні профілі стеролів були подібними для трансгенного і контрольного насіння, як у випадку гексанових, так і у випадку ХМ екстрактів.

Аналіз жирних спиртів

Жирні спирти з насіння були дериватизовані і проаналізовані щодо стеролів. Серії жирних спиртів від С16-С22, із супутніми ізо-розгалуженими жирними спиртами були ідентифіковані як у гексанових, так і ХМ екстрактах. Подібні профілі спостерігалися для трансгенного і контрольного насіння, з деякою варіацією у частках спостережуваних індивідуальних компонентів. Фітол, утворений із хлорофілу, був основним аліфатичним спиртом і відповідав за 47 95 ії 37 95 загальних жирних спиртів у гексанових фракціях із трансгенного і контрольного насіння, відповідно. Спирти з непарною довжиною ланцюга присутні з вищими рівнями у ГМ екстракті (37 95-38 95 від загального вмісту жирних спиртів), ніж у гексановому екстракті (16 95- 23 90). 3-17:0 (16 95-38 до) переважав над 17:0 (0,3 9о-5,7 90). Вміст інших спиртів із непарною довжиною ланцюга становив 19:0 (4,5 95-6,5 95). Інші знайдені спирти включали ізо-16:0, 16:0, ізо-18:0, 18:1, 18:0, з незначними рівнями ізо-20:0, 20:1, 20:0, а також були присутні ізо-22:0, 221 і 22:0.

Обговорення

Результати показують, що подрібнення за допомогою механізованої ступки і товкача із багаторазовою екстракцією гексаном при кімнатній температурі було ефективним з точки зору добування більшої частини ТАГ-вмісної олії із трансгенного насіння. На додаток до олії із трансгенного насіння, що містить помірні рівні ДГК, трансгенне насіння також містило значно вищі рівні АЛК в основних класах ліпідів (триацилгліцероли, гліколіпіди і фосфоліпіди), у порівнянні з контрольним насінням. Це показало, що активність А15-десатурази значно підвищувалася у трансгенному насінні в ході розвитку насіння. Цікаво, що існували деякі невеликі відмінності у складі жирних кислот і частках ДГК у різних екстрактах і фракціях,

Зо причому рівні ДГК були вищими в багатому на ТАГ гексановому екстракті і ТАГ із ГМ екстракту (6 У5-6,8 95) і нижчими у фракціях полярних ліпідів (З 9о у гліколіпідах і 1,6 96 у фосфоліпідах).

Рівень 16:0 був вищим у фракціях полярних ліпідів, гліколіпідів і фосфоліпідів у ХМ екстрактах (19 95-21 95), в порівнянні з багатим на ТАГ гексановим екстрактом і ТАГ із ХМ екстракту (6 5-7

Зо).

Таблиця 16

Склад стеролів ( 95 від загальних стеролів) у трансгенному і контрольному насінні Сатеїіпа. 11111111 | Траногенненасіння.ї | Контрольненасіння.//: га4-дегідрохолестерин.//-/:/ | 08 2 | 18 | 05 | 714

Кампестанол..//-/:/-/// |. 70417771 1 1104 | 2 щ(Б08 інші 1 оміСавтав 77777777 77117106 17771112 | 07 | 12 мзСгягав 77777777 77117109 17771711718 | 713 | 24 2 щФ - оміаСавтав 77777777 7717103 1777109 | 06 | 7

Продовження таблиці 16

Скорочення: Н/в означає невідомий стерол, число після С вказує на кількість атомів вуглецю, і аБ позначає кількість подвійних зв'язків.

Склад стеролів у трансгенному насінні і контрольному насінні був подібним до знайденого у рафінованій олії Сатеїїпа (Зпикіа еї аї., 2002), біли присутні ті ж основні стероли, вказуючи на те, що додані гени не впливали на синтез стеролів у насінні. Рівень холестерину в олії Сатеїїпа був вищим за той, що зустрічається у більшості рослинних олій. Присутній брасікастерол, який є характерним стеролом, знайденим у родині Вгаззісасеає, що включає Сатвеіїйнпа заїїма.

Приклад 8. Продукування ДЛ-ПНЖК у насінні Вгазвіса |ппсєа

Трансгенні рослини Вгаззіса їнпсеа одержували із застосуванням конструкції 5А7-тоав (Приклад 3) для продукування ДГК, як указано нижче. Семена сорту В. |ипсеа, чутливого до тривалого світлового дня, стерилізували із застосуванням газоподібного хлору, як описано

Кеге57і еї аї. (2007). Стерилізоване насіння пророщували у середовищах МС з 1/2 активності (Мигазпіде і 5Косо, 1962), затверділих з 0,8 95 агару, з корекцією рН до 5,8, і вирощували при 2476 і флуоресцентному освітленні (50 мкЕ/м2с) з фотоперіодом 16/8 години (світло/темрява) протягом 6-7 днів. Черешки котиледонів із стеблом 2-4 мм були виділені із цих саджанців в асептичних умовах і використовувалися як експланти. Адгорасіегішт їшптегасіеп5 штам Асі 1 трансформували бінарною конструкцією СА7. Культура Адгобасієгійт була висіяна і оброблена для інфікування, як описано Веїїде еї аї. (2013). Для всіх трансформацій близько 50 свіжовиділених котиледонних черешків інфікували 10 мл культури А. їштеїасіеп5 протягом 6 хвилин. Інфіковані черешки промокали стерильним фільтрувальним папером для видалення надлишку А. ішптеїасієп5 і переносили у середовища для сумісного культивування (МС, що містять 1,5 мг/л БА, 0,01 мг/л НКК і 100 мкМ ацетосирингону, і також містять І -цистеїн (50 мг/л), аскорбінову кислоту (15 мг/л) і МЕС (250 мг/л). Всі планшети запечатували мікропористою стрічкою та інкубували в темряві при 242С протягом 48 годин сумісного культивування. Далі експланти переносили у передселекційне середовище (агар МС, що містить 1,5 мг/л, БА, 0,01 мг/л НКК, З мг/л АдМО», 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину) і культивували протягом 4-5 днів при 242С з фотоперіодом 16/8 годин, після чого експланти переносили у селекційне середовище (агар МС, що містить 1,5 мг/л БА, 0,01 мг/л НКК, З мг/л Ад9МОз, 250 мг/л цефотаксиму, 50 мг/л тиментину і 5 мг/л ФФТ) та культивували протягом 4 тижнів при 242С із фотоперіодом 16/8 годин. Експланти із зеленим калюсом переносили в середовище для

Зо регенерації пагонів (агар МС, що містить 2,0 мг/л БА, З мг/л ЛоМО»з, 250 мг/л цефотаксиму, 50 мг/л тиментину і 5 мг/л ФФТ) і культивували ще протягом 2 тижнів. Маленькі бруньки регенеруючих пагонів переносили у середовище МС без гормонів (агар МС, що містить З мг/л

Ад9МО:», 250 мг/л цефотаксиму, 50 мг/л тиментину і 5 мг/л ФФТ) і культивували ще протягом 2-3 тижнів.

Потенційно трансгенні пагони розміром щонайменше 1,5 см виділяли і переносили у середовище для коренеутворення (агар МС, що містить 0,5 мг/л НКК, З мг/л АдМО»з, 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину) і культивували протягом 2-3 тижнів. Трансгенні пагони з великою кількістю коріння, підтверджені ПЛР, переносили в грунт у теплиці і вирощували з фотоперіодом 16/8 годин (світло/темрява) при 22 "С. Були одержані три підтверджені трансгенні рослини. Трансформовані рослини вирощували у теплиці, дозволяли їм самозапилюватися і збирали урожай насіння Т1. Склад жирних кислот ліпіду аналізували в пулах насіння Т1 від кожної із трансформованих рослин ТО, і знайшли присутність 2,8 95 ДПК і 7,2 95 ДГК в одній лінії, позначеній УТ 1-4, тоді як інша лінія, позначена /Т1-6, продемонструвала 2,6 956 ДПК.

Масло насіння з індивідуального насіння Т1 проаналізували щодо складу жирних кислот; частина даних наведена у Табл. 17. Декілька насінин Т1 продукували ДГК на рівні від 10 95 до близько 21 95 від загального вмісту жирних кислот, включаючи 1 1-4-А-13, УТ1-4-А-5 і УТ1-4-8- 13. Дивно і несподівано було знайдено, що деякі з насінин Т1 містили ДПК на рівнях від 10 95 до близько 18 95 від загального вмісту жирних кислот, за відсутності ДГК, що піддавалася б виявленню (« 0,1 95). Автори винаходу зробили висновок про те, що ген Д4-десатурази у Т-ДНК, вставленій в цих рослинах, інактивувався, можливо внаслідок спонтанної мутації, подібної до описаної у Прикладі 2. Насіння Т1 пророщували, і один котиледон, що з'являвся із кожної насінини, аналізували щодо складу жирних кислот в залишковій олії. Решту частини кожного саджанця зберігали і вирощували до стану зрілості, щоб одержати насіння 12.

Трансгенні рослини, що були гомозиготними по одиничних інсерціях Т-ДНК, були ідентифіковані і відібрані. Рослини однієї відібраної лінії, позначеної УТ1-4-17, містили одиничну інсерцію Т-ДНК і продукували ДГК і тільки низькі рівні ДПК, тоді як рослини із другої відібраної лінії, позначеної 9УТ1-4-34, також містили одиничну інсерцію Т-ДНК, але продукували ДПК без продукування ДГК. Авторами винаходу був зроблений висновок про те, що оригінальний трансформант містив дві окремих Т-ДНК, одна з яких забезпечувала продукування ДГК, а інша забезпечувала продукування ДПК без ДГК. Рослини В. |їшпсєа, що продукують ДГК у насінні, були схрещені з рослинами, що продукують ДПК у насінні. Потомство Е1 включало рослини, що були гетерозиготними за обома інсерціями Т-ДНК. У насінні цих рослин-нащадків спостерігалося продукування близько 20 95 ДГК і близько 6 95 ДПК, із загальним вмістом ДГК

ДПК 26 95. Рослини Е1 самозапилювалися, і очікувалося, що потомство, гомозиготне за обома інсерціями Т-ДНК, буде продукувати до 35 95 ДГК і ДПК.

Близько 18 95 ДПК спостерігалося в ліпіді пулу насіння потомства 13, позначеного УТ1-4-34- 11. Так само, близько 17,5 95 ДГК спостерігалося в ліпіді пулу насіння потомства ТЗ )Т1-4-17-20.

Склад жирних кислот пулу насіння 49Т1-4 Т1, одиничного насіння ТІ, пулу насіння 12, одиничного насіння 172 і пулу насіння Т3, одиничного насіння ТЗ наведений у Табл. 18-21. УТ1-4

ТЗ сегрегант ОТ-1-4-34-11 містив у пулі насіння ТЗ 18 95 ДПК, і одиничне насіння від даного конкретного сегреганту містило близько 26 95 ДПК, у кожному випадку як відсоток від загального вмісту жирних кислот.

Наступні параметри були обчислені для олії з насіння, що містило 17,9 956 ДПК: загальні насичені жирні кислоти, 6,8 9о, загальні мононенасичені жирні кислоти, 36,7 90; загальні поліненасичені жирні кислоти, 56,6 95, загальні б жирні кислоти, 7,1 90; нові 0б жирні кислоти, 0,4 95 з яких складала ГЛК; загальні 03 жирні кислоти, 46,5 95; нові 03 жирні кислоти, 24,0 90; співвідношення загальних 06 : загальних 03 жирних кислот, 6,5; співвідношення нових 06 : нових 03 жирних кислот, 60; ефективність перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією А12- десатурази, 61 9о; ефективність перетворення АЛК на СДК під дією Аб-десатурази, 51 90; ефективність перетворення СДК на кислоту ЕТК під дією Дб-елонгази, 90 95; ефективність

Зо перетворення ЕТК на ЕПК під дією Д5-десатурази, 87 до; ефективність перетворення ЕПК в ДПК під дією Д5-елонгази, 98 95.

Для одержання більшої кількості трансгенних рослин В. іппсеа з конструкцією тоавВ, трансформацію повторювали п'ять разів, і регенерували 16 передбачуваних трансгенних пагонів/саджанців. Провели аналіз насіння Т1, щоб визначити вміст ДПК і ДГК.

З метою одержання іншого насіння, що містить ДПК і не містить ДГК, генетична конструкція, що являла собою варіант конструкції тоав без гена Д4-десатурази, була одержана наступним чином. Були синтезовані два фрагменти ДНК, фрагмент ЕПК-ДПК 1 ії фрагмент ЕПК-ДРК 2 (Сепеагії, Німеччина) з придатними рестрикційними сайтами. Проміжний клонуючий вектор, руР3660, було одержано клонуванням фрагменту АайІ-Міш! фрагменту ЕПК-ДПК 1 у сайти Авсі-

Аайц вектора, позначеного як 1ІТАВНАНС сА?7-їад а6О рмМ5, причому даний вектор раніше застосовували при конструюванні (СА7-тоаВв, що містить касету Дб-десатурази. Далі одержували руРЗб6бЄЇ клонуванням фрагмента РітеІ-РерОМІ руРЗ6б6О у сайти РітеІ-РзроМіІ тоавВ. Після цього збирали вектор ДПК, руР3662 (Фіг. 4), шляхом клонування фрагменту ВвімумІ-

РЗрОМІ фрагменту ЗПК-ДПК 2 у сайти В5імм-г5роОМіІ руОРЗб661. Даний вектор містив гени біосинтезу жирних кислот, що кодують ферменти, які перетворюють олеїнову кислоту на ОРАюЗ і відповідну 0б жирну кислоту. Одержану в результаті конструкцію застосовували для трансформації В. |йипсєа і В. пари5. Одержано насіння потомства, що містить до 35 906 ДПК у загальному вмісті жирних кислот в ліпіді насіння.

При аналізі методом ЯМР олії, екстрагованої з насіння рослини, що продукує ДГК, щонайменше 95 95 спостережуваної ДГК було присутнє в положенні 5п-1,3 молекул ТАГ.

Таблиця 17

Склад жирних кислот в олії насіння із насіння Т1 В. їипсеа, трансформованих Т-ДНК зі СА?7. сі 3 | ст КВ сюієсєю смс за | с

Насіння ТР | СІ ЗА ОЇ СІ СІВ ВО ЄТЬЯ Ї сЗех | с5ах | С2О| ма | ЗК | ма | Ява | 253 25 | Б

Ме Кая З | Я АНІ) З гу З а З || в 5 З З з 3

РР-Я-А-В

РАЛІ

Іті--АЛА

ПАЛ

ТТН

ІТІ-3-Н-АЗ

ТТЕ-Я-В-Я

ІТР-а-Н-5

ТТ1-8-Н-я

Зразки олії з насіння додатково містили 0,1 95 С14:0; 0,1-0,2 96 С16:3; 0,0-0,1 95 кожної з

С20:1Д13, С20:306 і С20:406; 0,3-0,4 95 С22:0; не містили С22:11 і Сб22:206; містили 0,295

С24:0 і 0,2-0,4 у6 С2471.

Таблиця 18

Склад жирних кислот ліпіду з насіння Т1 (пул) В. їипсеа, трансформованого Т-ДНК з СА7-тоавВ.

Ліпіди додатково містили близько 0,1 95 кожної з 14:0, 16:3, 201413 і 16:22, а 221 не була виявлена. тож оч З Я ов З З В З Я З» З 3 Ж З 8 ен З З о ОДБ ЖЕ ж Пп 0 0 я 0 БЕ 7 5 В А я ВО вка Во пн

Насіння ТОМ Юм тії ал дя З як 31 БЕ 0: Нд ат 05 12 бі 0 дб 05 ба йо паб бл б 03 35 58 08 яз ха аз 3 БЕ 35 тя дя мя аз 35 1 03 ав о аб в 03 35 ат по в обл аз я ли зі-6 ак пд 23 373 35 Зо 04 3 плобо 14 03 Зб дб 07 03 пе бр бо 03 03 05 26 03

Таблиця 19

Склад жирних кислот олії з насіння Т1 (одиничного) В. їипсеа, трансформованого Т-ДНК із СА?7- тоаВ. . С16 , С181С18 С1815,А.. 1 С201| 02010201 0201022 С22

Й І 9 І І І б З І З б З З З З З

Ут1-4-А-1 15,0 10,2 | 2,7 |(23,5| 3,4 (17,01 0,7 |(24,8|10,712,0|111 1021 08|40|06124 | 9,9 ут1-4-А-2 4,3 10,3 | 2,6 |37,2| 3,2 (11,01 0,3 (22,11 0,710,911,3 102 11,4 |32|03194 | 00

Ут1-4-А-3 5,6 | 0,3 | 2,7 |20,8| 3,7 (16,01 0,6 (2441 0,712,010,9 (102 111 |45|07| З (114)

Ут1-4-А-4 4,6 | 0,4 | 2,8 |36,2| 3,4 |10,6| 0,3 (24,51 0,819,911,7 (02 10,3 |0510,0125 Д100

Ут1-4-А-Б 5,0 10,2 | 3,2 |20,3| 3,6 |13,7| 0,7 |25,910,712,010,9 102 11,3|144|151| 1,6 | 155)

Ут1-4-А-6 4,8 10,4 | 3,4 |37,9| 3,7 | 74 10,4 119,91 0,911,4 11,4 101 1 0811,9104 |13,9100

Ут1-4-А-7 5,6 10,3 | 3,0 |(26,2|14,018,91|0,3 26,61 0,611,811,01 0 11,81 37|1,31| 22 | 11,3)

Ут1-4-А-8 4,8 10,4 | 2,9 |40,3| 3,4 | 7,8 10,3 (2221 0,811,4 11,3 101 1 08|24|04 196 |00

Ут1-4-А-9 7,1 10,93 | 3,6 |17,7| 4,3 117,91 0,7 |(г31| о 12и110,8 102 11,51|361|0,8| 20 |11,9) тю |в ог аг роз за ев от оттов|тв|0в|02 17 тв ое| то 65 пово ов авівтв| лоти о4 лег ол те тя|02 05 16 09 вв 00 т |52 оз зорволо92 оз ста ов те оо 15 за ти | те ог това ог зомелат)ве ов свв ото оо 17 20 и | 20 те моб |в бя зи фвоо аю тв оз отт ол || тосол ов ся ов| та тв шо |в бя вія зє|во ов соя ол те 02 06 47 09200

У71-4-8-11 5,5 10,2 | 2,7 (18,91 4,0 117,61 0,8 |241|0,812,211,0102 12|46|0,9Ю| 22 | 11,5) у71-4-8-2 5,5 10,2 | 2,7 |20,2| 4,0 (14,31 0,5 (25,51 0,7 11,7 10,9 102 11,6|87|1,31| 22 | 8,5

Ут1-4-в-31 5,3 | 0,3 | 3,6 |34.1| 3,5 І35,010,619,3|10,8102|1,4104|06109|01 10 | 21 у71-4-8-4 5,3 10,3 | 31 |25,2| 3,6 (17,01 0,7 |2411 0,7 11,911,0102 10,8 |431|051| 23 | 7,8 у71-4-8-5 5,5 10,5 | 22 |ЗОЛ| 4,6 (10,21 0,5 |21,7| 0,611,4 111102 109124 |05 бло

У71-4-8-6 5,6 | 0,3 | 2,5 |19,5| 3,8 (1521 0,5 |27,7|0,612110,9 102 111137 |061|53 ТМ)

У71-4-8-7 5,9 10,5 | 2,0 (29,91 4,0 (11,21 0,3 |26,21 0,6 111,5 1,4 102 103104 |0,0 | 41 | 01 у71-4-8-8 6,2 10,5 | 1,9 |33,1| 4,0 130,01 0,5 |12,7| 0,610,311,3104 114109 |01144 | 00

Ут1-42-в-914,9| 20,2 | 3,4 |24,6| 3,0 118,51 0,3 26,2|10,8|11,3| 11 102|2,0|15510,610,8 | 52 тю 52 оз гл воло оо ов зов ол тв то|02 17 49 11 | 30 Гог по ф|авоог зорраи| зл ви ов свв ол тв т2|02 тв 45 ов те 96 т |50 02 ав ев зя4 ов ов ово ов зи 102 09 55 09/35 17

У11-4-8- моб |ви ов зи фрвв| за вл от ово ов|тв|т2|02 09 25 04/29 92 т |веровігл вв ат о ов ра ол |2л |09|о2 от ва | 19 |в | 85

Зразки олії з насіння додатково містили 0,1 956 С14:0; 0,1-0,2 956 С16:3; по 0,0-0,1 95 кожної з

С20:1А13, С20:306 і С20:406; 0,3-0,4 95 22:00; не містили С2211 і С22:206; містили 0,295

С24:0 і 0,2-0,4965 С2471.

Таблиця 20

Склад жирних кислот олії з одиничного насіння Та2 В. |їипсеа, трансформованого Т-ДНК з СА?7- таавВ. Ліпіди додатково містили 0,1-0,2 95 С16:149, С16:3 і С20:206, 0,5-0,6 956 С20:0, не містили

С20:306, С20:406 і С22:206 5-3 в 5 34453

Ж ЖЕ ЕЕ ВЕ ВЕ А В Вп А А Я НЯ А я

Навня | юю

В я 32 40 30 55 оз с70 47 ія 23 п: 85 бо ві 03 06 0703 3 по 53 16 354 35 51 03 М. п 13 б? 041 3 б 03 бі 08 то 83 Ще 00

Таблиця 21

Склад жирних кислот олії з одиничного насіння ТЗ В. їипсеа, трансформованого Т-ДНК з СА?7- тоавВ. Насіння додатково містило по 0,1-0,2 95 кожної з С16:3, С20:1А13, С20:206. Не виявлені

С20:306, С20:406, С22:206, С22:506 і С22:603. - - ш- от - торт - р а че р ще БЕонЗ -к ще -к ж ще - ще с - о ех я 5 я

І 55 па о я я 3 А 150 07 10 5 1105 15 ва 3 15 п 115 45 Я Зб я зб 53 0 155 07 о і аа ооо ізо

ІЗ бЯ 25 31 Я ло 13 07 3 ІА 11 о 16 05 03 14 0505 4 ІЯ 04 35 3535 55 53 04 155 012 5 1003 1 0 0 15 0514 5 Іа оо о 30 5 0307 ВЕ 13 115 20051505 0312043 5 Іа ба 50 І зл 5 а 105 071113 13 01003130 10 т |За 05 32 2985 40 5 па 15 0 17 13 15 05 15 б 3 145235 ж 52 05 37 345 41 45 03 133 10614 15 15 04 15 05 03 19 05 1154 5 55 05 34 534 5 а ох та 0 7 ІЗ 1 Я 10513 аю 1БІЯбБ ся Зо 355 я 51 03 178 05 0 тв ї4 о 1 04 3 15 па 16

І ІЯ5 04 31 17 53 в пз 1505 07 п І: 15 0 14 035 03 15 85 237

ІЗ 05 оз База ов їі 15 вав 1х|5ї 04 35 805 35 52 03 151 0 1015 1405 14 04 0 1405135

І І1Я45 0 З 36 57 55 03 155 0 15 15 11 03 Б ох 1 1 155 05 35 56 я а 0 ЗО а 185 05 10010015 1752 ва 25 075 37 53 05 153 05 17 15 10 05 15 07 03 1757 за бе 25 7 41 5 05 18 05 15 13 14 05 14 06013641 15 |Іба 0 27 5 35 а 03 161 о 1 і опо ота ооо

ЗІ хх 3 353 35 57 ВО І 0 Ов ів 17 05 3 05015 05 15

Приклад 9. Подальший аналіз трансформованих рослин і польові випробування

Гібридизаційний аналіз методом саузерн-блотингу проводили для відібраних рослин Т2 В. 5 пари5, трансформованих Т-ДНК із конструкції ЗОА7-тоав. ДНК, екстраговану із зразків тканини рослини, розщеплювали декількома рестрикційними ферментами для гібридизаційного аналізу методом саузерн-блотингу. Радіоактивний зонд, що відповідав частині Т-ДНК, гібридизували з плямами, які промивали в суворих умовах, і плями приводили в контакт із плівкою, щоб знайти смуги гібридизації. Деякі із зразків продемонстрували одиничні смуги гібридизації для кожної із сумішей після розщеплення рестрикційними ферментами, що відповідало одиничним інсерціям

Т-ДНК у рослинах, тоді як інші продемонстрували дві смуги, а наступні знову продемонстрували декілька смуг Т-ДНК, що відповідало 4-6 інсерціям. Кількість смуг гібридизації, спостережуваних в саузерн-блотинг аналізі, добре співвідносилася із кількістю копій Т-ДНК у трансгенних рослинах, визначеною методом цифрової ПЛР, до кількості копій близько З або 4. При кількості копій, більшій, ніж близько 5, метод цифрової ПЛР був менш надійним.

Деякі з відібраних ліній використовували як донори пилку при схрещуванні із серіями з близько 30 різних сортів В. париб5 із різним фоновим генотипом. Подальші зворотне схрещування здійснювали для визначення того, чи є множинні інсерції Т-ДНК генетично пов'язаними, чи ні, і дозволити сегрегацію генетично не пов'язаних трансгенних локусів. Таким чином були відібрані лінії, що містять одиничні трансгенні локуси.

Однопраймерні реакції ПЛР проводили у трансгенних лініях із застосуванням праймерів, суміжних із лівими і правими межами Т-ДНК, і будь-які лінії, що демонстрували присутність обернених повторів Т-ДНК, відкидали.

Деяка кількість трансгенних ліній продемонструвала затримку цвітіння, тоді як у інших було знижено утворення насіння і, таким чином, знижений вихід насіння на рослину після вирощування в теплиці, що узгоджувалося із зниженою чоловічою або жіночою фертильністю.

Досліджували морфологію квітки у цих рослинах і спостерігали, що в деяких випадках розкриття насіннєвих коробочок і вивільнення пилку із пильовиків затримувалося таким чином, що рильця товкачика подовжувалися до розкриття насіннєвих коробочок і вивільнення пилку, таким чином віддаляючи пильовики від рилець. Повна фертильність могла б бути відновлена штучним запиленням. Крім того, визначали життєздатність пилку у момент розкриття насіннєвих коробочок і вивільнення пилку за допомогою фарбування фарбниками для визначення життєздатності ФДА і ПИ (Приклад 1), і було показано, що вона знижена у деяких лініях, тоді як у більшості трансгенних ліній життєздатність пилку становила близько 100 95 від життєздатності в контрольних рослинах дикого типу. Як подальший аналіз для виявлення можливої причини зменшення виходу насіння з деяких рослин, аналізували вміст і склад жирних кислот у квіткових бруньках, включаючи пильовики і рильця/товкачики деяких рослин ТЗ і Т4. ДГК не була знайдена в екстрагованих ліпідах, вказуючи на те, що гени у генетичній конструкції не експресувалися в квіткових бруньках у процесі розвитку рослини, і виключаючи це як причину зниженого виходу насіння.

Вміст олії вимірювали методом ЯМР, і визначали рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот для насіння 12. Трансгенні лінії, що містили менш ніж 6 95 ДГК, відкидали. Кількість копій

Т-ДНК у зразках листя рослин поколінь 11, 12 ії ТЗ визначали методом цифрової ПЛР (Приклад 1).

Відібрані партії насіння ТЗ і Т4 висівали у полі на двох ділянках у Вікторії, Австралія, кожну у рядах завдовжки 10 м із щільністю висіву 10 насінин/м. Відібрані партії насіння включали одержану із В003-5-14 лінію, яка демонструє рівні ДГК в пулі насіння близько 8-11 95 і рівні ДГК для індивідуального насіння Т2 до близько 19 95, із кількістю копій Т-ДНК З у рослині ТО. Крім того, відібрані партії насіння включали одержані із В0050-27 лінії, які продемонстрували рівні

ДГК у насінні Т2 понад 20 9б, і кількість копій Т-ДНК 1 або 2 у рослинах 12. Насіння, висіяне в полі, проростало і давало пагони із такою ж швидкістю, що і насіння дикого типу. Рослини, вирощені з більшості, але не всіх висіяних партій насіння, були фенотипово нормальними, наприклад, демонстрували морфологію, швидкість росту, висоту рослин, чоловічу і жіночу фертильність, життєздатність пилку (100 95), утворення насіння, розмір і морфологію стручків, які були по суті такими ж, як у контрольних рослин дикого типу, вирощених у таких же умовах.

Вихід насіння на рослину був подібний до виходу для контрольних рослин дикого типу,

Зо вирощених у таких же умовах. Інші зразки насіння висівали на великих площах для масового виробництва відібраних трансгенних ліній. Загальний вміст ДГК в урожаї зібраного насіння становив щонайменше 30 мг/г насіння.

Кваліфікованим фахівцям в даній галузі техніки буде зрозуміло, що численні варіації та/або модифікації винаходу можуть бути здійснені, як розкрито в конкретних варіантах, без відходу від духу або контексту винаходу в його широкому значенні. Представлені варіанти, таким чином, слід розглядати в усіх відношеннях як ілюстративні, але не обмежуючі.

Будь-яке обговорення документів, дій, матеріалів, пристроїв, виробів, тощо, яке включено до цього документу, призначене виключно для цілей забезпечення контексту цього винаходу. Не слід робити припущення, що будь-які або всі ці питання утворюють частину відомого рівня техніки або являли собою загальнодоступне знання в галузі техніки, до якої відноситься це винахід, в тому вигляді, в якому воно існувало до дати пріоритету кожного з пунктів формули цієї заявки.

ПОСИЛАННЯ

Арбасді еї а!. (2004) Ріапі Сеї! 16: 2734-2748.

АРррбої! вї а!. (1998) бсієпсе 282:2012-2018.

Адаба еї а!. (2004) Магіпе Віоїесппої. (ММ) 6:251-261.

АЇмаге? єї а!. (2000) Тнеог Аррі Сепеї 100:319-327.

Агтьгиві єї а!. (2004) Зсієпсе 306:79-86.

Вайтівіп єї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 225:459-467.

Вайтівіп еї а. (1992) Ріапі у). 2:233-239.

Веацаоіп еї а!. (2000) Ргос. Маї!. Асад. бсі. 0О.5.А. 97:6421-6426.

Веїїде еї а). (2013) Ріапі Сеї! Тівв Огдап Сиїї. 113:543-553.

Вегбетгісн. єї аї. (1998) Ріапі Мої. Вісої. 36:297-306.

Вгошп еї а. (1998) Ріапі 9. 13:201-210.

Вгомлп еї аї. (2002) Віоспет .). 364:795-805.

Спап еї аї. (2006) Майте Віоїесппоіоду 28:951-956.

СНнартаг еї а!. (2004) Сеп. Оєм. 18:1179-1186.

СнНеп еї а!. (2004) Тне Ріапі Сеї! 16:1302-1313.

Снепа еї аї. (1996) Ріапі Сеї! Вер. 15:653-657. 60 Снепа єї аї. (2010) Тгапздепіс Вез 19: 221-229.

Спо еї а. (1999а) . Вісі. Спет. 274:471-477.

Сно еї а!. (199960) У. Віої. Снет. 274:37335-37339.

СнНтгівііе (1982) у. Гіріа Нев. 23:11072-1075.

Ратиае єї аї. (2006). Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 103: 9446-9451.

Оепіс апа М/віззтап (2007) Сеї! 130:663-677.

Ботегаце евї а. (2002) Єиг. У. Віоспет. 269:4105-4113.

Ротегаце еї аї. (2003) 9. Вісі. Спет. 278: 35115-35126.

Ботегаце евї а!. (2005) Віоспет. .). 1 389: 483-490.

Рипоуеєг еї а. (2004) Те Ріапі Сеї! 16:11235-1250.

ЕПегвіготє еї аї. (1996) Ріапі Мо!. Вісої. 32:1019-1027.

Сате? єї а!. (2003) Роса Вез Іпіегпайопаї! 36: 721-727.

Сагсіа-Магоїй еї а. (2002) Ііріав 37:417-426.

СіїКе еї а!. (1998) Ріапі 9. 15:39-48.

Нагауата (1998). Тгтепаз Віоїтесппо!. 16: 76-82.

Назвіїпоз єї а)ї. (2001) Ргос. Майї). Асад. 5сі. 0О.5.А. 98:14304-14309.

Ніпснеєе еї а!. (1988) ВіотесппоІоду 6:915-922.

Нойтанпт есеї аї. (2008) У Віої. Снет. 283:22352-22362.

Нопа ев! а!. (200г2а) Ііріаз 37:863-868.

Ногідисні єї а!. (1998) Ріапі СеїІ РНузіої. 39:540-544.

Ниапоа еї а!. (1999) Ііріав 34:649-659.

Іпадакі еї а. (2002) Віовсі. Віоїтесппої. Віоспет. 66:613-621.

Ка|Кама еї аї. (2004) Ріапі Мої. Віої. 54:335-52.

Каїїкама єї а!. (2006) РЕВ5 І ен 580:149-154.

Кегез7ї вї аї. (2007) Маїшге Ргоїос 2:948-952.

Кіт еї а. (2005) Ріапі СеїІ. 2005 1073-89.

Кпиїгоп еї а. (1998) 9. Віо! Спет. 273:29360-6.

Коїеїгко еї а!. (1988) Ат. у). Сіїп. Миїк. 47:954-959

Ко?лівї еї а. (1996) Ріапі Мої. Віої. 32:393-405.

Ї аззпег (1995) Ріапі Рпувзіої. 109:1389-94.

Ї еопага еїа!. (2000) Віоспет. 9. 347:719-724.

Ї еопага еї аї. (20005) Віоспет. 9. 350:765-770.

Ї еопага еї а!. (2002) ІПіріаз 37:733-740.

Ї емувеу єї аї. (2007) Ріапі 9. 50:240-252.

Г о вї а. (2003) Сепоте Нез. 13:455-466.

Ги апа Кап (2008) Ріапі! Сеї! Нер. 27:273-8.

Маїогу еї а!. (2002) Маї. Віоїесп. 20:622-625.

Магаподопі еї а!. (1995) Тгепав іп Роса 5сі. Тесппої. 6: 329-335.

Меезаруоа3зик еї аї. (2007) У Віої Снет 282: 20191-20199.

Мепа еї аї. (2008) 9. Сеп. Мігої. 89:2349-2358.

Меуєг єї а!. (2003) Віоспет. 42:9779-9788.

Меуег еї а). (2004) І іріа Ве 45:1899-1909.

Міснає!5оп еї аї. (1998а) у. Віої. Снет. 273:19055-19059.

Міснає!зоп вї аї. (199860) ЕРЕВЗ І еїї. 439:215-218.

Митгазніде апа 5Косяд (1962) Рпузіоіодіа Ріапіагит 15:473-497.

Марієг еї а. (1998) Віоспет. 9. 330:611-614.

Меєаієтап апа УУипз5сй (1970) 9. Мої. Віої. 48:443-453.

РаїКегї-Ватез еї а!. (2000) Ргос. Маї). Асад. осі. ОБА 97:8284-8289.

Регеїга єї а. (2004а) Віоснет. У). 378:665-671.

Регеїга єї а!. (20045) Віоспет. 9. 384:357-366.

Реттіп еї аї. (2000) Мої! Вгеєа 6:345-352.

Реїтгіє еї а. (2010а) Меїар. Епод. 12:233-240.

Реїтгіє еї а. (20100) Ріапі Меїносдвз 11:6:8.

Реїніє еї а!. (2012) Ттапздепіс Нев. 21:139-147.

Роїеп?ла ві а!. (2004) Іп Міїго Сеї! Оєм ВіоІ-РіІапі 40:1-22.

ОЇ еї а. (2002) РЕВЗ І ейї. 510:159-165.

ОЇ еї а. (2004) Маї. Віоїесн. 22: 739-745.

Ом еї а!. (2001) 9. Віої. Снет. 276:31561-31566.

Ведау апа Тротазх (1996) Маї. Віоїесі. 14:639-642.

Ведау еї а. (1993) Ріапі Мої. Вісі. 22:293-300. 60 Вобет еї а!. (2005) Рипс. Ріапі Віої. 32:473-479.

Вобет еї аї. (2009) Маїпе Віоїесйп 11:410-418.

Виї2-І оре? вії а!. (2012) Ттапздепіс Нев. 21:139-147. зага еї аї. (2006) Ріапі Рпузіо!. 141:1533-1543. зЗаїю єї а. (2000) Єик. У. Віоспет. 267:1813-1818. зЗакигтадапі єї а. (1999) Сепе 238:445-453. зай єї а!. (2004) Стор 5сі. 44: 646-652. зЗакигадапі єї аї!. (2005) Аррі. Містобріої!. Віоїеснпо!. 66:648-654.

Зауапома єї а!. (2006) У Віої Снет 281: 36533-36541.

Зауапома єї а!. (1997) Ргос. Майї). Асад. 5сі. 0О.5.А. 94:4211-4216.

Зауапома єї а. (2003) РЕВ5 І ейї. 542:100-104.

Зауапома єї а!. (2006) Ріапіа 224:1269-1277.

Зауапома вї а!. (2007) Ріапі Рнузіо! 144:455-467.

ЗПпиКІа еї а. (2002) 9. Атег. ОЇЇ Спет. бос. 79:965-969. зіпой еїаї. (2005) Сит. Оріп. іп Ріапі Віої!. 8:197-203. зЗрегапла еї а!. (2012) Ргосев5 Віоспетівігу (Іп Ргев5). зЗретпінпа єї аї. (2000) Єиг. 9. Віоспет. 267:3801-3811. зЗрепінпа єї аї. (2001) Агсн. Віоспт. Віорпуз. 388:293-8.

Зргеснег вї а!. (1995) У). ІПіріа Ве. 36:2471-2477. зруспаїа єї аї. (1997) Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. 0.5.А. 94:1142-1147.

Топоп єї а. (2003) РЕВЗ5 І еїї. 553:440-444.

Ткгашймувїп (2001) Еигореап .. І іріа 5сі. апа Тесн. 103:45-55.

Тмгаїк (2000) 9. Сеї! Віо!. 149:707-718.

Мепедаз-Саїегоп еї а!. (2010) Ргсоад. І ірід Бевз. 49:108-119.

Моіппеї еї а. (2003) Ріапі У. 33:949-956. маїїв апа Вгому5е (1999) Агсп. Віоспет. Віорпу5. 365:307-316.

Манз апа Вгом/зе (19996) Агсп. Віоспет. Віорпувз. 362:175-182.

Муеї55 еї аї. (2003) Іпі. У. Мей. Містобвіо!. 293:95:106.

Мепа єї а!., (2004) Ріапі Моіесшаг" Віоїоду Неропег 22:289-300.

М/піїпеу ета. (2003) Ріапіа 217:983-992.

Зо моса (2009) Ріапі Віоїтеснпої у. 7:914-24.

Ми еї а. (2005) Маї. Віоїеєсй. 23:1013-1017.

Уапа еї а. (2003) Ріапіа 216:597-603. 2гапк еї аї. (2002) Ріапі 9. 31:255-268. -7апк еїаї. (2005) УО 2005/012316 7Ппапяд єї а. (2004) РЕВЗ5 І еїї. 556:81-85. «папа еїаї. (2006) 20:3255-3268. «папа еїаї. (2007) РЕВ5 І енег5 581: 315-319. «папа еї а. (2008) Уеаві 25: 21-27. 2 пои еї а. (2007) Рпуюснет. 68:785-796. 2пои еї а. (2008) Інзесі Мої Віо! 17: 667-676. 7ои еї а. (1997) Ріапі СеїІ. 9:909-23.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 Мизеєей Рсу Іа сгаїп Ккезеагсй апйа ремеІортепе Согрогатіоп

Соттопмеа!сн 5сіепеіТіс апа Іпдизегіа! Кезеагсн

Оогдапізаєтоп «1205 ЛІПІД, ЩО МІСТИТЬ ДОКОЗАПЕНТАЄНОВУ КИСЛОТУ «1305 517416 «1505 ду 2014902471 «1515 2014-06-27 «1505 15 14/575,756 «1515 2014-12-18 «1505 АК 20140104761 «1515 2014-12-18 «1505 РСТ/АШ2014/050433 «1515 2014-12-18 60 «1605 58 «1705 РакепсІп версія 3.5 «2105» 1 «2115 21527

«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» рІРЗ416-бА7 нуклеотидна послідовність. хА0О0» 1 тІсСстухтаде аддсаєсдсаса тасааастудда сдаасддата аасстттсса сдссстттта 60 аасаєсссдає хтассстаата аасдсесте кстсттаддас ссасссдсса ататассста 120 тІсааасаста ахсадсссааа стдааддсда дааасдасаа єстастадса даєстсссад 180 тІсасдасдеї асаааасдда сдссссасда ааадсетдса дссасссдає стадсаасат 240 адаєсдасасс дсдсасдата ассттаєсста дЕстасдсдс татаєссєтттує сесстатсдс 300 дсаєсстааасд тасаасстодсуд ддастстаає састааааасс сасстсатаа ахсаасдесат 360 дсаєтасаєд тааєсстаєса сасдсттаас дсаасссаас адаааєтата сдасаатсат 420 сасаадассуд дсаасаддає ссаассттаа дааастттає сдссааатує стдаасдаєс 480 дасдсдсстс асттадсдадс стсстсадсс те ссдєтаа сдсадсадчід стдесссасс 540 ххтассааддас стададаааді адссттссаа дсассасаді аадададсас сетдасадетд 600 адсссссаст хсттадсдаа аддаасдаає сесстдстаа сстсаддстд кстдааєтда 660 дасатаєсад ддааададаєсд дсддасаасс сдасадесаа ддсаєсссає аадссадес 720 асдстаєсстс тадааддаєс дасаєсаасуд дсасдаєсаа садсасадея аасссаадаа 780 аддсдасетає садасддаас аасадддадд сдадсаєдад аадсададаа дседадсдааа 840 аддсасаєсує аадсдаєсса дітссдааа дсдаассасс адсаадсаас аддссаадад 900 тасссадсад саадасттдає аасадсадес стаасаасаї дадааасдад саєссаадаа 960 дсстстсає адессстсстс асддадаастї тадасстаддає ддадаасдса дасссадааа 1020 дстітдаасаа даадіссада дасаасадда асдааадсісс аадстсдаад сстадсссаа 1080 дсестадада ассстстадд хстудєстаєсс ссаасадсад тдсдаадаа адссасадса 1140 ддадсддасає саадаєссає ассдєуаєста асстссдад ддадасадсатд дсдсетсдста 1200 тасасстдудє сссасаєстс ассадаадса дааадсссда асссасаадї сатадсстда 1260 адсстсттдДс ссасдсааас адаєссддса адададесає дсессассстс атдастдаасс 1320 сасссасаєс хтадсІссдаа дааадсассуд тааасаасад аадсааєсдає адддсаєсса 1380 дсдасасасаа дадсадсссс аададсдааї дсадсаадаа дсісдадаад хстдсаадсс 1440

Зо асасдддаєда садааддсес даадааєсса сстстстІсаа дстсадсасд ссасстадсад 1500 ааассстсаа дсасаддадс ассстсадас стсадаєстстї сдасстсадс аддасстадаа 1560 ддсааадссс хаадсаєстс ссаадсстсуд ададаасдса тдсддаассс сстсдааадсс 1620 тсадсадсає садсассадїі десадсаадс асдсадаада ссасадаєсс ассаддатас 1680 тсдаадссад ссасаєсдсра стсаасдісс хсаастстаа сссатстаді стсдааадта 1740 дсадсаадсї саєсдаддсес аададсстса адаєсаасад дадсадсада адсаєсстта 1800 дсассаадад сстісадсада адаєссадас стдудсаадсд дадаєсстадд адаадаєссет 1860 ссаєссадссї хтаддадддса сасддсасдд саассдсааа тдсаассдвта асдсстаєста 1920 тдссуєсд стдссддасаа стдДссдсааа адаєсстсає дсасаєсьсь аассттаєт 1980 дсассдаєда десссдадас дадсааадад сдаадсддає дадссааєсе асаддстата 2040 ааддадаєссє дсасддсдає сасдєдсаасє аасдсаєсдса сдасатдаєдає сосасоєсоа 2100 тастуаєсдада дадаадстстї хтаддасдасссд аадддадсда саадсддсда адааааасаа 2160 тЕсСтІссдсдод стдасатдста стдсдсаасді дсадсстаасд єсстддсатда дсаєсттата 2220 аасдаєсстє ссстаааааса аддсааааас стстаастссає аааассаааава. ааааааасдчи 2280 тсастаадї ддасссаааад дддасдадас хтадсадаєсд дстдаєсддає єессатоатас 2340 садааддсес ассстаєстад ссдааадесуд ааастттуєс ссстастсаа ктссстадета 2400 тасааасдса сдсастасдса асдсдсасаа аасдсадстас стстаааєсдаст аддаатдаєт 2460 стЕсдадассуд асдададаєуд ддадсадаас тааадаєдасє дасаєсаасса адаасдаатт 2520 тдаааддссс ттаддаесєсда ассстаєтссд адаасдєсс судссааадає адсдасдатси 2580 тсдаассааа даааасаєсї аааааваєссад тасссддєта сдуіссатдса аатадааадс 2640 ддаєстаддає стдаєссдсраа сссадассс ааададесес ссаадаєсса ассстддаста 2700 тадасасаааас тасааасааст ахсассстстада стасстддсс ссаастааас тессастсатє 2760 тасссастда ддассададаа садасссдсд аасааасаса тссссдадаа ахкастсатда 2820 тсссатааєі адссададдд тасдссаасс адаєстаада асасасаєюсс сстсааасттт 2880 таастдсасає дсаассатад ссстадсасаа сссааааата асдсадсає ааадасадаа 2940 асстдсадас єс сду сдєсаааада адастаадес стастасдсаса стттастеета 3000 адсддаааас сдаааєсссс сассдаааста стасдааєсса дсасасасає єсстдсаатд 3060 тастаєссстд стаєсстсддс аастттсаді ддастастас сстасттасаа тдтоататдда 3120 тасаєсдадеє сдадсасаса сасдсстааа тдсасдсес дсаааасдса асддассаса 3180 ааададдаєс сасасаааста сасстсастад стксстссаєт татттсссда сасааасада 3240 60 дсасссстаса асаасстасса асаасаасаа асаасаааса асастасаасє сасаєстаса 3300 ассассатас сатддааєссс дсссадсстс тд тдстає ддасссаадад саатасдста 3360 стассдасас хдєкдссдсе сстдстаєст ксестдстас сдаєсестаєс ддадасддддас 3420 тсаадсстає стстсстдсе астааддаст хтдсстсттЯДс тдадестсст асасстстса 3480 тссттЕСТтт Є дсттдсттас ттсдстаєсд єсддаєстдд астсадаєсстас адааадаєть 3540 65 тссстадаас сдсдааддда саадаєссає сс тдаа ддстсттатд сттдстсаса 3600 асакадасссст хтассддастє кстсттстаса тасдсстсаа дсетдсдсас даддсетасад 3660 тсаасаадса стсттстдод ддааасдссс асаассстдс їсааастдад ахаддстаадд 3720 тсасстдуддає сесстасдсд адсаадаєсї асдадессає ддасасстсс ахсатдстсс 3780 тсаадддааа тдісаассад деЕстадстесс ссасдстста ссассасдда стасстста 3840 70 даасстдудсд даєдаєсаст сасдстдссс стддсддаєда кдсттастсс тстдстдсес 3900 тсаастсттд ддасесасдсд хтдасасдсаса сстастаєсе татддастдсс дкастесста 3960 аддасдадаа аасстаадада аадсассссї дасддддаад асассттасс сааатдсада 4020 тассссадее сессаєсдаас стсстссада стадестасст стстастст хсаєсстсстт 4080 ассстаадес хтассдсссад стсстсдсду касасасддає тастстестс атдсетесса 4140 дааастсста стасаєсдаад сассасдста дсаадсдатд аддасдсдссд адссдссдес 4200 асдсдасада ссдааддаад ааадсдсаас аадасдасес ссастасссд ассдстадта 4260 ассуєсаєсд ссасасасаа саасдісаєс стсасааст тастсдсаатд сатдаєдааас 4320 тасаасасає таассстасті тдссатаєсда саасастстс сссатттааа астсттадсса 4380 ассстааадає асаадаєссстї стааасдаєсї ааааааааса стасстасааає ссаатсастс 4440 стастаасаа ассассаассї ассасстсаєс даєсаааааа асасттатас хтаассттадес 4500 тдаасадаає аассадаєсс хтадестсаєс сссттттааа ссаасттаде ааасаєтьс 4560 теЕсеЕстаатт тсасдаадеї аадесестас сттдссста ааааадааєсд есатаадатє 4620 дссастдссад аасаєсстадссї асасдісаса сасадсасдс адссдсддад аастдеєсе 4680 стссдссаст хтуєсастссс тІсааасасс таададстес тстстсасад сасасасата 4740 саассасатуд сдсдсасдса стассасасдд сдассдссає дсааасстсс тттатадсст 4800 асаааєссаас хсасссдст састстсттас ссааассааа астсаєссдає асааасаада 4860 тсааааасає асасдаддає стссстасаас аастассаас аасаасааас аасааасаас 4920 ассасааєста сасстстасаас стассатасса тдсстссаад ддастсттас ксттатдста 4980 стЕсстссттсС тудстсаастї сасдаадесуд асастсстса ададсасдас аадааададс 5040 тстдесассдд адасадддсє тасдаєтдаєса ссаасттсдї стаададасас сстдасддаа 5100 адаєсаєсдс сстассаадеї ддаассдаєд стассдаєдс сстасаадсад ссссатдста 5160 дасєсстдсстаа ддссдасаад асдсестаадеі стстесстес тсассстуєс сасаадддах 5220 астстссаад аадддассдає стстаєссдстуд асссссаада дессассаад саастсдада 5280 стдадддаає деЕссдадсся хстсттсстс асдстдсеста садасттдсе даддаєсаєсад 5340 стасдсасає хдстдусєдсе дсестстаєссі ддсасддата састессудсс ддаассдста 5400 тастсддаді стдасесаддда адаєсдасддає ддсестасдса сдадддасдда саттастстс 5460 тсастддааа састдстссс дасададста хссаадсстдс ссастасада сеттддасата 5520 даасдєстдд хдссддасду судсаассадс асаасаадса ссастдстаст сстсаааадс 5580 тісадсасда тастдаєстє дасассстсс стстсдстдс стссатдад адаассаста 5640

Зо стааддетаа дістсстдсе асдааддсес дадасеесстає дсаадстаад сттттсдсес 5700 стдЕсассас сексу дсестсддає ддсадсесста сстссассст адасасатдс 5760 тсаддасстаа дсастасдає дадссттдста хтдстсддаасї садатасдда сттастадає 5820 ассттдстдс таастасддас дстддастасд сеЕстсдсету стасстестє тсасдессадс 5880 тсддадстає дсасаєстсс тдсаасттсд стдесестса тастсасстс сстастаєта 5940 адсстаасда дсасдстастї куддуєсдаді асдстдсстаа ссасастаст аастдстс 6000 саєссттддсд дсдсдаєсдуд сддасдесє асстсааста ссадаєсдад сассасстт 6060 асссттстає дсстсааєтіс адасассста адаєссдстсс тададссаад садсееесса 6120 адаадсасдд асстссастас дасдєсадад дасассссда ддастасддсес дасасьсса 6180 стаассттда саасдесдсес састдстсстуд адаадаааас дсадсаасда дассдессаа 6240 асасссддса асааадеесс сстаадаєсда ассстуєсдс сддссттдсуд асдаєсаєса 6300 тасаассестї деЕсдаассас деЕсаадсасд таасаастаа сатдсаастдс асдасдттат 6360 тсасдадаєсд дасесесасд ассададсісс сдсаастата састтаастас дсдатадааа 6420 асаааасата дсдсдсааас таддасааас стассдсдсдс дакдєсаєст асдстастад 6480 ассддєсдає саааааєссс аастасаєтс даєстааєс адсссддсає сдадсаааас 6540 ааасссдаас сааассаааа стасааасата тадесееесає асастасдсст ссаадасте 6600 тсасадааєс сеЕстстаааа аатасстада аасасссдсд астстестдд сатдсаататє 6660 тЕсдссааає асдаадсдсе ссастестає саастттааа стаастддаєстд хтасдаєсаст 6720 тест тассаа дедесастаа аасдсдссаа сс сттссатату сататдісаа 6780 аасстассаа аассстстата сассттс даасссдаад сдаааєссссуд асаасстааа 6840 ассааасада асасаєссає ассстаддсає сасаєсдаєс сстасастста астастааатє 6900 тсддассааст стсдааадсує асаєсаасда аааастадсс ааасдастаа аатааатсааа 6960 тассатуаєуає сассаадааа асксстсстаєї аадаастаєсє саасадаєса хтататетота 7020 аааааааєса асстсстаста асасасатає сстасттаєса ааааєссдас ааадсаадахє 7080 тТаааасааста тссасстаас аааавааааа ссадаааатд стдаааассс ддсаааасса 7140 аассаассса аассдастата детддессдуд сесдаєсссд асасааассуд аассаастсад 7200 дессасстдс асссстаасс асаасадсес саасаєссса адасаєсаєс аадссаасди 7260 тассаасаєс стддаааєс сдсааааєсда ассаадсста тастддастдста ахсасдаасти 7320 ааааадсадссї сдасдсдуаєд дсаасаєсдса асссасссда єсстааааааа ахсассссаад 7380 тассаасаає теЕстдстадд аадааддеста дстасдаєсо асадсааадс садаастасаа 7440 бо адаассасаа адсдаєсдаа дсісдаааста стасдааддаа сааатаєссс сааааааата 7500 сдсааєсдасі хтуддаасаааа дааадсдаста тассесдс сстсааасаа дсатсссстс 7560 тааадаасдд садесессст стдсасдстаа стастасдсе сссттсЯдаста сааааастсе 7620 ддасстастає сдддаастсс ссстдаааає адсдасадаа сссасасдад сасдєдсее 7680 ссаєтстаасс сстааааасса адааасастас астасасааса тсссассадс стстстстст 7740 65 теЕсстаєстасд деЕсаасдаст таааасасат сттасттаєсс сатссттаас асстадсадс 7800 дЕстстастас дасстсаєсуд ассассастї саааассатудд садастдстд стдсссстда 7860 адстддсаєс ддстаддссд ддєдссдсас тадассссддаа ддессстадс дасттуєста 7920 дассдасддд ассасстстс аасттсстдс тастдЕссст дстдстддає діесстдсстс 7980 асстддссда ссдсасдстс садссссстуд сасдсдсаст сдстсстІсаа стдсттаада 8040 70 тсассдсадс адстаєссдаа дсдстддссс хєтдссстс стссасоддсс тадстасад 8100 тадсадстдс сдссдссстї стддастесо ссссасадда ассдссдаає аасссдатад 8160 аассасасда дсасдідсес ссасстстаєссї сааааассаа дааасастаса саасаєтесса 8220 тсадсстстс ссСестстстс ЄСЕСЕСТСтсС ЄСЕСТСТСтС тсСтСтСтсСтсС хСтСТСТЯТа 8280 тсасадстує сасастаастї тааавасасає хсасстсаєтт астастаєта стасссатсс 8340 тсаасасста дсадсдссте сдсасдаєст сатаассдаєт сассссттІса тсаддасатсс 8400 тТсаддстсса стссаасдї деЕсдсадстста сддаасастдє асасассатс ахадтстса 8460 асдаастддс аадаєстсса адсссссаа аддсстаассс асастадаєестс ассдататах 8520 стадасадсдсе стсссастаас тест сдатд састсддасрад сттстстадс асддасадаат 8580 дддасссттд ааасдсадсуд асддадсаса сдадесссда сдасдссатд даадаєдаєт 8640 ссдаддаєсс сдаассстсї ассдасадса дсадсадсас ссттадсдаа адтссастст 8700 тдадсаєсує аасдаддсає адаадааєссд дсдсдссдаа ддааддсаас даааасаадс 8760 садсддестаа сааддаєсса аддасадаас сасдудаєда аадсаддсеса даасссдааа 8820 ассттдсаад сддсдсааас адаадсдадд дсадсаадда їсссаадаєс адааадаасд 8880 асдсассаді адсесстсстї ассдааааса дддсстадаад дссадсадсд адасесдаад 8940 аастсадааа сассадддса аддєсдєсса дсадсуєсад садсааддса аададааадс 9000 сстссаадсї діЕстддаасаа дададсдааа асададсада саддадеєес стсадсдата 9060 тсасдааддс тдадасаасттд дедстестст сдааєсссст сдасддсдса аддаасдааа 9120 ассатаєстс хтддссасдєд кссадсадсс стасддєдсє стадсаєсдада даасесссад 9180 стдаадсаад даассасаас аадададсдд адаасссаєс саасддсраєс дссаасссат 9240 ссасадссад адааадсада асдіссасас стсасдіссаа ддаєссадає сссдаатссад 9300 ааасаадада стададаасас дсаадсадас саадсадсда ахєстааддаа кесдсадада 9360 адаададдда сдсаддсаад сссаасдсаа дсдасадсад адасадссас датаєсстстс 9420 ассасдсаад асасадасссї сасдададає сестсудсаас адсдсссадд дасадсдсса 9480 аддастаєссї сдасддсдса асстддсасс стдаааасді сссдаадду ассдатсадсад 9540 дЕсСтеттдсЕ дсесдааада кдсаасд єс ссадаасдсес таасддаєстс адсадатссс 9600 тсааддаєсї садаєсссада сасддсаасс стадасаєсдд хтасддаєааєт дсааасдсаа 9660 тсдсаасдеє адстдассдс каст ддаєаассдєс дсааааєьссє сдасадсдає 9720 тадесстеса аддасдаєдада дсдадесодсод адсстоасоасодд хдадеесдає дачастадад 9780 асддсддуєє сасасадсдуд адассдадда асдддадєсдє дадсдсєсаас стдсатсдад 9840

Зо стасасасад дес ду дсесасасді адсаєсаєтс асдсааасдс адссаатаса 9900 тасасддсає сссаасаасд тдсдддааса саатастдссд адстаєсьстас таасттетсдас 9960 аасдасааді дсасаєссдуд ассаєсттас стддсесестс ттдсессаає ссддаєтать 10020 тексасестст тассттддсс деЕссатаєсс асатссстаа аддсаадаса даастдаатд 10080 дсддссаааа ассаааасда сддасаєдас стасасадсуд стаддаєсаасє саасдссдаа 10140 ддаааасасі даєссстссіса адсасасдда саадддсааа саасасадес ассадаасат 10200 аасааасааа аадсдсадаа дсаадасстаа ааааасстадс тахтдуддасаєс саддессата 10260 тстддааасає састаєсста деЕсттдсдас саєсссттсст сстдстстад сдададдсс 10320 тсдддастаа сдададдуіса десдддастад садаєссстта хсстадаста дссттстад 10380 тасесссадад ссттсдсдсс дссдсстаса хстасстсса таддаєстда адаєсдастст 10440 тсасассаас дасдссстаад дестстаєсс тастсстадс стодсаатасс тдасттодсаа 10500 тасстддадс ассдсдсасд ахсдассддає астдасддада аддадвсаєсе дстдаєстад 10560 адстсссдає хдддєдассі дастетссдаєс ссадессадд сттуєсдааа тет есадатє 10620 тссасстуєда адсстссада дсттдадссе ссттссатдє саасдссттд ассдаатаст 10680 сстададааа адддаадссуд асссстдаді ассдааассуд аадсдсасає стеесаа 10740 сдсдессаає саасссасаа асааадсада адасаддсаа сстсесатас статастдас 10800 аадсаасаді стстассдіса стдсасаасаа сдістсдЕсс стісаадада даеесссда 10860 сасссатаас дасссдаадс стсаєсдааад сасстадддаа даасесстддуд ссстесттд 10920 сасддсстсс асаддасдсса дссдадсссуд ссааєссссд хссдастддс тссдсаааатх 10980 асссдаасдд саадссасдд асссдсаасс асаастссас ддасаєссдадс аддасстати 11040 дсдаадассс асстсастддда дсессадаасє дсдурєсдіса дсааассаас дассдааатс 11100 сассасаєда сддасдусса дсдддасєдадс дааасдааас аддаадсдсес татсттсад 11160 адссдідадс хссасассдуд ассссддсаа стасдсдесуд ддасаддсесеес дссоатсаєтад 11220 адасасдаєсд аддсадассс асстдідсса стсдстасаає хтасдададеє дессееа 11280 тдаєссессст аадсесстсує сдастддсдад стсатаєтст асаєссдсатд дестстсаас 11340 дЕсдеЕесс десаєстдає ассссуєсає ссдсаєсссас дсдсдссдсес тсссдісдсса 11400 адсссстадд хдєсасдсас дссааастду хтадсдуєдсд дастдссста хдстесттас 11460 сдасддаєсад аддаєсдаде сдддддєсес сасддсдатд дсадсддаєс дасдаєссда 11520 тасддаєсда сддасаєсдає саасстастє сттдсессаа ассстссддс адаааасаатх 11580 тсассадаєс адаастуддаа ассададсда сдадасддає саадссадає хссаасадад 11640 бо тсасаєстст таадааасаа тдсаасссст тадастсста статастссдса астааааааа 11700 таасссааст стетадастсс асасасаде ссаасааста адссстаасса стстаттати 11760 тасассдааа стаєсстутає деЕстсссстс тааатаааст хтдасаєссдсд етсасадаас 11820 стасаассаа асаассааста сстсаастдаа дессдсдсад ссааєссдаад ддассаасад 11880 ссаааасдса стадсаєсає саассдааста дасссасасі адасддсесає ссссассаат 11940 65 ассаєссдссд Ес Есттст деіссасатає ссссІстдаа астсдадада сасстдсаст 12000 тсаєссдссст тастсасдсудє сасааааєсда аасссатдса хссатдсааа стдаадаатд 12060 дсдсаадаас ссттсссстс саєстесттаєї дсддсдасєсса кссастесас сатстсссдс 12120 тасаааасас ссссатсаст хсасстадаа саєсаєсаст асттдсттає ссасссаааа 12180 дасасссаст тїтасаасаа стассаасаа саасааасаа сааасаасає стасааєстаса 12240 70 тсстасааєста ссатассастд ссасстадса стдстаадса аасдададст сстастадса 12300 тссасдстдд тастастдас стестдст хсассадааа ддастаєсдсе датадасста 12360 асстсассає сдєстддадає сстуєссасуд асдстааддс сесадаєст дадсаєсста 12420 дсаддсдстса сад ссст стдссддад даададаєдс тастдаддсее ссасддааатх 12480 ассатадаад ддсесддссІ аадсстадаа стдсстадаєс ссасдєсдда ссесттдсе 12540 стастдадда асстдсдсс дседаєдадд дасасстсса астттуєдсє аддаєсдста 12600 адасддсдсес ста ст сстддаєссд стсстдсеес ттастудддаєє ааддстсддас 12660 тстасссттдд аєстдстаєс дстсттдадд сттасатдст ссасдстдда аададасттс 12720 тссстесСтає састсестстдда хсддастессд стсттассдд хстсаасатс садсаєдата 12780 стаассастад кдстскосст аадсстдсе стдесаасст тдстстстдда стетдссада 12840 ассддаєсдуд аддаєстатд асссттсддс сссаададса тдасєсдссатд сассасстсс 12900 асастаасда тдсєсдасаад даєссстдаєс ааааддссса сддсдстсес адастсаадс 12960 стастдаєдс ссдудаєсасст асдсаєсдддс сссадсаєст сстассттд сстддсдада 13020 стасдсасдс сессаадсеє стдесстсуд асасстстда дсетодссатд сддсастдадад 13080 адддєдадсес хасстстаад сттдстддає асстстетає дсстсетд стустсаадс 13140 тсасстсстд ддастадаєсс десдсестодс стстттасст тдстсстст дессатаста 13200 стасасасає сдстдстаст десаєдасту даєсттеста сстсдсетес тсстістсса 13260 тстсссасаа стссдадддає десадсесста стоддасстда тддаєстаєс астестатда 13320 стададдсдс хадсессстї аададасаад стдадастсс сстаасуєс ддаддасстс 13380 тЕСсСттдстас тстстаасддає ддастсааст ассааассда дсаєсасттд ессстадад 13440 тесассатдд ассстассст адасттдссс стсттадДссаа ддастдадсте даддстадаад 13500 даассдадста саадсастас сстастаєст дадаєстаасст тдстестасс стсадасата 13560 тасасдстстї тддаадаадд сстадаєста аддссдадса асдасаадсе татдсдасає 13620 дааасаасаа сддсааааста стасдсаасаа стаасаасаасє ааадссасаа адсдадаатад 13680 аддддааддуд дааасдсдса асдадссаді адссддаєдає дссааєссссд сассдсаєтад 13740 тсаасааасс ахкдаассссд сдассесстає дід ааассатдаа кестсаааття 13800 тасаааастаа сстссаассд даадаасаас асксссатаєс сатдсатдда хтатесстета 13860 сссааасста діссссдада ддаєсдаадса ссассдааса деЕстдсаас татссстсаа 13920 аадсстсстааа асдаасааса аддаасадад саасдуіссса аадаєссссаа асдааасата 13980 тсасстатас таастастата стассааста стастдсссдуд даассасаає ссстдаатда 14040

Зо тесстаєтсаа стасаадсст хтастддсдодс ддадаадсда хсддсдсдадс дадаадсадс 14100 ддасссддад асдаддсесес ддаадаєстуд адссдаасдд дсадааєсад тасстессст 14160 сдасдесаасє сдаєсстаса стасдсаддасє сасаєссаєс десссааєтє ссддссасса 14220 тсаассстд ссттдсст адддаєсдаєда асасдаасдд ссааддсаад адаатааааа 14280 таасссааає тааадсаада даддссаадї аадасаассс ааасдсасас ттассастдс 14340 саааасстаді аааасасссуд дсастсаєссуса сссссасаса сттассаааас ассдсататад 14400 тассддстдс ассстдсаєда асаасастас дсдсаадссс аааадаассс асасасадсс 14460 састдсааадсі саасастсас дассссаєтсс стсадсстсс астатасааа сссассатсс 14520 ссаасстсас сааасссасс асасаастса саастсастс ссасасстта аадаассаат 14580 сассассааа аасссттасаа саасстассаа саасаасааа саасааасаа састасаатт 14640 асаєссстасаа стассатасс асдадсдстд сстассуєсас тддаєстдає сстаадааса 14700 даддаєстсс тадсаасасс дадсаададд хсссаааадї хтдстассдає ассаасддаа 14760 асадатадасстс хасссстдає сссассаєса аддасаєсст тддадстаєс сстсатсдаде 14820 десасдадад аадаєссддсее асстстстст астасдсдєс сададастаєс ссстдсатдс 14880 тстассассдд акассттасс сатаадаєсс ттассстст сстсасстст тасасстста 14940 асадсаєсає саадсссаст ссстдддссс тетасастта сдессаадда сттттсддаа 15000 ссадааєстуд ддаєсстсдсе саєсдадсуєд дасаєссаадс еестстдає сасддааєтсад 15060 тдаасдаєсє сдасстддасдд ассстесаст сттассттає ддасессттас тесадстдда 15120 адсассстіса хтуддааадсас сасааддсста стддасасає дассададає асддаєсессад 15180 тЕсстдссас сааададдаа сІсаадаадсі стаддаастє сттсддсаас стсдстдадс 15240 астстдадда ссстссастс адаассстсї асдадсесст тдессаасаа сттддаддатх 15300 ддаєссдсета сстсттсуЄс аасдєсасад дасаасстта ссстдасаєє ссетсттддаа 15360 аасддаасса сттстддсеє асстстссас тес ссдадса аададаєдсеєе стстасатсст 15420 тссттсСтда ссттддааєс стсасссадда даатсдест хтастстттдд тасаадааатх 15480 тсаддаддаєд деЕссстсесс ахсаастдді хсдеЕссстта сасстддадсє аассастдас 15540 тсадастессає сасаттсстї садсасастуд ассстастає дсстсаттас аасдстдада 15600 аасддасесє сдстаадддає дстдстдста стассдасад ааадсссудда сссассддас 15660 стсасаєстї ссасдастаєс ассдадассс асдсдсесса ссастастдє сстаддассс 15720 саєссстасаа сдстадасстї дсесстдадд стаєссаадаа адссасддда аадсастаса 15780 ддаєстадсда сдадаасатд студдаадссас кетддаадес еесаддест ткдссаатасад 15840 60 тсдасддаєда саасддсдє стсасдсссс дсаасаєсаа саастдсдда дЕтдаадста 15900 стдадаадста асдааддддає даєсдаєсасє дадаєсдсас ааадасастуд стаддасаєта 15960 аддасддаста асаасаасаа саасдадастд аасдсуєєс аадссадсдс аасадстута 16020 асааададад ададададад ададададад ададададад ададададад адададдста 16080 асдааасуєє асдсасдес стсддеЕєсс аааасааасуд ааадсасатд стсататадах 16140 65 тстассдаає тастссддсда теЕсстдсдоад ааааадссса даадддсесдс сдсадстаст 16200 астасаасса аддссусдда ддадддсаас ададссадса сттсдасадс тдстдсдата 16260 асстсаадса ассдаддадс дадсдсасає дсаддддасі ддадсуєдса ассддссада 16320 тдаддсадда сасссадсад садддасадс адсаддаадї сдададдєда тсссатсаат 16380 стааасаадсі сдстадддас сттссдддас адсдсддсас ссадсстадс сдасдссадс 16440 70 тссаддддса дсадсадсісї дсатддєс даадсддаєда ссдасдадає сдсатааада 16500 састдстадд тдссааддає дддаєсаасаа дасдсуєс аадссаєстаа ссдсаатааа 16560 аадададада ддссдасдда асдссаєсдса сдасасденсс ссдуєссса аааєстааатад 16620 дааадсасає дсесдсдсду деЕсстаєсстс даєсстаааагаає сссааєстата ссттддсстаа 16680 теисадеессдд тассдадсаа аасаааєссуд аассааасса ааасасааає ахсатадє 16740 тасасасасд сстстаадас сесетастада ассессттста ааааастаєстї адааатаєтт 16800 дсдастсттс тддсаєсдсаа сассссдсса аасасдааді дсессаєтеє тастаась 16860 ааасаассдуд ссдсасдаєс асттестстає саадсуєсас стаааасдсудє саасстсте 16920 дЕссткссаєт атссатасдс саааасстає саааассстє асатаєстеє сссдааєтта 16980 аадсдаааєї ссдасаасссї ааааєсааас адаасастаєс астаєсссадд сассатаєтад 17040 астссастас сстаастаста аасссддеєса ассссдааад сдсасаєсаа сдааааатта 17100 дісааасдас хтаааасааас ааасаєсатд тдасстаєссаад ааааєссстсс тасаадаата 17160 теЕсстаасада ссататуєсс дсаааааааа стаастсстста стаасасата татттастта 17220 тсаааааєссї дасааадсаа дассааааса асасссаєсї аасааааааа ааассадааа 17280 асдссдаааа сссддсаааа ссдаассаасї ссааассдає асадессдуаєє сддасесдаєттс 17340 тсдасасааа ссдаассаас хсддсссаєтт тдсасссста ассатаатад стттаатаєтт 17400 тсаадасаєс ассаадссаа сдстдєсааєт ассстддааа сттдсаааа тдаассаадс 17460 стастасдудсу дсаасаєсдаа ссстаааадса дсісдасуаєд дсддасаасає дсааєстаст 17520 тдаєсстааа аааасаєссс аадсаєсаає аассстдсї аддаадаадд ссадстасда 17580 т2сасадсаа адссадааса сааадаасса тааадсдаєс даадсссдаа асасасдаад 17640 даасааасає сссстаааава асасдсаатд асссддааса ааадааадстд асатаєст 17700 тасестстааа саадсаєсссс стІстааадаа хтддсадеесе сстетдсатд саастаттає 17760 дсесссттсу стасааааає скттддастас тасстдуддаас сстстдаа аасадесста 17820 саддсстадса дассдуєсдуд ссдурєсесса сдсассадаа ддсттассст асттадссдаа 17880 адссдаааст тд сссста стсаатссстї аадассдсдсаа асдсасдсає асдсаатута 17940 тасаааасдє адсасстстааа сдастаддад тддеЕсстсда дассдатдад адасдддаадс 18000 адаассааад асдаєдасає аассаадаас даасссдааа ддассстсадда сседаатсст 18060 асссдадаає десессдсса аадасадсдд сдаєссссдаа ссааадаааа сасстааааа 18120 ассадсаєсс ддаєссасдесс асдсааасад ааадсддусс аддаєстдає содсааєссста 18180 дастсааада діссстсаад асссаассст ддстдсдсас аааасстасаа асаасататт 18240

Зо тІсадастаєс стддсстстаас тааастссса стсаттаєсо астдаддеєта дадаасадас 18300 тсдсдаасаа асасаєссссс дадааасасі саєдаєссса хтаастадсса даддасатдс 18360 саассадаєс стаадаасаса сассссстса аастстстаастуд сасасдсаас сасадестад 18420 сасаасссаа ааасаасдса дсассааада садаааєсссуд садастесес сстддсаєта 18480 ааадаадасі аадсссасас дсасаєстсса кестаадсдд аааассдааа ттесссатсад 18540 ааасасаєда асссадсаста сасасссстуд саасдсаста сстссдстаєс ссддсаасет 18600 тсадсддасеї астастстстат тасаастдаєтдає асддастдсає дадессдадеі асасасатди 18660 стааасдсає дсессдсааа асдсаасдда ссасаааада ддаєссатас ааатасатєст 18720 састадстссс хссасттаєтсї сссдасасаа асададсаєс ссасаасаасє сассаасаас 18780 аасааасаас ааасаасаєі асаасстасає стасааєссас сатассатдд сстстатсас 18840 тасссстдсе дстсттдстд даасссттдд асасдеєтасс тасаастдатдд стаассстда 18900 тассссадсе сстдадааад есстдстта стесатдсад дстдадсасе ддадасстас 18960 тассддаастї ассддастасс хсстстссає стасттсдда аадсдсаєса тдсадаасад 19020 асстсаасстї ссддассса адаасдстає дсісдеЕсєсас аастестасс адассттст 19080 саасадстас хдсаєстасс ктессуєстас тестсасадд дстсадддасє ссааддєста 19140 дддааасаєс сстдастаєда стдстаастс тстддддааєс сстсаддаєса сстддсесса 19200 стасаасаас аадсасдесд адсетестсда сассттстсс асддаєдаєда ддаадааде 19260 сдассадсее сет есстс асасстасса ссасастстт стсасстддас сатддаєесди 19320 тассаєсдаад сесдадсстд стоддадаєсд стастесдда хстеЕстаєта асассттсає 19380 дсасдасдаєс аскдсасестс астасдддаст тадстдсесес ддадесааст дессстоддаа 19440 даадсасаєс асссадаєсс адасдсесса деЕсстутаєс тадахдстестс астстатста 19500 сассдсттас діссадаата ссдстсесту дсекссттас сттсаастст ддадастатдахє 19560 даасасдєсс десстстссд ссаастеста ссдсаададд стасаадеєста адддаєдстаа 19620 даадсадсда саадддсесдс сдссасдіда садаєсдаад даадааадсд саасаадасад 19680 астстсаста стсдаєсудсе адсдаєсдєс ассуєсасає асаасаасдс сасстттесас 19740 аастстаєссдс аасдсасдсд ааастасаас асаєссаассс тасттуєсає асдасаасас 19800 тстссссаєт таааассстї десааєсссаа адасасаада єсстттаааєт дассаааааа 19860 аасасаєссає ааасссаасс астсстаста асаааєссаєс аастаєссаєс сассдаєтаа 19920 ааааасастє асастааєсї адсессдааса даасааєссад ассстадсст дсадддсдас 19980 сдсддаєссс асддадсесаа адаєсссааасє ададдасста асадаасссд ссдсааадас 20040 бо таддсдаасад тісастасада дестсттасд астсаасдас аадаадаааа ксттсдІсаа 20100 сасддасддад сасдасасас стдсстастс сааааасаєс ааадасасад сстсадаада 20160 ссааадддса ассдадасєє сссаасааад ддсаасаєсс ддааасстсс тсддаєттсса 20220 ткдсссадсе асстдісаст стассдсдаа датадсддаа ааддаадава дстсстасаа 20280 асдссаєсає хтдсдасааад даааддссає садассдаадає дсссстдссуд асадтддесс 20340 65 сааадасдда сссссассса сдаддадсає сдасддааааа даадасдуєс саассасдєс 20400 тЕсааадсаа дсддаєсдає дедастаєссс састдасдса адддаєдасд сасаатссса 20460 стассстссдуд саадассстї сстстастата аддаадесса теесаєсссддуд ададаасасад 20520 ддадассдаа ссааасаєда дссстдадад дсдссстуЄс дааассадас стдстастдс 20580 тастдасасд дстдстдс дедастассудс даассастас ассдадастє стассдутаа 20640 70 стссадаастї дадсстсааа сстсстІсаада дсддаєсдає дассесдада дассссаада 20700 тадасассст тдасттоєсд стдадаєсда ддахассодс дстддааєсд сттасдстад 20760 ассттддаад дсстадааасд стстасдаєсд дастдєсдад сстассдс асдаессаса 20820 садасаєсад адасссддас ссддаєстас сстттасаст сасстсстса адсстатдда 20880 адстсаддда сссаадестуд стдкдстЯє тассддастс сстаасдаєс стстуаєтад 20940 астссаєсдад дсесстсддасє асастдстад аддаасестс ададссдстд дасасаадса 21000 сдасддаєсдд саєдаєсдаєсуд даєссстддса аададаєсес дадсессстд стсстсстад 21060 асстдссада ссадсстассс адаєстдаає ссдсдсдаєс десссааасає ссддсаатаа 21120 адесстстаа дассдаассс кссдссдає стктдсдаєда ссассатата асстсстаєтад 21180 аассасдеєса адсасдсаас аассаасатдд стаасдсаєда сдесаєсссає дадатддаєтє 21240 тстсасдаєта дадісссдса астастасаєс саасасдсда тадаааасаа аататадсдс 21300 дсааастадд асааассаєс дсдсдсдудєд ксасстасдс састадаєса стадсдатди 21360 асддєстаааа ссассссаді асассааааа сдуіссдсаає дсдссаєссаа дестодаєстаад 21420 сдєсаасссд ссстасассас аасатаєсстї дссассадсс адссаасадс тссссдассад 21480 дсадсссддс асааааєссас сасссдастас аддсадссса ссадстсс 21527 «2105» 2 «2115 23512 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» род7-тод В нуклеотидна послідовність «400» 2 тІсСстухтаде аддсаєсдсаса тасааастудда сдаасддата аасстттсса сдссстета 60 аасаєсссдає хтассстаата аасдсесте кстсттаддас ссасссдсса ататассста 120 тІсааасаста ахсадсссааа стдааддсда дааасдасаа єстастадса даєстсссад 180 хХсасдасдсї дсаааасддд сдссссдсад ааадстсдсд ассдсадстас сдсессастсд 240 астксадаєст хссааддсест сасстссдад сссдстдст сесдссдсдс саатсасттс 300 тІссассодсса асааддсееста хтадессаасад даассаєсса дадаєсаєда єсссддасад 360 тадсаассаа саасастадса сстадсасада саасасдєсє сдсетдадає стттсддаасд 420 тЕдстстдД ссттдєтдє састссааад стессдадда асадссдсад аастастссда 480 хдасдстса ссстстІсаад аастадаєії дддасааадаа асасссатас ахтадататад 540 аасдетдєсс тсссдаєсдуд адаєсаєссє асааааєсса ааасссаєда сстааааааа 600 сасатааааа ссасааааєі саєсдаєетстає сдасаасасд асасааааєї адсассассд 660 дстастддсе састасасає сссссстксс сстсаттстс астттуєддс сстаєстсаєтта 720 тсасстаєссас ахсастаєсссста ссадастаєстсає сссасдссас асаадсттдє саастааєсса 780 ттадсдадсс тестсадсст тЕссдЕсаас асадсадсас тдесссасст тассаадаєт 840 ададааадса дсстїссаад сассасадса адададсасс тдсадесда деіссссастт 900 стІсадсдааа ддааасдааєс тІстастаас стсаддстудє седааєсдад дсастаєсадад 960 даададдасдуд сддасаассії дасадссаад дсассссата адссадесса сдтассстст 1020 адааддаєсд асассаасдд тдрєдаєсаас адсусадесса асссаадааа ддакдсетатс 1080 адасддааса асадддаддє дадсаєдада адсададаад сдадсдаааа дасасатата 1140 адсдаєссад тсссдааад сдаассасса дсаадсааса ддссаададу асссадсадс 1200 аадсссдата асадсддеєс саасаасастуд адааасдадс асссаадаад сстстссдута 1260 дЕссткстта сддадаастєї дістаддуєд дадаасдсад асссадааад сттдаасаад 1320 аадсссадад дісаасаддаа сдааадссса адсттдааді стадсссаад стстададаа 1380 тсстІсСтадду стдєтасссі саасадсадї дессдаадааа дссасадсад дадсаддсатс 1440 аадаєсссата хсдідЕстаа ссттесдадд дасадсаєсдуд хтасттдєстає дсасстаде 1500 ссасаєсіса ссадаадсад ааадсссдаа сссасаадсс асадсстдаа дестсттдєс 1560 сасдсаааса дасссддсраа дададссасд сссассстса тдссдаассс асссасатст 1620 адсіссдаад ааадсассудї ааасаасада адсааєсдаста дддсаєссад сасасатаад 1680 адсадесссса ададсдаасуд стадсаадаад стсдадаадсі стдсаадсса сатдддаєдах 1740 адааддсеесуд аадаасссає стстстсаад стсадсасдс сатстадсда аассстсаад 1800 састаддадса хсстсадасі садаєстстеї даєсстсадса ддастадаад дсааадссст 1860 аадсаєстсс саадсстсда дадаасдсає дсддаассст ссдааадсся садсадсатс 1920 адсассадсд сстадсаадса сдсадаадає сасадаєсса ссадддаєдсс сдаадссаде 1980 сасаєссдсрас хсаасдусст саастстаас ссаєстадіс ссдааадсад садсаадстс 2040 асдаддссса ададсесссаа даєссаасадд адсадсадаа дсаєссстстад сассаададс 2100 стісадсадаа дасссадасс тддасаадсдуд адаєсстадда даадаєстєс састсадесе 2160 аддадддсас асддсасддс аассдсааасє дсаассдсаа тастадсетоає ската 2220 тассддсаає тдсстдсаааа стаассааді дддасассес сддасддата адсаадтадс 2280 бо даєсдаєсдаєсс хтаддасдаадсі дасдддадса єсесасадсд ддадаєсддаєа ааасддасда 2340 тсдссасата адааатдуддад дддааддаєє сттдсдссає хстесаде дсасадатас 2400 асдддаєєсса сс дсааса сдсаасаадд асаасдаадсі дсаддасдєст стсаадес 2460 ададдддаста сдсддасада адаадаасдд сдаєсдастаєс дасддааатд дссаєстадс 2520 дсдаасстає ссдуєсдаста асастадсдс ассттддсесд ссаасссстє сааєстааста 2580 65 сасааастсс адссдадсає сдаєсаєссуд ассасаддаєє сстдсааасас аахтассаадсі 2640 тїсасссадад дддадасаса сааасадесї сдасасааасє аастададсдд ссааасттад 2700 тТсассаааас татастасааа дістаааадс саааєссаєсь єстсаастдс ааатататаа 2760 адсстааадд ддесасаєса сс стаада дасдсаастс тдассддааєс сдасттаатс 2820 сдсстсаєса стстддєеес садееєстаає стаасдааєс де естдсес ааадааєстта 2880 70 аадсаадаад хтааассдаєс аасдссдіса асссасасса аассдссаас ссастассат 2940 сассасддад асссссааас ссаасстсса сссатсдаса адаадсасад дасадсссдс 3000 ассассасса атітадсасд саєсдасасся ададасестдд сасдададдс дасдсасатад 3060 дасдсааатуд асдддасаєс адаєдасадд ааасдасдєс дададассає асдасдсада 3120 асасдадссс ассаєсаасуд адааассадд аааассасаа аааааасаас кстсдсааст 3180 дсасдадсдуд сасадаєсддд єстдсстсаа сатаєсстста асасддсдаа дсстдсссаа 3240 сасдсадесд ссддааєссуд дсдсддадсс сасдассстуд ааадасаддс дсеЕссстає 3300 тсдсесдсе сасссастдд асдіссдіса тдасдасддаєт стесдаєсаєт аддестдстда 3360 саассасаєі стдаадсссс асдадаєдад сстссасаасє аддсесстдсе саатассоута 3420 дадессасдає сдсаадссса саасттдссд сссдаатаєс ссдсддадсс адссддасда 3480 даассддсда дсісддссда сасстасааа ддссаєдаса адаадаасса ааадстсттс 3540 сстаасдстс ссасдаддсес ссдддаєсуаєс асддаєдусуд даааасссст сттдааддаа 3600 сдадасдеста ссасдсаєда сддсаадаст асстасттуаєс адсасаадса сдааадаєта 3660 сстДЕСтксСт дсеттуєссд куддаєсдаєс ддасасдесуд аааааааатд сдсастссда 3720 теЕссаатасті сададаєсда сттссст стстаддаді асссдаєсаа ддсатсттааса 3780 тадааддаад стсаадстсї аааддстсса саастддаасс хдааааассо саасаадсся 3840 ааассдааасє сдаадссааа ссасссаасс дддадсеста аассадсааа састсстсст 3900 ссасадстаєс саассаєссді дсасдаєсдсс ссаддсаєсд саадссаддє ассдсаадсс 3960 аддадсадда сададассесї ааасдісуєс дасдєдаада десаєсесса дасстаатсда 4020 адасадаєдє адасддсаддс асдаадассс сдааасасса даааддстад сссаддатаа 4080 ддаєстдста хсссаастда сстстсдіта деісссааддс стстсааста дадсаддада 4140 ааддасддес асаадасстад дасаасдаєтд есссаатає даасстдаає дсссатадст 4200 аастеесестта дісттдсеес тдсастеееє дессаєссасд єсстдудаєдас тасдєстає 4260 асссттассс дсасдсссда дддасассста дсадаєсддає сддастддеес ссатсдсасса 4320 дааддсестас сстастад дааадссдаа астттуєтсс стастсаате сстадесата 4380 тааасдсасд сасасдсаасї дсдсасаааа сдсадсасст ааасдастад даасадес 4440 тдадассдає дададасддд адсадааста аадаєдаєда сасаасстаад аасдааєсетад 4500 аааддсестє аддаеєссдаає сстасссдад аасуєєссд ссааадасад кддсдасьс 4560 даассааада ааасаєсстаа ааааєссадса сссддетасд ссасдсааа садааадсда 4620 тстаддаєст дассдсаасс стадасссаа ададсстст аадасссаає сстдастата 4680

Зо тасааааста сааасаастає асстсадаст асстддсст аастааасте ссастсатта 4740 теисастдадда ссададааса дасстстдсдаа тааасасаєс сссдадааає астсаєсдатс 4800 ссасааєсстад ссададддса сдссааєссад асстаадаас асасаєтстссс тсааастттта 4860 асдсасасдас аассасадтї садсасааєї сааааасаасє дсадсаєсаа адасадааахє 4920 тсдсадастє сет ддсд стаааадаад астаадссса хтасдстасаєс тсассстааа 4980 тададаааассуд ааасстссса ссдааастата сдаассстаді асасасаєсе стоасаатоата 5040 стасстсдсе ассстсддсаа стессадсдуд астастастс тастасаатд косасодата 5100 саєсдадеєсд адсасасаса тдустааастд сасдстссдІ аааасдсаас ддассасааа 5160 ададдаєсса тасааасаса сстсатадст ксстссатта т сссдаса сааасададс 5220 астсасаас аастассаас аасаасааас аасааасаас астасааєтста саєсстасаатє 5280 тассатасса тддсстстає сдстаєсссст дстдстсттд стадаастст тддатасаєт 5340 асстасаатуд хтддсстаассс кдастаєссса дсесстдада аадстсстдс ттасттсата 5400 саддеєсдаді астддддасєс тастассддда астаєссддає асстсстстт сатстасттс 5460 ддааадсудста ссасдсадаа садаєстсаа сстттсддас ссаадаасдс тахтдстсдє 5520 тасаасттстї ассадасстї стссаасадс тастдсаєст ассттессЯає тасетстсатє 5580 адддсеєсадд дасстсааддасє ссдудддааас асссстдата сдастдстаа стсттдддда 5640 асстстсадд єтасстддсее ссастасаас аасаадсасд ссдадсесст сдасассттс 5700 тсесасддєда сдаддаадаа дессдассад стетсттесс тссасатєста ссассасаст 5760 стсстсаєсст ддаєсасдуєс суєсдесасд аадсетсдадс стдастддада ссдстастс 5820 ддасстстуд ссаасасстї сурсдсасдсд ассасдсрасе сттастасдд асетдстдс 5880 сттддадесса астдуєсстуд даадаадсас ассасссада сссадаєтдсте ксадеЕсстдх 5940 асстадакдсес стсастстає стасассдст тасуєссада астсассдсееє стддсетсс 6000 тассттсаас тстдддаєсає ддасдаасастд ссдсстст хсодссаасте стассдтсаад 6060 аддсасааді стаадддасдс стаадаадсад сдасааддсд сдсдасдсдс саддссдесса 6120 ссасдсдаса дассдаадда адааадсудса асаадасдас кстсастаст сдаєссдстад 6180 тдаєсдссає тдсстасастає аасаасдєса сстессасаа сттассдсаа тдсатдсдаа 6240 астасаасас ассаассста сттуєсастає дасаасастс тссссаєстта ааастсттди 6300 саассстааад асасаадаєс стсстаааєда сстаааааааа стахтассасаа асссаатсас 6360 тсстастаасї аааєстаєсаа стастаєссса ссдаєссаааа ааасасттаєт астаастстаад 6420 тстдаасада асаасстадає єстадестса хссссттета аассаастта дсааасаєтте 6480 бо Есе таа теЕстасдаад стаадесесє ассттдс сааааадаає сдссатаад 6540 асдссасдсес адаасаєсад стасасдіса сасасадсасє дсадссдсдуд адааєстадєє 6600 іст ссдсса сттдссастс ссттсаааса сстаададсе хстстстсас адсасасаса 6660 тасаассаса тдсдсдсасд састаєсстаса сдєдаєсдсс астдсаааєст сстетатадс 6720 стасаааєта астсасссдс кссастстсу асссааасса ааастсаєсуд ахтасааасаа 6780 65 дассааааас асасасдадд асстссстаса асааєсстасса асаасаасаа асаасаааса 6840 асассасаасє тасаєстсаса ассассатас сасдсстсса адддастстє астсттатдс 6900 тастсстсст тстдстісаас ттІсасдааді сдасастсст саададсасд асаадааада 6960 дсетдассасс ддадасаддд стсасдаєсдс стассаастсс дссаададас ассстдасад 7020 ааадаєсаєс дсестассаад ссддаассда сдстассдає дсесасаадс адессссатди 7080 70 тадаєстдсе ааддстдаса адастдссстаа діестсессст хстсассста есасаадад 7140 аксасстстсса адаадддстуд асстстаєсдс сдаєсстсссаа дадсссасса адсаасттда 7200 доастдаддда асдіссдадс стестсттсс тсасдетдсе стасадастту стсдаддетат 7260 сдстасдсає деЕстдстдутд стдсестстає стддсасдда стасасьтессуд стддаатсдс 7320 тасдсесдда десдассесадд даадаєсдаєдд асддсееєстастд сасдаддадасд дасаттастс 7380 тстсастдда аасастдссс ссдасададс тасссаадее дсттассаса дастстадата 7440 тадаатуаєст дасдссдДаєЄ доасдсаасса дсасаасаад сассатдста стсстсаааа 7500 дстссадсас дасдєсдаєс ссдасассст ксстстсдс дсетессатуд ададаатсдс 7560 тастааддаєє аадсстсстуд стасдааддс ссдадсесест асдсаадста адсттессас 7620 тсстдєтасс астсттсттд єтоастсттдод асддсадсте хтасстесаєс стадасасатє 7680 дсесаддасі аадсасстасуд асдадсесдс тасдсссдда ассадастасд дасстаєсда 7740 аксассттдс дстаастасуд дсдстддата сассстсдсе ткдассасстес тттасуєсса 7800 дсетддадсе аскдсасаєст сстдсаастє сдстдееест сатастсасс тссстатає 7860 тдадсстаас дадсатдста сттдддассда дсасдстдсї аассасаста стаастаєтс 7920 тссаєсстстдоа стддсодасдаєс доасддасдсс ссассттаас тассадаєсд адсассасст 7980 тсасссттст акдсстсааї сїсадасассс хтаадаєсдсе сстададеста адсадсеест 8040 сдадаадсас ддасессасі асдасдєсад аддасасссс даддссаєсдд ссдастась 8100 сдстаасстї дасаасдесд сссасдстсс сдадаадааа асдсадсаас дадатсдєсс 8160 ааасаєссдуд саасааадес кстстаадаєс даассстуєс дссдадаєсттд сдаєсдаєтатє 8220 састастааєтсс стдсєсдааєс асдісаадса сдсаасааєс аасасдєсаає дсаєсдасдуєтє 8280 асссаєсдада хддуєєссса сдаєссададі сссдсааєсса тасаєссаає асдсдатада 8340 ааасаааата стадсдсдсаа астаддасаа ассассдсдс дсддедесає статдаєтаст 8400 адаєссддєсд ассаааааєс ссааєстатає ссдудєстаає ссадессдоає ассдадсааа 8460 асааасссда ассааассаа аасасаааста стахсадеесс асасасасдс стесаадаст 8520 теЕсстасадаа сеЕсестстаа аааасаєста дааатаєссд сдастстст ддасатдтаатє 8580 астсуєсаа асасдаадсд стссаєстсо ассаасесста аасаассдді содстасдаєса 8640 сЕстсттасс аадсдесасі аааастдсуєс аасстстттд ссстессата кссататуєс 8700 аааасстаєс аааавсістста сасаєссттсс ссдааєсссда адсдааассс сдасааєтта 8760 ааассаааса даасастаєса стасссаддасє ассастаєсда ссестастаст саастастаа 8820 асстддєсраа стссдаааді дсасаєсаас даааааєстад ссааасдаст аааастааата 8880

Зо аасаєссасадає дссассаада ааассстсст асаадаасає сстаасадає сасастуєстау 8940 таааааааає саасстессас стаасасатає асстастстає саааааєстд асааадсаад 9000 ассаааасаа стасссасста асаааааааа аассадаааа сдссдаааас ссддсаааас 9060 сдаассааєс сааассдата садссддаеєс даєсссдаєсє сдасасааас сдаассааст 9120 сддаєссассті дсасссстаа ссастаасадс сссаасаєтс саадасаєтса ссаадстаас 9180 дЕсдсєсаата хсстддааає сстдсаааає даассаадсс татасддсетуд саасаєсдаат 9240 тсаааадсад стсдатоаєдд сдасаасасд стаасстастї дассстаааа ааахтатссса 9300 адсаєссааса асссстдста ддаадаадду садсстасдає ссасадсааа дссадаатас 9360 ааадаассає ааадсдаєсд аадсссдааа стасасдаадд аасааатаєс сстааааааа 9420 тасдсааєсда сетддаасаа аадааадсда сасастсс дссстсааас аадсатсссс 9480 тстааадаас ддсадесесс стттдсастду аастаєтатд стссстссдЕ тасааааатт 9540 тсддастасті асстдддааст стстдааа асадсдасад аасссасасд адсататасе 9600 тессаєсстсаа стЕстааааас саадааасає асатасаєсаа састссаєса дсстстстс 9660 ст сттастта сддаєсаасда стстаааасас ассттаєстає сссастсстта асасстадса 9720 дасте сстаєс асдаєстсає сдаєсассас тІсаааасса тдсадастдс тастдсссс 9780 ддадссддса ссдудстаддс кддуаєдссдс астдєсссду ааддуссста дсдасттаєє 9840 тадаєсдаєсд ддассасстс хсаасттсст дстдстдЕсс стастдстда ахтатсстасс 9900 тсасстддсс дастдсасдс хссадісссс тдсатдсдса стсдстсстс ааттодсттаа 9960 дассаєсдса дсадстаєсуд аадсдстддс сстдесдссс тсстссасдд ссттддетах 10020 адсадсадсе дссдссдссс Естддастє сессссасад даассдссда асаасссдатє 10080 адаассасас дадсасдсдс кеесассстає сссааааасс аадааасата сасаасаєт 10140 саєсадсестс ссСесестстс КСЕСЕСЕСТС КСЕСЕСЕСЕС КСЕСЕСЕСЕС КСЕСТСТСТТ 10200 тассасадсї десасастаа сттаааасас асссасстса стастаєтсає тастаєссатє 10260 ссттаасасс тадсадсдсс сесудсасдає стсасааєсдуд ассасссстт сатсаддсатє 10320 ссттаддсес састссаасд стдсдсаді стасддаасає дсасасасса тсатддєєст 10380 саасдаастуд дсаадаєстс саадесссс аааддсстаас ссасастдєсс тсассдатах 10440 дЕстдасадсуд стстсссата асттстсда сдсасстсддє адстестста дсасддтада 10500 асдддаєссї сдааасдсад сдаєсддадса сасдадестс даєдаєдєса стоддаадаєда 10560 тіссдаддає сссдаастстї стассдастад стадсадсадс асссттадсд ааадстссаст 10620 стЕсдадсаєс дсаасдаддс асадаадаасє сддсдсдстд ааддааддса асдаааасаа 10680 бо дссадсдуди аасааддаєс сааддасада ассасдєдає дааадсаддс садааєсссда 10740 ааасстстдса адсддсдсаа асадаадсда дддсадсаад даєссссаада ссадааадаа 10800 сдаєсдсасса дсадесстсс стассдаааа садддсстада аддссадсад сдадасесда 10860 адаасссада аасассаддд сааддеєсдєс садсадсуєс адсадсаадд сааададааа 10920 десстссаад стдістддаас аадададсда ааасададса дасаддадеє ссстсадсда 10980 65 тассдєдаад дстддсааст хкдасдссст стетдааєтсс стсдасддсд стааддаасда 11040 ааассатаєс хстддесатд кудаєссадсад ссттасдудаєд сттадсаєда дадаасетсс 11100 адссдаадса аддаассата асаадададі ддадаассса сссаасддсра ссдстаассс 11160 асссдсадес ададааадса даасдіссас астсасдссс ааддаєссад асттссдаатс 11220 сдааасаада дасададаас асдсаадсад ассаадсадс даассстаадд аасссуєтад 11280 70 ддадаададд дасдсаддса адсссаасді аадсдасадс ададасадсс асдатаєстс 11340 тсассасдса адасастадас сссасдадад асстстсдса асадсдсета додатсадсає 11400 сааддастаєс стсдасдудєд саасстддса сстсдаааас деЕссссдаад дсассдатад 11460 сдассттд стдсссдааа дасдсаасді ссссадаасд сстаасддес стсадсадатс 11520 сстІсааддає сісадаєсса дасасддсраа ссттадасає ддасасддсраа ссдсааатдче 11580 аассдсаастд стада сссдєсдсд ссдуаєааєстд ссдсаааатєс сстдасадка 11640 ассдадаєсстс сааддасдаєсда дадсдадесуд сдадесоасає дасдадеєсо дсдадаєсда 11700 ддасддсдад сссасасаді ддадассдад даасдддааєс дсдадсдеєса асестдсата 11760 дадастасасає ддаєес дуддсеєсасас дсадсаєсає ссасдсааас дсадссаата 11820 сасастасдає ассссаасаа сусусдддаа стасаасаєсдс сдадсаєсьє астааєста 11880 дсаасдасаа дсдсасаєсє ддаєсаєстє асттддсесес кстсдсеста асссддаєта 11940 теЕссттаєсьст сттассттдд ссадассатає схсасаєсссст аааддсаада садаастдаа 12000 тадсддссаа ааассаааас дасддасасд асстасастад тдсаддаєса астаасаєсд 12060 ааддааааста стдаєсстісї саадсасасуд дасаадддса аасаасасад ссассадаас 12120 асаасаааса аааадсдсад аадсаадасі ааааааасста дстастддаса сссаддесса 12180 тассддааас аксасттаєсс тадесетдсд ассасссттс стсстадстст адссдадада 12240 ссттдддасі аасдададдає садссдддає адсадаєсст тассстддас тадссеесст 12300 ддаєдессад адссессусд ссдссуєста саєстаєстс саєстаддаєсє даадаєдаст 12360 стссасасса асдасдеєса аддестстає сстастсста дсттдсаата сстддсетдс 12420 аасасстудда дсассдсдса сдаєсдаєсдуд асастусдда дааддадсдє ссдседась 12480 ададсссссд дЕтддуєдає ссдастссда кессадесса дасттуєсда аасесеетсад 12540 десссастає даадсстсста дадсесдадс сесстсссає дсстаасдсст сдассдаата 12600 стЕсстадада ааадддааді сдаєстстда дсассдааасє сдаадсдсас атс 12660 аасдсдссса ассаасссас ааасааадса даадасаддї аасстсесає асттатаста 12720 асаадсааста дістстассдс сасдсаєсаає аасдустсдє хсстсаада ддддеЕсесс 12780 дасасссата асдасссдаа дсстсаєсдаа адсаєссаддд аадаасесеє дасте 12840 десасддсст ссасаддасдс садссдадсс сдссаасссс сдхссдастуд дстссдсааа 12900 асасссдаас ддсаадссасє ддасеєсдсаа ссасаастсс асддасаєсда дсаддасста 12960 ттдсдаадас ссасстсатд дадсттсада асдсддаєсдє садсааасса асдассдааа 13020 тссассасає дасддасдсіс садсдддаєда дсдааасдаа асаддаадсд сстасстетс 13080

Зо ададссдсда дстссасасс ддассссддс аастасдсді сдддасаддсес ссдссоатаєтт 13140 ададасасдє сдаддсадас ссасстдсдс сасссдсаса астасдадад стдсесе 13200 тасдаєсьсс стадеесстс деЕсдастддсд адстсатаєо стасаєсдста тдасстстса 13260 асдусденсс стдссаєсту асассссуєс асстдсаєсс асдідсдссд сстсссдсдс 13320 саадсссста ддсдєсасдс асдссааасс дасддасдуєд сдддстдссс тасасесст 13380 ассдасаддає ддаддаєєдад сссдддадес тссдсддсда хтаддсадсддуд ссдасдаєєт 13440 ддасдсдаде дасддсаєсд ассааєсстас есттдсеес аааєстстттд дсадааааса 13500 асссаєссада ссадаассдд ааассададі даєсдадасдд ассаадссад ассссаасад 13560 адссасаєст стсаадааас аасдсаассс стттадастє тататаєссуд саастааааа 13620 аасаассстаа стттстадаст стасасасад сестаасаас таадесстаас састстатта 13680 тссастаєссда аастаєсстує асдустсссс хстааатааа сттдасаєстд хтдстасада 13740 асстасаасс ааасаассаа стасссаастуд ааадсесдсдс адссааєтсда адддаєсаас 13800 ддссаааатд састадсаєі ассаассдаа тадаєссаса стадаєсддес аттсссатса 13860 аксассаєсдс сдеЕкстест студсссасат ассссстстуд ааастсдада дасасстдса 13920 стссаєссдєс стстастасді дссасаааасє дааасссатуд сатссатдса аастдаадаа 13980 таддсдсаада асссттсссс хссастсстї асдсддсдас сатссаттсс ассатстссс 14040 дстасаааас асссссаєса сттсасстад аасаєсаєса стасттдсес асссатссаа 14100 аадасассса сттттасаас аастассаас аасаасааас аасааасаас астасаатта 14160 састсасаасє тассатасса тдссасстад сдстдстаад сааатдддад стестастда 14220 тасессасдсе дадасадасстастуд астстестдс т есассада ааддатаєстд стдатадасс 14280 тдаєстсасс ахсдастодддад ассстдссса сдасдстаад дстессадає стдадсатсс 14340 тадсдадасдсе састссдєс сеттдєссдо аддаададає дстастдада сттесатсдда 14400 асассатада адддсесддс стаадсстад аасудсєстада ссссасдєсу дасстсттдс 14460 те2стастдад даасстуєсд стдстдаєсда дддасасстє саастетдсд стаддатсдс 14520 таадастддтд сстестає стсстддаєє сдстсстдсе сттастддд ссааддстад 14580 асттассстї ддаєсстдста ссдстстсда ддастстасатд стттасдстуд дааададаст 14640 тстссстЕсТ ассасесттд дасддссес сдсесттаєс ддасстсааса хссадсатда 14700 тастаассає дасасестуДЄ стаадестдс ста стаас сттдстстта дастттасса 14760 ддаєссддаєс ддаддаєста сдасссессуд дсеЕссаадад сатдєсдета тдсассасся 14820 ссасастаас дасдєсдаста аддаєсстда ссааааддсс сасддсдстс стадастсаа 14880 бо дсстастдає дсетдудєсас стасдсаєсу дсессадсає сетттасстес ткодсстддоасда 14940 дастасдсрас дсттссаадс ст ссст сдасаєстст дадсестдєса соахддсаєта 15000 ддаддадєдад сстасстста адсетстдстдуд астасстстес асдсстестс тдсттстсаа 15060 дсетасстсс тдддстадає ссдекдсее дсстстетас сттдстсстх статесатас 15120 тастдасуаєуає ассдстдста стадастасдас хтуддаєсстесс тасстсдастє єстсстсст 15180 65 сасстсссас аастссдадд дсдесдсесс хуссддасся дасддаєста хсасесстат 15240 дастададає дстадсессс стаададаса адсстдадаст ссесстаасд ссддаддасс 15300 тстеЕсСттдсСя астстстаасуд дсддасссаа стассааасї дадсаєсаст хтатессстад 15360 адсссассає ддаєссстасс стадасттдс хсстсттуЄс ааддссдадс сдаддстад 15420 аддааєсдад стасаадсаст ассстастає стддестаас сттдстеста ссстсадаса 15480 70 тасдсасдсе сттддаадаа ддсстадаєс хтааддссдад саасдасаад сттатдсдас 15540 дсдааасаасє аасддсаааа сасасдсаасє аасаасааса асааадссас ааадсдадаа 15600 тааддддаад дддааасдсд саасдадсса дсадссддсад дсастааєтсе сдстассатає 15660 тассаасааа ссасдааєссє кдд асдтдесс ссаааєссатд аасттттааатє 15720 т2сасаааає аасстссааї сддаадааса асаєссссата хссатдсата датдсесст 15780 тасссааасс тадесстсда даддаєдаад сассассдаа садесстодса астастссстс 15840 аааадсссста ааасдаасаа сааддаасад адсаасдієс сааадаєссс ааасдаааса 15900 тассаєстає астаастаста тасстаєссаає тастастдсс сддаассаса ахссстдаат 15960 даєсссстасєс аастасаадс сттдаєсдоудсд дсддадааді даєсддсдсд дсдадаадса 16020 дсаддасссдуд адасдаддсес ссддаадаєс сдадесдаас дддсадааєс адсастессс 16080 тЕсдасдєса ассдаєсста састатдастад дссатассса хсастестаає еттддссас 16140 сасссааєссс хаєсттдсст сстадддаєдс даасаєдаас ддссааддса ададаатааа 16200 аасаасссаа ассааадсаа дададдссаа дсаадаєсаає ссааасдсас асттдссатт 16260 дссааааєста дсаааасасі сддсатаєсуд стасссссаса саєттаєсааа атассудсата 16320 тасассддсе дсаєсстдсає даасаасасі асдідсаадс ссаааадаас ссасасасад 16380 сссатдсааа дісаасастс асдассссає ксстсадест ссастатата аасссассатє 16440 ссссаасстс ассааассса ссасасаастї сасаастсас сстсасасст тааадаасса 16500 ассассасса аааасссстас аасаасстасс аасаасааса аасаасааас аасаєстасаа 16560 тТсасаєссас аастассата ссатдадсдс хдаєтассдєє астддаєстд ассстаадаа 16620 сададдаєсі їстадсааса ссдадсаада ддесссаааа детдсстаєсд асассаасда 16680 ааасдідесс хстуєссстуд ассссассає сааддасаєс сттддадста сссстсатда 16740 дсдссасдад адаадаєсдд стасстстст стастасуєд сссададата ксесстдсат 16800 дсетассасс ддасасстта сссастаадає сстттассст стсстсатст сттасасстс 16860 таасадсаєс ассаадссса сттестдддс сстттасаст тасдісєсаад дасьтессад 16920 аассддааєс хтддуєсстсд стсаєсдадсуд сддасаєсаа дсеестстуд астасддаат 16980 сдєдаасдає сссуєссддає ддассстсса стсттасстт асддеєссстє асессадста 17040 даадсасссї сасддааадс ассасааддс тастддасас асдассадад асасддєє 17100 сдксстдсс ассааададд аасссаадаа дестаддаас сстсддаса асстсдстда 17160 дсассстдад даєссстссас стадаассст ттасдадсес сттуєссаас аасттддада 17220 асддаєсдсе хтасстстссд сстаасуєсас аддасаасст тассстдата сссстстта 17280

Зо дааасддаас састтстддс стасстстсс асттссдад сааададатд стстстасат 17340 стЕсст тс дассттддаа ссстсассса ддадаассуєє сттассстс ддсасаадаа 17400 асссддадда хддіссст ссассаастуд деЕссдеЕесст тасаєстддд ссаассаста 17460 дсесдес ассасаєссс тссадсасас тдассстаст асдсстсаєс асаасдстда 17520 ддаасддасі сєссдстаадд дсдстдстдс тастаєсдає адаааденссуд даєссаєсда 17580 асстсасаєс тсссасдата ссассдадас ссасдідсес сассастаст деЕсстаддат 17640 сссаєссстас аасдстадас стдсесстда ддстаєссаад ааадссаєсдд дааадсаста 17700 саддуестадс дасдадааса сдсддаадес астттддаад ссттесаддс сттдссаата 17760 сдссдасдає дасаасддрд ксстсасдес ссдсаасаєс аасаастдсуд дадссддадс 17820 тастдадаад саасдааддда дедассдаєї асдадаєсдс асааадасас тастаддсде 17880 тааддаєсдда саасаасаає аасаасдада сдаасдсдє ссаадестадеі дсаасадста 17940 таасааадад ададададад ададададад ададададад ададададад ададададдс 18000 тдасдааасд сстасдастасдє сесттдс сстаааасааа сдааадсаса хтадастсатата 18060 деЕсстассда ассасссддс ддаєссстусд ддааааадес садаадддсес дссдсадста 18120 стастасаас сааддссусд даддадддса асададссад састссдата дстдстдсда 18180 тдаєстсаад саассдадда дсдадсдсас асдсадддда стддадсдсд саассддсса 18240 дасдаддсад дасаєсссадс адсадддаса дсадсаддаа дссдададдє ддаесссатса 18300 асстааасаа дсесдстаддд асстєссддд асадсдсддс асссадсста дссдатсдсса 18360 дсессаддад садсадсаді стдсасдуєє ссдаадсдду даєсдаєдад ассдсатааа 18420 дасастдста ддасдеєсаадд асдддаєаас аадасдєдєсє ссаадссаєс аассдсаата 18480 аааададада даддссдастд даасдеєсасд сасдасасдєє ссесдурєс сааааєтааа 18540 тадааадсас ахтдстсдтує ддаєсстаєс хсдаєссаааа ассссаастта тасттдаєси 18600 аасссаднсї ддсассдаді аааасаааєї сдаассааас саааасасаа асастатаде 18660 тссасасата сдсстстаад астессетстаста даактсстї таааааастає стадааатат 18720 ткдсдастст сстддсасдє аасассссує сааатаєсдаа дсдстссате етатстааст 18780 тсааасаасс ддасстдстасда ксастесст ассаадсдсє астаааатдс деЕсаатстст 18840 тідеЕсстесс ахтасссатає деісааааєст ассааааєсс ссасастаєст етесдааєтт 18900 тдаадсдааа сессдастаає стаааастаа асадаасата хсастаєстта ддастассатає 18960 тдаєсессає астсаассас тааасссддє саастссдаа адсдсасаєс аасдааааатх 19020 тадссааасд астаааасаа асааасаєсса тдрсдсстаєсса адаааассся сстатаадаа 19080 бо тассссааса дассататує ссдсаааааа аасстаассьсє стастаасаса тататетаст 19140 тассааааає ссдасааадс аадаєсаааа саасаєсссає сстаасааааа ааааваассада 19200 ааасдссдаа аасссддсаа аассдаасса асссааассуд асастадесдуд сстдоасесда 19260 теЕстдастата аассдаасса астсддісса стдсасссс таассатаат адстттаата 19320 теЕссаадата ссассааде аасдстдєса астассстдда аастстстстдсаа аасдаатссаа 19380 65 дсстасасдуд стдсаасатд аасссаааад садстсдатд стддсддасаає асдсааєста 19440 стсдаєсста аааааасаєс ссаадсаєса асаасссстд стаддаадаа ддесадстас 19500 дасссасадс ааадссадаа стасааадаас сасааадсда ссдаадсссуд ааататсасда 19560 аддаасааає ассссстаааа ааасасдсаа сдасссддаа саааадааад сдасатаєт 19620 теЕтдДсстта аасаадсаєс ссстстааад аасддсадее сєссстсдса хдсаастати 19680 70 асдстссст сдєстасаааа ассстсддасе астассддда асєсстстд аааатадесс 19740 тасаддстад стадаєсстддєє дасстддесс сасдсассад ааддсетасс стастааета 19800 ааадссдааа стстдесссс тастсааєттс стадесдсд ааасдсасдє асасдсаатад 19860 тасасаааас дсадсассста аасдастадда адсддаєссс дадассдатд ададасаддда 19920 дсадаассаа адаєдаєдас асаассаада асдааєсссда ааддссстста ддаестсдаатс 19980 стасссдада ад ссудсі сааадасаді ддасдаєсссуд аассааадаа аасаєсстааа 20040 ааассадсає ссддєсасдс ссасдсааає адааадсдду стаддаєстд ассдасааст 20100 тадастстааа дадестстста адаєссааєсс стддстдсдс асаааастас ааасаатата 20160 тЕстадаста стесддсстта астааастсс састсаттає ссастдаддає сададаасад 20220 асттдсдаасє ааасасаєсс ссдадаааста стсаєдаєсс сатаассадсі сададддасатх 20280 дссаассада їстаадааса сасаєсссст сааассссаа сдсасаєсдста ассасадаеси 20340 адсасааєсс ааааастаасуд садсаєсааа дасадааасс сдсадасьеє сеестддсах 20400 таааадаада стаадессає асдстасаєсє стассссаадс ддаааассда аатетттссат 20460 сдааасасасє даасссадса сасасаєсссс тдсаасдсрас тасстесдста ттесддсаас 20520 теЕссадсдда стастастсо ассасаатуає дсасддаєдс асдадессда дсасасасат 20580 дЕстааасдс асдсессдса ааасдсаасуд дассасаааа даддаєссає асааатсасатє 20640 стсатадсее сстссаєттає тІсссдасас ааасададса тсстасааса астассааса 20700 асаасаааса асааасааса стасааєсстас асстасааєі ассастассає ддаасттдси 20760 саасстстсд стдстасддс ссаададсад тасдстдсста ссдастдстає хтадастдсесст 20820 дстассткст стдстассда стстаєссдда сддддассса адсстаєстс сстдстаст 20880 ааддаєстсс стстсєсда асстсстасс сстсттассс теестСТСсСт сдсттасттс 20940 дстассаєсд деЕсстддасі суєссассді ааадсуєссс стадаассді саадддасад 21000 дассстттсс тЕстсааддс ксттасдстс дстсасаасд ее сссттає содддастсадс 21060 стстасасає дсстсаадссї суєсстасдад дсестасдсда асаадсастс сттстддода 21120 аасдсттстаса ассстдстса аассдадастд дстааддєда єстддаєсеє стасдідссс 21180 аадаєстасд адсссасдда сасстссасс асдсесстса адддааасду саассаддє 21240 тсстссстсс ахтдестстасса ссасддаєст асстстоддаа хстдасддає дассасттатє 21300 дстдстссад дсддадаєдс стасесстст дстдсестса астсттдддає хсасдтасас 21360 асдсасасстї астастссає ддстдстде сессстаадд асдаааадас саададааад 21420 тасстсстдуає ддддаадаста ссттасссад асдсааатдає хссадессте сатдаассту 21480

Зо стссаддастуд етасстсст стастсттст кстссттасс стаадсссає кдстсаастс 21540 стсдЕтЯЄ асасддєтас сстсстсатуд стттссддаа астсстаста сасдаадсас 21600 сасдстсста адсдасаадд дссдссдсса тдсдасадає сдааддаада аадсдсаата 21660 адасдастстї састасссда ссдстадсда сстдссаєстдсє сасасасаає аатдетасст 21720 тусасаастї ассдсаасдс асдсдааастї асаасасаєс аассстастт ассатаєсдат 21780 аасастстсс ссассттаааа сісттудєсаа ссттааадата стаадаєсстє саааєсдаєта 21840 ааааааасає ассасааасєсї саассастсс тастаасааа сстассааєсста стасстаєттад 21900 ассааааааа стастстастасі аасстсадсссї даасадааса ассадаєсст адсстдсада 21960 дсддссдсдд ассссастддда дісааадаєі сааасададд асстаасада астсдссдта 22020 аадассддсд аасадсссасє асададсссс стасдассса асдасаадаа дааааєсттс 22080 дісаасасдуд тддадсасда сасасттуєс тастссаааа асассааада сасадсстса 22140 даадассааа дддсаассда дастєсссаа сааадддсаа стасссуддааа сстсстсдда 22200 тиссаєстдсс садстаєстуд хсастетаєті дсдаадаєсад тддаааадда аддасаддстсс 22260 тасааасдсс ассастдсда саааддааад дссассдєсд аадасдсестс тдссдасадс 22320 ддаєсссааад асддассссс асссасдадд адсаєссдідд ааааадаада сдесссаасс 22380 асдістссаа адсаадсудда ссдаєсдєдає асстссастуд асдсааддда сдасдсасаа 22440 тсссастаєс сттсдсаада сссттсстст атастааддаа дстсаєссттса етддадада 22500 асасддддда стдаассааа сасдадсссї дададдсдуєс стдссдааас садасстдст 22560 астдстдстуд асасддсетдс хуєссдєдає ассусєдаасс астасаєсда дастестасс 22620 десаастсса даастдадсес ссааастсстї саададсудда ссдаєдаєст сдададастс 22680 саадасадає асссттддудсее кдєсдссдад десдаддадєд ссдскдссдо аассдсетас 22740 дстддасстї ддааддстад ааасдсеєтас даєсддастд ссдадсстас састсасаєт 22800 тІсасасадас ассададастї хкддасесдда єстассстт асастсасст стсаадтся 22860 асддаадссс адддаєссаа дістдсуєс дстуєсаєсуд дастссстаа сдасссттст 22920 десадастсс асдаддсест куддасасасі дстададдаа ссстстададс тдстддатас 22980 аадсасдудсд дасддсаєда сдєсддаєсс сддсааадад ассссдадсСсе ссстдсесст 23040 сстадасстуд стадассаді стасссадаєс сдаасссдсд сдаєссуєсса аасаєсстддс 23100 аасааадеє стсаадаєсд аассстдесд ссддаєсесдс даєдаєсаєс ататааттс 23160 тассдааєста сдісаадсає дсаасааєсса асасдастаасд сасдасадаєса тетатсдадатє 23220 ддааєсессає даєссададес ссдсааєтає асаєссстааса сдсдасадаа аасаааататх 23280 бо адсдсдсааа стаддасааа сстассдсдсд садсдесаєс тастуаєсаста даєсастадие 23340 дасдсасддс саааассасс ссадсасаєі ааааасдісс дсаатдаєдаєс ассаадетде 23400 стаадсдуса асстдссас ассасаатаєт ассстдссас садссадсса асадстсссс 23460 дассддсадс хсддсасааа ассассастіс дасасаддса дсссатсадс сс 23512 «2105» З 65 «2115 1254 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії 70 12 десатурази гаспапсеа КІйумегі в рослинах

«4005» З асдадсдста стассдетас тдадаєстдає сстаадааса даддаєстсс тадсаасасс 60 дадсаададд стссаааадт тастаєсдає ассаасддаа асдідестс тд ссстдатх 120 т Есассаєса аддасаєсст туддадстаєс сстсаєдаді деЕсасдадад аадаєстдаси 180 асстстстст астасдтдссї сададастаєс сстдсаєдс сстассассдд ахкассттасс 240 сатаадаєсс жтЕтассстст сстсаєстст тасасстста асадсаєсає саадсссасе 300 тЕстдддссс те срасастта сдіїсаадда стттссуддаа ссддааєстду даєсстсаси 360 сасдадсдсад дасаєсаадс ЕЕстстдає тасддааєсуд тдаасчдаєіє сдсддатда 420 асссттсаст сттассттає дассссттас есадстдда адстастстіса тддааадсас 480 сасааддсста стддасасає дассададає ахддаєссд єЕсстдссас сааададдаа 540 тЕсаадааді стаддаастє сттсдасаас стсдстдаді ассстдадда кестссастт 600 адаасссттс асдадсетст хтассісаасаа сетдуддаддає ддаєсдстта ссесттст 660 аасдєстасад дасаасстта ссстдатаєс сстЕстсдда аасддаасса стестадсь 720 асстстссас тт тсдадса аададатасе стстасаєст сссттстда ст сддаатс 780 сесасссадда даассдеест тасістсдо тасаадааас єсодддаддаєуд дісссес 840 ассаастдає хсдессстта сасстудддаєє аассастддс хсадсееесає сасаєсстсстт 900 садсасаста ахсстастає дсстсаєтас аасдстдадда аасддась сдстааддах 960 дстдстдста стассдасад ааадсссудда кссассддас стсасаєстс ссасдататс 1020 ассдадассс асдідсесса ссастастдсє сстаддаєсс саєссстасаа сдстадасст 1080 дсесстдадд стаєссаадаа адссасддда аадсастаса ддістадсда сдадаасата 1140 тадаадссас тестддаадсс теЕссаддест хдссаатасд ссдасдаєда саасадтаєт 1200 стсасдєссс дсаасаєсаа саастдсдда деЕсддадстуд стдадаадса асда 1254 «210» 4 «2115» 416 «212» Білок «2135 Іаспапсеа КІшпумегі «400» 4

Мес б5ег Аїа ма! тийг о ма! тийг сіу 5ег А5р Рго Гу5 АЗзп Агуд су 5ег 1 5 10 15 5зег бег Ап ТИг сім сіп сій мМмаї Рго Гуз ма! АТа ІЇїе д5р ТЕИг А5Пп 20 25 30 с1у А5зп ма! Ре 5ег маїЇ Рго Азр Ре Тпг ІЇе Гуз А5р ІЇе гГеи су

Аїа Ії1е Рго Ні5 сіи Су5з Туг сої Агд Агд Гей АТа тНг 5ег Геи туг 35 50 55 60 тукг ма! Ре Агд Ар ІЇе РМПе Суз Мет гей Ттиг о тиг сіу туг Гей тиг 65 70 75 80

НІі5 Гуз Іч1Їе Гей Туг Рго Ге Гей ІЇе 5ег Туг ТИг 5ег А5Зп 5ег теє 85 90 95 40 ІІе Гуз Ре Тйг РПе Ттгр АТа гГеи Тукг тТийг туг ма! сіп сІіу Гей РНе 100 105 110 сіу тйг с1у че тер маїЇ Гей Аїа ніх сіи Су5з Су Ні сіп АЇїа РНе 115 120 125 5зег Ар Туг сіу ч1Іе ма!Ї А5п А5р Ре ма! сіу Тер тис Геи Ні 5ег 45 130 135 140 туг Ге Меє ма! Рго ТтТуг Ре 5ег Тер Гуз Туг 5ег НІі5 сІу Гуз Ні 145 150 155 160

Ні Гуз Аїа тийг о сіу Ні мес тТийг Аг АЗр Мет ма! РНе маї Рго АїЇа 165 170 175

ТАйг гуз сім сій Ре Гуз Гуз 5ег Агд Азп Ре Ре су Ап Гей АїЇа 180 185 190 сіи туг бек сій А5р 5ег Рго Гей Агуд тТиг Ге Туг сіи Геи Геим маї 195 200 205 сіп сіп гей сіу сіу тер ІІе Аїа тТуг Гей Ре маїЇ Азп ма! тйг с1У 210 215 220 сій Рго тТуг Рго АЗзр маЇ Рго 5ег Тер Гуз Тер Азп Ні РПе Тер Гей 225 230 235 240

Тк 5ег Рго Ге Ре сЇи сп Агд Ар Аїа Ге Туг ІІе РПе гГеи 5ег 245 250 255 60 А5р Ге сіу ІЇе Гей Тийг о сіп сіу ІчІїЇе маїЇ Ге тйг о їеи тер туг Гуз 260 265 270

Гуз Ре сіу сіу Тер 5ег Гей Ре чІіе Азп Тгр Ре ма! Рго Туг Пе 275 280 285

Тер ма! Ап нНІі5 Тер Гей ма! Ре ІЇе тТйг РіПе Геи сіп Ні ТНг А5р 65 290 295 300

Рго Тйг Мес Рго Ні5 Туг А5ЗпП АЇа сіи сій Тер Тис РВе АїЇа Гуз С1У 305 310 315 320

Аїа Аїа Аїа тийг ІЇе д5р Агуд Гуз Ре сІіу Ре ІЇїе сТу Рго Ні ІїЇе 325 330 335 70 Рпе Ні А5р ІЇе Іїе сіи Тйг Ні маїЇ Ге ніх Ні туг Суз5з 5ег Ага

340 345 350 ч11е Рго Ре Туг А5п АЇїа Аг Рго АїЇа 5ег см АїЇа ІЇе гу Гуз маї 355 360 365 мекє сіу Гуз Ні туг Агд 5ег бег А5р си АЗп Мет Тгр Гуз 5ег Геи 370 375 380

Тер Гуз 5ег Ре Агуд 5ег Суз сіп Туг ма! Азр сІу А5р Азп су маї 385 390 395 400

Геи Мет Рпе Агуд Азп ІЇе А5п Ап Су оЇу ма! с1у Аїа Аїа си Гуз 405 410 415 «2105. 5 «2115 1251 «212» ДНК «2135 Ріспта ра5ттогів «А005 5 ахдістаадд тассдвдес кддаєстдад аєссттєдадд дасєстастаа дассдетадд 60 сасстддаа асдассдсаєс сІсаадсад саааадассдуд стаєсдатас сттсддааас 120 дЕссссаадад хдссадаєтста сассаєсаад дастаєссттд асдстаєссс таадсастах 180 тасдададає сістсдідаа деЕстасдєсе тасдсддєда дадасаєсдс ддстаєсест 240 дстассдсес асассддасі тасстасаєс сстстЕстсс стаасдааєт ссттадаєтс 00 дстдсетдає стдсестасає дессестаєс стосу даєсссддаає стддассстт 360 ддасаєдаді дсддасаєсс тастЕстст аастасддає дадесаасда тассассдда 420 тадасестсс астстсттує тасддеєссст хтастссадсе ддаадесстс сатодстаад 480 сассаєсаадд стастддаса сасдассада дасатдаєе ссдеЕссстта сассдссдад 540 даасссааад адаадсасса адсстассадс стссасдата ссдстдадда аастсстатс 600 тастстуєтт ссдстстст деЕсссаасад стсддаддас сестстета ссттадстаст 660 аасдстастад дасаасстта ссстддтаєе єстаадесст ссаадсстса стастадссе 720 тстадссстд ЕЕ Есдасаа дааддастас тддсасаєсд Ес стда кстсдддаатс 780 стЕтдстассс хсастсстдс стасассдсе тасааддаеєє ссддаєьсстуд дсстасттс 840 ассасасдає єстдєссттуд дасссттуєс аассастуддс стдсесесде тассттсст 900 садсасассд аєсстестат дсстсаєсас даєсдсесаад адстудасьсє содстаададе 960 дстдстдста стассдасад ададесссудда ассстсддаа ссасстссса сдасаєсатс 1020 дадасссатд хтдстссаєса стасдісєсса аддаєсссає сстассастдс тададаадст 1080 ассдадсдса їсаадаааді тасудддадад састасадас асассдаєда даасатотда 1140 десадссе ддаааассттуд дадаєссєстдс садссдсд адаассатда тддсдсдкас 1200 асдесссдса астдсаасаа сурєссддадсд аадсстаадд асасстдатд а 1251 «2105. 6 «2115» 415 «212» Білок «2135 Ріспта ра5ттогів «4005 6

Меє б5ег Гуз ма! тиг о маї 5ег сіу 5ег сій ч1Їе Гей сіи сіу 5ег ТНг 1 5 10 15

Гуз Ттийг о маї Агуд Агуд 5ег с1іу Азп ма! АТа 5ег РПе гу сп сп Гуз 20 25 30

Тс Аїа Іїе д5р Тс о РИпе сІіу А5п ма! Рпе Гуз ма! Рго А5зр Туг ТНг 35 40 45 чІ1е Гуз А5р ІЇе Гей А5р АЇа ІЇе Рго Гу5 Ні5 Су5з Туг сЇи Агд 5ег 60

Ге ма! Гуз бег Мет 5ег Туг ма! ма! Агдуд А5р ІЇе ма! АТїа Іе 5ег 50 65 70 75 80

АЇїа Іїе Аїа туг ма! сІу Ге Ттиг туг те Рго Гей Гей Рго Ап си 85 90 95

Ре Ге Агуд Рпе АїТа Адіїа Тер бек Аїа туг ма! Ріпе 5ег ІЇе 5ег суз 100 105 110 55 Ре сіу Рпе сіу ІЇїе Тер ІЇе гей сІу Ні5 сіи Суз5з сіу Ні5 5ег АїЇа 115 120 125

Ре 5ег АЗзп Туг сіу Тгр ма! Ап А5р о тйг ма! су Тер маї гГеи нН1і5 130 135 140 5зег Гей ма! Мес ма! Рго Туг Ре 5ег Тер Гуз Ріпе 5ег Ні АїЇа Гуз 60 145 150 155 160

Ні Ні Гуз Аїа тТйг о сіу Ніб5 Мет Тйг Адгд Азр Мет ма! Рпе ма! рРго 165 170 175 туг ТНг АїТа сіи сій Рбе Гуз сіи Гуз Ні сіп ма! тТНг 5ег Гей нів 180 185 190 65 А5р ІІе Аїа сіи сій Тйг оРго І1е туг б5ег ма! Ре АїЇа Геи Ге РПе 195 200 205 сіп сіп Гей сіу сІу Гей 5ег Гей Туг Гей АЇїа ТНг А5Зп АЇа тйг с1У 210 215 220 сіп о Рго ТтТуг Рго сіу маЇ 5ег Гуз Ре Ре Гуз 5ег Ніз Туг Тер РгОо 70225 230 235 240

5зег б5ег Рго Ма! Ре А5р Гуз Гуз Азр Туг Тгр Туг ІЇе маї Геи 5ег 245 250 255

А5р Гей сСіу ІЇе ге АЇїа тйг о Ге Тийг об5ег о маї Туг типг АЇа туг Гуз 260 265 270

Ма! Рпе с1у Ре Тер Рго Тис Ре ІЇїе тТйг Тер Ре сСуз Рго Тгр Іе 275 280 285

Гей ма! Азп Ні Тер Ге ма! Ре ма! тис Ре Гей сіп Ні Тйг А5р 290 295 300 5зег бег Мет Рго Ні Ттуг А5Зр 'АЇа сіп сіи Тер тйг Рпе АїЇа Гуз сіІу 305 310 315 320

Аїа Аїа Аїа тиг ІЇе А5р Агуд сім Ре СсІу ІЇе гей сЇу ІЇїе ІЇе РПе 325 330 335

Ні А5р ІчІЇе Іїе сіи Тк Ні маї гГеи ніх ніх туг ма! 5ег Агд Іїе 340 345 350

Рго Ре Туг Ні АТа Агд сім Аїа тийг сіи Суз ІЇе уз Гуз ма! мес 355 360 365 с1у сіи Ніб5 Ттукг Агуд Ні Тс Ар сої Азп Мет Тгр ма! 5ег Геи Тер 370 375 380

Гуз ТийгоТер Агуд б5ег Суб сіп Ре маї си А5зп Ні Ар сіу ма! туг 385 390 395 400

Мес Ре Агд Ап Су А5п АбЗп ма! су ма! Гуз Рго Гуз А5Зр тег 405 410 415 «2105 7 «2115 1392 «212» ДНК «2135 Міскготопа5 ри5з1!їа «4005 7 асдідсссдс сдаадасдда сддссдаєсуд хссссдсдає сдссдстдас дсдсадсааа 60 тсстссдсду аддсдстсда сдссааддас дсдісдассд сдсссдесда Естсааааса 120 сеЕсдадссдс асдадстсадс дасдасдсєс дадасдсдає дадедсодсдє ддаддасдес 180 дадсасдасд ссасааастї сааасасссуд ддаддсадсд єдастаєсста саєдстсдсад 240 аасасдддса сддасдссас ддаддсдсс ааддадессс асатдсдаєс дсесааддсад 300 тадаадасдс ссададсдсе дссдісдсдс сссдсддада ссааасдсад сдададсдад 360 дасдсдссда хтдастддадда єсссдсдсдо хдасдсадсдд адсусдаасд сдасдддетс 420 0 тетаадссст сдасаасдса сдісдсдтає сддетастсд адстсстсдс дассттсдсс 480 сесддсассд ссстсатдта садассдддстас ссдаєсаєсд сдхссассдє деасддасадса 540 тІстЕсддсуд стсддсадсдо єкдддЕссад сасдадддсд ддсасаастс дстсасддаа 600 тссудєстасуд ссдасаадсд сстссаадсуд асдасдєдсд ддессдддсе дессасдадс 660 ддддаадасді ддаассадасє дсасаасаад сассасдсда сдссдсадаа адсдаддсас 720 дасаєсддасс хддасасдас ссссдсдастд дсдаеесса асассдссдє ддаддасаас 780 сддссдадда ддасесссд сасдддасе сддсессадд сдєддасдеє сдесссдата 840 асстссдддс хдстсдісса дасдеєстдд аєстасдєсс тдсасссдсд дсадатаєта 900 сдааадаада астасдадда дасдЕсдсдо ахтдсесдєсяе стсасассдє саддассдсад 960 дсдассааас хсдсдасддд дсастсдідд сссдусдсЯє астддасддаєє сассттсдас 1020 аастддаєсд сдсасаєсдсра сстстссдсуд састтстсса сдадссасас дсасстсссад 1080 десдсдссс суддасаадса сстдадстду дсдаастасд сддссдаєса сассдсддас 1140 ассдасссасє сдсдсдддса сдєдаастдуд ссдасдддає асстдаастуд ссаддусатт 1200 сассасстадсє хсссддасає дссдсадеес сдссадссдуд аддасдадссд дсадеЕссдєс 1260 ссадасссдсда адаадсдуддуд дседаастас ааддсдстдє сстаєссасдд сдсстддаад 1320 дсдасдєстї сдаастсдда сааддуесддуд садсастасі асдісаасдд сааддсоддад 1380 ааддсдсасе да 1392 «2105» 8 «2115 1395 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії

Місготопах5х ризі!їа б десатурази в рослинах (версія 1) «А00» 8 бо акдідссстс стаадастда тддаадаєся сстсстадає сетссасттас саддістааа 60 тстеСтТСтТЯ аддстсттда тдстааддат дстестаста стсстастда сстсаадаст 120 сЕсдадсстс атдадсетадс тастасттсс дадастадає дддесададі сдаддасдет 180 дадсасдатад сдастаастї саадсассся дасодаєстд сдаєстєста сатдсетдси 240 аасастддса стдаєсдстас тдаддсессс ааадаастсс асатдсдетс тсесааддст 300 65 ходаадаєдс стададсеес дссесстада сстдстдада єсаададаєс сдадестдад 360 дасасесста хдстсдадда сссдстада хтддсдтастд адсесдадад адаєтддаєтс 420 тссаадсстї стаєсассса тдєддсттас адастсстсд адсттсттдс хтасаєтсаси 480 сттддаастуд стстстасдса сдстддасас сстассаєтд стестуєтає ссасдатаси 540 тІстхсддад стадатаєдд асдддаеєєсаа саєдадддсд дасасаастс хсттассдда 600 70 хстдетасд хтуддасаадад асттсаддст аєдасттводсод дасссддасе естасттся 660 дасдадасдс ддаассадає дсасаасаад сассатдста сссстсаааа ддсадасас 720 дасаєсддаєс тдасассас хсстдстата дстеЕстеса асастдстді сдаддатаас 780 адасстадад дасссестад адсттддасі адастссаад сттддасеьсє сдексстат 840 асстстддас Есттдесса аасестдд асстасдес тссассстад асааадттстс 900 сасаадаада астасдаада дасеестсдд асдсесавес стсатаєтдс садаассдст 960 дссассаадс ссдстастдоа асастсттдд сстдеЕсдс астддасдаєє састессдадаа 1020 аастддаєсд стстасаєсдста ссттессдсе састестста сттстсатас хсасстссси 1080 дестдаєессає стдасаадса ссттсттдо дссаастасд стдассдаєса сассдетдатє 1140 ассдаєсстс стададдаста сурєдаастдд стсасдддає асстсаастд хсаддетатс 1200 сассасстст хссстдастаєї дсстсааєтсс адасадсстд аддасєссадсад аадаєсссдєє 1260 сстттсдста адаадсдддд астсаастас ааддсдсест сттастасдд хтасттсдааад 1320 дстастстсст стаасстсда сааддсддда садсастаст асдісаасдд аааддстдад 1380 ааддстсасе аасда 1395 «2105» 9 «2115 463 «212» Білок «2135 Міскготопа5 ризі!їа «А00» 9

Мек сСуз Рго Рго Гуз ТИг А5зр сіу Агд 5ег 5ег Рго Агу 5ег РгоОо Гец го 1 5 10 15

ТК Агуд 5ег Гуз 5ег 5ег АЇа сім АїЇа гей А5р АЇа Гуз Ар АїЇа 5ег

Тиг АТа Рго ма! Азр ем Гу5 Тиг Гей сіи Рго Ні сій Гей АїЇа АїЇа 25 Тс Ре сіи Тиг Агдуд тер ма! Агд ма! сій А5р ма! сіи туг Азр маї 60

ТВг о АЗп Ре Гуз Ні Рго сіу сіу 5ег ма! ІІе Ре Туг Меє гГеи АїЇа 65 70 75 80

А5п Тс о1у АТа д5р Аїа тйг сій Аїа Рйе уз сіи Ре Ніх мет Ага 30 85 90 95 5ег Гей Гуз Аїа Тер Гуз мет гГеи Агд АЇїа Гей Рго 5ег Агд Рго АїЇа 100 105 110 соми че Гу5 Агуд 5ег сіи 5ег сій Азр АЇїа Рго Мет гей си А5Зр РНе 115 120 125 35 АїЇа Агуд тер Ага Аїа сій Гей сій Агуд А5р с1у РБе Ре Гу5 Рго 5ег 130 135 140

ІІе тиг ніх ма! Аїа туг Агд Гей їеи сій Ге Ге Аїа Ттиг РПе Аїа 145 150 155 160

Гей сіу ТиПг Аїа Гей Меїс туг АЇа сіу туг Рго Іе ІЇе АїЇа 5ег ма! 40 165 170 175 ма! Туг с1у АТа Ре Рпе сіу Аїа Агд Суз сіу тгр ма! сп ніх си 180 185 190 сІ1у с1у Ні А5п 5ег Ге Тийг сіу 5ег Ма! Ттуг ма! Азр Гуз Ага Геи 195 200 205 45 сіп Аїа мес тТиг Суб с1у Ре сіу Гей бег Тиг 5ег сіу сім меє тер 210 215 220

АЗзп о сіп Мет Ні А5п о гу Ні Ні АЇа Тйг о Рго сіп Гуз ма!ї Агд ні 225 230 235 240

Азр Мет А5р Гей А5Зр ТИг о тТйг о Рго АЇа ма! Аїа РПе РПе А5п Тиг Аїа 50 245 250 255 ма! сій А5р АЗп Агу Рго Агуд соЇу Ре 5ег Аг АїЇа тгр АїЇа Ага гГеи 260 265 270 сіп Аїа Тер тс РБе маЇ Рго ма! тйг 5ег с1у Гей Геи маї сіп Аїа 275 280 285 55 Рпе Тер чІІе Туг ма!ї Геи ніх Рго Агу сіп ма! гГеи Агуд Гуз Гуз А5ПпП 290 295 300 тукг сої сі Аїа бек Тгр Мет Ге ма! бек Ні ма! ма! Агд тиг Аїа 305 310 315 320 ма! че гуз Гей АЇїа тТийг сіу Ттуг 5ег Тгр Рго ма! АїЇа туг тер Тер бо 325 330 335

Рпе Тйг Ре сіу А5зп Тгр ІІе АїЇа туг Меє Ттуг Гей Ре АїЇа Ні РНе 340 345 350 5зег ТИг об5ег Ні Тйг Ні Ге Рго Ма!Ї ма! Рго 5ег А5р Гуз Ні Ге 355 360 365 65 5зег Тгр ма!ї Ап туг АїЇа ма! А5р Ні Тийг ма! Ар ІЇе А5р Рго 5ег 370 375 380

Агд сіу туг ма! Ад5п Тер їеи Мет сіу Ттуг Гей А5Зп Суз сіп ма!ї Пе 385 390 395 400

Ні Ні Гей Ре Рго Ар Мет Рго сіп Ре Агд сіп Рго сіи ма! 5ег 70 405 410 415

Аг Агуд Ре ма! Рго Ре АїЇа Гуз Гуз Тер с1у Гей А5зп Туг Гуз ма! 420 425 430

Ге 5ег Туг Туг С1уУ АЇїа Тер Гуз АЇїа Тийг РМПе 5ег А5п Гецй А5р Гуз 435 440 445 ма! сіу сп Ні5 Туг Туг ма! Азп су Гуз АїЇа си Гуз АїЇа Ні 450 455 460 «2105 10 «2115 1449 «212» ДНК «2135 Оо5х1геососсиз ІТсітагіпив «400» 10 асдсдсдєсд ааасдассда аддсасаєсуд сдаасдаєсдд сдаасдаасуд сасдадсесад 60 тсдЕсдЕсдс тдадсдаадд сддаасдссуд асддудасдд ссддадаєсддда аадсдаадас 120 дсддддаада адасссдааа сдсдадсдаєс асддсдсдда сдааададеї ддадссдсас 180 дсдаєсдсда адасдеєсда асддсддсас дедасдаєсд ааддсасдда асасдасатад 240 асддаєьсста адсаєсссдуд аддаєсдаєс асстаєстаса тдстдІсдаа сасдддадсад 300 дасадсдасда аддасеестаа ададеєесає тассддісда ааааддсдсд сааддсаєта 360 дсдасдсдс сдсасаадсс адсддасдсд дсдасдсддд аассдаєсда адаєдаддсад 420 асдстдаадд ассісдсдса дсддсдсаад дааєсддадс дедадддаєє сеесаадссс 480 жсдссддсдс асдіддсдста сєсдаєстсдсс дадсесдсдд сдаєдеєсдс дстсддсаса 540 дсассдасдс асадсдсдетод дсасдесасе хссдхдаєсд сдтастсдтад есе сдас 600 дсдсдаєдса дЕсдддаєдса дсасдаддадає ддасасааєе сдсдассдд ааасаєесдд 660 таддасаадс дааєссаадс стесдссдсд дадессддсе тддсодаєсдад сддасдасата 720 тадаасааса тдсасаасаа дсаєсасдсуд асдссссааа аддсдсдаса сдастаєддах 780 сесдасасса стсссасдає дасдеєстсс аастссдсдд єсдаадаааа ссдсссдсда 840 ддасссадса адстдєддає дсдсстссаа дсдхддасся ссдедсссдє дасдіссаде 900 асдаєькас єстстддає деЕссдєсттд сасссдсдва асдсдстдсдуд асдсаааадс 960 тІсдаадаад сддасттддає деЕсесссдса сасдусаттс дсасддсаді тассааадсс 1020 десассддсе астсстддає сдсстсдсас дасттуєссд сддсдасдає дсдддасдадс 1080

Зо ддасдестаст хусєссдсдса стетессасуд сстсасасдс асттддаєсдс сдатдссдадс 1140 дасааасасс хсІсдсддає дсдасасдсес дісдаєсаса сдаєсдасає саасссдаас 1200 аасадсдєсуд хсаастдуєс дасдддсетас ссдаастдсес аадссаєсса ксасстаєтс 1260 ссадасаєсдс стсадесссуд ссаасссдаа дістсссдсес даєсссуєссс діссдсдаад 1320 аадсддаасі сааасстасаа ддаесесдасд тастасдудад сстддааддс дасдессдас 1380 аастсдаасд асдісдддаа дсастаєстас дсдсасддає сссадсдсді саааєссааад 1440 тсоадсдсда 1449 «2105 11 «2115 1449 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії

Оо5їгеососси5 Іисітагіпи5 б-десатурази в рослинах «4005 11 асдсдкдєса адастастда дддаасстсї адаастаєсдд стаасдадад дасстстся 60 ст ЕсСттсас тстстдаддд хддаастсся астдетастд тдддааєсддда асстдаддах 120 дстддааада ааассадааа сдстестасе астдсесдда ссааададст сдадсстсас 180 дстаєссдста адасстсєсда дадаадастас детассаєсд адддасаєссда дсасдататад 240 ассдаєтсса аасассстдд хадаєстаєд асстастаса тдсестстаа састадатадсе 300 дасастастад аддстссаа ададеєссас хтассдесєста адааддстад аааддсестт 360 дстасесетс стсасаадсс хастсдатасі дстастадад адсстаєссда ддасдаддсе 420 асдстстаадд асстісдстса дсддадаааа дадесддада дададддаєє сесаадсся 480 хсСтсСстдстсС асдетдстта ссдЕсссдсе даастсдстд статадаєтсдс стсддаасс 540 дсесттасдс атастадатд дсасдетасі адсдеєтаєсд татастсстд сеестссодда 600 дстадастаєсд дасдадесса асаєсдададє ддасасааст сесттассдд ааасаєстда 660 таддасаада дааєссаадс сеЕсдстдсе ддаєсссддас седстксес тдасдасата 720 тадаасааса тдсасаасаа дсассасдсе астсстсада аадсдадаса сдастатсддає 780 сЕсдастасса сссстассає хастеестс аасестдстд хтддаддаааа садасстадад 840 ддасссеста адстетддсі садастссаа дсттддасся хсдексстЯє тасстстода 900 бо аксдасдсест стЕстддає деЕссдеестс сассстадаа асдсестссдуд ссдхаадеся 960 тІсдаададда стдасттддає деЕсстстдсІ сасдсстаєса даассдстдє тассааддсе 1020 десассаддає астстсддає сдстадстас ддасессд стдстастає дсддасесс 1080 ддасдстасс ттессдстса стестстаст сстсасассс асстсдатає таєсссатст 1140 дасаадсасс стадстдудає саддсасдсхї дсесдаєсаса ссассдасає саассстаас 1200 65 аастстаєсд сдаастдудсеє ктасдддатас стсаастдсс аддестаєсса ссасстстс 1260 сстдасасдс стсааєсссад асадсстдад дсдссаадаа даєсссудєссс ттсдстаад 1320 аадсддаасс хсаастасаа ддсдстсаст тастасддаєд ссттддааддс тастессдадаа 1380 аасстсаасуд ахтдістуддааа дсастастас деіссасддає сссадададі даададсаад 1440 адсдсттда 1449 70 «2105 12

«2115 482 «212» Білок «2135 О5їгеососси5 Тисітаг1іпив «4005 12

Мет Суз ма! сЇи тйг о тйг сій с1у тг об5ег Агдуд твг мес Аїа А5п си 1 5 10 15

Аг ТИг обег 5ег 5ег бег б5ег Ге 5ег сіи сіу с1у ТтНг Рго ТЕг ма! 20 25 30

Тк ма! сіу мес сіу б5екг си А5р АїЇа сіу Гуз Гуз ТИг Агуд Азп АїЇа 35 40 45 5ег ма! тийг Аїа тер тиг гу си Гей си Рго Ні АїЇа ІЇе Аїа Гуз 50 55 60

Тк Ре сім Агуд Агуд тує ма! тс чІ1Їе сіи сІу ма! сіи туг Азр маї 65 70 75 80

Тс А5р РБе Гуз Ні Рго сіу сіу бег ма! ІІе туг Ттуг мес гГеи 5ег 85 90 95

А5п Тс о1у АТа д5р АЇїа тйг сої Аїа РБйе Гуз сіи РіБе Ні Туг Агд 100 105 110 5ег Туз Гуз Аа Агд Гу5 АїЇа ем АЇа АЇа гей Рго НІі5 Гу5 Рго ма! 115 120 125

А5р Аїа АТа тиг Аго сій Рго ІЇе сім А5р сій АТа мес гГеи Гуз А5р 130 135 140

Ре АїТа сіп Тер Агуд Гуз сій гей сій Агд сій с1у Ре РПБе Гуз Рго 145 150 155 160 бек Рго Аїа Ні5х ма! Аїа Туг Агуд Ре Аїа сій Гей Аїа Аїа Мет РНе 165 170 175

Аїа гей с1у тиг Аа гей мес Ні5 АЇа Агд Тгр Ні5 ма! Аїа 5ег ма! 180 185 190

ІІе ма! туг 5ег Су5з Ре Ріе сіу АЇїа Агуд Суз сіу Тер ма! сіп НІі5 195 200 205 си сіу сіу Ні А5п 5ег о геи Тийг су Азп ІЇе Тгр Тгр А5Зр Гуз Ага 210 215 220 ч11е сіп Аїа Ре АїЇа АіЇа сіу Ре СсСІу ге АЇїа б5ег 5ег с1у Азр Меє 225 230 235 240

Тер Ап Ап Мет Ні Азп губ Ні Ні АЇа Тийг Рго сіп Гуз ма! Ага 245 250 255

Ні Ар Мет Азр Гей АЗр ТИйг о Тиг оРго Тиг омаї АЇїа Ре Ре Азп 5ег 260 265 270

АїТїа ма! си си А5п Агу Рго Агуд сіу Реве 5ег Гуз Геи Тер Геи Агд 275 280 285

Гей сіп АТа Тер Ттийг Ре маїЇ Рго ма! тТийг 5ег сІу Мет ма! ге РНе 290 295 300

Ре Тгр Ммеє Рпе ма! Геи Ні Рго Аг Ап АЇа гей Агуд Агод Гуз 5ег 305 310 315 320

Ре сім сім Аїа Аїа Тгр Меє РПе 5ег Аїа Ні ма! Іїе Агд Тк Аїа 325 330 335 ма! чІІе Гуз АЇїЇа ма! тиг сіу туг 5ег Тер ІЇе АЇа 5ег Туг Сс1Уу Ге 340 345 350

Рпе Аїа Аїа тйг Мес Ттгр АТа 5ег сіу Су5 Туг Гей Ре АЇа Ні РНе 355 360 365 5зег ТИг об5ег Ні Тйг Ні Ге АЗр ма!Ї ма! Рго 5ег А5р Гуз Ні Ге 370 375 380 5зег Тгр ма!ї Агуд туг Аїа ма! А5р ніх тТйг ІЇе А5р ІЇе дбп РГгО А5П 385 390 395 400

А5зп бег ма! ма! Азп Ттгр Гей Мет сіу Тукг Гей А5Зп Суз сіп ма! Пе 405 410 415

Ні Ні Гей Ре Рго Ар Мет Рго сіп Ре Агуд сіп Рго сіи ма! 5ег 420 425 430

Аг Агуд Ре ма! Рго РПе АїЇа Гуз Гуз Тер Азп Гей А5Зп Туг Гуз ма! бо 435 440 445

Гей тТйг о туг туг С1у Аїа Тер Гуз АЇїа Тийг РПбе СІ1У А5п Геи А5бп А5р 450 455 460 ма! сіу Гуз Ні Туг Тукг ма! ніх сіу 5ег сіп Агуд ма! Гуз 5ег уз 465 470 475 480 65 зег АїЇа «2105» 13 «2115 456 «212» Білок 70 «2135 О5їгеососсиз таигі

«4005» 13 мес Суз ма! сіи Ттиг сіи А5п о АЗп Ар о с1іу ч1іе Рго Ттйг ма! сіи Пе 1 5 10 15

Аїа Рпе Азр ОсТУу сім Агуд си Агу АЇїа сій Аїа Азп маї Гуз геи 5ег 20 25 30

Аїа сіи Гуз Меї сіми Рго АЇа Аїа ге АЇїа Гуз ТНг Ріе АїЇа Ага Агд 35 40 45 туг ма! ма! те сіи сіу ма!ї сіи туг Азр ма! Тийг А5Зр РПе Гуз Ні 50 55 60

Рго сіу сіу Тк ма! І1ІЇїе Ре Туг АЇїа Ге 5ег А5Зп ТИг су Аїа дор 65 70 75 80

Аїа тк си АТа Ре уз сіи РПе Ні Ні Агуд 5ег Агд Гуз АїЇа Агд 85 90 95

Гуз Аїа Гей Аїа АїТа Геи Рго 5ег Аг Рго АЇа Гуз Тиг Аїа Гуз маї 100 105 110

А5р А5р АЇа сЇи Меє гей сіп А5р Ре АїЇа Гуз Тгр Агд Гуз си Гей 115 120 125 сій Аг А5р о сіу Ре Ре Гуз Рго 5ег Рго АЇа Ніх ма! Аїа туг Ага 130 135 140

Ре Аїа сій Гей АТа діа Меє Ттуг Аїа ге сіу тйг туг Ге мес туг 145 150 155 160

АТїа Агуд туг ма! Ма! бек бек ма!ї Геи ма! туг АТа суз5 Ре РПе СУ 165 170 175

АТа Агд Суз соІу Тер ма! сіп ні5 сіи сіу сіу Ні5 5ег 5ег Гей тиг 180 185 190

О1Уу А5п ІЇе Тгр Тер А5р Гуз Агу ІЇе сп Аїа Ре Тйг Аїа су РПе 195 200 205 сІіу Ге АТїа сіу б5ег сіу А5зр Мет Тер Ап 5ег Мет Ні А5пП Гуз НІ15 210 215 220

Ні Аїа Тйг оРго сіп Гуз ма! Агд Ні дор Мет А5р Ге А5р ТтигО тег 225 230 235 240

Рго Аїа ма! Аїа Ре РПе доп Тийг АїТа ма! сіи А5р Абп Ага РгО Ага 245 250 255

О1У Ре б5ег їу5з туг Тгр Ге Агд Ге сЇп Аїа Тер Тйг РПе ІЇе Рго 260 265 270 ма! тик 5ег сіу Ге маї ге гей Ре Тер Мес Ре Ре Геи Ні Рго 275 280 285 б5ег Гуз АЇа Гей Гуз сІіу сіу Гуз Ттуг сім сій Гей мМаї Тер Меє гГеи 290 295 з00

Аїа Аїа ніх ма! Іїе Агуд тийг Тер тс ІЇе Гуз АЇїа ма! тик су РНе 305 310 315 320

Тиг АТа мес сіп 5ег Туг сіу Ге Ре Ге Аїа Тийг о 5ег Тгр ма! 5ег 325 330 335 сіу Суз туг Ге Ре АЇа Ні5 Ре 5ег Тийг о5ег НІі5 ТИг НІі5 Геи дер 340 345 350 ма! ма! Рго АїТа д5р сіи Ні Ге 5ег Тер ма! Агуд туг АЇїа ма! А5р 355 360 365

Ні Тег Іч1Їе Ар ІчІЇе А5р Рго 5ег сіп сіу Тгр ма! Азп тер Геи мет 370 375 380 сіу туг Ге А5п Су5з сіп ма! ІІе Ні Ні Ге Ре Рго бег Мет РгОо 385 390 395 400 сій Ре Агуд сіп Рго сіи Ма! б5ег Агуд Аг Ре ма! Аїа Ре Аїа Гуз 405 410 415

Гуз Тер Азп Ге АЗп Туг Гуз ма! Мет тиг туг АТа сСІу АЇа Тер Гуз 420 425 430

АЇїа тийг о Геи сіу А5п Гей А5р АЗп Ма! сІу Гуз Ні Туг Туг маї Ні 435 440 445 сіу сіп ні5 5ег сІу Гуз Тиг Аїа 450 455 бо «2105» 14 «2115 894 «212» ДНК «2135 Ругатітопа5 согдата «400» 14 65 акддадесд стсадсстст тдсдодстатд дсасаддадс адсаєсдссдс аассдасдса 60 дедасадссс стодсааєтсс стсадстасс дасадсаєсд дЕсддаадЕсе саадсссатт 120 адсадсдсда саааддаєст сстстса дададсссда сдссдстсатс астдадсста 180 тЕсоддсстаєт ссдсдасєсує сддасестддадд стддсдсасс дсааадтаєс ссстсдсаса 240 дсаааддддс аадасссстї сстдстдаад дсдастсасдс ссдсдсасаа сдідессстс 300 70 акскддсстса діЕстастасає дседстсдаад сттдістасд аддстсасді саасаадтас 360 тсстЕсСт99д дааасдсеста саассссдса садассдада тддсдааддс сасстддаттс 420 тЕстасдіст ссаадаєста сдадессасд дасасдієса ссасдсестс даадддсаас 480 деЕсаассада хстстеЕсст дсасдедсас сассатддсе ссаєстстда таєстадкода 540 асдаєсасстї асдстдсссс тадсддедас дсутасттст сддсддсдст саастсдтада 600 дкдсасдтді дсасдсасас дсастастсс ахтадсддасдд хтастдсссаа ддасдадаад 660 ассаадсдса адсассестуд дсддддссдс хасстдассс адатдсадає детссадьнс 720 тссаєдаасс тдстссаддс ддстасстс стстастсст стадсссста ссссаадтіс 780 ассдсссадс хдстддедає дсасаєдаєс асдстдстда хтдстстссдда саастсстас 840 тасаєдаадс ассасдсдад саадаадсад аадстддсса дсаадаадса дхад 894 «2105» 15 «2115 870 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії

Ругатітопах согдаста б елонгази в рослинах (вкорочена на 3' кінці 1 кодуюча функціональну елонгазу) (версія 1) «400» 15 акддааєссд сссадсстст тассдстасд дсісаададс аастасдстдс таєсдатдси 60 дЕсдєкдстс стдстассте стстдстаст даєсстаєсд дасддддасе стаадсстатс 120 тсттІсСтдста стааддастт дсстсттЯстІ дадестсста сасстстсат сстттсттта 180 сЕкЯдсттаст єсоастаєсаЯає тадаєстадада стсдессаса даааддаєесє ссстадаасс 240 дедаадддас аадаєссаєе ссттеЕдаад дстісттаєдс ттдстсасаа сддеесст 300 ассададасетс сестетасає дсдсстсаад сттдтдсасд аддсестасді саасаадтас 360 жсЕтЕІст9ддд дааасдстста саассстдсї сааастдада тадстаадде тасстддатс 420 тЕстасдіда дсаадаєста сдадессасд дастассттса ксатдстсст саадддааатє 480 деЕсаассада стадсеесст тсасдеєсас сассасадає стаєстстда аасєстддатаа 540 асдаєсастс асдстдстсс хддасддєдає дсестасетст стдстдсесе таасесттад 600 дессасдтді дсасдстасас стастаєстє асддстдссд тдсесстаа ддасдадааа 660 астаададаа адсасстстуд дсддддаада стассттасіс ааасдсадає десссаднс 720 тссасдаасс тестссаддс тастстасстт сестастстт сасстсстта ссстаадеь 780 ассдстсадс хсстсдтдає дсасаєдаєє астстсстса тдсеесссдоа ааастестас 840 тасаєдаадс ассасдстад сааасдаєда 870 «210» 16 «2115» 297 «212» Білок «2135 Ругатітопа5 согдата «400» 16 мес сі Ре АїЇа сіп Рго Гей маЇ АЇа мех АїЇа сіп сіи сіп туг АїЇа 44 1 5 10 15

АЇїа Іїе А5р АЇа ма! ма! АЇїа Рго АЇа ІІе РПе 5ег АЇа ТНг А5р 5ег 20 25 30 ч1і1е сІу тер сІЇу Гей Гуз Рго ІІе 5ег 5ег АЇа ТтиПг Гуз Ар Гей РгГО 35 40 45

Ге ма! сіи бек Рго Тйг Рго Гей ІЇе Ге 5ег Гей Гей АЇа туг РПе 60

Аїа ІІе ма! сІу б5ег сіу гей Маї туг Агд Гуз ма! Ре Рго Агд тЕпг 65 70 75 80 ма! Гуз сіу сіп д5р Рго Ре Гей їеи Гуз АЇа Гей Меє гей АїЇа Ні 50 85 90 95

Азп ма! Ре Гей ІчІЇе сІіу їеи 5ег Гей Туг Меї сут Гей Гуз Геи ма! 100 105 110 туг си Аїа туг маЇ Азп Гуз Туг б5ег Ре Тгр СсІу А5Зп АЇа туг А5ЗПп 115 120 125 55 Рго Аїа сіп тк сіи Мет Аїа уз ма! ІЇїе Тер чІЇїе РПе туг маї 5ег 130 135 140

Гуз ІІе Туг сі Ре Мет А5р Тийг Ре ІЇе Мет Гей їеи Гуз СІ1У А5П 145 150 155 160 ма! Азп сіп ма!ї 5ег РіПе Ге Ні5 Ма! Туг Ні Ні сіу 5ег ІЇе 5ег бо 165 170 175 сіу т1Іе Тер Тер мет ІЇе тНг Ттуг АЇа АїЇа Рго СсІу СсСІу А5р АїЇа туг 180 185 190

Рпе 5ег АЇїа АЇїа Гей Ап б5ег о Тгр ма! Ні ма! Субз Мет Туг тиг туг 195 200 205 65 Ттуг Ре мМмеє Аїа АїЇа ма!ї Геи Рго Гуз Азр сіи Гуз ТИг Гуз Ага Гуз 210 215 220 тукг Гей Тер Тер сіу Агд туг Геи Тйг о сіп мес сіп Меє Ре сіп Ре 225 230 235 240

Ре Мет Азп Ге Гей сіп Аїа ма!їЇ Ттуг Гей їеи ТтТуг 5ег б5ег 5ег РгО 70 245 250 255 туг Рго Гуз Ре ІЇе АЇа сіп Ге Гей ма! ма! туг мес маї тНг ге 260 265 270

Геи Мет Гей Ре сіу Азп Ре Туг Туг Мет Гуз НІ5 Ні АЇа 5ег Гуз 275 280 285

Гуз сіп Гуз Гей Аїа 5ег Гуз Гуз сп 290 295 «2105 17 «2115 288 «212» Білок «2135 Ругатітопа5 согаата «4005 17 мес сі Ре АїЇа сіп Рго Гей маЇ АЇа мех АїЇа сіп сіи сіп туг АїЇа 1 5 10 15

АЇїа Іїе А5р АЇа ма! ма! АЇїа Рго АїЇа ІІе РПе 5ег АЇа тйг А5р 5ег ч1і1е сІу тер сІЇу Гей Гуз Рго ІІе 5ег 5ег АЇа ТтиПг Гуз Ар Гей РгГО

Гей ма! сі 5ег Рго ТПг Рго Гей ІЇе Гей 5ег їеи їеи АЇа Ттуг РНе 60 20 Аїа ІІе ма! сіу бек сіу Гей ма! Туг Агд Гуз ма! Ре Рго Агд тег 65 70 75 80 ма! Гуз сіу сіп дор Рго Ріє Гей ей Гуз АЇа гей Мет гГеи АїЇа Ні 85 90 95

Азп ма! Ре Гей ІчІЇе сІіу їеи 5ег Гей Туг Меї сут Гей Гуз Геи ма! 25 100 105 110 туг си Аїа туг маЇ А5зп Гуз Туг б5ег Ре Тгр с1у А5Зп АЇа туг А5ЗПп 115 120 125

Рго АЇїа сіп тйг сій Мест Аїа Гуз ма! ІчІЇїе Тер 1ІІе РПе Ттуг ма! 5ег 130 135 140 30 Гуз ІІе ТтТуг сі РіПе Мет дор Тийг Ре ІЇе Мет гей їеи Гуз О1У А5ЗП 145 150 155 160 ма! Азп сіп ма!ї 5ег РіПе Ге Ні5 Ма! Туг Ні Ні сіу 5ег ІЇе 5ег 165 170 175 сіу т1Іе Тер Тер мет ІЇе тНг Ттуг АЇа АїЇа Рго СсІу СсСІу А5р АїЇа туг 35 180 185 190

Рпе 5ег АЇїа АЇїа Гей Ап б5ег о Тгр ма! Ні ма! Субз Мет Туг тиг туг 195 200 205 туг Ре мет АЇїа Аїа ма!ї гГеи Рго Гу5 Ар сЇи Гуз ТИг Гуз Агд Гуз 210 215 220 40 Тукг Геи Тер Тер с1у Агуд туг Геи Тс о сіп Мес сіп Меє Ре сіп РНе 225 230 235 240

Ре Мет Азп Ге Гей сіп Аїа ма!їЇ Ттуг Гей їеи ТтТуг 5ег б5ег 5ег РгО 245 250 255 туг Рго Гуз Ре ІЇе АЇа сіп Ге Гей ма! ма! туг мес маї тег ге 45 260 265 270

Геи Мет Гей Ре сіу Азп Ре Туг Туг Мет Гуз НІ5 Ні АЇа 5ег Гуз 275 280 285 «2105» 18 «2115 1278 50 «212» ДНК «2135 Раміома 5аїїпа «400» 18 аскдссдссдс дсдасадста стсдтасдсс дссссдссє сддсссадсе дсасдаддес 60 дасассссдс аддадсаєсда стаадааддад стсдісаєсдуд дедассдсдс дтасдасата 120 55 ассаастсд єдаадсдсса сссдуддіддс аадаєсаєсуд сатассаддс хддсасадає 180 дсдасддасад сдісасаадса десссатастд сддаєстдсса аддсддасаа даєдстсаад 240 тсдстдсстЕ сдсдсссдує дсасаадддс тастсдсссс дссдсдстда сстсаєтдсс 300 дасстсссада адссісассаа дсадстддад дсддадддса та сдадсс деЕсдстдсса 360 сасасддсає ассдсстддс ддааддаєдаєс дсдаєдсасд тдадссддсдс сдсдстсатс 420 60 ходдсасддде асасстссдс адддсассдсс асдсссддсд кдсодсадда ссастдсдас 480 тадсесасдс асдадддсдд ссастасісуд стсасдддса асастустсс єдассдтдсс 540 асссаадсса сдідстасадд ссттддстдс ддсатдссдд дсдсдсдоєад дсдсаассад 600 сасаасаадс ассасдсдас дссдсадаад тдсадсасд асдісдасст сдасассстс 660 ссдсісдЕсЯ ссттссасда дсддастадсс дссааддіда ададссссдс даєдааддса 720 65 ходдсетадста сдсаддсдаа дсістІсдсд ссадсдасса сдстдстдає сдсастддас 780 тадсадстдє асстдсассс дсдссататд стдсдсасса адсастасда сдадстсдса 840 асдсісддса єЕсдстасдуд ссттдЕсддс хтасстсдсдд сдаастасдд сдсддадкас 900 дедсісдсЯс дстасстдсії дсасдсдсад стсддсдсса тдтасаєстт стдсаастт 960 дссасдсдс асасасасстї дссудеЕтасєс дадсстаасуд адсасдсаас дкддасодад 1020 70 тасдссдсда ассасасдас саастдстсд ссстсдстдаЯає датодсдаста дсадастаєса 1080 тасстсаастї ассадаєсда дсассасстс тасссдісса тдссодсад ссодссассса 1140 аадассдсдс сдсдддєдаа дсадссстсс дадаадсасд дсстдсаста сдасдсдсах 1200 ддастасстссд аддссасддс ддасасде єс дссаассттуд асаасдусдс дсасдсдссад 1260 дадаадаада хдсадсда 1278 «2105» 19 «2115 1281 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Раміома за!йїпа 5 десатурази в рослинах (версія 1) «400» 19 акдсстссаа дддасестта стсттатасе дсесстсстт стдстсааст ксасдаадт 60 дастасьсстс аададсасда саадааадад сттдетаєсд дадасадддсе тасдатаєт 120 ассаастссд стаададаса ссстддідда аадаєсаєтд сттассаадс тоддааседах 180 дстассдата сттасаадса детссатаєє адаєстдста аддсєдасаа даєдсетаад 240 хЕсСтЕСтЕсстК стсдЕсстудх сасааддда тастстссаа даадддстда сттаєсаси 300 даєсссссаад адсссассаа дсаасетдад дстдаддадаа тдеЕсдадсес тЕсСтСтсст 360 сасдекдсес асадасссдс сдаддаєсаєс дстасдсатд ссдстддкдс хдстсттатс 420 жхддсакддає асасттесдс хддааєсдсєе ахтадасттддад стдесаддд аадасаєсодда 480 тадсестасдс асдаддасдд асаєтастст сесастуддаа асастдстсє сдасададси 540 асссаадета сетдєтасдд астсддастдає ддаатдєстд адсдсетддса дсдсаассад 600 сатаасаадс ассакдстас ссстсаааад стссадсасд акдесдаєст сдатассстї 660 ссеЕСтСдЕтЯ сеЕстссатда дадааєсдсе дстааддета адестсстдс таєдааддст 720 тадстесста тдсаадстаа дсттсесдст сстастасса стсттсттас тастсттадда 780 тадсадстее асстесаєсс тадасасаєд сесаддаста адсастасда єдадсетаси 840 асдсісддаа ссадастасдд асттдєтдда стассетдстд стаастасдда тадастддатас 900 дЕсстсдст десассттст стасдеєсад сттддадста хтдастасаєстє стдсаасттс 960 дстдееестс атастсасст ссстдЕтуЄ дадсстаасд адсастдстас ссддассдад 1020

Зо тасдстдста ассасастас таастаєтст ссассттаді адатасдаєса асадатдест 1080 тасстстаастї ассадаєсда дсассасстт тассстсста тдсстсааєто садасассст 1140 аадаєссдстс стададссаа дсадстесс дадаадсасуд дастссаста сдасдстада 1200 ддасассссд аддстасддс сдасастссс дстаассттд асаасдєстдс ссатдстсст 1260 дадаадаааа хтдсадсаатд а 1281 «2105» 20 «2115 425 «212» Білок «2135 Раміома 5аїїпа «400» 20

Меє РгОо РгО Ага А5р 5ег Туг 5ег Туг АЇа Аїа Рго Рго 5ег АїЇа сп 1 5 10 15

Гей Ні сіи ма! А5зр тйг Рго сіп си Ні А5р гу Туз Сс1Їи Геим маї 20 25 30

ІІе сТ1у А5р Аг АїЇа туг Ар ма! ТИг А5Зп РНе маї Гуз Аг Ні Рго 35 40 45 сіу сіу Гуз чІЇе ІІе АЇа туг сіп ма! сіу тйг А5р АЇа тТНг дор Аїа 60 тукг Гуз сіп Ре Ні ма! Агд 5ег АЇа гу5 Аїа д5р Гуз Мет гГеи Гуз 65 70 75 80 50 бек Геи Рго бег Агд Рго ма! Ні Гуз сіу Туг 5ег Рго Агд Ага Аїа 85 90 95

А5р Гей ІІе АЇа А5р Ре сіп сій Ре тТНг Гуз сіп Геи сім АїЇа сіи 100 105 110 сІ1у Мет Рпе сіи Рго 5ег Ге Рго Ні5 Ма! Аїа туг Аг Ге Аїа си 55 115 120 125 ма! че Аїа мес ні ма! АїЇа СсІу Аїа Аїа гей ІЇе Тер Ні сіу туг 130 135 140

ТК Ре АТа сіу ІЇїе АїТа Мет Ге сіу ма! ма! сіп сіу Агд сСу5з Ос1Уу 145 150 155 160 60 Тер Геи меє Ні сіи сіу сіу Ні5 туг 5ег Ге Тпг сіу Ап Іе Аїа 165 170 175

Рпе А5р Агуд Аїа Іїе сіп ма! АїЇа Суз туг сіу ем сіу Суз су меє 180 185 190 5ег сіу АТа тгр Тер Агуд А5п сій Ні доп огу5 Ні Ні АЇа Тс РгО 65 195 200 205 сіп Гуз Гей сіп Ні5 Ар ма! Азр ге Азр ТИг Гей Рго Гей ма! Аїа 210 215 220

Рпе ніх сій Агуд ІЇе АЇїа АЇїа їу5 ма!ї Гуз 5ег Рго АЇа Ммеї Гуз АїЇа 225 230 235 240 70 Тер Ге 5ег Меє сіп Аїа Гуз Гей Ре Аїа Рго ма! Тиг тНг гГеи Геи

245 250 255 ма! Аїа гей сІу Тер сіп їеи туг Ге Ні Рго Агу Ні Мет Геи Агд 260 265 270

Тк Гуз ні туг Азр соЇи Ге АЇїа мех гей с1у Іїе Агд Ттуг су Ге 275 280 285 ма! сіу туг Гей АЇа АЇа А5п Туг сіу АЇїа сіу Ттуг маїЇ ге АїЇа су 290 295 300 туг Гей Ге Туг ма! сіп ге сіу АЇїа Мет туг ІЇе Ре Су5 А5Зп РПе 305 310 315 320

Аїа ма! 5ег Ні Тиск Ні Гей Рго ма!Ї ма! си Рго А5п сіЇи Ні Аїа 325 330 335

ТВг тер маї сіи туг АЇїа АЇїа Аб5п Ні Тс о тТиг о АЗп Су 5ег Рго 5ег 340 345 350

Тер тер Суб АЗр Тер Тер Мет 5ег Туг Ге АзЗп Туг сіп ІЇе си Ні5 355 360 365

Ні Гей туг Рго 5ег Меє Рго сіп Ре Агд Ні Рго Гуз ІЇе АїЇа РгО 370 375 380

Агд ма! Гуз сп Ге Ре сіи Гуз Ні сіу Гей Ні туг А5зр ма! Агд 385 390 395 400 сіу туг Ре сім Аїа Мет Аїа д5р Ттпйг РПе АїТа А5п Геи А5р Азп Маї 405 410 415

АЇа Ні5 АЇа Рго сіи Гуз Гуз Меї сп 420 425 «210» 21 «2115 1329 «212» ДНК «2135 Ругатітопа5 согдата «400» 21 асддадааадда даддсаатдс тадсдстсст астдсдаада аддадастдаєє даєсдаддда 60 аадетсесасд ахдісассда сттсаддсас сссддідаєс сдаєсаєсаа деЕсстстсд 120 даєсстддаса стдасдссас састтсстас сдсдадессс асдесаддес адсдааддса 180 дасаадесстї сдаадасдсї дссстсссдс даадссасіс сссаддадсе даадсаддса 240 десдадеьст ссаадстсаа сссдссстсс дсадададстд ссестдстсс сстдассдас 00 сЕсдассаада хддаадсдсї даасааддас ссдадасеє сссдеідадса дсесаєссад 360 даддастест таадсссаа тассссдсаєї дсддісаадс дсаєссасадада адссдідасд 420 асдаєсддсса хадсстсстуд даєсдаєдаєд садассаасд стсттастд дассстсдда 480 деЕсстдаєсс дсаддсаєтодс асадддсесс9дд хдсддеЕсддс ссаєдсасда дддсддссас 540 тасадестста студддаадає сессассдає аддсасєстдс аддадісаає сасдддаєтс 600 дастдсддаа хтдІссддсадс стддЕддсдс аассадсаса асаадсасса сдсаасссса 660 садаадстдс адсаєдасді сдасстддад асссттсстс єдасддсесс саасаасдаси 720 деЕсассдата дасдсаадає даадсстаді адсстссадд стстдстддсе саадсассад 780 дсстЕссЕсСТ ксСтЕсСсссаЄ дасстссстї стддісддсс хсуддеЕсддас сассдісстс 840 сассссаддс асадсетдсуд сассаадсас хтасттсдадс тасестодсає ддстдстсдкс 900 тасдсдаате ссудстдстсЕ єЕЕсдстссс аадстасддас стдсаддадс тадссдддстс 960 тасстсдсса ссттсдстд сдддсдсаас хтатастстса ссаасттстс аддестстсас 1020 астсасстдс ссдсдадсдуд тдсдадсдад стасстдсаєс ддадассуєдаста сссддссатс 1080 сасассаста асассааасс садсасдстуд ктадасдаєсддас ддаасдєсаєь сстсаасттс 1140 садассдадс ассасстдес ссстссаатуд ссссадессс дссасаадає тасстссссад 1200 сдсдсааадд ссттдссда даадсасддає сестуєудсасд асдсдсдссс стастддоада 1260 дссастддстуд асасстссаа даастсдаас дасуєсддса стсасдсаєс састссаад 1320 дсдсастад 1329 «2105» 22 «2115 442 «212» Білок «2135 Ругатітопа5 согдата «4005» 22 мес сіу Гуз сіу с1у Ап АЇа 5ег АЇа Рго Тйг АїЇа Гуз Гуз сіи ма! 1 5 10 15

Гей ІІе сіи сіу Гуз Ре Туг Азр ма! тТиг дор Ре Аг Ні5 Рго су бо 20 25 30 сіу 5ег те ІчІЇе Гу5 РПе Геи 5ег сіу 5ег сІіу АЇТа А5р АЇа тиг Аїа 35 40 45 5зег Ттуг Агуд сій Ре Ні ма! Агдуд 5ег АЇа гу5 АЇїа А5р Гуз РПе гей 50 55 60 65 Гуз Тиг Гей Рго 5ег Агд сім АЇїа тТиг Рго сіп сіи гей Гуз сп АїЇа 65 70 75 80 ма! сі Ре 5ег уз Ге А5Зп Рго Рго 5ег АЇа сіи 5ег АЇа 5ег АїЇа 85 90 95

Рго Ге ТНг А5р гей АїЇа Гуз ма! сім Аїа ге А5Зп Гуз А5Зр Ре си 70 100 105 110

Аїа Рпе Агу сЇи сіп гей ІЇе сіп сіи сіу Ре РПе Гуз Рго А5Пп ІЇе 115 120 125

Рго Ні ма! ма! Гуз Агуд ІІе Тк сіЇи Ма! ма! Аїа мес мес Аїа маї 130 135 140

АЇїа бек Ттгр Мет Мет ма! сіп тиг А5п АЇа гей ма! ма! тйг геи с1у 145 150 155 160

Уа! Гей ІТе Агу сІ1у ІЇе Аїа сіп сіу Агд Су5 сЇу тер Геи Меє Ні 165 170 175 сі сіу сіу ніх туг 5ег Ге Тк су Гуз ІІе б5ег ІЇе А5р Ага Ага 180 185 190

Гей сіп сі 5ег ІІе туг сІіу Ре сіу Су5з сіу Мехє 5ег Су АЇа тер 195 200 205

Тер Агу А5посіп Ні Абп Гуз Ні Ні АЇа тНг Рго сіп Гуз гей сп 210 215 220

Ні А5р ма! А5р Геи сіи Тис Ге Рго Геи Мет АЇїа РМПе доп доп АїЇа 225 230 235 240 ма! Тиск А5Зр Агуд Агд Гуз ма! Гуз Рго сІу 5ег Гей сп Аїа геим Тер 245 250 255

Гей Гуз Туг сіп Аїа Ре Гей Ре Ре Рго ма! Тиг 5ег геий гГеи ма! 260 265 270 о1Уу Геи сіу Тер тийг о тйг ма! гей Ні5 РГО Агду Ні 5ег Гей Ага тег 275 280 285

Гуз Ні Туг Рпе сЇи Геи Геи Суз Мет Аїа Аіа Агд туг АЇїа 5ег РПе 290 295 300

Аа АїЇа Ге Ріе Аїа Рго Гу5 Туг сіу Гей Аїа с1у АїЇа АїЇа СТУ гей 305 310 315 320 туг Гей Аїа ТтиПг Ре АЇїа ма! сіу Су5 А5зп Туг ІЇе Ре ІЇе А5Зп РНе 325 330 335 5зег ма! 5екг Ні Тйг о НІі5 Ге Рго Ма! 5ег сіу Аїа 5ег си Ттуг Гей 340 345 350

Ні Тер ма! маї Туг 5ег АЇїа ІЇе Ні ТНг ТНг Абп ІЇе Гуз 5ег 5ег 355 360 365

Меє ге сСуз А5р Тгр Тгр Мет 5ег Рпе Гей А5Зп Ре Ссіп ІЇе си Ні 370 375 380

Ні Гей РПе Рго бег Мет Рго сіп Ре Агд Ні Гуз ІІе ІІе 5ег Рго 385 390 395 400

Агд ма! Гуз АТа Ге Рпе сіи Гуз Ні сіу Геи ма! туг А5зр ма! Агд 405 410 415

Рго Ттуг Тер сіу Аїа Меї АЇїа Ар ТИйг РПе Гуз Ап Ге А5ЗпП А5р маї 420 425 430 с1іу тйг Ні5 АЇїа 5ег Ні5 5ег їГу5 АїЇа Ні 435 440 «2105» 23 «2115 804 «212» ДНК «2135 Ругатітопа5 согдата «4005» 23 акддасуєста стдсдаєссс дастдсдстд дсадддастс ссддеєсасді дасдсасаає 60 деЕсдсааасс садатаєссс тасаєссдад аааддтдсстд сттастстсає дсаддеусдад 120 хаєстдддддс саасдаєсда дассаєсддає таєстестає єсасстастє хддсааасодд 180 ассасдсааа асаддадсса дссдЕєтддс стдаадаасуд статдстдде дсасаасьтс 240 тассадастє ссттсаастс дтастдсата тасстнед ссасдісдса ссдсдсесад 300 ддадсідааад ссддддааа сасссссдає асдастдсса асадстдддд даєстсасад 360 дедасстддс хдсастасаа саасаадстас деЕсдадстдс тодадасасдеє сттесатоудес 420 атдсдсаада адсссдасса дсеЕсссдЕсс стдсасаєсстї ассаєсатас сстдесдатс 480 тадесетадЕ ссуєддаєдає дааассоддад сссдстддад астдстастє хєддстстадс 540 деЕсаасасдс стасдсасає сасстаєдсас єсатастасд дссттдссдс дстсдадаата 600 аассдсестІ ддаадаадста сасстасдсад асссадасдс тдасадесстд таєстасдсе 660 тсдсастсда тЕтастассдс статдідсад аасассдсде стддЕтдсс ттасттдсад 720 60 стдеддаєда суддедаасає деЕссасуєтд сесдссааст стассдсаа дсдстасаад 780 адсааддаєд ссаадаадса діаа 804 «2105» 24 «2115 807 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії

Ругатітопах согдаста 5 елонгази в рослинах (версія 1) «400» 24 70 акддсстста ссдстаєсссс тдстдсЕстт дстддаастс тддасасдє тасстасаатє 60 дедастаасс стдастаєссс адстстдад ааадеьссстд сттастссає дсаддаеєєдад 120 тастддддас стастаєсдд аастассдуда тасстсстст хсасстастс сддааадсх 180 ассасдсада асадаєстса ассіттсдда сісаадаасд статдстсді тасаасетс 240 тассадасст сстїсаасад стастдсаєс тассттссод єтастсстса тадддстсад 300 ддастстаадд єссддддааа сасссстдає асдастдста асестсдддаа ааєстстсад 360 деЕстасстддс есастасаа саасаадстас деЕсдадсес ссдасасстт стесатдата 420 асдаддаада адсссдасса дсеЕсЕс стесасаєст ассассасас хсттстсатс 480 тадесасддає ссадассдссаст даадсесдад сстастддадч астдстастт сддассттст 540 дЕсаасасст хсасдсасає дассатдстас ссттастасд дасттодстдс ст сддаде 600 аастаст ддаадаадста сассасссад асссадаєдс єссадестд тасстасдсе 660 тстсастста Істасассдс ттасдессад аактассудстт єстддсексс ттассттсаа 720 сЕСТДДдЕта сдасдаасає дессдЕстсС тЕсдссааст стассдтаа даддсасаад 780

Істаададсад стаадаадса адсдасаа 807 «2105» 25 «2115» 267 «212» Білок «2135 Ругатітопа5 согдата «4005» 25 мет АЇа 5ег ІЇе АЇа ІЇе Рго АЇа АЇа гей АЇїа сіу тйг Гей сіу туг го 1 5 10 15 ма! тик о туг Азп ма! АЇа А5Зп РгО Азр ІЇе Рго АЇа 5ег сіи Гуз ма!

Рго АЇїа туг Ре Мет сіп ма! сіи туг тер сіу Рго Тйг ІЇе сіу тиг 25 ІІе с1у туг Гей гей Ре ІЇїе Ттуг Ре сіу Гуз Аг ІІе мес сіп д5п 60

Аг бек сіп Рго Ре сіу гей Гуз А5п АЇа Мет Гей Ма! туг А5Зп РІПе 65 70 75 80 тукг біп Тс о РИБе Ре А5п о б5ег о Туг Суз ІІе туг Ге Ре маїЇ тиг 5ег 30 85 90 95

Ні Агд Аїа сіп сіу гей уз Ма! Тер сІіу А5зп ІЇе Рго А5р Мет тТЕг 100 105 110

АТїа Азп 5ег Тгр сіу ІІе 5ег сіп ма!їЇ ІЇе тгр Геи Ні Туг Абзп А5ПпП 115 120 125 35 Гуз туг ма! сіи Гей Ге А5р Тис РМПе Ре Мет ма! мес Агдуд Гуз Гуз 130 135 140

Рпе Азр сіп Геи б5ег Ре Гей Ні ІчІЇе Туг Ні НІі5 ТИйг Гей їГеи Пе 145 150 155 160

Тер б5ег Тер Ре маЇ ма! Мет уз Гей сіи Рго ма! сСІу А5зр Су туг 40 165 170 175

Рпе сіу б5ег 5ег ма! Ап Тиг Ре ма! Ні ма! ІїІе мет туг 5ег туг 180 185 190 туг с1у Гей АТа АїЇа ге сіу ма! Азп Суз Ре Тер Гуз Гуз Туг Іе 195 200 205 45 Тс сіп 11е сіп Меє гей сіп РПе Су5 ІЇе Ссу5 АЇа 5ег Ні 5ег Пе 210 215 220 туг ТНг АїТа туг маїЇ сіп Азп Ттйг АЇїа Ре Тгр Геи Рго Туг Геий сп 225 230 235 240

Гей Тер ма! меж ма! Аб5п Меє РПе маїЇ Ге Ре Аїа А5п РНе туг Ага 50 245 250 255

Гуз Агд Туг Гуз 5ег Гуз су АїЇа Гуз Гуз сп 260 265 «210» 26 «2115 1344 55 «212» ДНК «2135 Раміома 5аїїпа «400» 26 асдсстіссда дсдсддсдаа дсадаєдддс дсдадсасдд дсдедсаєсдс дддсдісаса 60 даєсссдєсда ссттїсасдсуд сааддатаєс дссдасаддс сддасстсас датсатдадах 120 60 дасадсасдє асдастдсдаа ддсдісссдс тссдадсаєс сддасддсдс дсастетата 180 тсдстдЕссу дсдддсасда хтдссасддад дсдессасдд адстассассд дсдсдсстда 240 сссаадесдс дсасдісдсд сттссасаєс ддсестстдд саєсдассда ддадсссдес 300 дссадссдата адддстасстї ссадстдсдс дстсдсаєсд ссаадастуде дссдссоддес 360 адсадсдддас єсасдссдас деісдтастдд дедааддссд дастдаєсся сддстссдса 420 65 ассдсдсісд аддсдсасає дстдсасдсд ддсаадсдсес тдстсссдіс дассдтдстс 480 даасддстас єтасудседає сддсстдаас асссадсасд асдссаасса сддсдсдстс 540 тссаадссдуд сстсддісаа сстддсдстс доадесасдсс аддастддає сдоасдддадс 600 асдаєссстстІ ддстдсадда дсасдетадсс атдсассаст тдсасассаа сдасдастдас 660 ааддасссдд ассадааддс дсасддсдсс стдсддсіса адссдассда сдсдтаддадс 720 70 ссдатдсастї ддстдсадса ссестасстд стдсстдадда адасдаєдста сдестссаад 780 стдстдсс хсдасаєсад сдадстдасд ахтасддсдді дададддсда дсссассадс 840 аадстддсса ддактассестї сасдссстсд стдстсстса адстсасст стдддсдсдс 900 тІтдЕсдсдс тодссдстдва ссесдсдссс адсдідсаса сддсддедса сатсдсддса 960 асддсаасда сддддадсеє стасстсдсес тест еЕсткст тсасстсдса саастссдад 1020 ддсасддсда дсадассддасс ддасддсадс ассассадса сдасдсдсдд сдсатсстс 1080 сісаадсддс ададассдадас стсдіссаас дідддсддсс садстдстсдс сасдсесаас 1140 ддсддсстса астассааає сдадсассас стстісссса дддсдсасса сддсесстас 1200 сстсдсстсЯ сдссдЕтдЯаЄ сааддсддад сесдаддсдс дсддсаєсда деасаадсас 1260 тассссасса тасддадсаа сстддсаєсс асдстдаддс асасдстасдс дстсддссадс 1320 аддссдсдса дсааддсдда дсда 1344 «2105» 27 «2115 1347 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Раміома заіїпа 4 десатурази в рослинах (верстя 1) «400» 27 акдссасста дсодстдстаа дсааатддда дстестастд дідессатдс хкддедЕаст 60 дастстьста сттссассад аааддатаєє дстідастадас стдаєстсас сатсдетдда 120 дассстас асдасдсстаа ддсетессада хстдадсаєс стддсдадакадс хсастьсаєт 180 ст ЕтдДссу даддаадада стдстастдад дсеессатдд аатассатад аадддсетоа 240 сстаадеста даасдестад ассссасаєе ддаєстсттд стестастда ддаасстде 300 дстастдата адддатасся ссаастєтує дстаддаєсд стаадастддє дссесстде 360 тстеСсСтТудає ссдстсстдс теЕсСттастда астааддста дасттастсст тддасстаст 420 аксдсестта аддсттасає дстстасодсе ддааададас сеЕстсссттс тассаест 480 ддасддсеес єсастсттає сддеістсаас асссадсатд асдстаасса тддтасета 540 тстаадсстд сесстдстаа ссттдстсттІ адастетаєс аддассддас сддааддатст 600 аскдасссттї ддстссаада дсаєсдетасє асдсассасс тссасастаа сдатадаєтдах 660 ааддаєсстд ассааааддс хсасддтдсе сттадасеса адсстастда кдсетддеса 720 сстасдсаєс ддстссадса єстттасстю ттдсстддсд адастаєдста сдсесесаад 780 сЕсттуЄссс тсдасаєстс тдадсесуєє асдсддсає дададдаєда дсстасстс 840 аадсеттдстуд дасасстстт тасдсесекст тдстсстса адсттасстє стдддстада 900 тіСдДстСстЄ тдсстстета ссттдСстсстТ тстастсата стастатаса тассастаст 960 астуєсаєда стддаєстсе стасстсудсе єсстесттст хсасстссса саасттсдад 1020 ддасдеєкдсес стдссддасс хдасддаєст ассастеєста сдастададда тдстадсетс 1080 стстаададас аадссдадас сс естаас детдддаддас стстесттдс тастсттаас 1140 ддасддассса астассаааї сдадсаєсас тд ссста дадсссасса тддаєестас 1200 сстадасттуд стсстсттдД сааддссдад стстдаддста даддааєсда дсасаадсас 1260 тассстаста сстддістаа ссттдстстТ ассстсадас ахтасдтасдс тсттсаддаада 1320 аддсстадає стааддссда дсаасда 1347 «2105» 28 «2115 447 «212» Білок «2135 Раміома заїїпа «400» 28

Меє Рго Рго 5ег АЇа АЇа Гу5 сіп Мет сіу Аїа б5ег Тиг сІу ма! нН1і5 1 5 10 15

АТа сіу ма! тиг дор бек б5ег АЇїа Ре Ттйг Агуд Гуз Азр ма! Аїа А5р 20 25 30

Аг Рго А5р Ге Тйг о ІЇе ма! с1у А5р 5ег ма! туг А5Зр АїЇа Гуз АїЇа 35 40 45

Ре Агд б5ег сіи Ні5 Рго сіу сіу Аїа Ні5 Ре ма! 5ег Ге Ріе су 50 55 60 сІ1у Агуд А5р АЇа Тс сій АТа Ре мех сіи туг Ні Агд Аг АїЇа тгр 65 70 75 80

Рго Гуз б5ег Агуд Меї 5ег Аг Рпе Ні5 Ма! сіу б5ег їеи Аїа 5ег тТЕг 85 90 95 си сім Рго ма! АТа АЇїа Ад5р сіи сІу туг Геи сіп гГеи Суз5 Аїа Ага бо 100 105 110

ІІе АїТа Гуз Мет маЇ Рго 5ег ма! 5ег 5ег сІ1у Ре АЇа Рго АїЇа 5ег 115 120 125 туг тер маї Гуз АЇа сіу Гей ІЇе Гей сіу 5ег АїЇа Пе АїЇа гей си 130 135 140 65 АїЇа туг Ммеє гей туг Аїа с1у Гу5 Агуд Гей Ге Рго б5ег ІЇе маї гГеи 145 150 155 160 сіу Тер Гей Ріє АЇа гей ІЇе сіу Ге А5п ІЇе сп Ні А5р 'АїЇа доп 165 170 175

НІі5 с1у АЇїа Гей 5ег Гу5 5ег АЇа 5ег ма! Азп Гей АїЇа гГеи су Ге 70 180 185 190

Су5з сіп А5зр Тер ІІе сіу сІу 5ег Мет ІЇе геи Тгр Геи сіп сіи Н1і5 195 200 205 ма! ма! мет ні Ні Ге Ні ТИг о А5п А5р маїЇ А5Зр Гуз А5р РгОо д5р 210 215 220 сп Гуз АТа Ні5 сІ1у АЇа гей Агд Ге Гуз Рго ТНг А5р АїЇа Тгр 5ег 225 230 235 240

Рго Мет Ні5 Тер Гей сіп Ні5 Гей Туг Гей Ге Рго сіу сій тйг мес 245 250 255 туг АТа Ре Гуз Гей їеи Ре Ге А5р ІЇе 5ег сіи Гей ма! мес тер 260 265 270

Агд Тер сЇм су сій Рго ІЇе 5ег Гуз Ге Аїа сіу туг Ге Ре мес 275 280 285

РгО 5ег їеи їеи Гей Гуз Ге Тс Ре Тгр АЇїа Агдуд Ріе маї Аїа гГеи 290 295 300

РгОоО Геи Туг Гей АТа Рго 5ег ма! Ні5 Тиг Аїа ма! су5 Пе Аїа Аїа 305 310 315 320

Тиг ма! мес тиг о сіу б5ег РПе Туг Гей АЇїа Ре Ре Ре РПе ІЇе 5ег 325 330 335

Ні АЗп Ре сіи сіу ма! Аїа б5ег ма! СсІу Рго А5р сіу 5ег ІЇе тег 340 345 350 5зег мес тиг Агуд с1у Аїа б5ег РПе Геи Гуз Агуд сіп АТа сіи Ттйг 5ег 355 360 365 5зег Азп ма! сіу сІіу Рго Ге Гей АЇа ТНг Гей А5Зп сіу сіу Геи д5п 370 375 380

Туг сіп ї1Іе сіи Ні5 Ні5 Гей Ре Рго Агд ма! ніх ніх сіу РПе туг 385 390 395 400

РгОо Агд Гей Аїа Рго Геи ма! гу5 АТїЇа сЇи Геи сім АїЇа Ага су Пе 405 410 415 сіи туго Гуз Ні Туг Рго ТНг ІЇе Тер 5ег А5зп Гей АЇа 5ег ТЕГ Гей 420 425 430

Агд ніх Меї туг АЇа гей с1Уу Аг Агд Рго Аг 5ег Гуз АїЇа си 435 440 445 «2105» 29 «2115 263 «212» Білок «2135 Ізоспгузів даІрапа «400» 29 мес Аїа гей Аїа А5Зп А5р АЇа сіу си Аг ІЇе тгр Аїа Аїа ма! тис 1 5 10 15

А5р РГО сій ІЇе Гей ІЇе сіу Тийг РПе б5ег туг Гей Гей їеи Гу РгОо 20 25 30

Гей Ге Агд Азп б5ег сіу Геи ма! Азр сЇи Гуз Гуз сіу АТа туг Ага 35 40 45

ТИг об5ег мет ІІе тгр Ттуг Азп ма! Гей їеи АЇїа Ге Ріе 5ег АїЇа Ге 60 5ег Ре Туг ма! Тйг АТа тйг АТа гей сІу Тер А5Ззр Ттуг сіу тик су 65 70 75 80

Аїа тер Ге Агуд Агуд сіп Тс су А5р тс Рго сп Рго Гей РПе сп 85 90 95 50 сСуз Рго 5ег Рго ма! Тгр Азр 5ег Гуз Гей Ре Тийг Тегр тиг Аїа Гуз 100 105 110

АІїа Ре Туг туг 5ег Гуз Туг ма! сіи туг Гей А5Зр Тпг АїЇа тер Ге 115 120 125

Уа! Гей Гуз с1у Гуз Агуд ма! 5ег Ре Геи сіп АТа РіБе Ні Ні РНе 55 130 135 140

О1У Аїа Рго Тгр Азр ма! Туг гей су ІЇе Агд Геи Ні А5Зп си с1у 145 150 155 160 ма! Тер ч1Їе РПе Мет РМПе РПе А5п б5ег Ре ІЇе Ні Ттийг ІЇе Меє туг 165 170 175 60 тс о туг туг с1у Гей Тиг Аїа Аїа сіу туг Гуз Рпе Гу5 АЇїа Гуз Рго 180 185 190

Гей че Тийг Аїа мес сіп І1ІІе Су5х сіп Ре ма! сІу сСіу Ріє гГеи Гей 195 200 205 ма! Тер А5р туг ІчІЇе АЗп ма! Рго Суб Ре Азп 5ег Ар Гуз СОІУ Гуз 65 210 215 220

Гей Ре 5ег Тгр АЇїа Ре А5п Туг АЇа туг ма! сІу 5ег ма! РНе Гей 225 230 235 240

Гей Ре Су Ні Ре РПе Туг сіп А5р Ап ге АЇа тТйг Гуз Гуз 5ег 245 250 255 70 Аїа Гуз АЇа су Гуз сп Ге

«2105» 30 «2115 801 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Еті!тапіа пихІеуї 9 елонгази в рослинах «4005 30 акдсссдата дадстссаєс кдасдстдст аєстдуддадсд стдеЕеестда хсстдадатс 60 сЕтассддаа сстЕстсСтта ссттттдДсСТт аадсстстсс тсадааастс тодасттота 120 дасдададаа адддадсстста ссдтастсст асдаєстодде асаасаєтде ссетдсест 180

ЕЕсСтЕСтДСТа сстсСЕЕЕсСТта сєтастусе астдстсттд дасдоддастаа дддаастадс 240 дадсддсета дасстсттас тадсдаєстст сстсаасаас стддсадтд сссттстада 300 дЕссдддаса дсааастстт сттосудасі дстааадсстї єстастасіс саадтасаєс 360 дадсассета ахтастдсетд дсЕсдеЕсІс аадддааада аддесссаєь сстссаддда 420 тсссаєсаєі ссудедстсс акдддадаєдеє сасстсддаа ссаддсесаа даасдаддда 480 деЕссодаєст єсасдест саасадстсс асссасастд сттасдсасас ттастасдда 540 сеЕтастдстд стддастасаа дассададда аадсстаєса ссассдстає дсааасстся 600 саасссаєсд дсддаєссдє єсеЕсдсдсду дастасаєса асдєтссттд сетессатдси 660 дасдсстддас аадесеестс стддасадсс аастасдсес асдсдддаєс тассесст 720

СЕС ЕсСтдсс асттстеста сатудасаас ассдстаадд стааддстаа аааддстде 780 дстассадаа аддстсс вда 801 «210» 31 «211» 266 «212» Білок «2135 Еті!тапіа пихІеуї «400» 31 мес Гей Ар Агуд АЇїа 5ег 5ег А5р АЇа АТїа ІІе тгр 5ег АїЇа ма! 5ег з30 1 5 10 15

Азр Рго сім ІЇе ге ІІе сіу Тийг РПе 5ег Туг Гей їеи їеи Гу5 Рго 20 25 30

Гей Ге Агд АЗп б5ег сіу Геи ма! Азр сЇМи Агд Гуз сіу АїЇа туг Ага 35 Тис обег мет ІІе Тер туг Азп Ма! ма!Ї гей АТа гей Ре 5ег АїЇа тНг 60 5ег Ре Туг ма! Тйг АТа тйг АТа гей сСІу Тер А5Зр Гуз сіу тик сІу 65 70 75 80 си Тер Гей Агдуд 5ег Ге Тийг сіу Азр 5ег Рго сіп сіп Геи Тер сіп 40 85 90 95 суз Рго 5ег Агд ма! Тер А5р б5ег уз Ге Ре їеи Тгр тТНг Аа Гуз 100 105 110

АІїа Ре Туг туг 5ег Гуз Туг ма! сіи туг Гей А5Зр Тпг АїЇа тер Ге 115 120 125 45 МмаїЇ гГеи Гуз сіу Гуз Гуз ма! 5ег Рпе Гей сіЇп сіу Ре Ні Ні РНе 130 135 140

О1У Аїа Рго Тгр Азр ма! Туг гей су ІЇе Агд Геи Гуз А5зп оси Сс1у 145 150 155 160 ма! Тер ч1Їе РПе Мет РМПе РПе А5п б5ег Ре ІЇе Ні тик ма! Ммеє туг 50 165 170 175

Тк туг туг су Гей ТтНг АТа АЇа сіу туг Гуз ІІе Агд сіу Гу РгОо 180 185 190 ч11е те тик АТа мес сіп ч1Їе 5ег сіп Ре ма! сіу сІу РПе маї гГеи 195 200 205 55 Ма! Тер А5р туг І1е Азп ма! Рго Су5 РПе НІі5 АїЇа Ад5р АїЇа су сп 210 215 220 ма! Ре 5ег Тгр ма! Ре А5п Ттуг АїЇа туг ма! сіу б5ег ма! РНе Ге 225 230 235 240

Гей Ре Суз Ні Ре Ре Туг Мет дор Ап ІЇе АЇа Гуз АїЇа Гуз АїЇа бо 245 250 255

Гуз Гуз АїЇа ма! АТа тТйг Агд Гуз Аїа Геи 260 265 «2105» 32 «2115 819 65 «212» ДНК «2135 Раміома ріпдці5 «4005 32 асдаєсдсдс сасссаєсас дстсдадсдд стдстсссдс сдаадстсаа ддатдсадта 60 тЕсдаєдадаоа аддєдстста стестсса дсстасстде сЕсттдсдсес сасетевдаад 120 70 сдсассссдї худдсддасас дсддаадддс дсдстасаада дсдасаєдає сдсдсасаас 180 дедаєссатас дсасдеєстс дстддедсдс есаєстдсс адстсдсадс сстддастає 240 дасасдддсс астсдсадсд дасдсдідас стсасадддд асдадаєтдє ссссстстас 300 саддасдідс: ссссдісссс сасстестсс аасаадстст ссаадстаєсс деЕстастдсс 360 тЕссастасі ссаадстасує сдадсасаєд дасассдсає ддстддеєдає даадддсаад 420 сссасдсст хдстссаддад сттссассас стддсдссдуд сстдддасас стастстдас 480 ассассттсс адаасдаддд сасстасастд ссдідасдс ссаасдсест сахтссасасад 540 ассасдктасд састастасадс дассастоасд дсадддЕстса адеестсасе даадсссдєс 600 ассасдстса тдсадаєсас ссааттссаас дсдддстссдуд саасддсдка ссастасатс 660 ассстддаді асттссдсаа стсассддад стсдеістЕст сстасстттт саастаєсдсад 720 жасдсстдса сддаскЕстсст сстстесата садесесст асасддасаа стттддсаад 780 аадааддссд стдссдссдс дддсаадаад аадаадсад 819 «2105» 33 «2115 272 «212» Білок «2135 Раміома ріпдиі5 «4005 33 мес ма! Аїа Рго Рго ІЇе ТтНг Гей сіи Тер ге Геци 5ег Рго Гуз Гей 1 5 10 15

Гуз А5р АЇа ма! Ре сіу сіу сіи ма!їЇ Гей туг Ріпе 5ег ІЇе АїЇа туг 20 25 30

Гей Ре Гей Аїа Рго ІЇе Ге Гуз Агуд Тиг Рго Ге маї Азр тТНг Ага 35 40 45

Гуз сіу Аїа Туг Гуз 5ег сіу Мехт ч1іе Аїа туг А5зп ма! ІІе мет су 50 55 60 ма! Ре 5ег Ге маї Су5 Ре ІЇе Су5 сіп Гей АїЇа АЇїа гей сіу туг 65 70 75 80

Азр мех сІу туг Ге сіп Тгр ма! Агд А5зр Гей тиг сту А5р сій Іїе 85 90 95 ма! Рго Ге Туг сіп А5зр ма! 5ег Рго 5ег Рго АЇа Ре 5ег Ап Гуз 100 105 110

Ге Ре Гуз Туг 5ег 5ег ІІе АЇа Ре Ні Ттуг 5ег Гуз Туг ма! си 115 120 125 туг мет Азр ТИг АЇїа Тер Гей ма! Мет Гуз сІу Гуз Рго МаїЇ 5ег Геи 130 135 140

Гей сіп сіу Рпе Ні5 Ні Ре сіу Аїа АТа Тер Азр тийг туг Ре Сс1У 145 150 155 160 чІІе ТтиПг Ре сіп Азп сі сіу 1іе Ттуг ма! Ріе маї маїЇ гГеи Ап АїЇа 165 170 175

Рпе ІІе Ні5 Тйг ІІе Меє туг АЇа туг туг АЇа АТїа тйг АЇа АїЇа СсСІ1У 180 185 190

Гей Гуз Ре 5ег Гей Гуз Ре ма!їЇ ч1іе тик їеи Ммеє сіп І1Іе тйг сп 195 200 205

Рпе Азп ма! сіу Ре ма! Меїс ма!ї туг Ні туг те тйг Гей сіи туг 210 215 220

Ре Агд А5п бег Рго сі Геи ма! Ре 5ег Туг Ге Ре Азп Туг АїЇа 225 230 235 240 туг ма! Суб тиг о маїЇ ге ге їеи Ре Мет сіп Ре Ре Туг Мет А5р 245 250 255

Азп Ре СІ1У Гуз Туз Гуз АЇа АЇа АЇїа АЇїЇа АїЇа СсІу Гуз уз Гуз Гуз 260 265 270 «2105» 34 «2115 840 «212» ДНК «2135 Раміома 5аїїпа «4005 34 асддасдаста аадддаєдсес дасдаєтаасд студастддс тдсестсдсс сддастдаад 60 дасадассдсаа стаддсдддда дасдсестас есе сдсткд датаєстдсе дстсдадссс 120 ассстіІсаадс дстсассдії хасуддасаад сдсаадддсд сатассдсаа сддсаєсдатс 180 дсдсасааса хсстсататд садеестсд стадстасдсе ссдхдсдсса даєддсддса 240 60 сесддссттд ассдсддсса сстдсаднї діссдсдасс хсасдддсда садсдтдата 300 садсістасс аддасдідад сссаєсссст дсаєттсдсда асаадстст ссддтастса 360 дсдасддсдс ссастастс ааадстасастд дадстасаєсдд асасадсута дсетатоста 420 аадддсаадс ссасстсдЕЕ сстдсадддс Ессассаст хсддсдссдс дедддасасс 480 тасттсддса ссасдіссса даасдадддс асстасдест ттЕдсдстдст саасдсаєтс 540 65 асссасасаа їсатдсасас стастасддс дсдасддсад сддасаєсаа аасстсдата 600 аадссудстда ссассстсаї дсадаєсасд садетсстдс хтудддстссдс дсесдЕстас 660 ссдсасаєтад асстсддста сттссдтдсд хсдсссдадс хсдідсддад стасстдес 720 аастасдсдс асастастсає дасдсеЕстс стстесасдс дстестста ссасдасаас 780 тЕ1садсаадс асаадссаає стісдсдсаєс дастссадса ассдсаєдаа аассдадсад 840 70 «2105» 35

«2115 279 «212» Білок «2135 Раміома 5аїїпа «4005 35

Мет АїЇа тийг си сіу Меє Рго АЇїа ІЇе тйг гей А5р тер Геи Геи 5ег 1 5 10 15

Рго сІу Гей Гуз А5Зр АЇа ма! ІЇе сіу сіу сіи ма!Ї їеи туг Ре 5ег 20 25 30

Ге сіу Туг Гей Гей Ге сіи Рго ІЇІе Ге Гуз Агд б5ег Рго Ре маї 35 40 45

А5р уз Агуд Гуз с1у Аїа Туг Агд А5зп сіу мес Іїе АТа туг А5зп Пе 50 55 60

Геи мет Суз сіу Ре 5ег Ге маї Суз Ре ма! Су5 сіп меї АїЇа Аїа 65 70 75 80

Ге с1у Гей А5зр Агуд сіу Ні Гей сіп Ре ма!Ї Агд Азр Гей тиг с1у 85 90 95

Азр 5ег ма! ма! сіп Гей туго сіп Ар ма! 5ег Рго 5ег Рго АЇа РІНе 100 105 110

АТа А5п Гуз Ге Ре Агуд Туг 5ег АЇїа ма! Аїа РіПе ніх туг 5ег Гуз 115 120 125 туг ма! сіи туг Мет дор ТПг АїЇа тер гГеи маїЇ гГеи Гуз сіу Гуз РгО 130 135 140 ма! 5ег Ре Гей сіп сіу Ре Ні5 Ні Ріе сіу АЇїЇа Аїа Тер Азр тЕиг 145 150 155 160

Туг Ре сіу ІІе Тк РПе сіп А5п сій сіу тТйг отуг ма! РНе маї Геи 165 170 175

Гей А5зп АЇа Ре ІІе Ні Тйг ІЇе Мет туг тиг туг туг с1Їу Аїа тиг 180 185 190

АЇїа Аїа сіу ІЇе їу5 ІІе 5ег Меї Гу5 Рго Гей ІІе Тк Ге Меє сіп 195 200 205 че тНг сіп Ре гей їеи сіу Ре АЇа ге мМма!їЇ Туг Рго Туг Іе А5р 210 215 220

Ге сіу ТтТуг Рпе Агуд Аїа 5ег Рго сі Ге ма! Тер бег туг Ге РПе 225 230 235 240

А5п о туг АЇїа туг маїЇ Гей Мес Ма! Ге Рпе гей РіПе Мет Агд Рпе РНе 245 250 255

Ттук Ні А5р А5п Ре 5ег Гуз Ні Гуз Рго ІІе 5ег Аг ІЇе А5р 5ег 260 265 270 зег Азп Аг Мет Гуз Тиг си 275 «2105» 36 «2115 1284 «212» ДНК «2135 Раміома 5аїїпа «4005 36 асдддасдсд дсддадасад садсдддсад дсдсаєссдд сададсддадсе ддсдасссса 60 адсдассдса сддаддєдад саасдстдас адсааадсдс тадсасаєсує дстдсасддс 120 аадсдсдєда атасдассаа десссаасдс асдсасссдд дсддсадсаа ддЕстсссда 180 асстіссада ассдсдатдас дасддадсад єссдадесся ассастсдаа дсдсдсдатс 240 аадаєсдаєдд адддасаєдсс саадаадссї даддаєдстс ссдссдасас дсссттдссс 300 тсссадтсас сдахтддадаа ддасстссаад дсдаєсдаєсд адсддсасає хдсадсдади 360 тастасдаєс сасдсссдсе сдаєдадстд сІсаадстса дсстсдкдст сстсссдасс 420 тЕсдсдддаса хтдтасасдсе сааддсдддс дісддастссс сдстстдсда сдссстсата 480 дедадсета дстддкасстї сдаєсддстдуд стсдсдсасдуд астаєстдса ссастссдєс 540 тсаадддді ссдісдсасд сассдісдда хкддаасаасд сддсдддста сттсстсадс 600 т ссудєдсадд доатастдсддає сдадсдуєдд сдсдсдсддсо асаасасдса ссасдтдетдс 660 ассааєсдада асддсісдда ссссдасаєс аааасддсдс сдстдстсає ахтасдсдсдс 720 аасаадссда дсассдссаа дсдсстдаас дссттссадс дстассадса дсастастат 780 дедссддаєда хдодсаассст сдасстдсас хддсддстсд адесдаєсдс стасдассдса 840 60 акдсдсстдс сдаадасдсе дссдсаддсс сісдсастсд ссдсдсаста сдссассдіс 900 дсасддаєс стодсудддсаа стассасстд стсссдстсд тдасдаєсся дсдсадає 960 ддсастддда ссассдєсс судсдасдсас тасддасдадд асастсістсда сдсддассад 1020 дедсдєсаса єдасдстсдс сдадсадасд дсастсассї сдсдсаасає стсддасддс 1080 тадсссудєда асдсдстсас сддстсаєс хсастдсада сддадсасса сстаттссса 1140 65 асдасдссаа ссддсаасст саєсдастаєс садсссдадд хтдсдсдссех стесаадаад 1200 сасддастуд адсассдсда дддсаасстс ассдадсдсд стдсддсадаа сатссдсдсад 1260 стстдсаєссдуд адсасстдст стда 1284 «2105 37 «2115 427 70 «2125 Білок

«2135 Раміома 5аїїпа «4005 37 мес с1у Агд сіу су А5р 5ег 5ег ОТу сп Аїа Ні Рго АїЇа Аїа си 1 5 10 15

Гей Аїа ма! Рго 5ег д5р Агд АЇа сіи Ма! 5ег А5зп АїЇа А5р 5ег Гуз 20 25 30

Аїа гей Ні ІЇІе ма! Гей Тукг сІу Гуз Агд ма! Азр ма! тТийг Гуз РНе 35 40 45 сп Аг Тс Ні Рго сіу сіу бек Гуз ма! Ре Агд ІЇе Ре сп дор 50 55 60

Аг А5р Аїа тйг сій сіп Ре сЇи 5ег Туг Ні 5ег Гуз Агд АїЇа ІїЇе 65 70 75 80

Гуз мет Меї сіи сіу Мег гей їГу5 Гуз 5ег сіи А5Зр АЇа Рго АїЇа дор 85 90 95

Тйг Рго Ге Рго 5ег сіп 5ег Рго Мет сіу Гуз А5р Ре Гуз АїЇа мес 100 105 110

ІІе си Агд ніх ма! АїТа АТа сіу Тукг Ттуг А5р Рго Су5 Рго Гей А5р 115 120 125 сій Ге Ре Гуз Ге б5ег ге маЇ Ге Гей Рго Тиг Ре АЇа сіу мес 130 135 140 туг мес гей Гуз АїЇа сіу ма! сіу 5ег Рго Гец Суз СсСІЇу АЇа Гей Мес 145 150 155 160 ма! 5ег Ре сіу Тгр туг Ге А5Зр сіу Тер Гей АїЇа Ні5 А5р туг Ге 165 170 175

Ні Ні 5ег ма! Ре уз сіу 5ег ма! Аїа Агуд тиг ма! сіу Тер А5п 180 185 190

А5зп АЇа Аіїа сіу туг Ре ге сіу Ре ма! сіп сіу туг АЇа маїЇ сіим 195 200 205

Тер тер Аг АЇїа Агуд Ні Ази Тс Ні Ні Ма! Су5з ТИйг А5Зп си А5р 210 215 220 с1у б5ег А5р Рго А5р ІЇе Гуз ТИг АЇїа Рго Ге їеи ІЇе туг ма! Ага 225 230 235 240

А5зп Гуз Рго 5ег ІЇе АЇа Гу5 Агд Ге А5Зп АЇа Ре сп Агд Туг сп 245 250 255 сіп туг туг тТуг маї Рго ма! мет Аїа ІЇе Гей А5р 'Геи Туг тТгр Ага 260 265 270

Гей сіи бек ІІе АїТа туг ма! Аїа Меї Агд Ге Рго Гуз Мет Геи Рго 275 280 285 сіп АЇїа гей АЇа Гей маїЇ Аїа Ні5 туг АїЇа ч1іе маїЇ Аїа тер ма! РНе 290 295 300

Аїа сіу Ап Ттуг Ні Гей їеи Рго Ге Ма! Тийг ма! ге Агд сіу РПе 305 310 315 320 сіу тйг с1у ч1іе тТийг о маїЇ Ріе Аїа тйг Ні туг СІЇу сіи А5р ІЇє Гей 325 330 335

А5р АЇа А5р сіп маї Агуд Ні Метст Тис гей ма! сіи сіп тис Аїа Геи 340 345 350

Тк 5ег Агд А5п ІчІЇе 5ег су сіу Тер Геи маї Ад5п ма! геи тийг с1у 355 360 365

Ре Іїе бек Гей сіп Ттйг осіи Ні Ні Ге Ре Рго Меї Мет Рго ТЕГ 370 375 380

О1Уу А5п Гей Меє тТийг ІЇе сіп Рго сіи ма!ї Агуд Аїа РПе РНе Гуз Гуз 385 390 395 400

Ні сіу Гей сЇи Ттуг Агуд сій о1у А5п ге ІЇе сіи Су5 ма! Агд сіп 405 410 415

А5п ІЇе Агд АЇа Ге Аїа Рпе си Ні Геи Геи 420 425 «2105» 38 «2115 116 «212» Білок бо «2135 Вірус жовтої кучерявості листя томату «4005 38 мес Тер А5Зр Рго Гей Гей АЗп сі Ре Рго сіи б5ег ма! нНі5 сіу РНе 1 5 10 15

Агд Суз Мет Гей АЇїа чІЇе уз туг Ге сіп б5ег ма! сЇи сіи тйг туг 65 20 25 30 си Рго Ап Тс гей сіу ні Ар Ге ІЇе Агд Азр Гей ІЇІе 5ег маї 35 40 45 ма! Агд АТа Агуд А5р Туг ма! сЇи АЇїа Тйг Агу Агу туг Абп Ні РБе 50 55 60 70 Ні АЇїЇа Агуд Гей сіи сіу 5ег Рго Гуз АїЇа сіи Гей Агд сіп Рго Пе

65 70 75 80 спо сіп о Рго Суз Суз Суз Рго Ні Су5 Рго Агу Ні гГу5 сп АТа тег 85 90 95

ІІе мет Азр ма! сіп АЇа Ні5 ма! Рго сім АЇа сіп доп ІЇе сп А5Пп 100 105 110 ма! 5ег Гуз РгОо 115 «2105» 39 «2115 351 «212» ДНК «2135 Вірус жовтої кучерявості листя томату «4005 39 акдсдддаєс састтстааа тдааєттсст дааєстаєсс асддаєсссд седсасдєта 60 дстасстааає асстдсадсс сассдаддаа ассттасдадс ссаатасаєії дддссасдає 120

Єтаасстаддд аєсттатаєс тасстдстаадд дсссдєдасі асдісдаадс дассаддсда 180 тасааєсаєі сссасдсссд сстсдаадду ссдссдаадд стдаастссд асадсссата 240 садсадссдї дстдстдссс ссастдісса аддсасааас аадсдасдає сахддасдта 300 саддсссатад тассддаадс ссадаасата садааєсдсає сдаадссстд а 351 «2105» 40 «2115 389 «212» Білок «2135 Агартдорзіх тпа!тїапа «4005» 40 мес ма! те АїЇа АЇїЇа АїЇа ма! ІЇе ма! Рго Ге сСІУу Ге Гей Ре РНе 1 5 10 15

ІІе б5ег сіу Гей Аїа ма! Азп Ге Ре сіп Аїа ма! Су5з Ттуг маї гГеи 20 25 30 ч11е Агу Рго Геи бек Гуз Азп ТИйг о Ттуг Агуд Гуз ІЇе А5зп Агд маї ма! 35 40 45

Аїа сіи тиг огГеи Тер Гей сіи Геи ма! Тер ІТе ма! д5р тгр тгр Аїа 50 55 60 сІіу ма! Гуз ІЇе сп ма! Ре АЇїа А5р Ап сіи Тиг Ре Азп Ага мес 65 70 75 80 о1у Гуз сій Ніб5 АТа геи ма! ма! Ссуз5з Азп Ні Агд б5ег А5Зр ІЇе дор 85 90 95

Тер Геи ма! сіу Тер ІЇе ге АЇїЇа сіп Агуд 5ег сіу Су5 Гей сіу 5ег 100 105 110

Аїа гей АЇїа ма! Мет губ Гуз 5ег 5ег Гуз Ре Гей Рго ма! ІЇе сІу 115 120 125

Тер бег Мет Тгр Рпе 5ег сіи Туг Гей Рпе Геи си Агд Азп Тгр Аїа 130 135 140

Гуз Азр си бег ТИг Ге Гуз бек с1у Ге сіп Агд Гей 5ег А5Зр РІПе 145 150 155 160

Рго Агд Рго Рпе Тгр Ге АЇїа гей Ре маї сіи сіу тТйг Ага Ре тЕг 165 170 175

Сім АЇїа Гуз Ге Гуз АЇа АїЇа сіп сіи туг АЇа АЇїа 5ег 5ег сіи Гей 180 185 190

Рго Іїе Рго Агуд Азп Ма! Ге ІЇе Рго Агуд Тйг о їуз сіу Ре маї 5ег 195 200 205

Аїа ма! 5ег А5п Мет Агуд б5ег Ре ма! Рго Аїа ІчІЇе Ттуг Азр Меє тНг 210 215 220 ма! Тиск ІЇе Рго Гуз Тис бег РгОо Рго Рго Тийг Мет Ге Агд Гей РПе 225 230 235 240

Гуз сіу сіп Рго 5ег маї ма! ніх ма! ніх ІЇе Гу5 Суз НІі5 5ег Мет 245 250 255

Гуз А5Зр Гей Рго си 5ег дА5р А5р АЇа ІЇе АЇа сіп тгр сСуз Ага др 260 265 270 сіп Ре маї АїЇа Гуз Азр АЇа Гей їеи Ар Гуз НІ5 ІЇе АЇа АїЇа д5р 275 280 285 60 тег Ре Рго сІу сп сіп сім сіп Ап ІЇе су Агдуд Рго ІЇе Гуз 5ег 290 295 300

Гей Аїа ма! ма!ї Гей 5ег Тер АЇа Суз маїЇ Ге Ттиг Ге сСІУу АЇїа Пе 305 310 315 320

Гуз Ре Гей Ні Тер АїЇа сіп Гей Ре 5ег 5ег Тер Гуз сІЇу ІІе тНг 65 325 330 335 ч11е б5ег АїЇа гей сіу Ге сіу ч1іе ІІе тйг Ге Суз Меї сіп Пе ге 340 345 350

ІІе Агуд 5ег 5ег сіп 5ег си Агд бек ТИг Рго АЇа Гуз ма! маї рРго 355 360 365 70 Аїа Гуз Рго Гу5 Азр А5п Ні Ні Рго сі 5ег б5ег 5ег сп тНг си

370 375 380

Тег си Гуз си Гуз 385 «210» 41 «211» 281 «212» Білок «2135 І ітпапейех аїБра «400» 41 мес Аїа Гуз ТИг Агуд Тйг о б5ег б5ег ге Аг А5ПпП Агд Агу сіп Геи Гуз 1 5 10 15

Тиг АТа маїЇ АТа Аїа тйг Аїа д5р А5р А5р гу Азр сіу ІчІІе Ріе Мес 20 25 30

Уа! ге ге бек Суз Ре Гуз ІІе Ре ма! Су5 Ре АїЇа ІЇе маї Ге 35 40 45

І1е тиг Аїа ма! Аїа тгр с1у Ге ІЇе мес маїЇ ге гГеи гей Рго Тгр 50 55 60

Рго тТуг Ммеє Агуд Іїе Агд Геи сіу Азп Геци Туг с1у Ні5 те Пе су 65 70 75 80 сіу гГеи ма! ІЇе Тер Гей Туг сіу ІЇе Рго ІЇе сій ІЇе сіп сіу 5ег 85 90 95 си ні Тс Гуз Гуз Аг АЇїа чІІе туг Іїе 5ег А5зп Ні5 АЇа 5ег Рго 100 105 110 че А5р АЇа Ре РПе ма! Меє Тер Гей АЇа Рго ІЇе сІу тиг маї сіу 115 120 125 ма! Аїа Гуз Гуз сіи ма! че тер Ттуг Рго Гей Ге сІу сіп гГеи туг 130 135 140

Тк ге АїТа ніх Ні ІЇе Агуд ІІе А5р Агуд 5ег А5п Рго АїЇа АїЇа Аїа 145 150 155 160

ІІе сіп 5ег Мет уз сій АТа ма! Агд ма! ІЇе тйг сіи Гу5 Азп Геи 165 170 175 зег Гей ІІе Меї Ре Рго сіи сІ1у Тйг Агд б5ег су Азр Сс1У Ага гГеи 180 185 190

Гей Рго Ре Гуз Гуз сіу Ре маї Ні Гей АЇа Гей сіп 5ег Ніз Ге 195 200 205

Рго ІчІІе ма! Рго Мет ІЇе Ге Тк су тНг нів ге Аїа тгр Ага Гуз 210 215 220 со1у Ттйг Ре Агд маїЇ Агуд Рго ма! Рго ІїІе тйг ма! Гуз туг Геи Рго 225 230 235 240

Рго чІЇе А5зп о ТИг о А5Зр Ар Тер о тВйг ма! Ар Гуз ІІе А5р д5р туг маї 245 250 255

Гуз Мет ІчІІе Ні А5р ІІе Туг ма! Агд Азп Геи Рго АїЇа 5ег сп Гуз 260 265 270

РгОо Геи сіу бек ТНг А5ЗП Аг 5ег Гуз 275 280 «2105» 42 «2115 303 «212» Білок «2135 5ассНпаготусе5 сегемізіає «4005» 42

Меє б5ег ма! ІІе сіу Агу Ре Геи Туг Туг Гей Агд 5ег маї Геи ма! 1 5 10 15 ма! гей Аїа гей АЇїа сіу Суз сІіу Ре Туг сіу ма! ІїЇе АЇа 5ег ІїЇє 20 25 30

Гей Суз Тг Ге те сіу Гуз сіп Ні5 Гей АЇа сіп Тер ІЇе тйг Аїа 35 40 45

Агд Суз Ре туг Ні ма! мек Гуз Геи Мет гей сТу Ге А5зр маї Гуз 50 55 60 ма! ма! сіу сій сі Азп ге АЇа Гуз Гуз Рго Туг ІІе меї ІЇе АїЇа 65 70 75 80 60 Абзп Ні сіп бек ТйгогГеи А5Зр о Іч11е Ріпе Мет Ге сіу Агуд ІІе РіПе Рго 85 90 95

Рго сіу Суз ТиИг ма! тйг АТа губ Гуз б5ег гей Гуз Туг ма! Рго РіНе 100 105 110

Гей сіу Тер Рпе Мет діа Ге бек сІ1у тТийг туг Ре Гей А5р Ага 5ег 65 115 120 125

Гуз Агд сіп сій АТа ІЇїе д5р ТНг Гей Ап Гуз сЇу Гей си А5п маї 130 135 140

Гуз Гуз А5п Гуз Агуд АЇїа Ге Тгр ма! Ре Рго сіи сіу тНг Ага 5ег 145 150 155 160 70 Туг тНг 5ег сі Гей Ттийг Мет гей Рго РіПе Гуз Гуз сіу АТа РНе Ні

165 170 175

Гей АЇїа сіп сіп сіу Гуз ІІе Рго чІіе маЇ Рго ма! ма! ма! 5ег дп 180 185 190

Тк о бег тТийгогГеи ма! 5ег о РгГо Гуз Туг сіу ма! Ре доп Агуд сіу су 195 200 205 мес Іїе ма! Агуд ІЇе Ге Гуз Рго ІІе 5ег Тйг сі А5зп Ге ТНг Гуз 210 215 220

А5р уз ІЇІе су сім Ре АїЇа сіи Гуз ма! Агуд Ар сіп Мет ма! А5р 225 230 235 240 тс їеи Гуз сім ч11е сіу туг 5ег Рго АЇа Іїе д5п дор Тиг тТиг Ге 245 250 255

Рго Рго сп АЇа ІЇІе сіи туг АЇа АЇа гей сіп НІі5 А5р Гуз Гуз маї 260 265 270

А5зп Гуз Гуз ІЇе Гуз АЗзп сі Рго Ма! Рго 5ег ма! 5егкг ІЇе 5ег дп 275 280 285

Азр маЇ Азп о ТИйг Ні АЗп сі сіу б5ег б5ег маЇ Гу5 Гуз Мет Ні 290 295 300 «2105» 43 «2115 373 «212» Білок «2135 Міскготопа5 ризі!їа «4005» 43

Меє Тийг оРго Туг сіп Тер Ре Ап ма! мМмаЇ 5ег 5ег ге сіу Ттуг маї 1 5 10 15

Гей Рпе Тйг Аїа тийг о тйг об5ег тик ма! тиг мес геи ма! Рго АТа Пе 20 25 30

ІІе Ге Ге Агд Рго ма! 5ег АЇа Азп Гей Ттуг АЇїа Агд Суз Тиг 5ег 35 40 45

Тер чІТе Рпе АЇа Суз Тгр Тер ТИйг бек Суз Ге Ре ІЇе тйг си Ага 50 55 60

Гей А5п сіу ма! Гуз ма! Агд ма! тиг сТу д5р АїЇа геи РгОо Геи А5Пп 65 70 75 80

АЇїа Рго Ге Гей ІЇІе Мет 5ег А5Зп Ні Гуз Су5 АЗп Гей А5Зр Тгр Мет 85 90 95

Ре Геи Тер бек 5ег АЇїа ІІе Агуд Тийг сІу 5ег мет Ре Ні ма!ї с1у 100 105 110 ма! Рпе Гуз Аїа ма! Аїа гу5 5ег сіи ІІе Агуд ма! Іїе Рго ІЇе РНе 115 120 125 с1у Тер сіу Су5 Гуз Ге А5п сіу Ре АТа Ттуг ма! Агуд Агд Ага тгр 130 135 140 5зег б5ег А5р АЇа 5ег Ні Гей Тиг 5ег Тегр ІЇе сіп 5ег сіп ІЇе Агд 145 150 155 160

Аг Агуд Гей Ап АЇа А5п Тер Ттиг ге ІЇе Ре Рго сім сІу Ттйг Ага 165 170 175

Туг ТИг А5Зр Ага А5Зп о губ сої Аго б5ег А5р Гей 5ег Су АїЇа Гуз дор 180 185 190

О1У Геи сій Рго Меї АЇа сіу сіи ІЇе Ге Агуд Рго Агуд Тиг Гуз С1У 195 200 205

Гей АїТа гей Гей Гей Агд сіи бек АЇїа Гуз сіу сіу сіу туг туг Ага 210 215 220

Гуз ІІе ма! А5р Меї тпг ІЇе сіп туг ТНг А5Зр АїЇа А5р сіу Гуз РгГО 225 230 235 240

Гей Гуз сіу Аїа Аїа гГеи сіу Тийг Агд Су5з Ре сІ1у сіп гГеи Аїа Гуз 245 250 255 сІіу сіп Ге Рго маїЇ Аїа тийг Суз Ні ма! Ні РМПе дор ма! РНе 5ег 260 265 270

Ні Гуз А5зр маїЇ Рго АЇа СсІу си Азр си Азр сіи ма! сім АїЇа Тер 275 280 285 ма! Тер Гуз Агд Тер Агд Гуз Гуз АЇа Аб5п Мет гей си Аїа сСуз АїЇа бо 290 295 300 5зег Аїа с1у сіп Ре сіи сіу ма! Агд сіи Тер 5ег тТиг 5ег су тиг 305 310 315 320

АТа ма! Рго Ге Гуз Тйг о сіп тийг АТа ге Агуд Су5 Ре РПе маї геи 325 330 335 65 сіп сіу Гей маї Сузх ма! сіу ма!ї АТа су5 5ег б5ег ТИг Аїа РНе гГеи 340 345 350

АТїа туг ма! Аїа суз5 АїЇа АїЇа ма! сіу Аїа Аїа ма! ІЇе АЇа сіп тег 355 360 365

А5зр Рго АЇа Тгр Тер 70 370

«2105» 44 «2115 314 «212» Білок «2135 МогетегеЇїа аїріпа «400» 44

Мес 5ег ІІе сіу 5ег 5ег А5Зп РгГОо мМмаї Гей Гей АїЇа АЇїа ІЇе Рго РІНе 1 5 10 15 ма! Туг Гей Ре ма! Геи Рго Агд ма! Геи АїЇа РіПе Геи Рго сіп Гуз 20 25 30

АїТа сіп Ре Ге Аїа Гуз сСу5 ІІе ма! ма! гей ІТе АЇїа тйг їеи Пе 35 40 45

Мес 5ег ма! Аїа сіу Суб Ре ІЇе 5ег ІЇе ма! су5 АЇа гей Геи дер 50 55 60

Гуз Агд Туг ма! Іїе А5зп Туг ма! ма! 5ег Агд Ге Ре 5ег РНе гГеи 65 70 75 80

АТїа Аїа Агуд Рго Су5з сіу ма! тиг туг Гуз ІІе ма! су сіи сіи Ні 85 90 95

Гей А5р Гуз Туг Рго АЇа ІІе маїЇ ма! Суб А5зп Ні сіп 5ег 5ег Мет 100 105 110

Азр мет Мет ма! Гей сіу Агуд ма! Рпе Рго Гуз Ні Суз ма! ма! мес 115 120 125

АЇїа Гуз Гуз сій Ге Гей Туг Ре Рго Ре Гей сіу Меї РіПе Ме Іуз 130 135 140

Гей 5ег А5п АЇа Іїе Ре ІЇе А5р Агд Гуз А5п Ні їу5 Гуз АЇа Пе 145 150 155 160 сій 5ег Ттиг о тйг сіп Аїа ма! Аїа А5р Мет Гуз Гу5 Ні А5зп 5ег Сс1У 165 170 175

ІІе тер І1ІІе Ре Рго сіЇи сІ1у Тйг Агуд 5ег Агд Геи А5р Гуз АїЇа д5р 180 185 190

Гей Ге Рго Рпе Гуз Гуз с1у АїЇа Ріе Ні5 гГеи АїЇа ІЇе сп Аїа сіп 195 200 205

Гей Рго ІІе Ге Рго ІЇе ІІе б5ег сіп сіу туг 5ег Ні ІІе туг дзр 210 215 220 5ег б5ег Гуз Агуд Туг Ре Рго сЇу су сіи гей сЇи ІЇе Агд маї геи (225 230 235 240 сі Рго чІІе Рго Тийг тик сІу Гей Тйг тис А5р А5Зр маї Абп о А5р гей 245 250 255 мес др Гуз ТИг Агу АбЗпогГеи Мет гей Гуз Ні Гей уз сі Мет др 260 265 270 5зег сіп туг 5ег 5ег бек ТИПг Аїа сім А5п сіу 5ег Тиг ніх ІЇе д5р 275 280 285

Аїа Азр ІчІЇе АЇа Гуз 5ег Тйг АЇїа тТийг об5ег ІЇе сіу Ап ТИг А5Зр др 290 295 300

Аїа І1е тиг Гуз Агд Агуд Тйг Рго Гуз си 305 310 «2105» 45 «2115 391 «212» Білок «2135 Вгассіза пари «4005 45 мес АЇїа мес АЇа АЇїа АЇа Аїа ма!Ї ІЇе ма!Ї Рго Гей сІіу ІІе Ге РНе 1 5 10 15

Рпе ІІе 5ег сіу Ге маїЇ ма!їЇ Азп ге Гей сіп Аїа ма! Суз тТтуг ма! 20 25 30

Ге ІІе Агд Рго Ге бег Гуз А5Зп ТИг Туг Агд Гуз ІЇе Азп Ага ма! 35 40 45 ма! Аїа сіи тик їеи Тер Ге сій Гей ма! Тер І1Іе маї д5р тер Тер 50 55 60

Аїа сіу ма! Гуз ІІе сіп ма! Ре діа д5р Ар сіи Тиг Ре А5п Агад 6065 70 75 80 мес сіу Гуз сіи Ні5 АЇїа Геи ма! Ма! сСуз5 А5зп Ні Агуд 5ег А5р Іе 85 90 95

А5зр Тер Геи ма! сіу Тгр ІЇе ге АЇа сіп Агуд 5ег су сСуз Геи с1у 100 105 110 65 5зег Аїа Гей Аїа ма! Ммек уз Гуз 5ег 5ег їу5 Ре Ге Рго ма! Пе 115 120 125 с1у Тер бек Меє Ттгр Ре 5ег сіи туг Ге Ре їГеи сіи Агд А5п Тер 130 135 140

Аїа Гуз Ар сЇи 5ег Тк їеи Гуз 5ег сІ1у Гей сп Агд Геи А5п А5р 70 145 150 155 160

Ре Рго Агуд Рго Ре Тгр Ге АїЇа ге Ре ма! сіи сіу тНг Ага РПе 165 170 175

Тег см Аїа Гуз гей уз АїЇа АЇа сіп сіи туг АЇа АЇїа 5ег 5ег сп 180 185 190

Геи Рго Ма! Рго Агд Азп Ма! Гей Іїе Рго Агуд Тиг Гуз сІу РПе ма! 195 200 205 5зег Аїа ма! 5ег А5п Мет Агуд 5ег Ре ма! Рго Аїа ІїІе тТуг А5р ме 210 215 220

Тк ма! АТа ІЇїе Рго Гуз ТНг 5ег Рго Рго Рго ТИг Мет гей Аг Геи 10225 230 235 240

Рпе Гуз сіу сіп Рго 5ег ма! маїЇ ніх ма!Ї ніх ІІе Гуз Су5 Ні 5ег 245 250 255 мес Гуз Ар Гей Рго сіи 5ег Азр Азр АЇа ІІе АЇа сіп тер суз Ага 260 265 270

А5зр сіп Рібе маї Аїа Гуз Азр АЇа гей Гей А5р Гу Ні ІЇе АїЇа Аїа 275 280 285

Азр Тс РПе Рго сІу сіп Гуз си Ні Абп Іч1Їе СТУ Аго Рго ІїЇе Гуз 290 295 300 5ег Гей АЇїа маїЇ ма! ма! 5ег Тер АїЇа сут Ге їеи Тпг їГеи сіу АїЇа 305 310 315 320

Ммеє Гуз Ре Геи Ні5 Тгр б5ег А5зп Ге Ре 5ег 5ег їеи Гуз сіу Пе 325 330 335

АЇїа гей 5ег АїЇа ге сІіу Ге СсСІу чІЇе ч1ІІе тик Гей Су5з Мет сіп Пе 340 345 350

Ге ІІе Агд 5ег 5ег сіп 5екг сі Агд б5ег Тиг Рго АїЇа Гуз ма! Аїа 355 360 365

Рго АЇїа Гу5 Рго Гуз Азр Гу5 Ні сіп 5ег сіу б5ег 5ег 5ег сіп тиг 370 375 380 сіи ма! сій сіи Гуз сіп Гуз 385 390 «210» 46 «2115 390 «212» Білок «2135 Вгассіза пари «4005» 46 мет АЇїа мес АЇа АЇїа АЇа ма! ІЇе ма! Рго Ге сСІу ч1іе Гей Ре РНе 1 5 10 15

ІІе 5ег сіу Ге маїЇ ма! Азп Ге гей сіп Аїа ІЇе Су5 Туг маї Ге 20 25 30 те Агуд Рго Геи бег Гуз Азп Тийг Ттуг Агуд Гуз ІїІе Азп Ага маї ма! 35 40 45

АЇїа сіи тйг гей Тегр Гей сіи Гей ма! Тер ІЇе ма! Азр Тер тгр АїЇа 50 55 60 сІіу ма! Гуз ІІе сп ма! Ре АЇїа А5р А5п сіи Тиг Ре Азп Ага мет 65 70 75 80 о1у Гуз сій Ніб5 АТа геи ма! ма! Ссуз5з Азп Ні Агд б5ег А5Зр ІЇе дор 85 90 95

Тер Геи ма! сіу Тер ІЇе ге АЇа сіп Агуд 5ег сІу Су5 Гей сіу 5ег 100 105 110

Аїа гей Аїа ма! Меє губ губ 5ег бег Гуз Ре Гей Рго ма! Іе с1Уу 115 120 125

Тер 5ег Мет Тер Рпе 5ег си Туг Гей Ре Гей си Агд А5п Тгр Аїа 130 135 140

Гуз Азр си бег ТИг Ге Гуз бек с1у Ге сіп Агд Гей А5Зп А5Зр РПе 145 150 155 160

Рго Агд Рго Рпе Тгр Ге АЇїа гей РПе маї сЇи сіу Тйг Агуд Ре тТНг 165 170 175

Сім АЇїа Гуз Ге Гуз АЇа АїЇа сіп сіи туг АЇа АЇїа 5ег 5ег сіи Гей 180 185 190 бо Рго ма! Рго Агд Азп ма! Гей Іїе Рго Агуд Тийг Гуз сіу Рпе ма! 5ег 195 200 205

АТа ма! 5ег Азп Мет Агуд бег Ре ма! Рго Аїа Іїе туг А5р Меє тпг 210 215 220 ма! Аїа ІЇе Рго Гу5 ТИг бег РГгО РгГОо Рго ТИг Мет Ге Ага Гей РПе 65 (225 230 235 240

Гуз сіу сіп Рго 5ег маї ма! ніх ма! ніх ІЇе Гу5 Суз НІі5 5ег Мет 245 250 255

Гуз А5Зр Гей Рго си 5ег д5р А5р АЇа ІЇїе АТа сіп Ттгр Су5 Ага дор 260 265 270 70 с1п Ре маїЇ Аїа Гу А5р Аа гей Гей А5р Гуз Ні ІЇе АТа Аїа д5р

275 280 285

Тк Ре Рго су сіп сіп си сіп Ад5п ч1Їе с1у Аг Рго ІЇе Гу 5ег 290 295 300

Гей Аїа ма! ма!ї Гей 5ег Тер 5ег Суз Ге їеи че Ге сіу АЇа мес 305 310 315 320

Гуз Ре Гей Ні Тер 5ег АЗзп Гей Ре 5ег 5ег Тгр Гуз сЇу ІЇе АїЇа 325 330 335

Рпе 5ег АЇїа ге сСІу Гей СІу ІЇе т1іе тик їеи Су5 Мет сіп ІЇе Гей 340 345 350 же Агдуд 5екг 5ег сіп б5ег сі Агуд бег ТПг Рго Аїа Гуз ма! ма! Рго 355 360 365

Аїа Гуз Рго Гу5 А5р АЗпП Ні АЗп Ар б5ег сіу 5ег 5ег 5ег сп тег 370 375 380 сіи ма! си Гуз сіп Гуз 385 390 «2105» 47 «2115 361 «212» Білок «2135 РНпуткторпсНпога іпГе5тапь «4005» 47 мес АЇїа тийг огуз сій Аїа туг ма! Ре Рго Тйг Гей Ттйг сіи ІЇе Гуз 1 5 10 15

Аг бег Ге Рго Гуз Азр Су5з Ре сі АЇїа бег ма! Рго Геи 5ег геи 20 25 30

Туг туг Ттиг ма! Агд су5 Гей ма! Іїе Аїа ма! Аїа ге тис Ре ОС1У 35 40 45

Гей А5п Туг Аїа Агуд АЇїа Ге Рго сіи Ма!ї сіи б5ег РПе Тгр Аїа гГеи 50 55 60

А5р АЇа АЇїа Гей Суз Тиг сіу туг ІЇе гей ей сіп сіу ч1іе маї РНе 65 70 75 80

Тер с1у Ре Ре тТийг ма! сіу Ні А5Зр АЇа сІу Ні сІу АЇа Ріе 5ег 85 90 95

Агд Туг Ні Ге Ге А5п Ре Ма! ма! сіу тТйг РНПе мет Ні 5ег геи 100 105 110

ІчІ1е Ге Тйг о Рго Рпе сЇи 5ег Тер Гуз Гей тТНг Ні Агд Ні Ні Ні5 115 120 125

Гуз АЗп о Тйг о сіу Ап ІЇе Ад5р Агуд Ар сій Ма! Ре туг Рго сп Ага 130 135 140

Гуз Аїа А5р А5р НІі5 Рго Геи 5ег Аг Ап Геи ІЇе гей АїЇа Геи с1у 145 150 155 160

Аїа Аїа тгр Гей Аїа туг їеи маї сіи сіу РПе Рго РГгО Ага Гуз ма! 165 170 175

АЗп Ні Ре А5п Рго Ре сіи Рго Ге Ре ма! Агуд сіп ма! 5ег АїЇа 180 185 190

Ма! ма! те 5ег Ге Гей Аїа ніх Рпе РПпе ма! Аїа сІу гГеи 5ег Пе 195 200 205 туг Ге 5ег ей сіп Ге сіу Ге Гуз Тийг Мет Аїа І1Іе туг туг туг 210 215 220 с1у Рго ма! Ре ма! Ре сІіу б5ег Мет гей ма! ІІе тйг тНг РНе Гей 225 230 235 240

Ні Ні Аб5п Ар сій сій тб Рго Тер туг АЇа А5р 5ег сі Тер тег 245 250 255 тукг ма! Гуз сіу А5п Ге 5ег 5ег ма! Азр Агд 5ег Туг с1у Аїа Ге 260 265 270 ч11е А5р А5п Гей бек Ні АЗп ІЇе сіу Тийг Ні5 сіп ІЇе Ні НІі5 Ге 275 280 285

Рпе Рго ІІе ІЇе Рго Ні5 Туг Гуз Ге Гуз Гуз АЇа Тйг АЇа АЇїа Ре 290 295 з00

Ні сіп АТа РПе Рго сіи Гей ма!ї Агд Гуз 5ег А5Зр сим Рго ІЇе Іе 60 305 310 315 320

Гуз Аїа Рпе Рпе Агуд ма! сіу Агуд Ге туг АЇїа Азп Ттуг су ма! маї 325 330 335

Азр сп сім АїЇа Гуз Гей Ре ТНг Гей Гуз си АїЇа Гуз АЇа АЇа тег 340 345 350 65 сій Аїа діа діа гу5 тиг Гуз б5ег тиг 355 360 «2105» 48 «2115» 418 «212» Білок 70 «2135 Тпаїаз5іозіга рзейидопапа

«4005» 48 мес туг Агд Гей Ттиг о б5ег Тийг Ре Ге ІЇїе АЇїа ге АЇїа РіБе 5ег 5ег 1 5 10 15 5зег ІІе Азп Аїа Ре б5ег Рго сіп Агуд Рго Рго Агу Тиг о ІЇе ТЕг Гуз 20 25 30 5ег Гуз ма! сіп 5ег Тиг о ма!ї Гей Рго ІІе Рго Тйг Гуз А5р А5Зр геи 35 40 45

Азп Ре Геи сіп Рго сіп Гей А5Зр сіи А5Зп Ар оїеи Туг Ге Ар др 50 55 60

Ма! Ап Тиг о Рго Рго Агуд Аїа сіу Тйг ІЇе Мет Гуз Мет гей Рго Гуз 65 70 75 80 сі Тс Ре Аб5п о ІЇе Ар ТИг Аїа тйг бек оїеи сіу туг Ре сіу мес 85 90 95

Азр Мет АЇїа АїЇа ма! ма! 5ег 5ег Мет ТНг Гей Гей А5п АЇа ІїЇе ма! 100 105 110

Тиг о 5ег Азр сп Туг Ні АїЇа гГеи Рго Ге Рго Ге сіп АЇа АЇїа тег 115 120 125 ма! ІчІїЇе Рго Ре сіп Гей ге Аїа сіу Ре Аїа Меїс Тгр Суз Меє Тгр 130 135 140 сСуз ІчІІе с1у Ні А5р АЇїа сіу Ні б5ег Тийг Ма! 5ег Гуз тиг Гуз тер 145 150 155 160

ІІе Азп Агуд ма! ма! с1у сіи ма! Аїа Ні 5ег ма! ма! сСу5 Гей тНг 165 170 175

Рго Ре ма! Рго Тгр сіп Мет бек НІі5 Агд Гуз Ні Ні гГеи А5п НІі5 180 185 190

А5п Ні ІЇе сЇи Гуз Ар Туг 5ег Ні Гуз Тгр туг 5ег Аг А5р си 195 200 205

Рпе А5р Ар ІЇе Рго сіп Геи Тукг Гуз Тиг Ре сіу туг Азп РГгО Ага 210 215 220

Мес мес сіп Ге Рго Ре Геи Туг Рпе Меє Ттуг Геи Аїа геи сіу Пе 225 230 235 240

Рго Азр сіу сіу Ні5 ма! ма! Ре туг су Агд Меє Тгр сіи су ма! 245 250 255 5ег Гей сіп Гуз Гуз Ре А5р АЇїа АЇа ІІе б5ег ма! АЇїа ма! 5ег суз 260 265 270

Аїа тПг Аїа сіу 5ег гей Тер Мет Азп Мет сіу Тиг АЇїа А5р РПе ТЕГ 275 280 285 ма! ма! Суз Мет ма! Рго Тер Ге маЇ Гей б5ег Тер тгр Ге Ре мет 290 295 300 ма! тийг туг Ге сіп Ні Ні5 5ег сім А5р сіу Гуз Ге Туг Тиг А5р 305 310 315 320 сі Тис о Рпе Тис Ре сіи Гуз сіу АТа Ре сіи тТийг ма! А5р Ага 5ег 325 330 335 тукг сту Гуз Ге ІЇе А5зп Агу Мет б5ег Ні Ні Мет Мет дор су Ні5 340 345 350 ма! ма! Ні Ні Ге Ре Ре сі Агд Ма! Рго НІі5 Ттуг Агд Геи си 355 360 365

АЇїа Аїа тйг сій АЇїа гей ма! Гуз сіу Мет А5Зр сіи тийг су сіп Гуз 370 375 380

Ні Гей туг Гуз Туг ІІе А5зр ТИг Рго А5р Рпе А5Зп Аа сіи Іе ма! 385 390 395 400

Азп с1іу Ре Агуд А5р Ап Тер Ре Геи ма! сіи сіи си Ап Іе Гуз 405 410 415

Ага си «2105» 49 «2115 363 «212» Білок «2135 Руєптит іггедиаге 60 «4005» 49 мес АЇїа б5ег тТиг 5ег АЇа АїТа сіп дор АЇа АЇа Рго Туг сі Ре РгО 1 5 10 15 5зег Гей Тийг соми чІЇе їу5 Агуд Аїа Ге Рго б5ег сіи Суз Ре сіи Аїа 20 25 30 65 зег ма! Рго Ге 5ег їеи Туг Ттуг Тйг Аїа Агуд 5ег Геи АїЇа гГеи Аїа 35 40 45 о1у 5ег Гей АїЇа ма! АїЇа гГеи 5ег туг АїТа Агд АїЇа гГеи Рго Геи маї 50 55 60 сіп АЇа А5п АЇа Гей Гей АЗр АЇа Ттйг оГеи Суз Тиг сіу туг ма! Геи 70 (65 70 75 80

Гей сіп сіу ч1Іе ма! Ре Тер сіу РПе Ре ТтТйг ма! сіу нНі5 А5р су 85 90 95 сІ1у ніх сіу Аїа Ре 5ег Агд бек Ні Ма! Ге Азп Ре 5ег ма!ї с1Уу 100 105 110

Тиг огГеи Мет Ні 5ег ІчІЇе ІчІЇе Ге Тйг Рго Ре си 5ег Тер Гуз гей 115 120 125 зег Ні Агуд Ні Ні Ні Гуз Ап Тйг с1іу Абп о ІЇе А5р Гуз А5р си 130 135 140

ІІе Ре туг Рго сіп Агуд сій АЇїа Ар бег Ні5 Рго ма! 5ег Агд Ні5 145 150 155 160

Гей ма! Мес 5ег ге сіу 5ег АЇа Тгр Ре АЇа туг Ге РПе АїЇа сі1у 165 170 175

Ре Рго Рго Агуд Тийг Мет доп Ні Ре Азп Рго Тгр сій АїТа мес туг 180 185 190

МмаїЇ Агд Агуд ма! Аїа Аїа ма! Іїе І1Їе 5екг Геи сІу ма! Гей Ріпе Аїа 195 200 205

Рпе Аїа сіу їеи Ттуг бек Туг Гей Тйг РМПе ма! Гей сіу Ре тйг тНг 210 215 220 мес Аїа ІІе туг туг Ре СсСІу Рго Гей Ре ІІе Ре АЇїа Ттийг мет Геи 20225 230 235 240 ма! ма! тис тис Ре Геи Ні Ні5 А5п А5р сій сій Те о Рго Тер туг 245 250 255

АТїа Азр 5ег сіи Тер тТийготуг ма! Гуз сСІ1у А5Зп Гец 5ег б5ег Ммаї др 260 265 270

Агд бег Ттуг с1у Аїа Гей ІЇе д5р А5п Гей 5ег Ні А5п ІЇе су тНг 275 280 285

НІі5 сіп ч1Ї1е Ні Ні Гей Ре Рго ІЇе ІІе Рго НІі5 Туг Гуз Гей А5Пп 290 295 300

А5Зр Аїа тиг АТа АЇа РПе АїЇа Гуз АЇа Ре Рго сіи Ге маїЇ Агд Гуз 305 310 315 320

А5п АЇа Аїа Рго ІчІІе ІІе Рго Тийг РМПе Ре Агуд Мет Аїа Аа мес туг 325 330 335

Аїа Гуз туг сіу ма! ма! А5р Тиг А5р АЇа Гуз Тиг РПе Тег гГеи Гуз 340 345 350 сім АїЇа Гуз АЇа АЇа АЇа гу5 тНг Гуз 5ег 5ег 355 360 «2105 50 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний праймер «4005 150 дсдаадсаса хсдадсса 18 «210» 51 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний праймер «400» 51 даєсдаддата дсадстдада 20 «2105 чмі.52 «2115 26 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний праймер «220» 60 «2215 тівбс Театиге «222» («13)..(013 «223» М - Нех «220» «2215» тівс. Театиге 65 «222» (93..(9) «223» М - 7еп «220» «2215» тівс. Театиге «222» (26)..(26) 70 «223» М - ЗІАВКЕО

«4005 52 пЕстстаспс сасстсасат дасасп 26 «2105 53 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний праймер «4005 53 асасаадсас ддасддатда 19 «2105 54 «2115 22 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний праймер «4005» 54 тддЕстааса ддасстаддад да 22 «2105 055 «2115 29 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний праймер «220» «2215» тівс.

Театиге «222» («13)..(013 «2235 М - ЕБАМ «220» «2215 тівс Театиге «222» («11)3..(11)3 «223» М - 7еп «220» «2215» тівс.

Театиге «222» (293)..(29) «223» М - ЗІАВКЕО «4005 155 пседасааада пдасессдад стесстдсп 29 «2105 56 «2115 22 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний праймер «4005» 56 саадсассді адсаададад са 22 «2105 57 «2115 20 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний праймер «4005 57 садасадссї даддесадса 20 «2105. 58 «2115 29 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний праймер «220» «2215» тівс.

Театиге «222» («13)..(013 «2235 М - ЕБАМ 65 «220» «2215» тівс.

Театиге «222» («11)3..(11)3 «223» М - 7еп «220» 70 «2215 тівс Театиге

«222» (2935..(29) «223» М - ЗІАВКЕО «4005 58 пеіссссастт пстітадсдаа аддаасдап 29

Claims (22)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Екстрагований Вгавзіса 5р. ліпід, що містить жирні кислоти в естерифікованій формі, причому жирні кислоти містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 0б жирні кислоти, які містять лінолеву кислоту (ЛК), 003 жирні кислоти, які містять о-лінолеву кислоту (АЛК), докозапентаєнову кислоту (ДПК), стеаридонову кислоту (СДК), ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) і ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), і при цьому рівень ДПК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 до 35 95, і причому рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 до 16 95, і при цьому рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, якщо вона присутня, є менше ніж 1 95.

2. Ліпід за п. 1, де щонайменше 70 95 ДПК, естерифікованої у формі триацилгліцерину (ТАГ), знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ.

3. Ліпід за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що має одну або більше з наступних ознак: ї) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 до 15 95 або від З до 10 95, ії) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 до 30 905, від З до 30 905, від б до 30 95, від 1 до 20 95, від 30 до 60 95 або 30 95, або від 15дОо ЗО Ор, ії) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 до 35 95, від 4 до 20 95, від 4 до 17 95 або від 5 до 10 95, ім) рівень о-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 до 40 95, від 7 до 40 95, від 10 до 35 905, від 20 до 35 905, від 4 до 16 95 або від 2 до 16 Ов, Зо м) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 95, менше ніж З 95, менше ніж 2 95, менше ніж 1 95, менше ніж 0,5 9бо, від 0,05 до 7 90, від 0,05 до 4 905, від 0,05 до З 95 або від 0,05 до 2 95, мі) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше ніж 10 956, менше ніж 8 95, менше ніж 7 95, менше ніж 6 95, менше ніж 4 9б, менше ніж З 90, від 0,05 до 7 9бо, від 0,05 до 6 Об, від 0,05 до 4 905, від 0,05 до З 9о, від 0,05 до 10 95 або від 0,05 до 2 95, мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше ніж 6 95, менше ніж 5 95, менше ніж 4 95, менше ніж 1 95, менше ніж 0,5 уо, відО,О5 до 6 905, від 0,05 до 5 905, від 0,05 до 4 95, від 0,05 до З 95 або від 0,05 до 2 95, мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше ніж 4 95, менше ніж 2 95, менше ніж 1 905, від 0,05 до 4 9б, від 0,05 до З 90 або від 0,05 до 2 95, або від 0,05 до 1 95, їх) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 до 15 95, менше ніж 4 95, менше ніж З 95, менше ніж 2 95, від 0,05 до 10 95, від 0,05 до 5 95, від 0,05 до З 95 або від 0,05 до 2 95, х) рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот у екстрагованому насінні олійної культури становить менш ніж 2 95 або від 0,05 до 2 95, хі) ліпід містить об-докозапентаєнову кислоту (22:54771013и183 серед жирних кислот, що містяться в ньому, хії) ліпід містить менш ніж 0,1 95 0б-докозапентаєнової кислоти (22:5А5710и13153 серед жирних кислот, що містяться в ньому, хії) ліпід містить менш ніж 0,1 95 однієї або більше або всіх із СДК, ЕПК і ЕТК серед жирних кислот, що містяться в ньому, хім) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 до 25 9б, від 4 до 20 9б, від б до 20 905, від 6 до 12 95, хм) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 до 40 90, від 4 до 35 90, від 8 до 25 905, від 8 до 22 9б, від 15 до 40 95 або від 15 до 35 95, хмі) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот 60 екстрагованого ліпіду становить від 20 до 75 95, від ЗО до 75 95 або від 50 до 75 95, або від 60 до 75 96,

хмії) рівень загальних б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 35 до 50 95, від 20 до 35 9б, від б до 20 95, менше ніж 20 95, менше ніж 16 95, менше ніж 10 905, від 1 до 16 905, від 2 до 10 95 або від 4 до 10 95, хмії) рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше ніж 10 95, менше ніж 8 95, менше ніж 6 95, менше ніж 4 90, від 1 до 20 9б, від 1 до 10 95, від0,5 до 8 95 або від 0,5 до 4 95, хіх) рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 36 до 65 95, від 36 до 70 905, від 40 до 60 905, від ЗО до 60 95, від 35 до 60 905, від 40 до 65 95, від ЗО до 65 95, від 35 до 65 Об, хх) рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 21 до 45 9б, від 21 до 35 95, від 23 до 35 95, від 25 до 35 905, від 27 до 35 Об, ххі) співвідношення загальних б жирних кислот: загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1,0 до 3,0, від 0,1 до 1, від 0,1 до 0,5, менше ніж 0,50, менше ніж 0,40, менше ніж 0,30, менше ніж 0,20, менше ніж 0,15, ххії) співвідношення нових фб жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1,0 до 3,0, від0О,02 до 0,1, від 0,1 до 1, від 0,1 до 0,5, менше ніж 0,50, менше ніж 0,40, менше ніж 0,30, менше ніж 0,20, менше ніж 0,15, ххії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією А12-десатурази щонайменше 60 95, щонайменше 70 956, щонайменше 80 95, від 60 до 98 95, від 70 до 95 95 або від 75 до 90 95, ххім) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на СДК під дією Аб-десатурази щонайменше 30 95, щонайменше 40 956, щонайменше 50 95, щонайменше 60 95, щонайменше 70 905, від ЗО до 70 95, від 35 до 60 95 або від 50 до 70 95, ххм) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення СДК на кислоту ЕТК під дією Дб-елонгази щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 905, від 60 до 95 95, від 70 до 88 95 або від 75 до 85 95, ххмі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕТК на ЕПК під дією д5-десатурази щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 905, від 60 до 99 95, від 70 до 99 95 або від 75 до 98 95, Зо ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією д5-елонгази щонайменше 80 956, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, від 50 до 99 9б, від 85 до 99 95, від 50 до 95 95 або від 85 до 95 95, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДПК щонайменше 10 95, щонайменше 15 95, щонайменше 20 956, щонайменше 25 95, від 10 до 50 оо, від 10 до 30 95, від 10 до 25 95 або від 20 до 30 95, ххіх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДПК щонайменше 15 95, щонайменше 20 95, щонайменше 22 95, щонайменше 25 95, щонайменше 30 до, щонайменше 40 95, від 15 до 50 905, від 20 до 40 95 або від 20 до 30 905, ххх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДПК щонайменше 17 95, щонайменше 22 95, щонайменше 24 95, щонайменше 30 95, від 22 до 70 95, від 17 до 55 95, від 22 до 40 95 або від 24 до 40 95, хххі) загальні жирні кислоти в екстрагованому ліпіді містять менше ніж 1,5 96 С20:1, менш ніж 1 Фо С20:1 хххії) вміст (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше 70 95, щонайменше 80 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, від 70 до 99 95 або від 90 до 99 905, хуххії) ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ),, який містить ДПК; хххім) ліпід містить менше ніж 10 95, менше ніж 5 95, менше ніж 1 95 або від 0,001 до 5 95 вільних (неестерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду хххм) щонайменше 72 95 або щонайменше 80 95 естерифікованої ДГК та/або ДПК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, хххмії) в ліпіді найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДПК, є ДПК/18:3/18:3 (ТАГ 56:12), ххумії) ліпід містить три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15), хххмії) рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 до 31 905, від 7 до 28 95, від 10 до 35 9б, від 10 до 30 95, від 10 до 25 95, від 10 до 22 95, від 14 до 35 оо, від 16 до 35 905, від 16 до 30 95, від 16 до 25 95 або від 16 до 22 95.

4. Ліпід за будь-яким одним з пп. 1-3, який є олією Вгазвіса парив.

5. Ліпід за будь-яким одним з пп. 1-3, який є олією Вгазвзіса /ипсеа.

6. Спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду Вгаззіса пари, який включає стадії, в яких: ї) одержують насіння Вгавзвзіса 5р., що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти в бо естерифікованій формі, і при цьому жирні кислоти містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які містять лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які містять с- ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК), ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) та ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), причому рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду у насінні становить від 7 до 35 95, при цьому рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду в насінні становить від 2 до 16 9б5, і при цьому рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду в насінні, якщо вона присутня, є менше ніж 1 95. і) екстрагують ліпід із насіння, причому рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 до 35 95, причому рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 до 16 95, і при цьому рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, якщо вона присутня, є менше ніж 1 95.

7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що екстрагований ліпід має одну або більше ознак, визначених за будь-яким з пп. 2-5.

8. Спосіб за п. 6 або п. 7, який відрізняється тим, що насіння містить екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів: ї) ю3-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А15-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А12-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, їм) А12-десатураза, ю3-десатураза та/або АЛ15-десатураза, Аб-десатураза, А5-десатураза, Дб- елонгаза і Д5-елонгаза, м) о3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) А15-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) Д12-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) А12-десатураза, 03-десатураза та/або Д15-десатураза, Ав-десатураза, А5-десатураза, Ло- елонгаза і Д5-елонгаза, їх) шЗ-десатураза або Д15-десатураза, Лб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і дД5Ь- елонгаза, або х) Фшф3З-десатураза або Д15-десатураза, АВ8-десатураза, А5-десатураза, ДЛУ-елонгаза і д5- елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально зв'язаний з одним або більше промоторів, здатних керувати експресією вказаних полінуклеотидів в клітині насіння.

9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що насіння має одну або більше, або всі з наступних ознак: ї) А12-десатураза перетворює олеїнову кислоту на лінолеву кислоту в одній або більше клітинах насіння з ефективністю щонайменше 60 9565, щонайменше 70 95, щонайменше 80 95, від 60 до 95 Фо, від 70 до 90 95 або від 75 до 85 95, ії) Ф3-десатураза перетворює 06 жирні кислоти на 03 жирні кислоти в одній або більше клітинах насіння з ефективністю щонайменше 65 9565, щонайменше 75 95, щонайменше 85 95, від 65 до 95 Фо, від 75 до 91 95 або від 80 до 91 95, ії) ДАб-десатураза перетворює АЛК на СДК в одній або більше клітинах насіння з ефективністю щонайменше 20 95, щонайменше 30 95, щонайменше 40 95, щонайменше 50 95, щонайменше 60 до, щонайменше 70 95, від 30 до 70 95, від 35 до 60 95 або від 50 до 70 905, їм) Аб-десатураза перетворює лінолеву кислоту на у-ліноленову кислоту в одній або більше клітинах насіння з ефективністю менше ніж 5 95, менше ніж 2,5 95, менше ніж 1 90, від 0,1 до 5 95, від 0,5 до 2,5 95 або від 0,5 до 1 95, м) Аб-елонгаза перетворює СДК на ЕТК в одній або більше клітинах насіння з ефективністю щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, від 60 до 95 95, від 70 до 80 95 або від 75до 80 95, мі) А5-десатураза перетворює ЕТК на ЕПК в одній або більше клітинах насіння з ефективністю щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 90 оо, від 60 до 95 95, від 70 до 95 95 або від 75 до 95 95, мії) Д5-елонгаза перетворює ЕПК на ДПК в одній або більше клітинах насіння з ефективністю щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, від 50 до 90 95 або від 85 до 95 95, мії) ефективність перетворення олеїнової кислоти на ДПК в одній або більше клітинах насіння становить щонайменше 10 95, щонайменше 15 95, щонайменше 20 95, щонайменше 25 905, 20 905, від 10 до 50 95, від 10 до 30 95, від 10 до 25 95 або від 20 до 30 95. їх) ефективність перетворення ЛК на ДПК в одній або більше клітинах насіння становить щонайменше 15 95, щонайменше 20 95, щонайменше 22 95, щонайменше 25 95, щонайменше 30 60 Фо, від 15 до 50 95, від 20 до 40 95 або від 20 до 30 95,

х) ефективність перетворення АЛК на ДПК в одній або більше клітинах частини рослини становить щонайменше 17 95, щонайменше 22 95, щонайменше 24 95, щонайменше 30 9б, від 17 до 55 95, від 22 до 35 95 або від 24 до 35 905, хі) одна або більше клітин насіння містять щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, від 25 до 40 95 або від 27,5 до 37,5 956 більше 03 жирних кислот, ніж відповідні клітини без екзогенних полінуклеотидів, хії) Аб-десатураза переважно здійснює десатурацію о-ліноленової кислоти (АЛК) відносно лінолевої кислоти (ЛК), хії) Аб-елонгаза також має активність Л9-елонгази, хім) А12-десатураза також має активність Д15-десатурази, хм) Аб-десатураза також має активність Д8-десатурази, хмі) АДв-десатураза також має активність Аб-десатурази, хмії) А15-десатураза також має активність 003-десатурази відносно ГЛК, хмії) юо3-десатураза також має активність А15-десатурази відносно ЛК, хіх) фФ3-десатураза здійснює десатурацію ЛК та/або ГЛК, хх) ш3-десатураза переважно здійснює десатурацію ГЛК відносно ЛК, ххі) одна або більше, або всі десатурази виявляють вищу активність на субстраті ацил-КоА, ніж на відповідному субстраті ацил-ФХ, ххі) Дб-десатураза має вищу активність Лб-десатурази відносно АЛК, ніж ЛК як жирнокислотного субстрату, ххії) Аб-десатураза має вищу активність Дб-десатурази відносно АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж відносно АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххім) Аб-десатураза має щонайменше в 2 рази вищу активність Аб-десатурази, щонайменше в З рази вищу активність, щонайменше в 4 рази вищу активність або щонайменше в 5 разів вищу активність відносно АЛК як субстрату, в порівнянні з ЛК, ххм) Дб-десатураза має вищу активність відносно АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж відносно АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххмі) Дб-десатураза має щонайменше в 5 разів вищу активність Лб-десатурази або щонайменше в 10 разів вищу активність відносно АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж відносно АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххмії) десатураза являє собою фронт-енд десатуразу, і ххміїї) Дб-десатураза не має активності Д5-десатурази, що піддавалася б виявленню, відносно

ЕТК.

10. Спосіб за п. 8 або п. 9, який відрізняється тим, що екзогенні полінуклеотиди ковалентно з'єднані в молекулу Т-ДНК, інтегровану в геном клітин насіння, і кількість таких молекул ДНК, інтегрованих в геном клітин насіння, переважно становить не більше однієї, не більше двох або трьох, або становить дві або три.

11. Спосіб за будь-яким із пп. 6-10, який відрізняється тим, що загальний вміст олії в насінні, що містить екзогенні полінуклеотиди, становить щонайменше 40 956, щонайменше 50 95, щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, від 50 до 80 95 або від 80 до 100 95 від загального вмісту олії у відповідному насінні, у якому відсутні екзогенні полінуклеотиди.

12. Спосіб за будь-яким із пп. 6-11, який відрізняється тим, що додатково включає стадію, в якій обробляють ліпід для підвищення рівня ДГК у відсотковому вираженні від загального вмісту жирних кислот, причому обробка включає одне або більше із фракціонування, перегонки або переестерифікації, такої як одержання метилових або етилових естерів ДПК.

13. Рослина Вгаззіса 5р. або її насіння, що містить: а) ліпід у насінні, який містить жирні кислоти в естерифікованій формі, і б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів; ї) А12-десатураза, ою3-десатураза та/або Л15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб- елонгаза і Д5-елонгаза, ї) А12-десатураза, 03-десатураза та/або Д15-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Ло- елонгаза і Д5-елонгаза, ії) 0З-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5Ь- елонгаза, або їм) ФЗ-десатураза та/або АЛ15-десатураза, Ав-десатураза, А5-десатураза, ЛУ-елонгаза і Д5- елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально зв'язаний з одним або більше специфічними для насіння промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у насінні рослини, що розвивається, і при цьому жирні кислоти містять олеїнову кислоту, пальмітинову бо кислоту, Ффб жирні кислоти, які містять лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які містять с-

ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК), ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) та/або ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), при тому, що рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду насіння становить від 7 до 35 95 і причому рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот ліпіду насіння становить від 2 до 16 Фо, і при цьому рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот ліпіду насіння, якщо вона присутня, є менше ніж 1 905.

14. Насіння Вгаззіса 5р., що має одну або більше із наступних ознак: ї) одержана із рослини за п. 13, її) містить ліпід за будь-яким із пп. 1-5, або ії) може застосовуватися у способі за будь-яким із пп. 6-12.

15. Спосіб одержання рослини бВгазвзіса 5р., яка може застосовуватися для одержання екстрагованого рослинного ліпіду за будь-яким із пп. 1-5, який включає стадії, в яких: а) визначають кількісно рівень ДПК у ліпіді, продукованому однією або більше насінинами від множини рослин Вгазвзіса 5р., причому кожна рослина містить один або більше екзогенних полінуклеотидів, що кодують один із наступних наборів ферментів; ї) ю3-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А15-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А12-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, їм) Д12-десатураза, 03-десатураза або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб- елонгаза і Д5-елонгаза, м) о3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) А15-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) Д12-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) А12-десатураза, Ф3-десатураза або АЛ15-десатураза, Ав-десатураза, АЛ5-десатураза, ЛОо- елонгаза і Д5-елонгаза, їх) ФшЗ-десатураза або Л15-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Аб-елонгаза і д5Б- елонгаза, або х) ФшфЗ-десатураза або Д15-десатураза, Дв-десатураза, Л5-десатураза, ДЛУ-елонгаза і д5- елонгаза, Зо причому кожен полінуклеотид функціонально зв'язаний з одним або більше промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині частини рослини, і б) ідентифікують рослину Вгазвіса 5р. із множини рослин Вгавзвіса 5р., яка може застосовуватися для одержання екстрагованого рослинного ліпіду за будь-яким із пп. 1-5 в одній або більше її насінині.

16. Спосіб за п. 15, що додатково включає одержання потомства рослин від ідентифікованої рослини або її насіння.

17. Рослина або насіння за п. 13 або п. 14, які відрізняються тим, що містить ліпід за пп. 2-5.

18. Шрот, одержаний із насіння за п. 14.

19. Корм, що містить одне або більше із ліпіду за будь-яким з пп. 1-5 або шроту за п. 18.

20. Спосіб одержання корму, який включає стадію, в якій змішують один або обидва із ліпіду за будь-яким із пп. 1-5 або шроту за п. 18, щонайменше із ще одним поживним інгредієнтом.

21. Застосування ліпіду за будь-яким із пп. 1-5 в лікуванні або попередженні стану, при якому ПНЖК здійснюють сприятливу дію, де стани включають підвищені рівні тригліцеролів у сироватці, підвищені рівні холестерину у сироватці, наприклад, підвищені рівні ЛІНП холестерину, серцеву аритмію, ангіопластику, запалення, астму, псоріаз, остеопороз, камені в нирках, СНІД, множинний склероз, ревматоїдний артрит, хворобу Крона, шизофренію, рак, плодовий алкогольний синдром, синдром гіперактивності і дефіциту уваги, муковісцидоз, фенілкетонурію, уніполярну депресію, агресивну ворожість, адренолейкодистрофію, захворювання коронарних судин серця, гіпертензію, діабет, ожиріння, хворобу Альцгеймера, хронічне обструктивне захворювання легенів, виразковий коліт, рестеноз після ангіопластики, екзему, гіпертонію, агрегацію тромбоцитів, шлунково-кишкову кровотечу, ендометріоз, передменструальний синдром, міалгічний енцефаломієліт, хронічну втомленість після вірусних інфекцій або захворювання очей.

22. Насіння олійної культури виду роду Вгазвзіса 5р., яке містить жирні кислоти в естерифікованій формі, при цьому жирні кислоти містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 поліненасичені жирні кислоти, які містять лінолеву кислоту (ЛК), 03 поліненасичені жирні кислоти, які містять о-ліноленову кислоту (АЛК), докозапентаєнову кислоту (ДПК), докозагексаєнову кислоту (ДГК), стеаридонову кислоту (СДК), ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) і ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), причому рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті бо жирних кислот насіння олійної культури становить від 2 до 16 95, рівень міристинової кислоти

(С14:0) в загальному вмісті жирних кислот насіння олійної культури, при наявності, становить менше ніж 1 956, рівень ДПК в загальному вмісті жирних кислот насіння олійної культури становить від 1 до 16 95, рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот насіння олійної культури становить менше ніж 2 95 і щонайменше 70 95 естерифікованої ДПК у формі триацилгліцеролу (ТАГ) знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ. шї В Й ВимтиКоВ. М я ї хм. в, В і В З з З з р цй ще і ш З її З ї З й що Цй щ що меповікко ою ан нн НН и НН НН НН о є ЩЕ я те що 5 ї, . т й ЩЕ с О щ ЩО «Ж З дяк 1 й зу я ЩО - ї . : й ЩЕ и щ ш щ 5 з І : ї Е 2 ї Щі й ші з й щ її БО й о ї її -е дає | ї о ї о їй щ ку В й и. я й ї ! с ! о В о в дж ВЗАБО ІТК 0 ЗИ ЛЕО ВЯЮ я по о ши ул ї т пт і що ї й 7 і ї о пт В; ще о я ше | що й ще й я й Ще й ЩЕ ПОП ж ШКОЛИ ШКО ШО ОО ОО іа: СОЛЕ шо по ЕК С що ООИЮ й: ОЛИ Ш Ва с АЖЖАВИ БИЯОДИЯКЬ З тЗ зіва аю ЗАТ ЯИ шт оман аю ! ЩЕ я щ о Те т Е " . т ї ЩЕ цк т ї ЩЕ ї ще ї ЩЕ 5 че. З ЩІ З ЩЕ 5 що 5 ї : : - - ші 5 ПЕ 7 ще У - у ї; г - : 7 ще 7 що я го зач тили лліЗикі Ще : х : 7 ще 7 п 7 ШЕ 7 г г її ! - 7 ще 7 ШЕ Кт ЩО Е що ї т Не ще що ЩЕ ї Ш Ак не | ПЕ п ї т А? я п п ї по т п ш по ПИ що й Бе Й як с |! ї й Б й що опожвухтиза Баеідпку о тю ЗАЗ ВО о ЩЕ п А: І нави і Мао шЕ й й Те що : : о : г . пе ї ЩІ т з ех аа вза віВідгю | вісн : Я в в щі в ї щ ання

ФІГ. 1 Руксо-дДеЕ Рісрачо30 аск: А120 ВАВ ПМ деериАбО | Рауза-А5о Рауха-АЗО Ругго-АБЕ пм 4 і ЖЕ Кк дИпм / : їз іх ще ДИМ ок пі у Ї со і хо и х 5 х Кк х у х Ж ; до 1 ТЕР -БНОС ектинї нос Сий / Х Спо У спії А дектий нос про -я КЕРІ РАК, ЕРІ Сай Ста Сай ЕАЄІ 355хХ2 ФІГ, 2

Ах) ! ше к-т хе вх отдек, : і мо ще дин М ОС Шах т т І ; й «ее і ' яю же Кк : І х З х с пе нн ке жу і 1 ї ій щої : ! З Її. Шо ме ! ' ї : І - ї : і А т й ие т о Шу : ! Жхоже ме ай ак ! і я . Уже і І ж й і І -х 7 і Ін о ви шт : на я Ко "их : ва ї ся Зб холестан З ол ! ' Ж ТАК х ' В) і НИ ше ! зи ди і ї Ах Б ! і 2 шк і ! Ки ! Нет би кампестерол ТО ситостероп і і її тя де ! ! Г В і ! в шою А - рин, 4 че ння х Й І аа пре пн -к ча ей ку сект ет чи ку ет о ЩІ Тс г і дня ужив, ие ' х г хо У і ' хом й Ів й - й 70007 брасікастероло 7 стипмастероло сх 0 авенастерол

ФІГ. З

КП неоміцин-канаміцин ДЖЕРЕЛО піда4 фосфотрансферази тип ПІ х ! ліва межа Т-ДНК, М еще одержаний із плазміди НК? ТЕР-Адпи-НОС М 7 Ж... ДЖЕРЕЛО сові КА фосфінотрицин-К-ацетиптрансферази ке - 00 ЛЕР, МпнвСпій ПРО зБеха М -йх ; о х к Як-- КП Місри-авО ТЕР Сіута-Лектин М МХ ? й КП Ругсо дельта-б-елонгази у ак з зРЗббо її ЕНХАНСЕР ТМВ Лідер ря 77 ПРО піпив-сяі? «обом ду 27578 ЩІ ПРО дгаф-ЕАЄЕ1 Ся пар оснанв. я вс (7681) ДИМ мсевв СХ ше 7 ПРО АгайнЕдЕї ТЕР пивсяй 322 «б ТМ Лідер КП іаскіаї120 в г -е Ж з.

КА Ругсо-ібЕ ТМ Лідер.

ТУ г.

ОК АКА ХХ тер сіута-Лектин ПРО вве Фу у ХО ляща) й , і 1 У х хх ТЕР Іівиз-СвИ г і КК ПРО вВіапатрі КЛрісраляю 01003030 тМВ Лідер (000 КП рахувачво 110 тЕР-догпи-НнОС 1 ДАМ місанв? 1 ПРО Ціпив-Сспі ФІГ 4 "ТМ Лідер