KR101261066B1

KR101261066B1 - ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 그리고 그들의이용

Info

Publication number: KR101261066B1
Application number: KR1020077006113A
Authority: KR
Inventors: 사카유 시미즈; 에이지 사쿠라다니
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2004-08-20
Filing date: 2005-08-19
Publication date: 2013-05-06
Also published as: AU2005273230A1; WO2006019192A1; CA2576953C; JP2006055104A; DK1790720T3; EP1790720A1; CN101006176B; US20080032335A1; US7615364B2; CA2576953A1; TW200613551A; CN101006176A; EP1790720A4; JP4587451B2; AU2005273230B2; TWI396739B; KR20070043049A; EP1790720B1; MY149486A

Abstract

본 발명은, 넓은 기질 특이성을 갖고, 효율적으로 ω3 위치에 불포화 결합을 생성시키는 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이 폴리뉴클레오티드를 생물체 내에서 발현시킴으로써, n-3 계 PUFAs 의 대량 생산을 가능하게 한다. ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드로서 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드로서 서열번호: 2 또는 3 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 등은, n-3 계 지방산의 생산에 유용하다.

Description

ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 그리고 그들의 이용{POLYPEPTIDE HAVING ACTIVITY OF UNSATURATING ω3-FATTY ACID, POLYNUCLEOTIDE CODING FOR THE POLYPEPTIDE AND USE THEREOF}

본 발명은, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖고, n-3 계의 불포화 지방산의 합성 반응을 촉매하는 폴리펩티드, 및 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 그리고 그것들의 대표적 이용에 관한 것이다.

다가 불포화 지방산 (PUFAs: Polyunsaturated fatty acids) 은, 세포막 인지질의 구성 성분으로서, 또한, 프로스타글란딘, 트롬복산, 류코트리엔 등의 호르몬 유사 생리 활성 물질의 전구체로서, 생물체 내에서 중요한 역할을 하고 있다. 이 PUFAs 로부터 합성되는 생리 활성 물질은 에이코사노이드로 불리며, 필요시에 체내에서 합성되어, 염증 반응, 생식 기능, 면역 응답, 혈압 등을 조절한다. PUFAs 는 또, 유아의 뇌 발달에 필요하다는 것이 보고되어 있다.

이러한 PUFAs 는, 생합성의 경로별로 n-3 계, n-6 계, n-9 계 등으로 분류된다. 여기서, 「n-」에 이어지는 숫자 3, 6 및 9 는, PUFAs 의 메틸기로부터 세어 최초의 이중 결합이 몇번째의 탄소에 있는가를 나타낸다. 예를 들어, 「n-3 」계는, 메틸기의 탄소를 1 위치의 탄소로 하여, 카르복실기측을 향해서 순차 2 위치, 3 위치 … 로 하였을 때, 메틸기로부터 세어 최초의 이중 결합이 3 위치의 탄소에 있는 PUFAs 를 나타내고, ω3 계라고도 표시된다. 도 7 에, 동물에 있어서의 주요 n-3 계 및 n-6 계의 PUFAs 를 나타낸다. n-3 계 (ω3 계) 에는, 필수 지방산인 α-리놀렌산 및 생체 내에서 α-리놀렌산 (ALA) 으로부터 대사되어 생기는 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17, 에이코사펜타엔산 (EPA), 도코사헥사에노산 (DHA) 등이 속한다. 또한, n-6 계 (ω6 계) 에는, 필수 지방산인 리놀레산 (LA) 및 생체 내에서 리놀레산으로부터 대사되어 생기는 γ-리놀렌산 (GLA), 디호모-γ-리놀렌산 (DGLA), 아라키돈산 (AA 또는 ARA) 등이 속한다. 도면 중 예를 들어, 「18:2Δ^9,12」로 나타내는 표시 중, 18:2 는 탄소수가 18 이고, 이중 결합의 수가 2 인 것을 나타내고 있다. 또한, Δ^9,12 는, 카르복실기의 탄소를 1 위치의 탄소로 하여, 메틸기측을 향해서 순차 2 위치, 3 위치 … 로 하였을 때의 이중 결합의 위치를 나타낸다. 또, 동물은, Δ⁹ 위치를 넘어 메틸기측의 C-C 결합을 불포화화하는 것이 불가능하기 때문에, α-리놀렌산 및 리놀레산을 필수 지방산으로서 음식물 (식물성 음식물) 로부터 섭취하지 않으면 안되고, 또한, n-6 계를 n-3 계로, 또는 n-3 계를 n-6 계로 상호 변환하는 것도 불가능하다.

n-6 계 PUFAs 와 n-3 계 PUFAs 는, 각각 상이한 기능을 하는 것이 잘 알려져 있으며, 어느 것이나 생물체 내에서 중요한 역할을 하고 있다. n-3 계 PUFAs 에 관해서는, EPA 의 항혈전 작용, 혈청 지질 개선 작용, DHA 의 학습 기능 향상 작용, 항암 작용을 비롯한 많은 생리 활성이 알려져 있고, 생체의 항상성을 유지하기 위해서 필수적이다. 전술한 바와 같이, 동물은 n-3 계 PUFAs 를 체내에서 합성할 수 없기 때문에, n-3 계 PUFAs 를 경구 섭취하는 것이 매우 중요하다.

이상과 같이 최근 중요성이 지적되고 있는 n-3 계 PUFAs 가 합성되기 위해서는, 지방산인 메틸기로부터 세어 3 위치와 4 위치, 즉 ω3 위치와 ω4 위치 사이에 불포화 결합을 형성시켜, ω3 불포화 지방산을 생성하는 활성을 갖는 ω3 지방산 불포화화 효소가 필요하다. 이 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자는, 지금까지, 고등식물, 녹조, 선충, 난균류, 자낭균 (子囊菌) 류 등에서 클로닝되어 있다 (예를 들어, 일본 공개특허공보 2001-95588공보 (평성 13년 (2001) 4월 10일 공개), 국제 공개 제WO03/064596호 팜플렛 (평성 15년 (2003) 8월 7일 공개), Science 258:1353-1355 (1992), Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:1314-1327 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:1142-1147 (1997), Biochemistry 39:11948-11954 (2000), Biochem. J. 378:665-671 (2004), Microbiology 150:1983-1990 (2004), Biochem. Biophys. Res. Commun. 150:335-341 (1988) 참조).

일본 공개특허공보 2001-95588호, Science 258:1353-1355 (1992), Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:1314-1327 (2002) 에서는, 고등식물이나 녹조의 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자에 의해 코드되는 단백질은, 리놀레산 (18:2) 과 같은 탄소수 18 인 n-6 계 지방산을 n-3 계의 α-리놀렌산 (18:3) 으로 변환하는 활성을 갖는 것이 보고되어 있다. 그러나, 고등식물이나 녹조의 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자에 의해 코드되는 단백질은, 탄소수 20 인 지방산을 n-3 계로 변환하는 것은 불가능하다.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:1142-1147 (1997), Biochemistry 39:11948-11954 (2000) 에서는, 선충 (Caenorhabditis elegans) 의 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자 (FAT-1) 에 의해 코드되는 단백질이 탄소수 16∼20 인 n-6 계 지방산에 작용하여, 그 ω3 위치에 불포화 결합을 생성시키는 것이 보고되어 있다. 그러나, Biochemistry 39:11948-11954 (2000) 에서는, 이 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자를 효모에서 발현시킨 경우, n-6 계의 아라키돈산 (20:4) 으로부터 n-3 계의 에이코사펜타엔산 (EPA) (20:5) 으로의 변환율은 낮아, 1.9% 에 불과한 것이 보고되어 있다.

또한, 국제 공개 제WO03/064596호의 팜플렛, Biochem. J. 378:665-671 (2004) 에서는, 난균류 (Saprolegnia diclina) 의 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자 (SDD17) 에 의해 코드되는 단백질은, 탄소수 20 인 n-6 계 지방산에 작용하여 그 ω3 위치에 불포화 결합을 생성시키는 것이 보고되어 있다. 그러나, 이것에 대하여 탄소수 18 인 n-6 계 지방산의 ω3 위치를 불포화화하는 것은 불가능하다.

또, Microbiology 150:1983-1990 (2004) 에서는, 자낭균에 속하는 Saccharomyces kluyveri 로부터, ω3 지방산 불포화화 효소 유전자가 클로닝된 것이 보고되어 있다. 이 유전자에 의해 코드되는 단백질은, n-6 계의 리놀레산 (18:2) 을 n-3 계의 α-리놀렌산 (18:3) 으로 변환하는 활성을 갖는다. 그러나 이 ω3 지방산 불포화화 효소는, 이것에 대하여 탄소수 20 인 n-6 계 지방산의 ω3 위치를 불포화화하는 것은 불가능하다.

그런데, 지질 생산균인 몰티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) 는 저온으로 하면 에이코사펜타엔산 (EPA) 을 생성하는 것이 알려져 있다. 즉 에이코사펜타엔산은, 글루코오스를 탄소원으로 하여 M. alpina 를 25℃ 에서 배양하면 생성되지 않지만 11℃ 에서 배양하면 생성된다 (예를 들어, Biochem. Biophys. Res. Commun. 150:335-341 (1988) 참조). 이것으로부터, 저온 하에서 유전자 발현 유도 또는 활성화되는 ω3 지방산 불포화화 효소의 존재가 시사되어 있다.

또한, 다수의 Mortierella 아속 (亞屬) 의 균주에 관해서, 저온에서 배양하였을 때에 에이코사펜타엔산을 균체 내에 축적하는 것이 알려져 있다. 그 때, 에이코사펜타엔산 (EPA) 이외의 n-3 계 지방산이 검출되지 않았기 때문에, 저온 조건 하에서 아라키돈산의 ω3 위치가 불포화화됨으로써 에이코사펜타엔산 (EPA) 이 생성되는 것으로 생각되었다 (J Am Oil Chem Soc 65, 1455-1459 (1988) 참조). 이것으로부터, 탄소수 20 인 지방산을 불포화화하는 ω3 지방산 불포화화 효소의 존재가 강하게 시사되어 있다.

발명의 개시

전술한 바와 같이, ω3 지방산 불포화화 효소 유전자는, 지금까지 고등식물, 녹조, 선충, 난균류, 자낭균류 등에서 클로닝되어 있는 것이 보고되어 있다. 그러나, 지금까지 보고되어 있는 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자는, ω3 위치를 불포화화할 수 있는 기질이 특정한 탄소수의 지방산에 한정되어 있거나, 또는, 숙주 세포에 도입하여 발현시키더라도 불포화화의 효율이 나쁘거나 하는 등의 문제가 있었다. 보다 넓은 범위의 지방산에 작용하고, 더구나, 효율적이며, 그 ω3 위치에 불포화 결합을 생성시키는 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자를 취득할 수 있다면, 보다 효율적으로, 많은 종류의 n-3 계 지방산을 합성할 수 있다.

또한, 진균류에서 유일 클로닝되어 있는 S. kluyveri 유래의 ω3 지방산 불포화화 효소는 탄소수 20 인 지방산을 불포화화하는 것이 불가능하다. 이것에 대하여, 전술한 바와 같이, Mortierella 아속의 균주에서는 탄소수 20 인 지방산을 불포화화하는 ω3 지방산 불포화화 효소의 존재가 시사되어 있지만, 아직 그 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자의 취득에는 도달하지 못하고 있다. 이러한 기지의 ω3 지방산 불포화화 효소의 서열 비교에 의해 설계한 축중 (縮重) 프라이머 등을 사용하더라도, M. alpina 유래의 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자를 클로닝하는 것은 곤란한 것으로 생각된다.

본 발명은, 상기한 문제점을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은, 보다 넓은 범위의 지방산에 작용하고, 또한, 효율적으로, 그 ω3 위치에 불포화 결합을 생성시키는 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 진균류에서 유일하게 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자가 클로닝되어 있는 S. kluyveri 에서는, (i) 당해 S. kluyveri 유래의 ω3 지방산 불포화화 효소의 아미노산 서열이 S. kluyveri 자신의 Δ¹² 지방산 불포화화 효소와 가장 상동성이 높은 (60%) 점, (ii) S. kluyveri 의 ω3 지방산 불포화화 효소의 아미노산 서열은, M. alpina 유래의 Δ¹²지방산 불포화화 효소와도 상동성이 높은 (38.6%) 점 (Microbiology 150:1983-1990 (2004)) 으로부터, M. alpina 에서도, ω3 지방산 불포화화 효소와 Δ¹²지방산 불포화화 효소의 아미노산 서열의 상동성이 높을 가능성이 있음이 상정되었다. 그래서, M. alpina 의 Δ¹²지방산 불포화화 효소, S. kluyveri 의 Δ¹²지방산 불포화화 효소 및 S. kluyveri 의 ω3 지방산 불포화화 효소의 추정 아미노산 서열을 비교하여 프라이머를 설계하고, 이것을 사용하여, PCR 에 의해, M. alpina 의 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자를 취득하는 것에 성공하였다. 또한, 얻어진 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자를, 실제로 생물체에서 발현시킨 결과, 탄소수 18 및 20 인 n-6 계 지방산의 어느 것에나 작용하며, 또한, 효율적이고, 그 ω3 위치에 불포화 결합을 생성시킬 수 있음을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드로서, 이하의 (a) 또는 (b):

(a) 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,

(b) 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,

인 것을 특징으로 하고 있다:

상기 구성에 의하면, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, ω3 불포화 지방산 합성 반응을 촉매할 수 있다.

본 발명에 관련된 항체는, 상기 폴리펩티드와 결합하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기 구성에 의하면, 본 발명에 관련된 항체는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 생물체 또는 그 조직 또는 세포를 동정할 수 있다.

본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드는, 상기 폴리펩티드를 코드하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드로서, 하기의 (c), (d), (e) 또는 (f) :

(c) 서열번호: 2 또는 3 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드,

(d) 서열번호: 2 로 나타내는 염기 서열 중 제14번째부터 제1366번째까지의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드,

(e) 서열번호: 2 또는 3 에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,

(f) 서열번호: 2 로 나타내는 염기 서열 중 제14번째부터 제1366번째까지의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드

중 어느 하나인 것이 바람직하다.

상기 구성에 의하면, 형질 전환체에 있어서 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 합성하기 위해서, 상기 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다.

본 발명에 관련된 벡터는, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기 구성에 의하면, 상기 폴리뉴클레오티드를 생물 또는 세포에 도입하여 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 재조합 발현시키거나, 무세포 단백질 합성계를 사용하여 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 합성하거나 할 수 있다.

본 발명에 관련된 형질 전환체는, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있는 것을 특징으로 하고 있다. 상기 형질 전환체는, 진균 (효모, 사상균 등), 동물, 또는, 식물 또는 그 자손, 또는 이들 유래의 세포 또는 조직인 것이 바람직하고, 상기 식물은 대두, 유채씨, 참깨, 올리브, 아마인, 옥수수, 해바라기, 또는 홍화인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 관련된 형질 전환체는, 지방산 조성이 개변되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명에 관련된 상기 폴리펩티드의 생산 방법은, 상기 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하고 있다. 또한, 본 발명에 관련된 상기 폴리펩티드의 생산 방법은, 상기 형질 전환체를 사용하는 것이어도 된다.

상기 구성에 의하면, ω3 지방산 불포화화 반응을 촉매하는 폴리펩티드를 저비용이며, 또한 환경에 저부하인 조건 하에서 제공하는 것이 가능해진다.

본 발명에 관련된 지방산의 생산 방법은, 상기 형질 전환체를 사용하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 관련된 상기 폴리펩티드의 생산 방법은, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질 전환체를, 배양 개시로부터, 또는, 최적 배양 온도에서 배양한 후에, 최적 배양 온도보다 낮은 온도에서 배양하여, 폴리펩티드를 생산하는 것; 또는, 상기 폴리펩티드의 합성계를 0℃ 이상, 20℃ 이하의 온도 조건에 두고, 상기 폴리펩티드를 생산하는 것이 가능하다. 또한, 상기 최적 배양 온도보다 낮은 온도는, 0℃ 이상, 20℃ 이하로 하는 것이 가능하다.

또, 본 발명에 관련된 지방산의 생산 방법은, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 생물 또는 세포를, 배양 개시로부터, 또는, 최적 배양 온도에서 배양한 후에, 최적 배양 온도보다 낮은 온도에서 배양하여, 지방산을 생산하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 최적 배양 온도보다 낮은 온도는, 0℃ 이상, 20℃ 이하인 것이 바람직하다.

상기 구성에 의하면, ω3 지방산 불포화화 반응을 촉매하는 폴리펩티드를 보다 효율적으로 기능시킬 수 있다. 그러므로, ω3 위치가 불포화화된 지방산을 효율적으로 생산시키는 것이 가능해진다.

또한, 상기 지방산의 생산 방법은, 상기 지방산이, α-리놀렌산 (ALA), 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17, 또는 에이코사펜타엔산 (EPA) 인 것이 바람직하다.

본 발명에 관련된 식품 또는 공업 제품은, 상기 지방산 생산 방법에 의해 얻어진 α-리놀렌산 (ALA), 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17, 또는 에이코사펜타엔산 (EPA) 을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기 구성에 의하면, n-3 계의 PUFAs 는 알레르기, 염증, 혈액 응고 또는 혈관 수축을 억제하는 작용을 갖기 때문에, 식품 또는 공업 제품으로서 유효하게 이용할 수 있다.

본 발명에 관련된 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 취득하는 방법은, 생물로부터 조제된 게놈 DNA 또는 cDNA 로부터,

(g) 상기 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 프래그먼트인 올리고뉴클레오티드를 프로브로 한 하이브리다이제이션; 또는

(h) 상기 폴리뉴클레오티드의 프래그먼트인 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용한 PCR;

에 의해, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 취득하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기 구성에 의하면, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 효율적으로 취득할 수 있다.

또한, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드는, 상기 (c), (d), (e) 또는 (f) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드여도 된다.

상기 구성에 의하면, 상기 폴리뉴클레오티드를 안티센스 폴리뉴클레오티드로서 사용하여, 상기 생물체 또는 그 조직 또는 세포에 있어서의 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 제어할 수 있다. 또한, 상기 (a)ㆍ(b) 의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및, 상기 (c)∼(f) 의 폴리뉴클레오티드를 동시에 동일 세포 내에서 발현되도록 하면, RNAi 가 생성된다. 그 때문에, 폴리펩티드의 발현을 억제하는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드는, 상기 폴리뉴클레오티드의 프래그먼트여도 된다.

상기 구성에 의하면, 상기 올리고뉴클레오티드는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 하이브리다이제이션 프로브 또는 당해 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머로서 이용할 수 있다. 또, 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하면, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 생물체 또는 그 조직 또는 세포를 동정할 수 있다. 또, 나아가, 상기 올리고뉴클레오티드를 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용하여, 상기 생물체 또는 그 조직 또는 세포에 있어서의 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 제어할 수 있다.

본 발명에 관련된 검출 기구는, 상기 (c), (d), (e) 또는 (f) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 그 뉴클레오티드의 프래그먼트인 상기 올리고뉴클레오티드가 기판 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하고 있다.

상기 구성에 의하면, 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 검출하여, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 생물을 용이하게 검출할 수 있다.

또한, 본 발명에 관련된 검출 기구는, 상기 폴리펩티드가 기판 상에 고정화되어 있는 것이어도 된다.

상기 구성에 의하면, 상기 폴리펩티드와 상호 작용하는 물질을 검출하여, 상기 폴리펩티드의 ω3 지방산 불포화화 활성을 조절하는 물질을 용이하게 검출할 수 있다.

또한, 본 발명에 관련된 검출 기구는, 상기 항체가 기판 상에 고정화되어 있는 것이어도 된다.

상기 구성에 의하면, 상기 항체와 결합하는 항원을 검출하여, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 용이하게 검출할 수 있다.

또, 본 발명에는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열과의 상동성이 70% 이상인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및, 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열과의 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함된다.

본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 진균 (효모, 사상균 등) 또는 식물 등의 생물에서 내재성의 지방산을 ω3 불포화화하는 반응을 촉매할 수 있기 때문에, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질 전환체를 사용하면, 저비용이고 또한 환경에 대하여 저부하인 생산 프로세스에 의해 α-리놀렌산 (ALA), 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17, 에이코사펜타엔산 (EPA) 등의 n-3 계 지방산의 대량 조제가 가능해진다. 또한 본 발명은, α-리놀렌산 (ALA), 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17, 에이코사펜타엔산 (EPA) 등의 n-3 계 지방산을 대량 조제함으로써 저렴한 식품 또는 공업 제품을 제공할 수 있다.

도 1 은, Mortierella alpina 및 Saccharomyces kluyveri 의 Δ¹²지방산 불포화화 효소 및 Saccharomyces kluyveri 의 ω3 지방산 불포화화 효소의 추정 아미노산 서열과, 이들 사이에서 상동성이 높은 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.

도 2 는, Mortierella alpina 의 ω3 지방산 불포화화 효소의 아미노산 서열을, Mortierella alpina 의 Δ¹²지방산 불포화화 효소, Saccharomyces kluyveri 의 ω3 지방산 불포화화 효소, 대두의 소포체 국재 (局在) ω3 지방산 불포화화 효소, 대두의 클로로플라스트 국재 ω3 지방산 불포화화 효소의 아미노산 서열과 비교한 도면이다.

도 3 은, 기질로서 리놀레산을 첨가한 경우의, pYMAW3 을 도입한 효모 Saccharomyces cerevisiae 에 있어서의, 가스 크로마토그래피에 의한 지방산 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 4 는, 기질로서 γ-리놀렌산을 첨가한 경우의, pYMAW3 을 도입한 효모 Saccharomyces cerevisiae 에 있어서의, 가스 크로마토그래피에 의한 지방산 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 5 는, 기질로서 디호모-γ-리놀렌산을 첨가한 경우의, pYMAW3 을 도입한 효모 Saccharomyces cerevisiae 에 있어서의, 가스 크로마토그래피에 의한 지방산 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 6 은, 기질로서 아라키돈산을 첨가한 경우의, pYMAW3 을 도입한 효모 Saccharomyces cerevisiae 에 있어서의, 가스 크로마토그래피에 의한 지방산 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 7 은, 동물에 있어서 주요한 n-3 계 및 n-6 계 PUFAs 를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명에 관련된 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드, 당해 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 이용에 관해서 상세히 설명한다.

(1) 폴리펩티드

본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 신규 ω3 불포화화 효소로, 지방산의 ω3 위치를 불포화화하여, n-3 계 지방산을 생성시킨다. 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 지방산의 ω3 위치를 불포화화하는 활성을 갖는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, ω3 지방산 불포화화의 대상이 되는 기질로서, 탄소수 18 및/또는 20 인 지방산의 ω3 위치를 불포화화하는 활성을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 탄소수 18 및 20 인 지방산의 ω3 위치를 불포화화하는 활성을 갖는 것이 보다 바람직하다. 기질로서 ω3 위치를 불포화화할 수 있는 대상의 범위가 넓음으로써, 다양한 n-3 계 지방산을 생산하는 것이 가능해진다.

또한, 기질이 되는 지방산은, 포화 지방산이어도 되고, 불포화 지방산이어도 되지만, 불포화 지방산인 것이 보다 바람직하고, n-6 계 지방산인 것이 더욱 바람직하다. n-6 계 지방산의 ω3 위치를 불포화화함으로써, 생물의 체내에서 중요한 역할을 하는 PUFAs 를 생산시키는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 기질이 되는 지방산으로서 n-6 계 지방산의 ω3 위치를 불포화화하는 활성을 갖는 것이 바람직하지만, 그와 같은 지방산으로는, n-6 위치에 불포화 결합을 갖는 지방산이면, 그 이중 결합의 수나 위치는 특별히 한정되지 않는다. 그 중에서도, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 리놀레산, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산의 ω3 위치를 불포화화하는 활성을 갖는 것이 특히 바람직하다. 이것에 의해, ω3 위치를 불포화화하여, 리놀레산으로부터 α-리놀렌산을, γ-리놀렌산으로부터 스테아리돈산을, 디호모-γ-리놀렌산으로부터 20:4Δ^8,11,14,17 을, 아라키돈산으로부터 에이코사펜타엔산을 합성할 수 있는 것으로 생각된다. 얻어지는 n-3 계 PUFAs 는, 알레르기, 염증, 혈액 응고 또는 혈관 수축을 억제하는 작용을 갖기 때문에, 식품 또는 공업 제품으로서 유효하게 이용할 수 있다.

본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「폴리펩티드」는, 「펩티드」 또는 「단백질」과 교환 가능하게 사용된다. 또한, 폴리펩티드의 「프래그먼트」는, 당해 폴리펩티드의 부분 단편을 의도하고 있다. 본 발명에 관련된 폴리펩티드는 또한, 천연 공급원으로부터 단리되어도 되고, 화학 합성되어도 된다.

용어 「단리된」 폴리펩티드 또는 단백질은, 그 천연의 환경에서부터 추출된 폴리펩티드 또는 단백질을 의도하고 있다. 또, 숙주 세포 중에서 발현된 재조합 생성된 폴리펩티드 및 단백질은, 임의의 적절한 기술에 의해서 실질적으로 정제되어 있는 천연 또는 재조합의 폴리펩티드 및 단백질과 동일하게, 단리되어 있는 것으로 생각된다.

본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 천연의 정제산물, 화학 합성 수순의 산물, 및 원핵 생물 숙주 또는 진핵 생물 숙주 (예를 들어, 세균, 진균 (효모, 사상균 등), 고등식물 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함한다) 로부터 재조합 기술에 의해서 생성된 산물을 포함한다. 재조합 생성 수순에 있어서 사용되는 숙주에 의존하여, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있거나, 또는 비글리코실화될 수 있다. 그리고, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는 또한, 몇가지 경우, 숙주 매개 프로세스의 결과로서, 개시(開始)의 개변 메티오닌 잔기를 함유할 수 있다.

본 발명은, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 서열번호: 1 에 나타내는 아미 노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 변이체이고 또한 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드이다.

변이체로는, 결실, 삽입, 역전, 반복, 및 치환을 포함하는 변이체를 들 수 있다. 특히, 폴리펩티드에 있어서의 「중성」아미노산 치환은, 일반적으로 그 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 주지 않는다.

폴리펩티드의 아미노산 서열 중 몇 개의 아미노산이, 이 폴리펩티드의 구조 또는 기능에 유의하게 영향을 주지 않고 용이하게 개변될 수 있는 것은, 당해 분야에 있어서 주지되어 있다. 또, 인위적으로 개변시키는 것 뿐만 아니라, 천연의 단백질에 있어서, 당해 단백질의 구조 또는 기능을 유의하게 변화시키지 않은 변이체가 존재하는 것도 또한 주지되어 있다.

당업자는, 주지 기술을 사용하여 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수 개의 아미노산을 용이하게 변이시킬 수 있다. 예를 들어, 공지된 점 변이 도입법에 따르면, 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 임의의 염기를 변이시킬 수 있다. 또한, 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 임의의 부위에 대응하는 프라이머를 설계하여 결실 변이체 또는 부가 변이체를 제작할 수 있다. 그리고, 본 명세서 중에 기재되는 방법을 사용하면, 제작한 변이체가 원하는 활성을 갖는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서의 변이체는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 본 발명에 관련된 폴리펩티드 활성을 변화시키지 않은 변이인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 사일렌트 변이나 보존성 치환 등을 들 수 있다.

대표적으로 보존성 치환으로서 보이는 것은, 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu, 및 Ile 중에서의 하나의 아미노산의 별도 아미노산으로의 치환; 히드록실 잔기 Ser 및 Thr 의 교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu 의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln 간 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg 의 교환, 그리고 방향족 잔기 Phe, Tyr 사이의 치환이다. 또한, 사일렌트 치환은, 아미노산이 치환, 첨가 또는 결실되어도 폴리펩티드 활성에 영향이 없는 변이이다.

상기에 상세히 나타낸 바와 같이, 임의의 아미노산의 변화가 표현형적으로 사일렌트일 것 같은지 (즉, 기능에 대하여 유의하게 유해한 효과를 가질 것 같지 않은지) 에 관한 더욱 자세한 가이던스는, Bowie, J.U. 들의 「Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions」, Science 247:1306-1310 (1990) (본 명세서 중에 참고로서 원용된다) 에서 발견할 수 있다.

본 실시형태에 관련된 폴리펩티드는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드로서,

(a) 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열; 또는

(b) 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열

로 이루어지는 폴리펩티드인 것이 바람직하다.

상기 「1 개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된」 이란, 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 공지된 변이 폴리펩티드 제작법에 의해 치환, 결실, 삽입, 또는 부가 가능한 정도의 수 (바람직하게는 10 개 이하, 보다 바람직하게는 7 개 이하, 가장 바람직하게는 5 개 이하) 의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있는 것을 의미한다. 이러한 변이 폴리펩티드는, 전술한 바와 같이, 공지된 변이 폴리펩티드 제작법에 의해 인위적으로 도입된 변이를 갖는 폴리펩티드에 한정되지 않고, 천연적으로 존재하는 폴리펩티드를 단리 정제한 것이어도 된다.

또한, 본 발명에는, 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열과의 상동성이 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상인 아미노산 서열을 갖고, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드도 포함된다. 이러한 폴리펩티드에 있어서의 아미노산 서열의 상동성은 70% 이상이면 되지만, 90% 이상이 바람직하고, 95% 이상이 보다 바람직하고, 98% 이상이 더욱 바람직하고, 99% 이상이 특히 바람직하다.

또, 본 명세서에 있어서의 상기 「상동성」이란, BLAST (Basic local alignment search tool; Altschul, S.F. et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) 검색에 의해 얻어진 값을 의미하는 것으로, 아미노산 서열의 상동성은 BLAST 검색 알고리즘에 의해 결정할 수 있다. 구체적으로는, BLAST 패키지 (sgi 32bit 판, ver.2.0.12; NCBI 에서 입수) 의 bl2seq 프로그램 (Tatiana A. Tatusova 및 Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999) 을 사용하여, 디폴트 파라미터에 따라서 산출할 수 있다. 페어와이즈 얼라인먼트 파라미터로서, 프로그램명 「blastp」을 사용하여, Gap 삽입 Cost 값을 「0」으로 하고, Gap 신장 Cost 값을 「0」으로 하고, Query 서열의 필터로서 「SEG」를, 매트릭스로서 「BLOSUM62」를 각각 사용한다.

또, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 아미노산이 펩티드 결합하고 있는 폴리펩티드이면 되지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 폴리펩티드 이외의 구조를 포함하는 복합 폴리펩티드이어도 된다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 「폴리펩티드 이외의 구조」로는, 당사슬이나 이소프레노이드기 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 부가적인 폴리펩티드를 포함하는 것이어도 된다. 부가적인 폴리펩티드로는, 예를 들어, His 나 Myc, Flag 등의 에피토프 표지 폴리펩티드를 들 수 있다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 융합 단백질과 같은 개변된 형태로 재조합 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 관련된 폴리펩티드의 부가적인 아미노산, 특히 하전성 아미노산 영역이, 정제하는 동안 또는 이어지는 조작 및 보존하는 동안의 안정성 및 지속성을 개선하기 위해서, 폴리펩티드의 N 말단에 부가될 수 있다.

본 실시형태에 관련된 폴리펩티드는, 예를 들어, 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 코드하는 서열인 태그 표지 (태그 서열 또는 마커 서열) 에 N 말단 또는 C 말단으로 부가될 수 있다. 이러한 서열은, 폴리펩티드의 최종 조제 전에 제거될 수 있다. 본 발명의 이 국면의 특정한 바람직한 실시양태에 있어서, 태그 아미노산 서열은, 헥사-히스티딘 펩티드 (예를 들어, pQE 벡터 (Qiagen, Inc.) 에 있어서 제공되는 태그) 이고, 그 밖의 것 중에서는, 그들의 대 부분은 공적 및/또는 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, Gentz 들, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989) (본 명세서 중에 참고로서 원용된다) 에 있어서 기재된 바와 같이, 헥사히스티딘은 융합 단백질의 간편한 정제를 제공한다. 「HA」태그는, 인플루엔자 적혈구 응집소 (HA) 단백질 유래의 에피토프에 대응하는 정제를 위해서 유용한 별도 펩티드로, 그것은, Wilson 들, Cell 37:767 (1984) (본 명세서 중에 참고로서 원용된다) 에 의해서 기재되어 있다. 다른 그와 같은 융합 단백질은, N 또는 C 말단에서 Fc 에 융합되는 본 실시형태에 관련된 폴리펩티드 또는 그 프래그먼트를 포함한다.

또한, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 후술하는 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 (본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 유전자) 를 숙주 세포에 도입하여, 그 폴리펩티드를 세포내 발현시킨 상태여도 되고, 세포, 조직 등으로부터 단리 정제된 경우여도 된다. 또, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 화학 합성된 것이어도 된다.

재조합 생성은, 당해 분야에서 주지된 방법을 사용하여 실시할 수 있고, 예를 들어, 이하에 상세히 서술되는 벡터 및 세포를 사용하여 실시할 수 있다.

합성 펩티드는, 화학 합성의 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985) (본 명세서 중에 참고로서 원용된다) 의 방법을 사용할 수 있다. 이 「Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS)」프로세스는, 또한 Houghten 들 (1986) 의 미국 특허 제4,631,211호에 기재된다. 이 순서에 있어서, 여러 가지 펩티드의 고상 합성을 위한 개개의 수지는 별도의 용매 투과성 패킷에 포함되어, 고상법에 관련된 다수의 동일 반복 공정의 최적 사용을 가능하게 한다. 완전한 매뉴얼 순서는, 500∼1000 이상의 합성이 동시에 실시되는 것을 가능하게 한다 (Houghten 들, 상기 문헌, 5134). 이들 문헌은, 본 명세서 중에 참고로서 원용된다.

하기에 상세히 기재하는 바와 같이, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 지방산의 ω3 위치를 불포화화하여 n-3 계 지방산을 생성하기 위한 방법 및 키트에 있어서 유용하다.

이와 같이, 본 발명에 관련된 폴리펩티드는, 적어도, 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열을 포함하고 있으면 된다고 할 수 있다. 즉, 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열과 특정한 기능 (예를 들어, 태그) 을 갖는 임의의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다는 것에 유의하여야 한다. 또한, 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열 및 당해 임의의 아미노산 서열은, 각각의 기능을 저해하지 않도록 적절한 링커 펩티드에 의해 연결되어 있어도 된다.

(2) 폴리뉴클레오티드

본 발명은, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「폴리뉴클레오티드」는 「핵산」 또는 「핵산 분자」와 교환 가능하게 사용되고, 뉴클레오티드의 중합체를 의도한다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「염기 서열」은, 「핵산 서열」 또는 「뉴클레오티드 서열」과 교환 가능하게 사용되고, 데옥시리보뉴클레오티드 (A, G, C 및 T 로 생략된다) 의 서열로서 표시된다. 또한, 「서열번호: 2 에 나타내는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 프래그먼트」란, 서열번호: 2 의 각 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및/또는 T 에 의해서 나타나는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편부분을 의도한다.

본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드는, RNA (예를 들어, mRNA) 의 형태, 또는 DNA 의 형태 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 로 존재할 수 있다. DNA 는, 2 본쇄 또는 1 본쇄일 수 있다. 1 본쇄 DNA 또는 RNA 는, 코드 사슬 (센스 사슬로서도 알려진다) 일 수 있거나, 또는 그것은, 비코드 사슬 (안티센스 사슬로도 알려진다) 일 수 있다.

본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「올리고뉴클레오티드」는, 뉴클레오티드가 수 개 내지 수십 개 결합한 것을 의도하고, 「폴리뉴클레오티드」와 교환 가능하게 사용된다. 올리고뉴클레오티드는, 짧은 것은 디뉴클레오티드 (2 량체), 트리뉴클레오티드 (3 량체) 로 하고, 긴 것은 30량체 또는 100량체와 같이 중합하고 있는 뉴클레오티드의 수로 표시된다. 올리고뉴클레오티드는, 보다 긴 폴리뉴클레오티드의 프래그먼트로서 생성되어도 되고, 화합 합성되어도 된다.

본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드의 프래그먼트는, PCR 이나 프로브 등의 용도에 따라서 바람직한 사이즈를 적절히 선택하면 되지만, 적어도 12nt (뉴클레오티드) 가 바람직하고, 적어도 15nt 이상이 보다 바람직하고, 15∼25nt 의 범위내가 보다 바람직하고, 30nt 이상이어도 되고, 40nt 이상이어도 되며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 적어도 20nt 길이의 프래그먼트에 의해서, 예를 들어, 서열번호: 2 또는 3 에 나타내는 염기 서열로부터의 20 이상의 연속된 염기를 포함하는 프래그먼트가 의도된다. 본 명세서를 참조하면 서열번호: 2 또는 3 에 나타내는 염기 서열이 제공되기 때문에, 당업자는 서열번호: 2 또는 3 에 기초하는 DNA 프래그먼트를 용이하게 제작할 수 있다. 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 절단 또는 초음파에 의한 전단은, 여러 가지 사이즈의 프래그먼트를 제작하기 위해서 용이하게 사용될 수 있다. 또는, 이러한 프래그먼트는 합성적으로 제작될 수 있다. 적절한 프래그먼트 (올리고뉴클레오티드) 가, Applied Biosystems Incorporated (ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404) 392형 신시사이저 등에 의해서 합성된다.

또한 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드는, 그 5’측 또는 3’측에서 상기 서술한 태그 표지 (태그 서열 또는 마커 서열) 를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 융합될 수 있다.

본 발명은 또한, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 변이체는, 천연의 대립 유전자 변이체와 같이, 천연에서 생길 수 있다. 「대립 유전자 변이체」에 의해서, 생물의 염색체 상의 소정 유전자좌를 차지하는 유전자의 몇가지 교환 가능한 형태 중 하나가 의도된다. 천연에 존재하지 않는 변이체는, 예를 들어 당해 분야에서 주지된 변이 유발 기술을 사용하여 생성될 수 있다.

이러한 변이체로는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에 있어서 1 또는 복수 개의 염기가 결실, 치환, 또는 부가된 변이체를 들 수 있다. 변이체는, 코드 또는 비코드 영역, 또는 그 양쪽에 있어서 변이될 수 있다. 코드 영역에서의 변이는, 보존적 또는 비보존적인 아미노산 결실, 치환, 또는 부가를 생성할 수 있다.

본 발명은 또한, 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건 하에서, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 당해 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 포함한, 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드로, 또한

(a) 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드; 또는

(b) 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드

중 어느 하나인 것이 바람직하다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드로서, 하기의 (c), (d), (e) 또는 (f) :

중 어느 하나인 것이 바람직하다.

또, 상기 「스트린젠트한 조건」이란, 적어도 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 97% 의 동일성이 서열 사이에 존재할 때에만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미한다.

상기 하이브리다이제이션은, Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989) 에 기재되어 있는 방법과 같은 주지된 방법으로 실시할 수 있다. 통상, 온도가 높을수록, 염 농도가 낮을수록 스트린젠시는 높아지고 (하이브리다이즈하기 어려워진다), 보다 상동인 폴리뉴클레오티드를 취득할 수 있다. 하이브리다이제이션의 조건으로는 종래 공지된 조건을 바람직하게 사용할 수 있고, 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어, 42℃, 6×SSPE, 50% 포름아미드, 1% SDS, 100㎍/㎖ 연어 정자 DNA, 5×덴하트액 (단, 1×SSPE; 0.18M 염화나트륨, 10mM 인산나트륨, pH 7.7, 1mM EDTA. 5×덴하트액; 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 휘콜 (Ficoll), 0.1% 폴리비닐피롤리돈) 을 들 수 있다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드는, 상기 (c), (d), (e) 또는 (f) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

별도 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드는, 상기 폴리뉴클레오티드의 프래그먼트인 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는, 2 본쇄 DNA 뿐만 아니라, 그것을 구성하는 센스 사슬 및 안티센스 사슬 등의 각 1 본쇄 DNA 나 RNA 를 포함한다. 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는, 안티센스 RNA 메카니즘에 의한 유전자 발현 조작을 위한 툴로서 사용할 수 있다.

안티센스 RNA 기술은, 표적 유전자에 대하여 상보적인 RNA 전사체를 생성하는 키메라 유전자의 도입을 기본 원리로 한다. 그 결과로서 얻어지는 표현형은, 내인성 유전자에 유래하는 유전자 산물의 감소이다. 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 도입함으로써, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드의 함량을 저하시키는 것에 의해 생물 중의 n-3 계 산 함량을 저하시킬 수 있다. 또한, 동시에 기질이 되는 지방산의 함량 저하를 막는 것이 가능해진다.

따라서 예를 들어, 아라키돈산과 같은 n-6 지방산을 생산시키고자 하는 경우에, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드의 함량을 저하시킴으로써, ω3 불포화화에 의한 아라키돈산 함량의 저하를 막을 수 있다. DNA 에는 예를 들어 클로닝이나 화학 합성 기술 또는 그들의 조합에서 얻어지는 cDNA 나 게놈 DNA 등이 포함된다. 또, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는, 비번역 영역 (UTR) 의 서열이나 벡터 서열 (발현 벡터 서열을 포함한다) 등의 서열을 포함하는 것이어도 된다.

또한, RNA 간섭 (RNAi) 에 의해 폴리펩티드의 발현을 억제하는 것도 가능하다. RNAi 는, 2 본쇄 RNA 를 세포 내에 도입함으로써 세포 내에서 당해 2 본쇄 RNA 의 서열에 상동인 mRNA 가 분해되어, 유전자 발현이 억제되는 현상이다. 이 방법을 사용함으로써도, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드의 함량을 저하시키는 것에 의해 생물 중의 n-3 계 산 함량을 저하시킬 수 있다. 또한, 동시에 기질이 되는 지방산의 함량 저하를 막는 것이 가능해진다. 구체적으로는, 상기 (a)ㆍ(b) 의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및, 상기 (c)∼(f) 의 폴리뉴클레오티드를 동시에 동일한 세포 내에서 발현되도록 하면, RNAi 가 생성된다. 그 때문에, 폴리펩티드의 발현을 억제하는 것이 가능해진다.

본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 취득하는 방법으로서, 공지된 기술에 의해, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 DNA 단편을 단리하여, 클로닝하는 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 있어서의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열의 일부와 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브를 조제하고, 게놈 DNA 라이브러리나 cDNA 라이브러리를 스크리닝하면 된다. 이러한 프로브로는, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드의 염기 서열 또는 그 상보 서열의 적어도 일부에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브라면, 임의의 어떠한 서열 및/또는 길이의 것을 사용해도 된다.

또는, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 취득하는 방법으로서, PCR 등의 증폭 수단을 사용하는 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 있어서의 폴리뉴클레오티드의 cDNA 중, 5’측 및 3’측 서열 (또는 그 상보 서열) 중에서 각각 프라이머를 조제하고, 이들 프라이머를 사용하여 게놈 DNA (또는 cDNA) 등을 주형으로 하여 PCR 등을 실시해서, 양 프라이머 사이에 샌드위치되는 DNA 영역을 증폭함으로써, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 단편을 대량으로 취득할 수 있다.

본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 취득하기 위한 공급원으로는, 특별히 한정되지 않지만, 탄소수 18 및 20 인 n-6 위치에 불포화 결합을 갖는 지방산에 추가하여, 이들 지방산의 ω3 위치가 불포화화된 지방산을 포함하는 생물 재료인 것이 바람직하다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「생물 재료」는, 생물학적 샘플 (생물체로부터 얻어진 조직 샘플 또는 세포 샘플) 을 의도한다. 예를 들어, α-리놀렌산은 리놀레산으로부터 ω3 불포화화 반응에 의해서 생성되는 것으로 생각되고, 스테아리돈산은 γ-리놀렌산으로부터 ω3 불포화화 반응에 의해 서 생성되는 것으로 생각되고, 20:4Δ^8,11,14,17 은 디호모-γ-리놀렌산으로부터 ω3 불포화화 반응에 의해서 생성되는 것으로 생각되고, 에이코사펜타엔산은 아라키돈산으로부터 ω3 불포화화 반응에 의해서 생성되는 것으로 생각되기 때문에, 예를 들어 이들 기질-생성물 페어의 전부 또는 일부를 포함하는 생물 재료이면, n-3 계 지방산의 합성 반응을 촉매하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 취득할 수 있다. 후술하는 실시예에서는 상기 공급원으로서 Mortierella alpina 를 사용하고 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 목적은, 탄소수 18 및/또는 20 인 지방산의 ω3 위치를 불포화화하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 당해 폴리뉴클레오티드와 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것에 있는 것으로서, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드의 제작 방법 등에 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 각 방법 외의 방법에 의해서 취득되는 탄소수 18 및/또는 20 인 지방산의 ω3 위치를 불포화화하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명의 기술적 범위에 속하는 것에 유의하여야 한다.

(3) 항체

본 발명은, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「항체」는, 면역 글로불린 (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 이들의 Fab 프래그먼트, F(ab’)₂ 프래그 먼트, Fc 프래그먼트) 을 의미하고, 예로는, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단쇄 항체, 항이디오타입 항체 및 인간화 항체를 들 수 있으며 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 생물 재료를 선택하는 것에 유용할 수 있다.

「항체」는, 여러 가지 공지된 방법 (예를 들어, HarLow 들, 「Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)」, 이와사키 들, 「단일 클론 항체 하이브리도마와 ELISA, 고단샤 (1991)」) 에 따르면 제작할 수 있다.

펩티드 항체는, 당해 분야에 주지된 방법에 의해서 제작된다. 예를 들어, Chow, M. 들, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914 및 Bittle, F. J. 들, J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985) (본 명세서 중에 참고로서 원용된다) 을 참조할 것. 일반적으로는, 동물은 유리 펩티드에 의해 면역화될 수 있다. 그러나, 항펩티드 항체 역가는 펩티드를 고분자 캐리어 (예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 또는 파상풍 톡소이드) 에 커플링함으로써 추가 면역될 수 있다. 예를 들어, 시스테인을 함유하는 펩티드는, m-말레이미드벤조일-N-히드록시숙신이미드에스테르 (MBS) 와 같은 링커를 사용하여 캐리어에 커플링될 수 있고, 한편, 다른 펩티드는, 글루탈알데히드와 같은 보다 일반적인 연결제를 사용하여 캐리어에 커플링될 수 있다. 토끼, 래트, 및 마우스와 같은 동물은, 유리 또는 캐리어-커플링 펩티드 중 어느 하나로, 예를 들어, 약 100㎍ 의 펩티드 또는 캐리어 단백질 및 프로인드 아쥬반트를 포함하는 에멀전의 복강내 및/또는 피내 주사에 의해 면역화된다. 몇가지 추가 면역 주사가, 예를 들어, 고체 표면에 흡착된 유리 펩티드를 사용하여 ELISA 검정에 의해 검출될 수 있는 유용한 역가의 항펩티드 항체를 제공하기 위해서, 예를 들어, 약 2 주간의 간격으로 필요로 될 수 있다. 면역화 동물로부터의 혈청에 있어서의 항펩티드 항체의 역가는, 항펩티드 항체의 선택에 의해, 예를 들어 당해 분야에서 주지된 방법에 의한 고체 지지체 상의 펩티드에 대한 흡착 및 선택된 항체의 용출에 의해 증가될 수 있다.

본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체」는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 완전한 항체 분자 및 항체 프래그먼트 (예를 들어, Fab 및 F(ab’)₂ 프래그먼트) 를 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab’)₂ 프래그먼트는 완전한 항체의 Fc 부분이 결손되어 있고, 순환에 의해서 더욱 신속하게 제거되며, 그리고 완전한 항체의 비특이적 조직 결합을 거의 가질 수 없다 (Wahl 등, J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983) (본 명세서 중에 참고로서 원용된다)). 따라서, 이들 프래그먼트가 바람직하다.

그리고, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드의 펩티드 항원에 결합할 수 있는 추가적인 항체가, 항이디오타입 항체의 사용을 통하여 2 공정 수순에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은, 항체 자체가 항원이라는 사실을 사용하여, 따라서, 2차 항체에 결합하는 항체를 얻는 것이 가능하다. 이 방법에 따라서, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는, 동물 (바람직하게는 마우스) 을 면역하기 위해서 사용된다. 이어서, 이러한 동물의 비장 세포는 하이브리도마 세포를 생성하기 위해서 사용되고, 그리고 하이브리도마 세포는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체에 결합하는 능력이 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드 항원에 의해 블록될 수 있는 항체를 생성하는 클론을 동정하기 위해 스크리닝된다. 이러한 항체는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 항이디오타입 항체를 포함하고, 그리고 추가적인 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체의 형성을 유도하기 위해서 동물을 면역하기 위해 사용될 수 있다.

Fab 및 F(ab’)₂ 및 본 발명에 관련된 항체의 다른 프래그먼트는, 본 명세서 중에서 개시되는 방법에 따라서 사용될 수 있음이, 분명하다. 이러한 프래그먼트는, 대표적으로는, 파파인 (Fab 프래그먼트를 생성한다) 또는 펩신 (F(ab’)₂ 프래그먼트를 생성한다) 과 같은 효소를 사용한 단백질 분해에 의한 절단에 의해서 생성된다. 또는, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드 결합 프래그먼트는, 재조합 DNA 기술의 적용 또는 합성 화학에 의해서 생성될 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 관련된 항체는, 적어도, 본 발명에 관련된 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 인식하는 항체 프래그먼트 (예를 들어, Fab 및 F(ab’)₂ 프래그먼트) 를 구비하고 있으면 된다고 할 수 있다. 즉, 본 발명에 관련된 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 인식하는 항체 프래그먼트 와, 다른 항체 분자의 Fc 프래그먼트로 이루어지는 면역 글로불린도 본 발명에 포함되는 것에 유의하여야 한다.

즉, 본 발명의 목적은, 본 발명에 관련된 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 인식하는 항체를 제공하는 것에 있는 것으로서, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 개개의 면역 글로불린의 종류 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM), 키메라 항체 제작 방법, 펩티드 항원 제작 방법 등에 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 각 방법 이외의 방법에 의하여 취득되는 항체도 본 발명의 기술적 범위에 속하는 것에 유의하여야 한다.

(4) 본 발명에 관련된 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 이용

(4-1) 벡터

본 발명은, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 생성하기 위해서 사용되는 벡터를 제공한다. 본 발명에 관련된 벡터는, 인비트로 번역에 사용되는 벡터이어도 되고 재조합 발현에 사용하는 벡터이어도 된다.

본 발명에 관련된 벡터는, 상기 서술한 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 cDNA 가 삽입된 재조합 발현 벡터 등을 들 수 있다. 재조합 발현 벡터의 제작 방법으로는, 플라스미드, 파지, 또는 코스미드 등을 사용하는 방법을 들 수 있지만 특별히 한정되지 않는다.

벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않고, 숙주 세포 중에서 발현 가능 한 벡터를 적절히 선택하면 된다. 즉, 숙주 세포의 종류에 따라서, 확실하게 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해서 적절히 프로모터 서열을 선택하고, 이것과 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 각종 플라스미드 등에 도입한 벡터를 발현 벡터로서 사용하면 된다.

발현 벡터는, 바람직하게는 적어도 1 개의 선택 마커를 포함한다. 이러한 마커로는, 항생 물질 내성 유전자나, 영양 요구성 주를 보완하는 마커 유전자 (즉 영양 요구성 마커) 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 진핵 생물 세포 배양에 관해서는 디히드로엽산 환원 효소 또는 네오마이신 내성 등을 들 수 있고, 대장균 (Escherichia coli) 및 다른 세균에 있어서의 배양에 관해서는 테트라사이클린 내성 유전자 또는 앰피실린 내성 유전자를 들 수 있지만 특별히 한정되는 것은 아니다.

상기 선택 마커를 사용하면, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에 도입되었는지 여부를 확인할 수 있다. 또는, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 융합 폴리펩티드로서 발현시켜도 되고, 예를 들어, 히드라해파리 유래의 녹색 형광 폴리펩티드 GFP (Green Fluorescent Protein) 를 마커로 사용하여, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 GFP 융합 폴리펩티드로서 발현시켜도 된다. 이것에 의해 도입 발현을 확인할 수 있다.

또한, 식물에서 발현시킬 때에는, 재조합 발현 벡터를 사용하는 경우, 식물체의 형질 전환에 사용되는 재조합 발현 벡터는, 당해 식물 내에서 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것이 가능한 벡터이면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 벡터로는, 예를 들어, 식물 세포 내에서 폴리뉴클레오티드를 구성적으로 발현시키는 프로모터 (예를 들어, 칼리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터) 를 갖는 벡터, 또는 외적인 자극에 의해 유도성으로 활성화되는 프로모터를 갖는 벡터를 들 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 관련된 벡터는, 적어도, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하면 된다고 할 수 있다. 즉, 발현 벡터 이외의 벡터도, 본 발명의 기술적 범위에 포함되는 점에 유의하여야 한다.

즉, 본 발명의 목적은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 제공하는 것에 있는 것으로서, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 개개의 벡터종 및 생물종, 및 벡터 제작 방법 및 세포 도입 방법에 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 이외의 벡터종 및 벡터 제작 방법을 사용하여 취득된 벡터도 본 발명의 기술적 범위에 속하는 것에 유의하여야 한다.

(4-2) 숙주 및 형질 전환 방법

상기 숙주는, 특별히 한정되지 않고, 종래 공지된 각종 생물을 바람직하게 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 대장균 (E.coli) 등의 세균; 효모 (출아 효모 Saccharomyces cerevisiae, 분열 효모 Schzosaccharomyces pombe), 사상균 등의 진균; 선충 (Caenorhabditis elegans), 아프리카 발톱 개구리 (Xenopus laevis) 의 난모 세포, 돼지, 래트, 마우스 등의 포유류, 기타 동물 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기한 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당 분야에서 주지되어 있다.

또한, 본 발명에 있어서 형질 전환의 대상이 되는 식물은, 식물체 전체, 식물 기관 (예를 들어 잎, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 종자 등), 식물 조직 (예를 들어 표피, 체관부, 유조직, 목질부, 유관속, 책상 조직, 해면상 조직 등) 또는 식물 배양 세포, 혹은 여러 가지 형태의 식물 세포 (예를 들어, 현탁 배양 세포), 원형질체, 잎의 절편, 유합 조직 등의 모두를 의미한다. 형질 전환에 사용되는 식물로는 특별히 한정되지 않고, 단자엽 식물망 또는 쌍자엽 식물 망에 속하는 식물 중 어느 것이나 좋다.

상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법, 즉 형질 전환법도 특별히 한정되지 않고, 전기 천공법, 인산칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법, 아세트산리튬법, 파티클 딜리버리법 등의 종래 공지된 방법을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 예를 들어, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 곤충에서 전이 발현시키는 경우에는, 배큘로바이러스 (baculovirus) 를 사용한 발현계를 사용하면 된다.

식물로의 유전자 도입에는, 당업자에게 공지된 형질 전환 방법 (예를 들어, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 법, 유전자 건, PEG 법, 일렉트로포레이션법 등) 이 사용된다. 예를 들어, 아그로박테리움을 통한 방법과 직접 식물 세포에 도입하는 방법이 주지되어 있다. 아그로박테리움법을 사용하는 경우에는, 구축한 식물용 발현 벡터를 적당한 아그로박테리움 (예를 들어, 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 에 도입하고, 이 주를 리프 디스크법 (우치미야 히로후미 저, 식물 유전자 조작 매뉴얼, 1990, 27-31pp, 고단샤 사이언티픽, 동경) 등에 따라서 무균 배양엽편에 감염시켜, 형질 전환 식물을 얻을 수 있다. 또 한, Nagel 들의 방법 (Micribiol. Lett.,67, 325 (1990) 이 사용될 수 있다. 이 방법은, 우선, 예를 들어 발현 벡터를 아그로박테리움에 도입하고, 이어서, 형질 전환된 아그로박테리움을 Plant Molecular Biology Manual (S. B. Gelvin 들, Academic Press Publishers) 에 기재된 방법으로 식물 세포 또는 식물 조직에 도입하는 방법이다. 여기서, 「식물 조직」 이란, 식물 세포의 배양에 의해서 얻어지는 유합 조직을 포함한다. 아그로박테리움법을 사용하여 형질 전환을 실시하는 경우에는, 바이너리 벡터 (pBI121 또는 pPZP202 등) 를 사용할 수 있다.

또한, 유전자를 직접 식물 세포 또는 식물 조직에 도입하는 방법으로는, 일렉트로포레이션법, 유전자 건법이 알려져 있다. 유전자 건을 사용하는 경우에는, 식물체, 식물 기관, 식물 조직 자체를 그대로 사용해도 되고, 절편을 조제한 후에 사용해도 되며, 원형질체를 조제하여 사용해도 된다. 이와 같이 조제한 시료를 유전자 도입 장치 (예를 들어 PDS-1000/He (BIO-RAD 사) 등) 를 사용하여 처리할 수 있다. 처리 조건은 식물 또는 시료에 따라 상이하지만, 통상은 450∼2000psi 정도의 압력, 4∼12cm 정도의 거리에서 실시한다.

유전자가 도입된 세포 또는 식물 조직은, 우선 하이그로마이신 내성 등의 약제 내성에서 선택되고, 이어서 정법에 의해 식물체에 재생된다. 형질 전환 세포로부터 식물체의 재생은, 식물 세포의 종류에 따라서 당업자에게 공지된 방법으로 실시하는 것이 가능하다.

식물 배양 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 형질 전환은, 재조합 벡터를 유전자 건, 일렉트로포레이션법 등에 의해 배양 세포에 도입한다. 형질 전환의 결과 얻어지는 유합 조직이나 슈트, 모상근 등은, 그대로 세포 배양, 조직 배양 또는 기관 배양에 사용하는 것이 가능하고, 또한 종래 알려져 있는 식물 조직 배양법을 사용하여, 적당한 농도의 식물 호르몬 (옥신, 사이토카이닌, 지베렐린 (gibberellin), 아브시스산 (abscisic acid), 에틸렌, 브라시놀라이드 (brassinolide) 등) 의 투여 등에 의해서 식물체에 재생시킬 수 있다.

(4-3) 형질 전환체

본 발명은, 상기 서술한 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질 전환체를 제공한다. 여기서 「형질 전환체」란, 세포, 조직 또는 기관뿐만 아니라, 생물 개체를 포함하는 것을 의미한다.

형질 전환체의 제작 방법 (생산 방법) 은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 상기 서술한 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 형질 전환하는 방법을 들 수 있다. 또한, 형질 전환의 대상이 되는 생물도 특별히 한정되는 것이 아니라, 상기 숙주에서 예시한 각종 미생물, 식물 또는 동물을 들 수 있다.

본 발명에 관련된 형질 전환체는, 천연적으로 갖는 지방산과는 그 조성이 개변되어 있다. 본 발명에 관련된 형질 전환체는, 진균 (효모, 사상균 등), 식물 또는 그 자손, 동물 또는 이들 유래의 세포 또는 조직인 것이 바람직하고, 이러한 식물은 대두, 유채씨, 참깨, 올리브, 아마인, 옥수수, 해바라기, 또는 홍화인 것이 특히 바람직하다. 즉, 본 발명에서 형질 전환에 사용되는 식물로는, 유지 제조용으로 재배되는 식물을 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환체는, 당해 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를, 당해 유전자가 발현할 수 있도록 식물 중에 도입함으로써 얻을 수 있다.

유전자가 도입되었는지 여부의 확인은, PCR 법, 서던 하이브리다이제이션법, 노던 하이브리다이제이션법 등에 의해서 실시할 수 있다. 예를 들어, 형질 전환체로부터 DNA 를 조제하고, DNA 특이적 프라이머를 설계하여 PCR 을 실시한다. PCR 은, 상기 플라스미드를 조제하기 위해서 사용한 조건과 동일한 조건에서 실시할 수 있다. 그 후에는, 증폭 산물에 관해서 아갈로스겔 전기 영동, 폴리아크릴 아미드겔 전기 영동 또는 캐필러리 전기 영동 등을 실시하여, 브롬화에티듐, SYBR Green 액 등에 의해서 염색하고, 그리고 증폭 산물을 1 개의 밴드로서 검출함으로써, 형질 전환되었음을 확인할 수 있다. 또한, 미리 형광 색소 등에 의해서 표지한 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하여, 증폭 산물을 검출할 수도 있다. 그리고, 마이크로플레이트 등의 고상에 증폭 산물을 결합시켜, 형광 또는 효소 반응 등에 의해서 증폭 산물을 확인하는 방법도 채용할 수 있다.

본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드가 게놈 내에 도입된 형질 전환체가 일단 얻어지면, 당해 생물체의 유성 생식 또는 무성 생식에 의해서 자손을 얻을 수 있다. 또한, 당해 생물체 또는 그 자손, 또는 이들의 클론으로부터, 예를 들어, 식물의 경우, 종자, 과실, 이삭 조각 (切穗), 덩이줄기, 덩이뿌리, 주, 유합 조직, 원형질체 등을 얻고, 그것들을 기초로 당해 식물체를 양산할 수 있다. 따라서, 본 발명에는, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드가 발현 가능하게 도입된 생물체, 또는, 당해 생물체와 동일한 성질을 갖는 당해 생물체의 자손, 또는 이들 유래의 조직도 포함된다.

이와 같이, 본 발명에 관련된 형질 전환체는, 적어도, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있으면 된다고 할 수 있다. 즉, 재조합 발현 벡터 이외의 수단에 의해서 생성된 형질 전환체도, 본 발명의 기술적 범위에 포함되는 점에 유의하여야 한다.

즉, 본 발명의 목적은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 형질 전환체를 제공하는 것에 있는 것으로서, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 개개의 벡터종 및 도입 방법에 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 이외의 벡터종 및 생물종, 및 벡터 제작 방법 및 세포 도입 방법을 사용하여 취득한 형질 전환체도 본 발명의 기술적 범위에 속하는 것에 유의하여야 한다.

(4-4) 폴리펩티드의 생산 방법

본 발명은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.

하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 실시형태의 하나의 국면에 있어서, 본 실시형태에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은, 상기 벡터를 무세포 단백질 합성계에 사용하는 것이 바람직하다. 무세포 단백질 합성계를 사용하는 경우, 여러 가지 시판되는 키트를 사용하면 된 다. 바람직하게는, 본 실시형태에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은, 상기 벡터와 무세포 단백질 합성액을 인큐베이트하는 공정을 포함한다.

본 실시형태의 다른 국면에 있어서, 본 실시형태에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은, 재조합 발현계를 사용하는 것이 바람직하다. 재조합 발현계를 사용하는 경우, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 재조합 발현 벡터에 도입한 후, 공지된 방법에 의해 발현 가능하게 숙주에 도입하고, 숙주 내에서 번역되어 얻어지는 상기 폴리펩티드를 정제한다는 방법 등을 채용할 수 있다. 재조합 발현 벡터는, 플라스미드여도 되며, 숙주에 목적 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있으면 된다. 바람직하게는, 본 실시형태에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은 상기 벡터를 숙주에 도입하는 공정을 포함한다.

이와 같이 숙주에 외래 폴리뉴클레오티드를 도입하는 경우, 발현 벡터는, 외래 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 숙주 내에서 기능하는 프로모터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 재조합적으로 생성된 폴리펩티드를 정제하는 방법은, 사용한 숙주, 폴리펩티드의 성질에 따라서 다르지만, 태그의 이용 등에 의해서 비교적 용이하게 원하는 폴리펩티드를 정제하는 것이 가능하다.

본 실시형태에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 조직의 추출액으로부터 당해 폴리펩티드를 정제하는 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 폴리펩티드를 정제하는 공정은, 주지된 방법 (예를 들어, 세포 또는 조직을 파괴한 후에 원심분리하여 가용성 획분을 회수하는 방법) 에 의해 세포나 조직으로부터 세포 추출액을 조제한 후, 이 세포 추출액으로부터 주지된 방법 (예를 들어, 황산암모늄 침전 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피) 에 의해서 정제하는 공정이 바람직하지만, 이들에 한정되지 않는다. 가장 바람직하게는, 고속 액체 크로마토그래피 (「HPLC」) 가 정제를 위해서 사용된다.

별도 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 천연적으로 발현하는 세포 또는 조직으로부터 당해 폴리펩티드를 정제하는 것을 특징으로 한다. 본 실시형태에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은, 상기 서술한 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 천연적으로 발현하는 세포 또는 조직을 동정하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 본 실시형태에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은, 상기 서술한 폴리펩티드를 정제하는 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 화학 합성하는 것을 특징으로 한다. 당업자는, 본 명세서 중에 기재되는 본 발명에 관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 주지된 화학 합성 기술을 적용하면, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 화학 합성할 수 있음을 용이하게 이해한다.

이상과 같이, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 생산하는 방법에 의해서 취득된 폴리펩티드는, 천연에 존재하는 변이 폴리펩티드이어도 되고, 인위적으로 제작 된 변이 폴리펩티드이어도 된다.

변이 폴리펩티드를 제작하는 방법에 관해서도 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 부위 특이적 변이 유발법 (예를 들어, Hashimoto-Gotoh, Gene 152:271-275 (1995) 참조), PCR 법을 이용하여 염기 서열에 점 변이를 도입하고 변이 폴리펩티드를 제작하는 방법, 또는 트랜스포존의 삽입에 의한 돌연 변이주 제작법 등의 주지된 변이 폴리펩티드 제작법을 사용함으로써, 변이 폴리펩티드를 제작할 수 있다. 변이 폴리펩티드의 제작에는 시판되는 키트를 이용해도 된다.

이와 같이, 본 발명에 관련된 폴리펩티드의 생산 방법은, 적어도 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열, 또는 ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에 기초하여 공지 관용 기술을 사용하면 된다고 할 수 있다.

즉, 본 발명의 목적은, ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드의 생산 방법을 제공하는 것에 있는 것으로서, 상기 서술한 여러 가지의 공정 이외의 공정을 포함하는 생산 방법도 본 발명의 기술적 범위에 속하는 것에 유의하여야 한다.

(4-5) 지방산 생산 방법

본 발명은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 발현하는 생물체 또는 세포를 사용하여 지방산을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 생물체는, 천연의 미개변 생물체이어도 되고 재조합 발현계를 사용한 형질 전환체이어도 된다.

하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 지방산 생산 방법은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질 전환된 생물체 또 는 그 조직을 사용하여 지방산을 생산한다. 바람직하게는, 상기 생물체는, 진균 (효모, 사상균 등), 식물 또는 동물이다.

본 실시형태의 바람직한 국면에 있어서, 본 발명에 관련된 지방산 생산 방법은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 상기 생물체에 도입하는 공정을 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 상기 생물체에 도입하는 공정으로는, 상기 서술한 여러 가지 유전자 도입 방법을 사용하면 된다. 본 실시형태의 이 국면에 있어서, 상기 생물체는 형질 전환되기 전에 생성한 지방산과 형질 전환후에 생성한 지방산 사이에서 그 조성이 상이하다. 구체적으로는, 상기 생물체로부터 얻어지는 지방산은, 예를 들어, α-리놀렌산, 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17, 에이코사펜타엔산 등의 n-3 계 지방산의 함유율이 증가한다. 본 실시형태의 이 국면에 관련된 지방산 생산 방법은, 상기 생물체로부터 지방산을 추출하는 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

예를 들어, 전술한 바와 같이 α-리놀렌산, 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17, 또는/및 에이코사펜타엔산의 함량이 증가한 본 발명에 관련된 형질 전환체로부터 추출한 지방산을 함유하는 오일은, α-리놀렌산, 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17, 또는/및 에이코사펜타엔산의 함량이 높은 식품으로서 제공된다. 또한, 형질 전환 식물체의 경우, 추출한 지방산에 한정되지 않고, 상기 형질 전환 식물체의 종자, 과실, 이삭 조각, 덩이줄기, 및/또는 덩이뿌리 등도 또한, α-리놀렌산, 스테아리 돈산, 20:4Δ^8,11,14,17, 또는/및 에이코사펜타엔산을 많이 함유하는 식품으로서 제공된다. 지방산 조성을 개변하는 대상은 특별히 한정되지 않고, 식물 이외에도 동물, 세균, 또는 진균 (효모, 사상균 등) 등의 모든 생물을 대상으로 하는 것이 가능하다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 지방산 생산 방법은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 천연적으로 발현하는 상기 생물체에, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 안티센스 뉴클레오티드로서 도입하는 공정을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 상기 생물체에 도입하는 공정으로는, 상기 서술한 안티센스 RNA 기술을 사용하면 된다. 또한, 전술한 RNAi 의 기술도 이용할 수 있다.

본 실시형태에 관련된 지방산 생산 방법은, 상기 서술한 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 천연적으로 발현하는 상기 생물체를 동정하는 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 본 실시형태의 이 국면에 관련된 지방산 생산 방법은, 상기 생물체 등 지방산을 추출하는 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

본 실시형태에 있어서, 상기 생물체는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 도입하기 전에 생성한 지방산과 도입후에 생성한 지방산 사이에서 그 조성이 상이하다. 구체적으로는, 상기 생물체로부터 얻어지는 지방산은, 천연적으로 생성되는 α-리놀렌산, 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17, 에이코사펜타엔산 등 의 n-3 계 지방산의 함유율이 감소한다. 또한, 이들의 기질인 리놀레산, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산 등의 함유율의 감소 정도는 작아진다.

이와 같이, 본 발명에 관련된 지방산의 생산 방법은, 적어도, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 발현하는 생물체를 사용하면 된다고 할 수 있다.

즉, 본 발명의 목적은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드에 의해서 지방산의 조성이 개변된 생물체에 기초하는 지방산 생산 방법을 제공하는 것에 있는 것으로, 상기 생물체로서 동물, 식물 또는 여러 가지 미생물을 사용하는 생산 방법도 본 발명의 기술적 범위에 속하는 것에 유의하여야 한다.

(4-6) 식품 및 공업 제품

본 발명은, 상기 서술한 지방산 생산 방법에 의해 얻어진 지방산을 사용하여 제조되는 식품 및 공업 제품을 제공한다. 본 항에서 기재하는 식품은, 예를 들어, 상기 서술한 형질 전환체가 식물인 경우, 그 종자, 과실, 이삭 조각, 덩이줄기, 및/또는 덩이뿌리이어도 되고, 상기 서술한 형질 전환체로부터 추출된 지방산을 사용하여 제조된 식품이어도 된다. 또, 상기 서술한 형질 전환체가 미생물인 경우에는, 당해 미생물 자체여도 되고, 추출물 등의 가공물이어도 된다. 그리고, 본 발명의 식품은, 상기 서술한 형질 전환체인 동물의 고기 또는 젖이어도 된다.

또한, 공업 제품에는, 상기 서술한 형질 전환체로부터 추출된 지방산을 사용하여 제조된 음식물 보충제나 동물용 식이 보충제가 포함된다. 전술한 바와 같이, n-3 계 PUFAs 에 관해서는, EPA 의 항혈전 작용, 혈청 지질 개선 작용, DHA 의 학습 기능 향상 작용, 항암 작용을 비롯한 많은 생리 활성이 알려져 있고, 생체의 항상성을 유지하기 위해서 필수적이다. 그러나, 인간을 비롯한 동물은, n-3 계 PUFAs 를 체내에서 합성할 수 없기 때문에, n-3 계 PUFAs 를 경구 섭취하는 것이 매우 중요하다. 이 때문에, 음식물로부터의 n-3 계 PUFAs 섭취가 부족한 경우에는, 음식물 보충제나 동물용 식이 보충제로 보충할 것이 요망된다. 상기 서술한 형질 전환체로부터 추출된 지방산을 PUFAs 는, 상기한 바와 같은 목적으로 사용할 수 있다.

또, 상기 서술한 형질 전환체로부터 추출된 n-3 계 PUFAs 를 보충하면, 보충한 PUFAs 의 함유율뿐만 아니라, 그 하류 대사 산물의 함유율도 증가할 수 있다. 예를 들어, α-리놀렌산을 보충하면, α-리놀렌산뿐만 아니라, 도코사헥사에노산 (DHA) 이나 프로스타글란딘 등의 하류 산물의 함유율을 증가시킬 수 있다. 도코사헥사에노산은 유아의 뇌 발달에 필요하기 때문에, 상기 서술한 형질 전환체로부터 추출된 지방산은, 육아용 분유나 육아용 음식물 보충제로서도 유용하다.

(4-7) 검출 기구

본 발명은, 여러 가지 검출 기구를 제공한다. 본 발명에 관련된 검출 기구는, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 프래그먼트가 기판 상에 고정화된 것, 또는, 본 발명에 관련된 폴리펩티드 또는 항체가 기판 상에 고정화된 것으로, 여러 가지 조건 하에서, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현 패턴의 검출ㆍ측정 등에 이용할 수 있다.

본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「기판」은, 목적물 (예를 들어, 폴 리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질) 을 담지할 수 있는 물질을 의도하고, 용어 「지지체」와 교환 가능하게 사용된다. 바람직한 기판 (지지체) 으로는, 비드 (예를 들어, 폴리스티렌 비드), 고상 (예를 들어, 유리 튜브, 시약 스트립, 폴리스티렌제의 마이크로 타이터 플레이트 또는 아미노기 결합형의 마이크로 타이터 플레이트) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 목적물을 이들 기판에 고정화하는 방법은 당업자에게 주지이며, 예를 들어, Nature 357:519-520 (1992) (본 명세서 중에 참고로서 원용된다) 에 기재된다.

하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 검출 기구는, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드가 기판 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 실시형태의 바람직한 국면에 있어서, 본 실시형태에 관련된 검출 기구는 이른바 DNA 칩이다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「DNA 칩」은, 합성한 올리고뉴클레오티드를 기판 상에 고정화한 합성형 DNA 칩을 의미하지만, 이것에 한정되지 않고, PCR 산물 등의 cDNA 를 기판 상에 고정화한 첩부형 DNA 마이크로어레이도 또한 포함한다. DNA 칩으로는, 예를 들어, 본 발명의 유전자와 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브 (즉, 본 발명에 관련된 올리고뉴클레오티드) 를 기판 (담체) 상에 고정화한 DNA 칩을 들 수 있다.

프로브로서 사용하는 서열은, cDNA 서열 중에서 특징적인 서열을 특정하는 공지된 방법 (예를 들어, SAGE 법 (Serial Analysis of Gene Expression 법) (Science 276:1268, 1997; Cell 88:243, 1997; Science 270:484, 1995; Nature 389:300, 1997; 미국 특허 제5,695,937호) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않 는다) 에 의해서 결정할 수 있다.

또, DNA 칩의 제조에는 공지된 방법을 채용하면 된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드로서 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우에는, 피토리오그래피 기술과 고상법 DNA 합성 기술과의 조합에 의해, 기판 상에서 올리고뉴클레오티드를 합성하면 된다. 한편, 올리고뉴클레오티드로서 cDNA 를 사용하는 경우에는, 어레이기를 사용하여 기판 상에 부착하면 된다.

또한, 예를 들어, 퍼펙트 매치 프로브 (올리고뉴클레오티드) 와, 그 퍼펙트 매치 프로브에 있어서 1염기 치환된 미스 매치 프로브를 배치하여 폴리뉴클레오티드의 검출 정밀도를 보다 향상시켜도 된다. 또, 다른 폴리뉴클레오티드를 병행하여 검출하기 위해서, 복수 종의 올리고뉴클레오티드를 동일 기판 상에 고정화하여 DNA 칩을 구성해도 된다.

본 실시형태에 관련된 검출 기구에 사용하는 기판의 재질로는, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 안정적으로 고정화할 수 있는 것이면 된다. 상기한 기판 이외에는, 예를 들어, 폴리카보네이트나 플라스틱 등의 합성 수지, 유리 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 기판의 형태도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 판상, 필름상 등의 기판을 바람직하게 사용할 수 있다. 본 실시형태의 바람직한 국면에 있어서, 본 실시형태에 관련된 검출 기구는, 여러 가지 생물 또는 그 조직 또는 세포로부터 제작한 cDNA 라이브러리를 표적 샘플로 하는 검출에 사용된다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 관련된 검출 기구는, 본 발명에 관련된 폴리펩티드 또는 항체가 기판 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 실시형태의 바람직한 국면에 있어서, 본 실시형태에 관련된 검출 기구는, 이른바 프로테인칩이다.

본 실시형태에 관련된 검출 기구에 사용하는 기판의 재질로는, 폴리펩티드 또는 항체를 안정적으로 고정화할 수 있는 것이면 된다. 상기한 기판 이외에는, 예를 들어, 폴리카보네이트나 플라스틱 등의 합성 수지, 유리 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 기판의 형태도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 판상, 필름상 등의 기판을 바람직하게 사용할 수 있다.

상기한 방법 이외의 폴리펩티드 또는 항체를 기판 상에 고정화하는 방법으로는, 예를 들어, 니트로셀룰로오스막이나 PDVF 막에 폴리펩티드나 항체를 도트 블롯의 요령으로 스폿하는 물리 흡착법, 또는, 폴리펩티드나 항체의 변성을 경감시키기 위해서, 슬라이드 유리 상에 폴리아크릴아미드의 패드를 접합하고, 여기에 폴리펩티드나 항체를 스폿하는 방법을 들 수 있다. 또, 폴리펩티드나 항체를 기판 표면에 흡착시키는 것뿐만 아니라, 강고하게 결합시키기 위해서, 알데히드 수식 유리를 이용한 방법 (G. MacBeath, S. L. Schreiber, Science, 289, 1760 (2000)) 을 사용할 수도 있다. 또한, 기판 상에서의 폴리펩티드의 배향을 가지런하게 하여 고정화하는 방법으로는, 올리고히스티딘 태그를 통해서, 니켈 착물로 표면 수식한 기판에 고정화하는 방법 (H. Zhu, M. Bilgin, R. Bangham, D. Hall, A. Casamayor, P. Bertone, N. Lan, R. Jansen, S. Bidlingmaier, T. Houfek, T. Mitchell, P. Miller, R. A. Dean, M. Gerstein, M. Snyder, Science, 293,2101 (2001)) 을 사용 할 수 있다.

본 실시형태의 바람직한 국면에 있어서, 본 실시형태에 관련된 검출 기구는, 여러 가지 생물 또는 그 조직 또는 세포로부터의 추출액을 표적 샘플로 하는 검출에 사용된다.

이와 같이, 본 발명에 관련된 검출 기구는, 적어도, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 또는 본 발명에 관련된 폴리펩티드 또는 당해 폴리펩티드와 결합하는 항체가 지지체 상에 고정화되어 있으면 된다고 할 수 있다. 또한, 본 발명에 관련된 검출 기구는, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 또는 본 발명에 관련된 폴리펩티드 또는 당해 폴리펩티드와 결합하는 항체가 고정화되어 있는 기판을 구비하여 있으면 된다고 할 수 있다. 즉, 이들 지지체 (기판을 포함한다) 이외의 구성부재를 구비하는 경우도, 본 발명의 기술적 범위에 포함되는 점에 유의하여야 한다.

즉, 본 발명의 목적은, 본 발명에 관련된 폴리펩티드 또는 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명에 관련된 항체에 결합하는 폴리펩티드를 검출하는 기구를 제공하는 것에 있는 것으로, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 개개의 지지체의 종류, 고정화 방법에 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 지지체 이외의 구성부재를 포함하는 검출 기구도 본 발명의 기술적 범위에 속하는 것에 유의하여야 한다.

[실시예 1: PCR 에 의한 ω3 지방산 불포화화 효소의 부분 서열의 클로닝]

Mortierella alpina 및 Saccharomyces kluyveri 의 Δ¹² 지방산 불포화화 효소 및 S. kluyveri 의 ω3 지방산 불포화화 효소의 추정 아미노산 서열을 비교하여 상동성이 높은 아미노산 서열에 대응하는 프라이머를 설계하였다. 도 1 에, M. alpina 및 S. kluyveri 의 Δ¹² 지방산 불포화화 효소 그리고 S. kluyveri 의 ω3 지방산 불포화화 효소의 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 도면 중, 상단이 M. alpina 의 Δ¹² 지방산 불포화화 효소의 추정 아미노산 서열 (서열번호: 10) 을, 중단이 S. kluyveri 의 ω3 지방산 불포화화 효소의 추정 아미노산 서열을 (서열번호: 11), 하단이 S. kluyveri 의 Δ¹² 지방산 불포화화 효소의 추정 아미노산 서열 (서열번호: 12) 을 나타낸다. 도면 중의 하선으로 나타내는 상동성이 높은 아미노산 서열에 대응하는 축중 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 ω3-F1 및 ω3-R1 을 설계하였다.

ω3-F1 (대응하는 아미노산 서열: WVLAHECGH, 프라이머는 순방향)

5'-TGGGTIYTBGCICAYGARTGYGGHCA- 3' (서열번호: 4)

ω3-R1 (대응하는 아미노산 서열: TFLQHTDPK, 프라이머는 역방향)

5'-TTIGGRTCIGTRTGYTGVARRAAIGT -3' (서열번호: 5)

또, 상기 프라이머의 염기 서열에 있어서, 「I」는 이노신을 나타내고, 「Y」는 T (티민) 또는 C (시토신) 을 나타내고, 「B」는 G (구아닌), C 또는 T 를 나타내고, 「R」은 G 또는 A (아데닌) 를 나타내고, 「H」는 A, C 또는 T 를 나타내 고, 「V」는 A, G 또는 C 를 나타낸다. 또 상기 「I」는 서열번호: 4 및 서열번호: 5 에서는 「n」으로 표시되어 있다.

M. alpina (1S-4 주) 의 게놈 DNA 는, Sakuradani et al. 1999a, Δ⁹-Fatty acid desaturase from arachidonic acid-producing fungus. Unique gene sequence and its heterologous expression in a fungus, Aspergillus. Eur J Biochem 260: 208-216 의 방법에 따라서 조제하였다.

얻어진 M. alpina 의 게놈 DNA 를 주형으로 하여, 상기 프라이머 ω3-F1 및 ω3-R1 을 사용하여 PCR 을 실시하였다. PCR 은, ExTaq (다카라바이오) 를 사용하고, 94℃ 3분, (94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분) 을 30 사이클, 72℃ 10 분의 반응을 실시하였다. PCR 반응은, 1㎍ 의 게놈 DNA, 0.25㎕ 의 Takara Ex Taq 폴리머라아제 (다카라바이오), 5㎕ 의 10×Ex Taq buffer, 각 200μM 의 dNTP, 각 200pmol 의 프라이머를 함유하는 전체 내용적 50㎕ 의 반응 혼합액을 사용하여 실시하였다. 또한, PCR 산물을 아갈로스겔 전기 영동한 결과, 약 600bp 의 단편을 1 개 확인할 수 있었다.

이 PCR 조건에서는, Δ¹² 지방산 불포화화 효소 유전자를 주형으로 하여 증폭된 DNA 단편도 약 600bp 가 되는 것에서, 이 DNA 단편에는 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자 유래의 서열과 Δ¹² 지방산 불포화화 효소 유전자 유래의 단편이 혼재되어 있는 것으로 생각되었다. 그래서, 염기 서열이 밝혀져 있는 Δ¹² 지방산 불포화화 효소 유전자 중을 1 군데를 절단하는 제한효소 KpnI 에 의해 이 DNA 단편을 소화시키고, 다시 아갈로스겔 전기 영동하였다. 그 결과, 원래 사이즈의 DNA 단편 및 그것보다 짧은 2 개의 단편이 얻어져, PCR 산물에는 Δ¹² 지방산 불포화화 효소 유래의 DNA 단편과 그것과는 상이한 DNA 단편이 혼재되어 있음이 나타났다.

그래서, PCR 산물 중, KpnI 로 소화되지 않는 단편을 정제하고, 이것을 pT7Blue T-vecter (Novagen 사 제조) 에, ligation high (토요보사 제조) 에 의해 연결하였다 (이후의 TA cloning 도 모두 동일하게 실시하였다). 염기 서열의 해석은 ABI3100 (어플라이드 바이오 시스템즈사 제조) 로 실시하였다. 상동성 검색은 blastx 로, GenBank 에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 실시하였다. 그 결과, M. alpina (1S-4 주) 유래의 Δ¹² 지방산 불포화화 효소 유전자와 가장 높은 상동성을 나타내며, 그 영역의 염기 서열의 아이덴티티는 57% 였다.

[실시예 2: ω3 지방산 불포화화 효소의 게놈 DNA 서열의 결정]

얻어진 약 600bp 의 염기 서열을 바탕으로 이하의 프라이머를 설계하여, Inverse PCR (역 PCR) 을 실시하였다.

ω3-IPCRR2

5'-GACCCATCCAAAGATGGTGTTGATC-3' (서열번호: 6)

ω3-IPCRF2

5'-GACTGTCTTCATGTACTATGGCATC-3' (서열번호: 7)

우선, Mortierella alpina 로부터 조제한 게놈 DNA 를 EcoRI 에 의해 완전히 소화시키고, ligation high (토요보사 제조) 에 의해 15℃ 에서 밤새 반응시켜, 셀프 라이게이션에 의해 폐환시켰다. 그것을 주형으로 하여, 상기 프라이머 ω3-IPCRF2 및 ω3-IPCRR2 를 사용해서 PCR 을 실시하였다. PCR 의 반응 혼합물은, 주형의 농도가 50ng/㎕ 였던 것 외에는 실시예 1 과 동일하였다. PCR 은, ExTaq (다카라바이오) 를 사용하여, 94℃ 3분, (94℃ 1분, 60℃ 2분, 72℃ 3분) 을 35 사이클, 72℃ 15분의 반응을 실시하였다.

얻어진 3-4kb 의 DNA 단편은, 실시예 1 과 동일한 방법으로 벡터 pT7Blue T-vector (Novagen 사 제조) 에 TA 클로닝하고, 삽입된 약 4kb 의 단편 양단으로부터 각각 수백 bp 의 염기 서열을 결정하여, 앞서 얻어진 부분 서열과 연결하였다. 이 염기 서열을 서열번호: 2 에 나타낸다. 상동 서열과의 비교 및, 개시 코돈이나 종지 코돈의 출현 등에서 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자의 코드 영역을 추정하였다. 코드 영역은 14∼1366 이고, 인트론이 1 군데 존재하는 것으로 생각되었다.

[실시예 3: ω3 지방산 불포화화 효소 cDNA 의 클로닝]

ω3 지방산 불포화화 효소는, 저온 배양에 의해 활성이 발현됨이 밝혀져 있었다. 그래서, 먼저 M. alpina (1S-4 주) 를 GY 액체 배지에서 28℃ 7일간 배양 후, 12℃ 2일간 배양하여 균체를 회수하였다. Sakuradani et al. 1999a, Δ⁹-Fatty acid desaturase from arachidonic acid-producing fungus. Unique gene sequence and its heterologous expression in a fungus, Aspergillus. Eur J Biochem 260: 208-216 의 방법에 따라서 전체 RNA 를 추출하였다. 1㎍ 의 전체 RNA 를 1st-Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV) (Roche Diagnostics Corporation 사) 을 사용하고, 랜덤 헥사머를 프라이머로 하여 역전사 반응을 실시하여, cDNA 를 합성하였다. 합성된 cDNA 를 주형으로 하여, 이하의 프라이머 ω3-ExF3 및 ω3-ExR3 을 사용하여 PCR 을 실시하였다. PCR 반응은, 1㎍ 의 주형 cDNA, 0.25㎕ 의 Takara LA Taq 폴리머라아제 (다카라바이오), 5㎕ 의 10×LA Taq buffer, 2mM 의 MgCl₂, 각 200μM 의 dNTP, 각 100pmol 의 프라이머를 함유하는 전체 내용적 50㎕ 의 반응 혼합액을 사용하여 실시하였다. 또한, PCR 의 반응 조건으로는, 94℃ 3분, (94℃ 1분, 60℃ 2분, 72℃ 3분) 을 35 사이클, 72℃ 15분을 사용하였다.

ω3-ExF3: 5'-CAGAGTCATAaagcttAAatgGCCCCCCCT-3' (서열번호: 8)

ω3-ExR3: 5'-GACgcatgcCGTATTCAAATTGttaTTAATGC-3' (서열번호: 9)

또, 프라이머 ω3-ExF3 은, ATG 개시 부위 (서열 중 소문자로 나타낸다.) 와, HindIII 클로닝 부위 aagctt (서열 중 소문자로 나타낸다.) 를 포함하고 있다. 또한, 프라이머 ω3-ExR3 은, TAA 종지 부위 (서열 중 소문자로 나타낸다.) 와, SphI 클로닝 부위 gcatgc (서열 중 소문자로 나타낸다.) 를 포함하고 있다.

얻어진 DNA 단편을, 실시예 1 에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해서, 벡터 pT7Blue T-vector (Novagen 사 제조) 에 TA 클로닝하고, 염기 서열을 결정하였다. 결정된 cDNA 의 염기 서열을 서열번호: 3 에 나타낸다. cDNA 의 염기 서열은, 상기 실시예 2 에서 결정한 게놈 DNA 의 염기 서열 (서열번호: 2) 의 14번째 염기로부터 343번째 염기까지의 330bp 및 485번째 염기로부터 1366번째 염기까지의 882bp 로 이루어지는 1212bp 와 일치하였다. 이것으로부터, 서열번호: 2 에 나타내는 염기 서열의 14번째 염기로부터 1366번째 염기까지의 1353bp 가 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자이고, 또한 이 유전자는, 서열번호: 2 에 나타내는 염기 서열의 345번째 염기로부터 485번째 염기까지 141bp 로 이루어지는 인트론을 포함하며, 403 아미노산을 코드하고 있음을 알 수 있었다.

이 cDNA 에 의해 코드되는 아미노산 서열을, 지금까지 알려져 있는 다른 생물종의 ω3 지방산 불포화화 효소 및, M. alpina 의 Δ¹² 지방산 불포화화 효소의 아미노산 서열과 비교하였다. 도 2 에 상단에서부터 순서대로, M. alpina 의 ω3 지방산 불포화화 효소 (도면 중 「MAW3」으로 표시, 서열번호: 1), M. alpina 의 Δ¹² 지방산 불포화화 효소 (도면 중 「Mor-Δ¹²」로 표시, 서열번호: 10), S. kluyveri 의 ω3 지방산 불포화화 효소 (도면 중 「Sacω3」으로 표시, 서열번호: 11), 대두의 소포체 국재 ω3 지방산 불포화화 효소 (도면 중 「Soybeanω3 (ER)」로 표시, 서열번호: 13), 대두의 클로로플라스트 국재 ω3 지방산 불포화화 효소 (도면 중 「Soybeanω3 (Chl)」로 표시, 서열번호: 14) 의 아미노산 서열을 나타낸다. M. alpina 의 ω3 지방산 불포화화 효소의 아미노산 서열은, M. alpina 의 Δ¹² 지방산 불포화화 효소, S. kluyveri 의 ω3 지방산 불포화화 효소, 대두의 소 포체 국재 ω3 지방산 불포화화 효소, 대두의 클로로플라스트 국재 ω3 지방산 불포화화 효소의 아미노산 서열과, 각각 51%, 36%, 34%, 32% 의 아이덴티티를 갖고 있었다. 도 2 에 나타나는 바와 같이, M. alpina 의 ω3 지방산 불포화화 효소는, ω3 지방산 불포화화 효소 중에서 가장 아미노산 서열이 유사한 S. kluyveri 의 ω3 지방산 불포화화 효소와도, 36% 라는 낮은 아이덴티티밖에 나타내고 있지 않음을 알 수 있었다. 이것으로부터, M. alpina 의 ω3 지방산 불포화화 효소는, 지금까지 알려져 있는 다른 생물종의 ω3 지방산 불포화화 효소의 아미노산 서열보다, 오히려 M. alpina 자신의 Δ¹² 지방산 불포화화 효소의 아미노산 서열과 유사함을 알 수 있었다.

[실시예 4: ω3 지방산 불포화화 효소 유전자 발현 벡터의 구축]

얻어진 M. alpina (1S-4 주) 유래의 ω3 지방산 불포화화 효소의 cDNA 를 효모로 발현시키기 위한 발현 벡터를 구축하였다.

실시예 3 에서 얻어진 DNA 단편을 HindIII-SphI 로 처리하소, 효모 발현 벡터 pYES2 (Invitrogen 사 제조) 의 HindIII-SphI 사이트에 연결하여, 플라스미드 pYMAW3 을 구축하였다. 이 pYMAW3 은, pYES2 의 HindIII-SphI 사이트에, ω3 지방산 불포화화 효소의 cDNA 전장인 1212bp 가 도입되어 있다.

[실시예 5: 발현 벡터를 사용한 효모의 형질 전환]

이 플라스미드 pYMAW3 에서, 효모 Saccharomyces cerevisiae INVSc1 (Invitrogen 사) 를 형질 전환하여, 형질 전환체 ω3-1 및 ω3-2 를 얻었다. 형질 전환은, Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struht k., (1994) Transformation by electroporation. In Current protocols in Molecular Biology. pp.13.7.5.-13.7.7., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York 의 방법에 따라서 일렉트로포레이션법을 사용하여 실시하였다. 형질 전환체의 선택은 트립토판 영양 요구성을 지표로 하여, YNBD (-Trp) 배지를 사용하여 실시하였다.

[실시예 6: ω3 지방산 불포화화 효소 유전자의 발현과 기능 해석]

먼저, 라피노오스 2% (Difco), 폴리펩톤 2% (Daigo), 효모 엑기스 1% (Difco) 를 함유하는 액체 배지를 오토클레이브 후, ω3 지방산 불포화화 활성의 검출을 가능하게 하는 기질로서, n-6 계 지방산인 리놀레산 (LA; 18: 2Δ^9,12), n-6 계 지방산인 γ-리놀렌산 (GLA; 18: 3Δ^6,9,12), n-6 계 지방산인 디호모-γ-리놀렌산 (DGLA; 20: 3Δ^8,11,14), 또는, n-6 계 지방산인 아라키돈산 (AA 또는 ARA; 20: 4Δ^5,8,11,14) 의 메틸에스테르를 각각 0.1% (v/w) 첨가한 것을 준비하였다. 각각의 배지에 형질 전환주를 1 백금 루프 식균하여, 28℃, 300rpm, 24시간 진탕 배양하였다. 또, 대조로는, 변경하지 않은 pYES2 벡터를 함유하는 효모 INVSC1 를 사용하였다.

계속해서, ω3 지방산 불포화화 효소 유전자를 발현시키기 위해서, 배지에 갈락토스를 최종 농도 2% 가 되도록 첨가하고, 다시 28℃, 309rpm, 48시간 진탕 배 양하였다.

[실시예 7: ω3 지방산 불포화화 활성의 검출]

ω3 지방산 불포화화 활성을 검출하기 위해서, 세포 전체의 지방산 분석을 실시하였다. 지방산 분석은, Sakuradani et al.1999a, Δ⁹-Fatty acid desaturase from arachidonic acid-producing fungus. Unique gene sequence and its heterologous expression in a fungus, Aspergillus. Eur J Biochem 260: 208-216 의 방법에 따랐다.

원심에 의해 효모 세포를 회수하여, 증류수로 세정 후 100℃ 에서 건조시켰다. 건조된 세포는, 10% 염화수소 함유 메탄올을 첨가하여 50℃ 에서 3시간 방치하고, 직접 메틸기 전이시켰다. 이렇게 해서 염산메탄올법에 의해 균체 세포 내의 지방산 잔기를 메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하고, 헥산을 증류 제거한 후 얻어지는 지방산 메틸에스테르를 가스 크로마토그래피로 분석하였다.

결과를 하기 표 1 에 나타낸다. 또, 표 중 「pYES2」로 표시되어 있는 주는, 변경하지 않은 pYES2 벡터를 함유하는 대조주를 나타내고, 「ω3-1」, 「ω3-2」는, 다른 형질 전환주를 사용하여 실시한 2 회의 독립된 실험을 나타낸다. 「기질 (%)」은, 검출된 전체 지방산 중에 있어서의, 기질 (예를 들어, n-6 계 지방산인 리놀레산 (LA; 18: 2Δ^9,12)) 의 몰 조성을 나타낸다. 「생성물 (%)」은, 검출된 전체 지방산 중에 있어서의, ω3 불포화화 생성물 (예를 들어, 기질이 LA 인 경우에는 n-3 계 지방산인 α-리놀렌산 (ALA; 18: 3Δ^9,12,15) 의 몰 조성을 나타 낸다. 또한, 「변환율 (%)」은, {(생성물 (%)/(기질(%)＋생성물(%))}×100 을 사용하여 산출되었다. 또, 변경하지 않은 pYES2 벡터를 함유하는 대조주에서는, 기질로서 첨가한 지방산은 전혀 변환되어 있지 않았다.

주	기질	기질(%)	생성물	생성물(%)	변환율(%)
pYES2	18:2n-6 18:3n-6 20:3n-6 20:4n-6	13.2 19.4 7.0 8.3	18:3n-3 18:4n-3 20:4n-3 20:5n-3	0.0 0.0 0.0 0.0	0 0 0 0
ω3-1	18:2n-6 18:3n-6 20:3n-6 20:4n-6	10.8 17.3 5.8 3.9	18:3n-3 18:4n-3 20:4n-3 20:5n-3	1.4 1.9 0.3 0.4	11.6 9.8 5.4 9.1
ω3-2	18:2n-6 18:3n-6 20:3n-6 20:4n-6	9.3 10.3 7.1 9.0	18:3n-3 18:4n-3 20:4n-3 20:5n-3	1.9 2.6 0.3 0.2	16.9 20.1 4.2 2.4

표 1 에, 나타낸 바와 같이, M. alpina (1S-4 주) 유래의 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자를 효모로 발현시키면, 첨가한 모든 종류의 탄소수 18 및 20 인 n-6 계 지방산의 ω3 위치를 불포화화하여, n-3 계 지방산을 생성할 수 있음이 확인되었다. 즉 n-6 계 지방산인 리놀레산 (LA; 18: 2Δ^9,12) 은 n-3 계 지방산인 α-리놀렌산 (ALA; 18: 3Δ^9,12,15) 으로 변환되고, n-6 계 지방산인 γ-리놀렌산 (GLA; 18: 3Δ^6,9,12) 은 n-3 계 지방산인 스테아리돈산 (18: 4Δ^6,9,12,15) 으로 변환되고, n-6 계 지방산인 디호모-γ-리놀렌산 (DGLA; 20: 3Δ^8,11,14) 은 n-3 계 지방산인 20: 4Δ^8,11,14, ¹⁷ 으로 변환되고, n-6 계 지방산인 아라키돈산 (AA 또는 ARA; 20: 4Δ^5,8,11,14) 은 n-3 계 지방산인 에이코사펜타엔산 (EPA; 20: 5Δ^5,8,11,14,17) 으로 변환되었다. 다른 신규한 지방산은 검출되지 않았기 때문에, 이 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자는, Δ¹²지방산 불포화화 활성, Δ⁶ 지방산 불포화화 활성, 및/또는 Δ⁵ 지방산 불포화화 활성을 갖지 않는 것을 알 수 있었다.

또한, 표 1 로부터, M. alpina (1S-4 주) 유래의 ω3 지방산 불포화화 효소는 탄소수 18 및 20 인 n-6 계 지방산의 ω3 위치를 불포화화할 수 있는데, 탄소수 20 인 n-6 계 지방산에 비교하여 탄소수 18 인 n-6 계 지방산의 ω3 위치를 보다 효율적으로 불포화화할 수 있음이 개시되었다.

도 3∼도 6 에, 가스 크로마토그래피에 의한 지방산 분석의 결과를 나타낸다. 도 3 은, 리놀레산을 첨가한 경우의 분석 결과를, 도 4 는 γ-리놀렌산을 첨가한 경우의 분석 결과를, 도 5 는 디호모-γ-리놀렌산을 첨가한 경우의 분석 결과를, 도 6 은 아라키돈산을 첨가한 경우의 분석 결과를 나타낸다. 이들 도면에서는, ω3 지방산 불포화화 효소 유전자가 발현된 효모 세포에 있어서, 첨가된 n-6 계 지방산의 ω3 위치가 불포화화되어 생성된 n-3 계 지방산의 신규 피크가 확인된다. 또한, 이들 피크는, 동일 도면 중에 나타나 있는 대조주의 분석 결과에서는 보이지 않는다. 신규 피크로서 인정되는 지방산 에스테르는, 표준 물질의 유지 시간과의 비교, 및 GLC-MS 분석에 의해 얻어진 분자 이온 피크 및 프래그먼트 패턴으로부터 동정하였다.

[실시예 8: 효모에 있어서 저온 조건 하에서의 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자의 발현과 기능 해석]

실시예 4 에서 얻어진 플라스미드 pYMAW3 에서 효모 INVSC1 (Invitrogen 사) 를 형질 전환한 형질 전환체 ω3-1 을 사용하여, 저온 조건 하에서 ω3 지방산 불포화화 효소 유전자를 발현시켰다.

라피노오스 2% (Difco), 폴리펩톤 2% (Daigo), 효모 엑기스 1% (Difco) 의 액체 배지를 오토클레이브 후, 실시예 6 과 동일한 기질을 0.05% (v/w) 첨가하였다. 각각의 배지에 형질 전환주를 1 백금 루프 식균하여, 28℃, 300rpm, 24시간 진탕 배양하였다. 계속해서, 갈락토스를 최종 농도 2% 가 되도록 배지에 첨가하고, 다시 20℃ 또는 12℃ 에서 300rpm, 48시간 진탕 배양하였다.

대조, 지방산 메틸에스테르의 분석에 관해서는 실시예 5 와 동일하다. 결과를 하기 표 2 에 나타낸다. 또, 표에는 나타나 있지 않지만, 변경되지 않은 pYES2 벡터에서 형질 전환한 대조주에서는, 어느 온도에 있어서도 기질로서 첨가한 지방산은 변환되어 있지 않았다. 「기질 (%)」, 「생성물 (%)」, 「변환율 (%)」에 관해서는 실시예 7 에서 설명한 바와 같다.

반응 온도	변환율 (%)
반응 온도	18:2n-6→ 18:3n-3	18:3n-6→ 18:4n-3	20:3n-6→ 20:4n-3	20:4n-6→ 20:5n-3
28℃ 20℃ 12℃	2.3 19.0 30.1	7.8 30.9 45.9	2.4 8.7 19.8	2.1 4.6 14.7

표 2 에 나타낸 바와 같이, 어떠한 기질을 첨가한 경우에서도, 20℃ 또는 12℃ 저온 조건에 있어서는, 28℃ 일 때와 비교하여 변환율이 수배 높은 것이 확인되었다. 이것으로부터, M. alpina (1S-4 주) 유래의 ω3 지방산 불포화화 효소는, 저온에서 보다 효율적으로 기능하는 효소임을 알 수 있었다.

본 발명은 상기 서술한 실시형태에 한정되는 것이 아니라, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 가지 변경이 가능하다. 즉, 청구항에 나타낸 범위에서 적절히 변경한 기술적 수단을 조합하여 얻어지는 실시형태에 관해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

이상과 같이, 본 발명에 관련된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는, n-3 계 지방산의 생산에 유용하다. 또한, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 발현 가능하게 도입한 형질 전환체 또는 세포는, 식품 분야, 각종 공업 분야에 있어서, n-3 계 지방산, 또는 이들을 사용하는 제품을 생산하는 데에 매우 유용하다. 또한, 특히, 상기 형질 전환체가 식물체인 경우, 식물체 자체를 식품으로서 사용할 수 있기 때문에 농업 분야 등에 있어서 매우 유용하다.

<110> SUNTORY LIMITED <120> Polypeptide with desaturating activity for omega 3-fatty acid, polynucleotide encoding the polypeptide, and use of the polypeptide and Polynucleotide <130> PCT05-0068 <150> JP 2004-241671 <151> 2004-08-20 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 403 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 1 Met Ala Pro Pro His Val Val Asp Glu Gln Val Arg Arg Arg Ile Val 1 5 10 15 Val Glu Asp Glu Ile Lys Ser Lys Lys Gln Phe Glu Arg Asn Tyr Val 20 25 30 Pro Met Asp Phe Thr Ile Lys Glu Ile Arg Asp Ala Ile Pro Ala His 35 40 45 Leu Phe Ile Arg Asp Thr Thr Lys Ser Ile Leu His Val Val Lys Asp 50 55 60 Leu Val Thr Ile Ala Ile Val Phe Tyr Cys Ala Thr Phe Ile Glu Thr 65 70 75 80 Leu Pro Ser Leu Ala Leu Arg Val Pro Ala Trp Ile Thr Tyr Trp Ile 85 90 95 Ile Gln Gly Thr Val Met Val Gly Pro Trp Ile Leu Ala His Glu Cys 100 105 110 Gly His Gly Ala Phe Ser Asp Ser Lys Thr Ile Asn Thr Ile Phe Gly 115 120 125 Trp Val Leu His Ser Ala Leu Leu Val Pro Tyr Gln Ala Trp Ala Met 130 135 140 Ser His Ser Lys His His Lys Gly Thr Gly Ser Met Thr Lys Asp Val 145 150 155 160 Val Phe Ile Pro Ala Thr Arg Ser Tyr Lys Gly Leu Pro Ala Leu Glu 165 170 175 Lys Pro Ala Val Glu Glu Glu Val Ser Glu Gln Glu His His His His 180 185 190 Glu Glu Ser Ile Phe Ala Glu Thr Pro Ile Tyr Thr Leu Gly Ala Leu 195 200 205 Leu Phe Val Leu Thr Phe Gly Trp Pro Leu Tyr Leu Ile Val Asn Phe 210 215 220 Ser Gly His Glu Ala Pro His Trp Val Asn His Phe Gln Thr Val Ala 225 230 235 240 Pro Leu Tyr Glu Pro His Gln Arg Lys Asn Ile Phe Tyr Ser Asn Cys 245 250 255 Gly Ile Val Ala Met Gly Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Ser Met Val Phe 260 265 270 Ser Pro Leu Thr Val Phe Met Tyr Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Val 275 280 285 Asn Ala Trp Ile Val Cys Ile Thr Tyr Leu Gln His Thr Asp Pro Lys 290 295 300 Val Pro His Phe Arg Asp Asn Glu Trp Asn Phe Gln Arg Gly Ala Ala 305 310 315 320 Cys Thr Ile Asp Arg Ser Phe Gly Thr Ile Val Asn His Leu His His 325 330 335 His Ile Gly Asp Ser His Gln Cys His His Met Phe Ser Gln Met Pro 340 345 350 Phe Tyr Asn Ala Val Glu Ala Thr Lys Tyr Leu Lys Ala Lys Leu Gly 355 360 365 Lys Tyr Tyr Ile Phe Asp Asp Thr Pro Ile Ala Lys Ala Leu Tyr Arg 370 375 380 Asn Trp Arg Glu Cys Lys Phe Val Glu Asp Glu Gly Asp Val Val Phe 385 390 395 400 Tyr Lys His <210> 2 <211> 1381 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 2 tcataccgag aaaatggccc cccctcacgt tgtcgacgaa caagttcgac gcaggatcgt 60 cgttgaggac gagatcaagt ctaagaagca atttgagcgc aactatgtgc ccatggactt 120 tacgattaag gagattcgag atgcgatccc tgcccacctc ttcatccgtg ataccacaaa 180 gtcgatcctg catgtcgtca aggatctggt caccatcgcc atcgtctttt actgtgcaac 240 cttcattgag actctgccct cgctcgctct gcgagttcct gcctggatca cctactggat 300 catccaagga actgtcatgg tcggcccctg gatcttggct catggtaagg aaacgaaaaa 360 tcccatgtgt atttctgtac tacagaaggc gaagtttgta cctgaaaaga tcagcgtcgt 420 cccttgattt agaatgtaac taaccttgca atcgtatgac ctaaattttc ttgtgtcaac 480 gacagagtgc ggccacggag ctttctcgga tagcaagacg atcaacacca tctttggatg 540 ggtcctccac tctgctcttt tggtgcccta ccaggcctgg gctatgtcac actccaagca 600 tcacaagggt actggatcga tgaccaaaga tgtcgttttc atccctgcca ctcgttccta 660 caagggcctc ccagcactgg agaagcctgc cgtcgaagag gaggtttcgg agcaggaaca 720 ccaccaccac gaggagtcca tctttgccga aactcccatc tacacgctcg gagcgctttt 780 gttcgtcttg accttcggat ggcccttgta cttgatcgtc aacttttcag gacacgaggc 840 ccctcactgg gtcaaccatt tccagactgt cgctcctctc tatgagcctc accagcgcaa 900 gaacatcttc tactccaact gcggcattgt cgccatgggt tcgatcttga cttacctttc 960 gatggtcttc tcgcccttga ctgtcttcat gtactatggc atcccttacc tcggagtcaa 1020 cgcctggatc gtctgcatta cctatctcca gcacaccgat cccaaggtgc ctcacttccg 1080 tgataacgag tggaacttcc agcgcggtgc tgcctgcact atcgaccgat ccttcggtac 1140 catcgtgaac cacctgcacc accacattgg cgactctcac cagtgccacc atatgttctc 1200 gcagatgccc ttctacaatg ctgtggaggc tacaaagtac ttgaaggcca aacttggcaa 1260 gtactacata tttgacgaca cgcccattgc caaagccctc taccgcaatt ggagagagtg 1320 caaattcgtg gaggacgagg gagatgtagt gttttacaag cattaacaat ttgaatacga 1380 a 1381 <210> 3 <211> 1212 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 3 atggcccccc ctcacgttgt cgacgaacaa gttcgacgca ggatcgtcgt tgaggacgag 60 atcaagtcta agaagcaatt tgagcgcaac tatgtgccca tggactttac gattaaggag 120 attcgagatg cgatccctgc ccacctcttc atccgtgata ccacaaagtc gatcctgcat 180 gtcgtcaagg atctggtcac catcgccatc gtcttttact gtgcaacctt cattgagact 240 ctgccctcgc tcgctctgcg agttcctgcc tggatcacct actggatcat ccaaggaact 300 gtcatggtcg gcccctggat cttggctcat gagtgcggcc acggagcttt ctcggatagc 360 aagacgatca acaccatctt tggatgggtc ctccactctg ctcttttggt gccctaccag 420 gcctgggcta tgtcacactc caagcatcac aagggtactg gatcgatgac caaagatgtc 480 gttttcatcc ctgccactcg ttcctacaag ggcctcccag cactggagaa gcctgccgtc 540 gaagaggagg tttcggagca ggaacaccac caccacgagg agtccatctt tgccgaaact 600 cccatctaca cgctcggagc gcttttgttc gtcttgacct tcggatggcc cttgtacttg 660 atcgtcaact tttcaggaca cgaggcccct cactgggtca accatttcca gactgtcgct 720 cctctctatg agcctcacca gcgcaagaac atcttctact ccaactgcgg cattgtcgcc 780 atgggttcga tcttgactta cctttcgatg gtcttctcgc ccttgactgt cttcatgtac 840 tatggcatcc cttacctcgg agtcaacgcc tggatcgtct gcattaccta tctccagcac 900 accgatccca aggtgcctca cttccgtgat aacgagtgga acttccagcg cggtgctgcc 960 tgcactatcg accgatcctt cggtaccatc gtgaaccacc tgcaccacca cattggcgac 1020 tctcaccagt gccaccatat gttctcgcag atgcccttct acaatgctgt ggaggctaca 1080 aagtacttga aggccaaact tggcaagtac tacatatttg acgacacgcc cattgccaaa 1140 gccctctacc gcaattggag agagtgcaaa ttcgtggagg acgagggaga tgtagtgttt 1200 tacaagcatt aa 1212 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <220> <221> modified_base <222> (6) <223> n is inosine <220> <221> modified_base <222> (12) <223> n is inosine <400> 4 tgggtnytbg cncaygartg ygghca 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <220> <221> modified_base <222> (3) <223> n is inosine <220> <221> modified_base <222> (9) <223> n is inosine <220> <221> modified_base <222> (14) <223> n is 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Asp Ile Ile Ile Ser Asp Leu Gly Val Leu 245 250 255 Ala Ala Leu Gly Thr Leu Ile Tyr Ala Ser Met Gln Leu Ser Leu Leu 260 265 270 Thr Val Thr Lys Tyr Tyr Ile Val Pro Tyr Leu Phe Val Asn Phe Trp 275 280 285 Leu Val Leu Ile Thr Phe Leu Gln His Thr Asp Pro Lys Leu Pro His 290 295 300 Tyr Arg Glu Gly Ala Trp Asn Phe Gln Arg Gly Ala Leu Cys Thr Val 305 310 315 320 Asp Arg Ser Phe Gly Lys Phe Leu Asp His Met Phe His Gly Ile Val 325 330 335 His Thr His Val Ala His His Leu Phe Ser Gln Met Pro Phe Tyr His 340 345 350 Ala Glu Glu Ala Thr His His Leu Lys Lys Leu Leu Gly Glu Tyr Tyr 355 360 365 Val Tyr Asp Pro Ser Pro Ile Val Val Ala Val Trp Arg Ser Phe Arg 370 375 380 Glu Cys Arg Phe Val Glu Asp His Gly Asp Val Val Phe Phe Lys Lys 385 390 395 400 <210> 11 <211> 419 <212> PRT <213> Saccharomyces kluyveri <400> 11 Met Ser Ile Glu Thr Val Gly Ser Ser Ser Gly Val Ala Ile Asn Ser 1 5 10 15 Lys Ala Val Ser Ser Thr Ala Thr Thr Val Val Gln Pro Lys Thr Ala 20 25 30 Ile Asp Thr Asn Gly Asn Val Phe Lys Val 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Ile Met Ser 245 250 255 Asp Ile Gly Ile Val Ser Thr Leu Leu Ile Asn Tyr Leu Trp Tyr Arg 260 265 270 Ala Tyr Gly Ala His Val Val Leu Ile Asn Trp Phe Ile Pro Trp Leu 275 280 285 Trp Val Asn His Trp Leu Val Phe Val Thr Phe Leu Gln His Thr Asp 290 295 300 Pro Thr Met Pro His Tyr Asp Ala Glu Glu Trp Thr Phe Ala Lys Gly 305 310 315 320 Ala Ala Ala Thr Ile Asp Arg Asn Phe Gly Phe Val Gly Gln His Ile 325 330 335 Phe His Asp Ile Ile Glu Thr His Val Leu His His Tyr Cys Ser Arg 340 345 350 Ile Pro Phe Tyr Asn Ala Arg Lys Ala Thr Ser Ala Ile Lys Glu Val 355 360 365 Met Gly Gln His Tyr Arg Tyr Glu Gly Glu Asn Met Trp Lys Ser Leu 370 375 380 Trp Lys Val Ala Arg Ser Cys Gln Tyr Val Glu Gly Asp Asn Gly Val 385 390 395 400 Arg Met Phe Arg Asn Thr Asn Gly Val Gly Val Lys Pro Glu Asp Gly 405 410 415 Ser Ser Gln <210> 12 <211> 416 <212> PRT <213> Saccharomyces kluyveri <400> 12 Met Ser Ala Val Thr Val Thr Gly Ser Asp Pro Lys Asn Arg Gly Ser 1 5 10 15 Ser Ser Asn Thr Glu Gln Glu Val Pro Lys Val Ala Ile Asp 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240 Thr Ser Pro Leu Phe Glu Gln Arg Asp Ala Leu Tyr Ile Phe Leu Ser 245 250 255 Asp Leu Gly Ile Leu Thr Gln Gly Ile Val Leu Thr Leu Trp Tyr Lys 260 265 270 Lys Phe Gly Gly Trp Ser Leu Phe Ile Asn Trp Phe Val Pro Tyr Ile 275 280 285 Trp Val Asn His Trp Leu Val Phe Ile Thr Phe Leu Gln His Thr Asp 290 295 300 Pro Thr Met Pro His Tyr Asn Ala Glu Glu Trp Thr Phe Ala Lys Gly 305 310 315 320 Ala Ala Ala Thr Ile Asp Arg Lys Phe Gly Phe Ile Gly Pro His Ile 325 330 335 Phe His Asp Ile Ile Glu Thr His Val Leu His His Tyr Cys Ser Arg 340 345 350 Ile Pro Phe Tyr Asn Ala Arg Pro Ala Ser Glu Ala Ile Lys Lys Val 355 360 365 Met Gly Lys His Tyr Arg Ser Ser Asp Glu Asn Met Trp Lys Ser Leu 370 375 380 Trp Lys Ser Phe Arg Ser Cys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Asn Gly Val 385 390 395 400 Leu Met Phe Arg Asn Ile Asn Asn Cys Gly Val Gly Ala Ala Glu Lys 405 410 415 <210> 13 <211> 380 <212> PRT <213> Glycine max <400> 13 Met Val Lys Asp Thr Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Ala Asn Asn Gly Tyr 1 5 10 15 Gln Gln Lys Gly Ser 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Pro Leu Leu Val Leu Lys 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Ile Pro Tyr Trp Ile Phe Val Met Trp Leu Asp Phe Val 245 250 255 Thr Tyr Leu His His His Gly His His Gln Lys Leu Pro Trp Tyr Arg 260 265 270 Gly Lys Glu Trp Ser Tyr Leu Arg Gly Gly Leu Thr Thr Val Asp Arg 275 280 285 Asp Tyr Gly Trp Ile Tyr Asn Ile His His Asp Ile Gly Thr His Val 290 295 300 Ile His His Leu Phe Pro Gln Ile Pro His Tyr His Leu Val Glu Ala 305 310 315 320 Thr Gln Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Asp Tyr Tyr Arg Glu Pro Glu 325 330 335 Arg Ser Ala Pro Leu Pro Phe His Leu Ile Lys Tyr Leu Ile Gln Ser 340 345 350 Met Arg Gln Asp His Phe Val Ser Asp Thr Gly Asp Val Val Tyr Tyr 355 360 365 Gln Thr Asp Ser Leu Leu Leu His Ser Gln Arg Asp 370 375 380 <210> 14 <211> 453 <212> PRT <213> Glycine max <400> 14 Met Ala Thr Trp Tyr His Gln Lys Cys Gly Leu Lys Pro Leu Ala Pro 1 5 10 15 Val Ile Pro Arg Pro Arg Thr Gly Ala Ala Leu Ser Ser Thr Ser Arg 20 25 30 Val Glu Phe Leu Asp Thr Asn Lys Val Val Ala Gly Pro Lys Phe Gln 35 40 45 Pro Leu Arg 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Claims

ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호: 1 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
제 1 항에 기재된 폴리펩티드와 결합하는 항체.
제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
ω3 지방산 불포화화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호: 2 또는 3 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
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제 3 항 또는 제 4 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
제 3 항 또는 제 4 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터로 형질전환된 효모.
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제 8 항에 기재된 벡터를 사용하는 폴리펩티드의 생산 방법.
제 9 항에 기재된 형질 전환체를 사용하는 폴리펩티드의 생산 방법.
제 9 항에 기재된 형질 전환체를 사용하는 지방산의 생산 방법.
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제 15 항에 있어서,

상기 지방산은, α-리놀렌산 (ALA), 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17 또는 에이코사펜타엔산 (EPA) 인 지방산의 생산 방법.
제 15 항에 기재된 지방산 생산 방법에 의해 얻어진 α-리놀렌산 (ALA), 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17 또는 에이코사펜타엔산 (EPA) 을 포함하는 식품.
제 15 항에 기재된 지방산 생산 방법에 의해 얻어진 α-리놀렌산 (ALA), 스테아리돈산, 20:4Δ^8,11,14,17 또는 에이코사펜타엔산 (EPA) 을 포함하는 공업 제품.
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