CN102776213B

CN102776213B - 一种用于多不饱和脂肪酸生物合成的脱饱和酶ω3 Des

Info

Publication number: CN102776213B
Application number: CN201210309215.2A
Authority: CN
Inventors: 陈海琴; 顾震南; 张灏; 陈卫; 宋元达; 田丰伟; 赵建新; 陈永泉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2012-08-28
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2032-08-28
Also published as: CN102776213A

Abstract

本发明提供了来自高山被孢霉的用于多不饱和脂肪酸生物合成的新的脂肪酸脱饱和酶基因，特别是ω3脱饱和酶(FADS15)。本发明还提供了编码上述脱饱和酶的核酸序列、上述脱饱和酶的表达载体和表达上述脱饱和酶的重组微生物。

Description

一种用于多不饱和脂肪酸生物合成的脱饱和酶ω3 Des

技术领域

本发明涉及多不饱和脂肪酸（(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的微生物制造领域，具体涉及在多不饱和脂肪酸生物合成途径中起作用的脂肪酸脱饱和酶。

背景技术

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有两个或两个以上双键、碳原子数为16～26的直链脂肪酸。其中，ω-3和ω-6是两类人体所必需的脂肪酸，不能在体内合成，只能通过食物摄取。属于ω-3的有：α-亚麻酸(ALA,18:3)、二十碳五烯酸(EPA,20:5)、二十二碳六烯酸(DHA,22:6)等；属于ω-6的有：亚油酸(LA,18:2)、γ-亚麻酸(GLA,18:3)和花生四烯酸(ARA,20:4)等。多不饱和脂肪酸ω-3和ω-6在人体内有着多方面重要的生理功能，是所有细胞膜的重要组成成分，对激素代谢和许多酶的活性起调控作用，特别对新生儿脑和视力的发育是必需的。

PUFAs的生物合成途径是以硬脂酸(Stearic acid)为底物，主要通过脂肪酸脱氢酶(Desaturase,Des)和延长酶(Elongase,Elo)的作用，生成不同的脂肪酸产物。主要的脂肪酸合成途径有三条：Δ6脱氢酶-Δ6延长酶-Δ5脱氢酶-Δ5延长酶-Δ4脱氢酶途径(Δ6Des-Δ6Elo-Δ5Des-Δ5Elo-Δ4Des),

Δ9延长酶-Δ8脱氢酶途径(Δ9Elo-Δ8Des)和聚酮合成酶途径(Polyketide synthase,PKS)。研究PUFAs生物合成途径中的关键酶和节点，对其合成通路进行解析和改造，对于PUFAs的微生物制造具有重要意义。

高山被孢霉(Mortierella alpina，M.alpina)是目前产PUFAs真菌中唯一具有正式安全性评估的菌种(GRAS)，其PUFAs含量极为丰富，总的脂肪含量达到菌体生物量的50%，其中ω-3达到总脂肪酸含量的3%，而ω-6 达到总脂肪酸含量的近30%，是名副其实的油脂细胞工厂。目前已有M.alpina菌株用于ω-6脂肪酸花生四烯酸(ARA,20:4)商业化生产的报道。已知M.alpina编码1个c5，两个c6,3个c9,1个c12和1个ω3区位选择性脱氢酶，其具备所有已知的区位选择性膜脱氢酶组。

发明内容

膜脱饱和酶可以在多种宿主中表达，例如大肠杆菌、啤酒酵母、米曲酶和高山被孢霉。申请人已经对PUFAs生物合成途径中的关键酶(ω3Des、Δ12Des和Δ9-IDes)的高效表达、纯化和鉴定进行了大量工作。具体地，申请人在M.alpina全基因组测序的基础上，设计了三对分别针对编码M.alpineΔ9Des、Δ12Des和ω3Des这三个脱饱和酶的核苷酸的引物，具体引物序列在表1中列出。提取高山被孢霉RNA后进行反转录得到cDNA，用FF1和FR1、FF2和FR2、FF3和FR3三对引物PCR扩增出三条序列，将其插入pET19b(PP)并测序，进而亚克隆至毕赤酵母表达载体pPinkα-HC，构建上述三个脱饱和酶的表达载体，线性化后电转化至pPink strain2，得到的重组菌能够顺利表达上述三种脱饱和酶。酶学活性分析结果表明重组菌中的脱饱和酶能够发挥功能，并用Ni柱一步层析法得到纯化的脱饱和酶蛋白。

本发明提供了编码M.alpinaω3脱饱和酶(FADS15)和Δ9脱饱和酶(FADS9-I)的基因，其核酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了分别含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的表达载体，能够分别表达M.alpineω3脱饱和酶(FADS 15)和Δ9脱饱和酶(FADS9-I)。优选地，所述表达载体是毕赤酵母表达载体。

本发明还提供了一种重组微生物，它能够分别表达M.alpinaω3脱饱和酶(FADS15)和Δ9脱饱和酶(FADS9-I)。优选地，所述重组微生物是重组毕赤酵母，包括PichiaPink strain 1、PichiaPink strain2、PichiaPink strain 3和PichiaPink strain 4菌株，特别是PichiaPink strain 2，其中含有携带SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的毕赤酵母表达载体。

本发明成功表达和纯化了来源于M.alpina，在多不饱和脂肪酸生物合成途径中起关键作用的新的膜脱饱和酶ω3脱饱和酶(FADS15)和Δ9脱饱和酶(FADS9-I)，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，并对上述两种膜脱饱和酶进行了酶学活性验证。

1.本发明还涉及上述新的膜脱饱和酶Δ9脱饱和酶(FADS9-I)和ω3脱饱和酶(FADS15)在多不饱和脂肪酸生物合成中的用途，特别是利用此基因在高山被孢霉或其他转入此基因物种中用于不饱和脂肪酸的生产及人类健康治疗，特别是将饱和脂肪酸转化成单不饱和脂肪酸（Δ9脱饱和酶）和ω6多不饱和脂肪酸催化为ω3多不饱和脂肪酸（ω3脱饱和酶），比如Δ9脱饱和酶能将C14:0催化为C14:1^Δ9，C16:0催化为C16:1^Δ9，C18:0催化为C18:1^Δ9，C20:0催化为C20:1^Δ9，ω3脱饱和酶能将C18:1^Δ9催化为C18:2 ^Δ9,15,C18:2^Δ9,12催化为C18:3^Δ9,12,15,C20:4^Δ5,8,11,14催化为C20:5^{Δ5,8,11,14,17}

表1引物序列表及其酶切位点

附图说明

图1：pET19b和pPinkα-HC载体的详细信息以及构建表达载体的策略。

图2：ω3脱饱和酶(FADS15)克隆片段的测序结果，克隆自ATCC#32222的M.alpine的FADS15核苷酸序列与来自M.alpina 1s-4的AB182163具有93.1%的同源性。

图3：Δ12脱饱和酶(FADS12)克隆片段的测序结果，克隆自ATCC#32222的M.alpina的FADS12核苷酸序列与来自M.alpina 1s-4的AF110509具有99.9%的同源性。

图4：Δ9脱饱和酶(FADS9-I)克隆片段的测序结果，克隆自ATCC#32222的M.alpina的FADS9-I核苷酸序列与来自M.alpina 1s-4的AF085500具有98.4%的同源性。

图5：ω3脱饱和酶(FADS15)、Δ12脱饱和酶(FADS12)和Δ9脱饱和酶(FADS9-I)重组子的生长特性和重组蛋白的表达情况。A:生长曲线；B：蛋白表达时间曲线；C：重组子的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图；D：重组子中脱饱和酶蛋白的His-Tag增强染色图。

图6：ω3脱饱和酶(FADS15)、Δ12脱饱和酶(FADS12)和Δ9脱饱和酶(FADS9-I)重组子中脱饱和酶蛋白的离心分级。A：不同离心力下蛋白的分布情况；B：在最佳离心力下蛋白在不同组分中的分布情况。

图7：ω3脱饱和酶(FADS15)、Δ12脱饱和酶(FADS12)和Δ9脱饱和酶(FADS9-I)三种脱饱和酶蛋白溶解去垢剂的选择及亲和层析.A:脱饱和酶蛋白溶解去垢剂的选择；B：脱饱和酶经亲和层析后的SDS-PAGE结果

具体实施方式

实施例1高山被孢霉的培养

高山被孢霉M.alpina（#32222，美国典型培养物保藏中心，Manassas,Virginia,USA）接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PAD）（(BD DifcoTM Potato Dextrose Agar cat#213400)培养基上，并于25℃培养20-30天。向培养基加入5ml肉汤培养基（20g/L葡萄糖，5g/L Bacto酵母提取物BD Biosciences cat#212750,1g/L KH₂PO₄,0.25g/L MgSO₄,10g/L KNO₃)。使用灭菌环轻轻将孢子从表面刮下，并通过40-micron的细胞滤网过滤。12,000g将孢子离心15分钟，在小体积肉汤培养基中悬浮，使用血细胞计数器进行计数，并以约10⁷孢/mL的密度，在30%的甘油中，于-80℃进行保存。另外，3ml未浓缩的孢子悬浮液直接加入250ml烧瓶内的45ml不含KNO₃的肉汤中，覆盖8层粗布，200rpm，25℃摇动5天。培养物使用Braun手动匀质器以5秒/脉冲，共8脉冲进行匀质，接着取0.3g菌丝体接种到250ml烧瓶内的45ml不含KNO₃的肉汤培养基中，200rpm，25℃培养24小时。上述步骤重复一次，使得整个真菌培养物处于增殖期而适于实验。通过过滤收集菌丝体并且称重。样品在液氮中速冻，粉碎并保存于-80℃，用于RNA提取。

实施例2表达载体的构建

使用Trizol Reagent(Invitrogen)，根据说明书提取M.alpina总RNA。总RNA经过不含RNA酶的DNase消化，并使用RNase Mini kit(Qiagen)进行纯化。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies,Inc.)定量总RNA。在PCR扩增之前，使用PrimeScript RT reagent kit(Takara Bio,Inc)，根据说明书所述，逆转录总RNA。PCR条件为：95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共25个循环，每个样品的总体积为50μl。扩增产物克隆至在FADS和N-末端His标签之间含有PreScission蛋白酶切割位点的（(GE Healthcare)的pET19(Novagen)载体衍生物pET19b(PP)（购自美国Novagen公司，可参考文献Jonsson TJ,Johnson LC,Lowther WT.等人，Protein engineering of the quaternary sulfiredoxin.peroxiredoxin enzyme.substrate complex reveals the molecular basis for cysteine sulfinic acid phosphorylation.J Biol Chem 2009;284:33305-10）中，构建pET19b-FADS15,pET19b-FADS12和pET19b-FADS9-I。使用SF1与SR1-SR3之一组合的引物对（见表1）扩增包含6×His标签的脱饱和酶基因，PCR条件与上述扩增cDNA的条件相同。三个PCR片段纯化后插入到pPinkα-HC（购自Invitrogen）获得表达载体pPinkα-HC-FADS15,pPinkα-HC-FADS12和pPinkα-HC-FADS9-I。通过限制性内切酶酶切分析和测序方法验证外源片段的存在。图1显示了pET19b(PP)和pPinkα-HC载体的详细信息以及构建表达载体的策略。图2-4则分别显示了脱饱和酶FADS15、FADS12和FADS9-I克隆片段的测序结果。克隆自ATCC#32222的M.alpina的FADS15核苷酸序列与来自M.alpina1s-4的AB182163具有93.1%的同源性；克隆自ATCC#32222的M.alpina的FADS12核苷酸序列与来自M.alpina 1s-4的AF110509具有99.9%的同源性；克隆自ATCC#32222的M.alpina的FADS9-I核苷酸序列与来自M.alpina 1s-4的AF085500具有98.4%的同源性。结果表明，上述三种基因在M.alpina中具有高度的保守性。

序列分析显示：FADS15的序列包含一个ORF，其编码403个氨基酸的蛋白，预计分子量46,588Da，PI6.64（pH7时，电荷-2.82）；FADS12的序列包含一个ORF，其编码400个氨基酸的蛋白，预计分子量46,056Da，PI6.97（pH7时，电荷-0.18）；FADS9-I的序列包含一个ORF，其编码445个氨基酸的蛋白，预计分子量50,913Da，PI8.68（pH7时，电荷5.86）。如果包含分泌信号肽，FADS15的ORF编码521个氨基酸的蛋白，预计分子量59,233Da，PI 6.17（pH7时，电荷-12.84）；FADS12的ORF编码517个氨基酸的蛋白，预计分子量58,700Da，PI 6.24（pH7时，电荷-10.19）；FADS9-I的ORF编码562个氨基酸的蛋白，预计分子量63,444Da，PI 6.59（pH7时，电荷-4.16）。

实施例3蛋白的表达

构建的三个质粒pPinkα-HC-FADS15,pPinkα-HC-FADS12和pPinkα-HC-FADS9-I以及pPinkα-HC（阴性对照质粒）使用Spe I线性化，并利用MicroPulser电转仪（(Bio-Rad Laboratories)，将上述线性化质粒按说明书所述的酵母转化方法转化至毕赤酵母（P.pastoris），具体是 PichiaPink strain 1(ade2),strain 2(ade2,pep4),strain 3(ade2,prb1)和strain4(ade2,pep4,prb1)（全部购自Invitrogen），涉及的方法也参照Manual of PichiaPink Expression System(Invitrogen)的使用说明。转化子在YPDS培养基（在YPD培养基中添加1M山梨醇，所述YPD培养基购自Invitrogen）中，于Gene Pulser Cuvettes (Bio-Rad Laborato ries)中28℃静置培养2小时，接着将200μl细胞培养物涂布于PAD选择性培养基上，于28℃培养4天，直到有明显单克隆形成。从每个培养基上挑选8个白色克隆，利用克隆PCR验证目的质粒的插入情况，通过小规模蛋白表达验证目的基因的表达情况。Δ9脱饱和酶(FADS9-I)、Δ12脱饱和酶(FADS12)和ω3脱饱和酶(FADS15)转化子分别挑取了32个克隆（PichiaPink strain 1,strain 2,strain 3和strain 4转化子各8个）。通过PCR鉴定重组子中正确的cDNA插入，结果是6/32个克隆具有1305bp的FADS15,5/32个克隆具有1203bp的FADS12，5/32个克隆具有1338bp的FADS9-I。

PCR鉴定为阳性的重组子接种于50ml锥形管中的10ml BMGY培养基(Buffered Glycerol-complex Medium，包括1%的酵母提取物；2%的蛋白胨；100mM pH 6.0磷酸钾；1.34%的YNB-酵母基本氮源；0.0004%的生物素；1%的甘油)中，以250rpm在摇床(New Brunswick Scientific)中28℃培养48小时。培养物以1500g室温离心5分钟，弃去BMGY上清，在2ml BMMY培养基（Buffered Methanol-complex Medium，包括1%的酵母提取物；2%的蛋白胨；100mM pH6.0磷酸钾；1.34%的YNB；0.0004%的生物素；0.5%的甲醇）中重悬细胞进行诱导表达。继续培养72小时，每日补加0.5%的甲醇，以1500g离心10分钟收集细胞，将上清液转移至离心管，上清液和细胞沉淀均保存于-80℃。使用Coomassie SDS-PAGE和Western Blotting检测上清液和细胞沉淀的蛋白表达。PichiaPink strain 2中三种脱饱和酶的表达水平都较strain1,3,4的高。

实施例4表达条件的优化和目标蛋白定量

携带有FADS15,FADS12和FADS9-I基因的PichiaPink重组子在50ml锥形管中于28℃培养48小时，接着以5%的接种量分别接种于50mlBMGY培养基中，28℃250rpm培养24小时。1500g离心10分钟收集细胞，重悬于10ml含有0.5%的甲醇的BMMY培养基中，28℃250rpm诱导72小时，每日补加0.5%的甲醇。在0h，6h，24h，48h，72h和96h各收集100μl样品，分析OD600，细胞湿重，总蛋白浓度和脱饱和酶表达水平。

取100μl细胞培养物经1500g离心10分钟收集细胞沉淀，利用100μl裂解缓冲液（20mM Tris.Cl，pH7.9，1mM EDTA，5%甘油）悬浮细胞沉淀，加入0.5mm玻璃珠(Biospec products,Inc)到细胞悬液中，4℃涡旋振荡10分钟，接着加入70μl 4×SDS样品缓冲液，在95℃加热5分钟。将约5μl样品上样到蛋白预制胶（Mini-Protein Precast，4-15%，Bio-Rad Laboratories,Cat#456-1086)进行电泳分析。同时，细胞培养物的上清液也使用相同的跑胶方法进行蛋白分泌表达检测。电泳后进行考马斯亮蓝染色，His-tag凝胶染色(Invitrogen)或Western Blotting。蛋白分子量marker分别是预染Marker(precision plus protein standards,Bio-Rad Laboratories)和转印Marker（Magic Marker Western Standard，Invitrogen)。

跑胶结束后，为进行Western Blotting检测，使用Western Blotting转印系统(Bio-Rad Laboratories).通过电转印（100V，2h），蛋白被转移至硝酸纤维素转移膜(Schleicher&Schwell GmbH,Germany)。利用含3%BSA的TBST溶液(150mM NaCl,10mM Tris-ClpH 7.5,0.03%Triton)对膜进行封闭，用小鼠Penta·His抗体(Invitrogen)和HRP-偶联羊抗鼠IgG(GE Healthcare)检测。使用Western Blotting Luminal Reagent(Santa Cruz biotechnology,Inc)观察蛋白条带，并在成像仪Fluorchem E(Cell Biosciences,Inc)上成像。

总蛋白浓度使用Pierce BCA protein assay kit(Thermo Scientific)检测。总蛋白的条带密度利用AlphaView SA软件(Cell Biosciences,Inc)分析，目的蛋白浓度的计算是通过从密度分析得到的目的蛋白百分比乘以总蛋白浓度，或者与已知浓度的BSA标准作比较。

含有脱饱和酶基因的PichiaPink细胞与对照细胞具有相似的细胞密度，净重和总蛋白浓度（见图5A）。接种24小时后能够检测到脱饱和酶表达，并在高水平维持至少2天（见图5B）。细胞培养的温度不同（16℃,22℃,28℃)以及甲醇量不同(0.5%,1%)对脱饱和酶的表达水平没有明显影响。在标准条件下：即将单个克隆接种于10ml YPD中，28℃培养48小时；2.5ml培养物以5%的接种率接种于50ml BMGY中，28℃培养24小时；将细胞转移至10ml BMMY（含0.5%甲醇）中，诱导72小时，可以获得约130mg/L的ω3脱饱和酶(FADS15),110mg/L的Δ12脱饱和酶(FADS12)和350mg/L的Δ9脱饱和酶(FADS9-I)（见图5C）。

实施例5蛋白纯化

纯化步骤均在4℃进行。将800μl细胞培养物离心获得的细胞悬浮于裂解缓冲液中，加入0.5mm玻璃珠到细胞悬液中，4℃涡旋振荡10分钟后通过低速离心（500g,10min，4℃)从悬浮液中分离完整的细胞和细胞碎片。接着利用不同速度离心(1,000g×10min;10,000g×10min;10,000g×20min;20,000g×10min;20,000g×20min)确定何种速度适合获得膜部分。

将脱饱和酶在4℃条件下溶解于包含20mM Tris.Cl,pH 7.9,500mM NaCl,10%甘油,0.1mM EDTA,和1%浓度不同去污剂的溶解缓冲液中。所述去污剂包括Tween-20、Tween-80、NP-40、n-十二烷基-β-D-麦芽苷(DDM)、Fos-Choline 12(Avanti Polar Lipids,Inc)和Fos-Choline 16(Avanti Polar Lipids,Inc)。同时在不同的去污剂孵育时间(0.5h,1h,1.5h,2h和过夜)和不同的去污剂浓度(0.5%,1%,2%)条件下进行实验，不溶物质在4℃，25,000g离心30分钟沉淀。

进行去污剂筛选和条件优化后，选择优选去污剂进行初步纯化后进行Ni亲和层析。将His Mag Sepharose Ni亲和柱(GE Healthcare)在结合缓冲液(20mM Tris.Cl,pH 7.9,500mM NaCl,10%甘油,0.1mM EDTA,0.5%Fos-Choline 16,5or 20mM咪唑)中平衡5分钟，加入蛋白后在4℃孵育45分钟。去除流转的液体后，加入含有5mM或20mM咪唑的结合缓冲液清洗柱子3次。最后，每个脱饱和酶使用洗脱缓冲液（20mM Tris.Cl,pH 7.9,500mM NaCl,10%甘油,0.1mM EDTA,0.5%Fos-Choline 16,500mM咪唑)洗脱。纯化的Δ9脱饱和酶(FADS9-I)、Δ12脱饱和酶(FADS12)和ω3脱饱和酶(FADS15)储存于-80℃。

从图6中可以看出，P.pastoris中产生的重组脱饱和酶从膜部分回收，细胞裂解物以500g离心10分钟除去细胞碎片，接着10,000g，15分钟除去可溶蛋白，能够获得最高的回收率。

从图7A中可以发现：1%(w/v)Fos-Choline 12或Fos-Choline 16处理后，FADS9-I和FADS12完全溶解，而ω3脱饱和酶(FADS15)分别溶解50%或80%；而使用Tween-20,Tween-80,NP-40,DDM则没有明显的提取效果。从图7A中还发现从细胞膜中提取的脱饱和酶发生了蛋白降解，尤其是Δ12脱饱和酶(FADS12)和ω3脱饱和酶(FADS15)。我们选择Fos-Choline 16作为优选去污剂，结果表明脱饱和酶随时间推移提取越来越多，在孵育1.5h后观察到明显的蛋白降解，因此孵育时间优选1.5h。而加入0.5%,1%或2%的Fos-Choline 16，脱饱和酶的溶解率是相同的。上述结果表明，用0.5%Fos-Choline 16在4℃处理1.5h，三个脱饱和酶可以从膜部分有效溶解。

获得的三种脱饱和酶在高纯度和高载量策略下，在His Mag Sepharose Ni上纯化。使用高纯度策略，SDS-PAGE结果（图7B）表明：使用His MagSepharose Ni一步纯化能够获得高纯度(>95%)的脱饱和酶。而使用高载量策略，一步亲和纯化后的每种脱饱和酶产量比使用高纯度策略高两倍，但纯度降低，分别是ω3脱饱和酶(FADS15)的纯度为35%，Δ12脱饱和酶(FADS12)的纯度为45%，Δ9脱饱和酶(FADS9-I)的纯度为85%，每种脱饱和酶的产量在表2中列出。最终获得脱饱和酶的得率为22.5mg/L(FADS15),12mg/L(FADS12)and 188mg/L(FADS9-I)

表2.M.alpina脱饱和酶的纯化

ID：咪唑

实施例6脱饱和酶活性分析

体内：收集约20mg P.pastoris细胞用于脂质提取。在酸性的条件下，以十五碳烷酸和二十一碳烷酸为内标，利用Bligh和Dyer的方法提取脂质。溶剂用氮气从提取物中吹尽。在氩气氛围中，所提脂质用1mL新制的5%氢氧化钾乙醇溶液60°C皂化1h。冷却后，向样品中添加1mL水，用3mL正己烷提取未皂化的脂质。水相以220μL 6M的盐酸进行酸化，用3mL正己烷提取其中的脂肪酸。待正己烷被氮吹干后，脂肪酸先用1mL 0.5M的氢氧化钠甲醇溶液于100°C处理5min，后于氩气中以1mL 14%三氟化硼甲醇溶液100°C处理5min，以完成甲酯化。冷却后，向样品中添加2mL正己烷，之后再添加4mL饱和氯化钠溶液。待两相分离后，正己烷相再用正己烷稀释24倍，以用于GC-MS分析。将1μL样品以不分流方式加载至30m×250μm×0.25μm的DB-waxer柱（Agilent Technologies，Santa Clara，California）。升序升温的条件如下：100°C保持2min，后以16°C/min的速度升温至200°C并维持1min，再以4°C/min的速率升温至220°C并维持1min，后以10°C/min的速率升温至260°C并维持11min。氦气作载气，恒流1.5mL/min。质谱条件：阳离子电子轰击，柱上温度260°C，离子室温度200°C，发射电流250μA。质谱碎片获得范围50-450m/z，扫描时间0.433s。低沸点脂肪酸甲酯用十五碳酸内标定量，而高沸点甲酯用二十一碳酸内标进行定量。

体外：20μl纯化蛋白加入到200μl酵母EGY49细胞匀浆（用0.5mm玻璃珠，在裂解缓冲液中5次浓缩而裂解细胞来制备匀浆），在28℃，250rpm摇动3小时进行酶反应，体外活性检测的混合物220μl储存于-80℃用于脂肪酸分析。

100μl细胞（诱导3天后）的GC-MS分析结果表明，每个重组菌株中的脂肪酸与仅含有pPinkα-HC载体的对照菌株的脂肪酸不同。表3列出了与阴性对照相比，C16:1^Δ9,C18:1^Δ9,C18:2^Δ9,12和C18:3^Δ9,12,15的产量，我们可以看出，携带FADS9-I的P.pastoris的C16:1^Δ9和C18:1^Δ9含量较阴性对照多40％和20％。这些结果表明FAD9-I能够向C16:0和C18:0插入第一个双键，值得注意的是，对于C16:0的脱饱和酶活性比之对C18:0高2倍。携带FADS12的P.pastoris的C18:2^Δ9,12含量比阴性对照多27％，这表明FADS12能够在Δ12-位使C18:1^Δ9脱氢产生C18:2^Δ9,12。携带ω3脱饱和酶(FADS15)的P.pastoris，产生比阴性对照多5％的C18:3^Δ9,12,15。

为了研究纯化脱饱和酶的活性，向220μl EGY49细胞提取物中加入20μl纯化蛋白。结果表明：与阴性对照相比，Δ12脱饱和酶(FADS12)以C18:1^Δ9为底物的活性增强，脱氢为C18:2^Δ9,12增多116％；Δ9脱饱和酶(FADS9-I)以C16:0和C18:0为底物，脱氢为C16:1^Δ9和C18:1^Δ9分别增多6％和7％；ω3脱饱和酶(FADS15)以C18:2^Δ9,12为底物，脱氢为C18:3^Δ9,12,15增加8％。

表3.M.alpina脱饱和酶的细胞内外活性

a：与对照相比的增加值（%）；b、两产物转化率之和。

Claims

1.如SEQ ID NO:1所示的核酸，特征在于编码一种高山被孢霉的ω3脱饱和酶。

2.含有权利要求1所述核酸的表达载体，特征在于能够表达高山被孢霉的ω3脱饱和酶，所述载体是毕赤酵母表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，特征在于所述载体是pPinkα-HC。

4.含有权利要求2或3所述表达载体的重组微生物，其特征在于能够表达高山被孢霉的ω3脱饱和酶。

5.根据权利要求4所述的重组微生物，特征在于所述微生物是毕赤酵母。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，特征在于所述毕赤酵母是PichiaPink strain2菌株。

7.一种高山被孢霉的ω3脱饱和酶，特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

8.权利要求7所述的脱饱和酶在多不饱和脂肪酸生物合成中的用途，其特征在于将ω6多不饱和脂肪酸催化为ω3多不饱和脂肪酸。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于利用编码此酶的基因在高山被孢霉或其他转入此酶的基因物种中用于不饱和脂肪酸的生产，将脂肪酸C18:2^^9,12催化为C18:3^^9,12,15。