TWI396739B - 具有ω３脂肪酸不飽和化活性之多肽及編碼該多肽之聚核苷酸以及該等之利用 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種具有ω3不飽和脂肪酸不飽和化活性，且催化n－3系不飽和脂肪酸的合成反應之多肽，及編碼該多肽之聚核苷酸以及其等的代表性利用。
多元不飽和脂肪酸(PUFAs：Polyunsaturated fatty acids)係細胞膜磷脂質的構成成分，又，作為前列腺素(prostaglandin)、血栓素(thromboxane)、白三烯素(Leukotrienes)等荷爾蒙類生理活性物質的前驅體，而在生物體內發揮重要的角色。由該PUFAs所合成之生理活性物質稱為類花生酸(eicosanoid)，必要時可在體內合成，而調節炎症反應、生殖機能、免疫反應、血壓等。據報告PUFAs係嬰幼兒腦部發育所必須者。
此種PUFAs於生合成之途徑分可分類成n－3系、n－6系、n－9系等。此處，連接於「n－」之數字3、6及9表示從PUFAs之甲基開始計算的第1個雙鍵位於第幾個碳。例如「n－3」系表示以甲基之碳作為第1位之碳，朝羧基側依序為2位、3位、…時，從甲基開始計算的第1個雙鍵位於第3位的碳之PUFAs，亦表示ω3系。在第7圖中表示動物主要的n－3系及n－6系的PUFAs。於n－3系(ω3系)係屬於必須脂肪酸之α－次亞麻油酸及在活體內可從α－次亞麻油酸(ALA)代謝而得之十八碳四烯酸、20：4△8 ， 1 1 ， 1 4 ， 1 7
、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。又，n－6系(ω6系)係屬於必須脂肪酸之α－亞麻油酸(LA)及在活體內可從α－亞麻油酸代謝而得之γ－次亞麻油酸(GLA)、高二碳(dihomo)－γ－次亞麻油酸(DGLA)、花生四烯酸(AA或ARA)等。圖中例如「18：2△9 ， 1 2
」所示之顯示中，18：2係碳數為18，雙鍵之數目為2。△9 ， 1 2
係表示以羧基的碳為第1位的碳，朝甲基側依序為第2位、第3位…時之雙鍵的位置。又，由於動物不能使超過△9
位之甲基側之C－C鍵不飽和化，故以α－次亞麻油酸及亞麻油酸作為必須脂肪酸而必須從食物(植物性食物)攝取，又，亦無法使n－6系轉換成n－3系，或使n－3系轉換成n－6系。
所謂n－6系PUFAs與n－3系PUFAs分別發揮相異之功能已早為人所熟悉，任一者於生物體內均擔任重要的角色。有關n－3系PUFAs已知有以EPA之抗血栓作用、血清脂質改善作用、DHA之學習功能提昇作用、制癌作用為首的許多生理活性，係保持活體之恆常性所必需。如上述，動物因無法在體內合成n－3系PUFAs，故經口攝取n－3系PUFAs乃非常重要。
如上述，為合成最近指出重要性之n－3系PUFAs，必須從脂肪酸之甲基計數而於第3位與第4位、亦即ω3位與ω4位之間形成不飽合鍵，而具有生成ω3不飽和脂肪酸之活性的ω3脂肪酸不飽和化酵素係為必要。此ω3脂肪酸不飽和化酵素基因至今係以高等植物、綠藻、綠蟲、卵菌類、子囊菌類等進行選殖(例如參照日本特開2001－95588公報(平成13年(2001)4月10日公開)、國際公報第WO03/064596號手冊(平成15年(2003)8月7日公開)、Science 258：1353－1355(1992)、Biosci.Biotechnol.Biochem.66：1314－1327(2002)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：1142－1147(1997)、Biochemistry 39：11948－11954(2000)、Biochem.J.378：665－671(2004)、Micro biology 150：1983－1990(2004)、Biochem.Biophys.Res.Commun.150：335－341(1988))。
日本特開2001－9558813公報、Science 258：1353－1355(1992)、Biosci.Biotechnol.Biochem.66：1314－1327(2002)中指出以高等植物或綠藻之ω3脂肪酸不飽和化酵素基因編碼的蛋白質，係具有將如亞麻油酸(18：2)之碳數18的n－6系脂肪酸轉換成n－3系之α－次亞麻油酸(18：3)的活性。但以高等植物或綠藻之ω3脂肪酸不飽和化酵素基因編碼的蛋白質，係不能將碳數20的脂肪酸轉換成n－3系。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：1142－1147(1997)、Biochemistry 39：11948－11954(2000)中指出以線蟲(Caenorhabditis elegans)的ω3脂肪酸不飽和化酵素基因(FAT－1)編碼的蛋白質，乃作用於碳數16至20的n－6系脂肪酸，於該ω3位生成不飽合鍵。但在Biochemistry 39：11948－11954(2000)中指出當以酵母表現此ω3脂肪酸不飽和化酵素基因時，從n－6系之花生四烯酸(20：4)轉換為n－3系之二十碳五烯酸(EPA)(20：5)的轉換率低，不超過1.9%。
國際公報第WO03/064596號手冊、Biochem.J.378：665－671(2004)中已報告以卵菌類(Saprolegnia diclina)的ω3脂肪酸不飽和化酵素基因(SDD17)編碼之蛋白質，係作用於碳數20的n－6系脂肪酸，於該ω3位生成不飽合鍵。但，相對於此並無法使碳數18之n－6系脂肪酸的ω3位不飽和化。
Microbiology 150：1983－1990(2004)中已報告從屬於子囊菌之Saccharomyces kluyveri選殖ω3脂肪酸不飽和化酵素基因。以該基因編碼之蛋白質具有將n－6系的亞麻油酸(18：2)轉換成n－3之α－次亞麻油酸(18：3)的活性。但此ω3脂肪酸不飽和化酵素相對地不能使碳數20之n－6系脂肪酸的ω3位不飽和化。
脂質生產菌之高山被孢黴(Mortierella alpine)若於低溫時，已知會生成二十碳五烯酸(EPA)。亦即，以葡萄糖作為碳源而在25℃下培養M.alpine時不會生成二十碳五烯酸，但若在11℃下培養則會生成(例如參照Biochem.Biophys.Res.Commun.150：335－341(1988))。由此顯示在低溫下有表現誘導或活性化基因之ω3脂肪酸不飽和化酵素的存在。
對於許多被孢黴(Mortierella)亞屬的菌株，已知在低溫下培養時，於菌體內蓄積二十碳五烯酸。其時，因二十碳五烯酸(EPA)以外之n－3系脂肪酸未被檢出，而咸認在低溫條件下藉由使花生四烯酸之ω3位不飽和化而生成二十碳五烯酸(EPA)(參照J Am Oil Chem Soc 60，1455－1459(1988))。由此事實而強烈地暗示有使碳數20的脂肪酸不飽和化的ω3脂肪酸不飽和化酵素存在。
如上述般，已報告ω3脂肪酸不飽和化酵素基因至今係以高等植物、綠藻、綠蟲、卵菌類、子囊菌類等進行選殖。然而，至今所報告之ω3脂肪酸不飽和化酵素基因其可使ω3不飽和化之基質係受限於特定碳數之脂肪酸，或，即使導入於宿主細胞而表現者亦有不飽和化效率惡化等問題。若能取得作用於更廣範圍的脂肪酸，且效率佳，而於其ω3位生成不飽和鍵之ω3脂肪酸不飽和化酵素基因，即可更有效率地合成多種類之ω3系脂肪酸。
以真菌類惟一選殖之源自S.Kluyveri的ω3脂肪酸不飽和化酵素，係無法使碳數20的脂肪酸不飽和化。相對的，如上述般，在被孢黴(Mortierella)亞屬的菌株中，顯示有使碳數20的脂肪酸不飽和化的ω3脂肪酸不飽和化酵素之存在，但仍未取得該ω3脂肪酸不飽和化酵素基因。咸認即使使用藉由比較此類已知ω3脂肪酸不飽和化酵素的序列所設計之縮聚引子等，要選殖源自M.alpina之ω3脂肪酸不飽和化酵素基因亦很困難。
本發明係有鑑於上述之問題點而構成者，其目的在於提供一種作用於更廣範圍的脂肪酸，而且，具有效率佳，而於其ω3位生成不飽和鍵之ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽、以及編碼該多肽之聚核苷酸。
本發明人等為解決上述課題，經專心研究之結果，由於在於真菌類選殖唯一ω3脂肪酸不飽和化酵素基因之S.Kluyveri(克魯弗酵母)中，(i)源自該S.Kluyveri的ω3脂肪酸不飽和化酵素之胺基酸序列乃與S.Kluyveri本身的△1 2
脂肪酸不飽和化酵素相同性最高(60%)、(ii)S.Kluyveri之ω3脂肪酸不飽和化酵素之胺基酸序列係與源自M.alpina的△1 2
脂肪酸不飽和化酵素相同性亦高(38.6%)(Microbiology 150：1983－1990(2004))，因而推定即使在M.alpina中，ω3脂肪酸不飽和化酵素與△1 2
脂肪酸不飽和化酵素的胺基酸序列之相同性可能甚高。於是，比較M.alpina的△1 2
脂肪酸不飽和化酵素、S.Kluyveri的△1 2
脂肪酸不飽和化酵素及S.Kluyveri之ω3脂肪酸不飽和化酵素之推定胺基酸序列而設計引子，使用此，藉PCR(聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction))而成功取得M.alpina之ω3脂肪酸不飽和化酵素基因。又，發現使所得到之ω3脂肪酸不飽和化酵素基因實際上在生物體表現時，亦作用於碳數18及20之n－6系脂肪酸的任一者，而且效率佳，且於其ω3位可生成不飽合鍵，終於完成本發明。
亦即，本發明之多肽係具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽，其特徵在於以下之(a)或(b)：(a)由序列編號：1所示之胺基酸序列所構成的多肽；(b)由序列編號：1所示之胺基酸序列中，1個或複數個胺基酸係被取代、欠缺、插入、或附加之胺基酸序列所構成的多肽。
若依據上述構成，本發明之多肽係可催化ω3不飽和脂肪酸合成反應。
本發明之抗體其特徵在於與上述多肽結合。
若依據上述構成，本發明之抗體可鑑定表現具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的生物體或其組織或細胞。
本發明之聚核苷酸其特徵為編碼上述多肽。
本發明之聚核苷酸係編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的聚核苷酸，而宜為下述之(c)、(d)、(e)或(f)之任一者：(c)由序列編號：2或3所示之鹼基序列所構成的聚核苷酸；(d)由序列編號：2所示之鹼基序列中之第14號至第1366號的鹼基序列所構成的聚核苷酸；(e)與序列編號：2或3所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的聚核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的聚核苷酸；(f)與序列編號：2所示之鹼基序列中之第14號至第1366號的鹼基序列互補的鹼基序列所構成的聚核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的聚核苷酸。
若依據上述構成，在轉形株(transformant)中，為合成具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽，可使用上述聚核苷酸。
本發明之載體(vector)其特徵為含有上述聚核苷酸。
若依據上述構成，將上述聚核苷酸導入生物或細胞內而重組並表現具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽，或使用無細胞蛋白質合成系即可合成具有ω3脂肪酸不飽和化活性的多肽。
本發明之轉形株其特徵係導入上述聚核苷酸。上述轉形株宜為真菌(酵母、絲狀菌等)、動物、或植物或其後代、或源自此等之細胞或組織，上述植物宜為大豆、油菜仔、芝麻、橄欖、亞麻仁、玉蜀黍、向日葵、或紅花等。本發明之轉形株以可改變脂肪酸組成者為佳。
本發明之上述多肽的生產方法其特徵在於：使用上述載體。本發明之上述多肽的生產方法亦可為使用上述轉形株者。
若依據上述構成，可以低成本且對環境低負荷的條件下提供催化ω3脂肪酸不飽和反應之多肽。
本發明之脂肪酸的生產方法其特徵在於使用上述轉形株。
本發明之上述多肽的生產方法係使導入上述多肽之轉形株從培養開始或以最適培養溫度培養以後以低於最適培養溫度的溫度進行培養，而生產多肽；或，將上述多肽的合成系置於0℃以上、20℃以下之溫度條件，即可生產上述多肽。低於上述最適培養溫度的溫度可為0℃以上、20℃以下。
本發明之脂肪酸的生產方法係以包含將導入上述聚核苷酸之生物或細胞從培養開始，或最適培養溫度培養以後，以低於最適培養溫度的溫度進行培養，而生產脂肪酸者為佳。低於上述最適培養溫度的溫度係以0℃以上、20℃以下為佳。
若依上述構成，可更有效率且充分發揮催化ω3脂肪酸不飽和化反應之多肽之機能。是故，可有效率佳地生產ω3位不飽和化之脂肪酸。
上述脂肪酸的生產方法係以上述脂肪酸為α－次亞麻油酸(ALA)、十八碳四烯酸、20：4△8 ， 1 1 ， 1 4 ， 1 7
或二十碳五烯酸(EPA)為佳。
本發明之食品或工業製品其特徵在於：含有藉上述脂肪酸生產方法所得之α－次亞麻油酸(ALA)、十八碳四烯酸、20：4△8 ， 1 1 ， 1 4 ， 1 7
或二十碳五烯酸(EPA)。
若依上述構成，n－3系之PUFAs因具有抑制過敏、炎症、血液凝固或血管收縮的作用，而可有效地利用來作為食品或工業製品。
取得本發明具有ω3脂肪酸不飽和化活性的聚核苷酸之方法，其特徵在於包含如下步驟：從由生物所調製之基因組DNA或cDNA，藉由(g)以與上述聚核苷酸在嚴格的條件下可進行雜交之聚核苷酸或為其片段之寡核苷酸作為探針進行雜交；或，(h)使用上述聚核苷酸之片段的寡核苷酸作為引子進行PCR；而取得編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性的多肽之聚核苷酸之步驟。
若依上述構成，可有效率地取得編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的聚核苷酸。
又，本發明之聚核苷酸係亦可為上述(c)、(d)、(e)或(f)之任一聚核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的聚核苷酸。
若依上述構成，使用上述聚核苷酸作為反義(antisense)聚核苷酸，可控制在上述生物體或其組織或細胞中具有ω3脂肪酸不飽和化活性的多肽之表現。又，若為使編碼上述(a)及(b)之多肽的聚核苷酸、及若上述(c)至(f)的聚核苷酸同時地在同一細胞內表現，則會產生RNAi。因此，可抑制多肽之表現。
本發明之聚核苷酸亦可為上述聚核苷酸的片段。
若依上述構成，上述寡核苷酸係可利用做為檢測編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽之聚核苷酸的雜交探針或用以增幅該聚核苷酸的引子。此外，若使用上述寡核苷酸，則可鑑定表現具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的生物體或其組織或細胞。又，使用上述寡核苷酸作為反義寡核苷酸，可控制上述生物體或其組織或細胞中具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的表現。
本發明之檢測器具其特徵在於：與上述(c)、(d)、(e)或(f)之任一聚核苷酸於嚴格的條件下進行雜交的聚核苷酸及/或該核苷酸之片段的上述寡核苷酸係於基板上固定化。
若依上述構成，可檢測與該聚核苷酸或寡核苷酸雜交的聚核苷酸，而可容易的檢測出表現具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的生物。
本發明之檢測器係亦可為上述多肽係固定化於基板上者。
若依上述構成，檢測出與上述多肽相互作用之物質，而可容易地檢測出調節上述多肽的ω3脂肪酸不飽和化活性之物質。
本發明之檢測器係亦可為上述抗體係固定化於基板上者。
若依上述構成，檢測出與上述抗體結合之抗原，而可容易地檢測出具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽。
又，在本發明中，具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽，亦包含：具有與序列編號：1所示之胺基酸序列相同性為70%以上的胺基酸序列的多肽、及具有與序列編號：1所示之胺基酸序列相同性90%以上的胺基酸序列的多肽。
本發明之多肽係可於真菌(酵母、絲狀菌等)或植物等生物中催化使內在性脂肪酸進行ω3不飽和化之反應，故若使用含有導入編碼本發明之多肽的聚核苷酸之重組表現載體的轉形株，則以低成本且對環境低負荷的生產製程，即可大量調製α－次亞麻油酸(ALA)、十八碳四烯酸、20：4△8 , 1 1 , 1 4 , 1 7
、二十碳五烯酸(EPA)等n－3系脂肪酸。此外，本發明係可藉由大量調製α－次亞麻油酸(ALA)、十八碳四烯酸、20：4△8 , 1 1 , 1 4 , 1 7
、二十碳五烯酸(EPA)等n－3系脂肪酸而提供廉價之食品或工業製品。
以下，詳述有關本發明具有ω3脂肪酸不飽和化活性的多肽、編碼該多肽之聚核苷酸、及此等之利用。
(1)多肽本發明之多肽係新穎之ω3脂肪酸不飽和化酵素，使脂肪酸之ω3位不飽和化，而生成n－3系脂肪酸。本發明之多肽只要為具有使脂肪酸之ω3位不飽和化的活性者即可，並無特別限定，但就作為ω3脂肪酸不飽和化對象的基質，以具有使碳數18及/或20之脂肪酸的ω3位不飽和化之活性者為佳。以具有使碳數18及20之脂肪酸的ω3位不飽和化之活性者更佳。藉由可使作為ω3位不飽和化基質之對象的範圍廣，而可生成多樣之n－3系脂肪酸。
成為基質之脂肪酸，可為飽和脂肪酸，亦可為不飽和脂肪酸，但以不飽和脂肪酸更佳，最宜為n－6系脂肪酸。藉由使n－6系脂肪酸之ω3位不飽和化，而可生成在生物體內發揮重要角色之PUFAs。
本發明之多肽以具有使作為基質之脂肪酸n－6系脂肪酸之ω3位不飽和化之活性者為佳，此種脂肪酸，只要為於n－6位具有不飽和鍵之脂肪酸，其雙鍵之數目或位置並無特別限定。其中，本發明之多肽以具有使亞麻油酸、γ－次亞麻油酸、高二碳－γ－次亞麻油酸、花生四烯酸之ω3位不飽和化之活性者尤佳。認為可藉此使ω3位不飽和化，而從亞麻油酸合成α－次亞麻油酸、從γ－次亞麻油酸合成十八碳四烯酸、從高二碳－γ－次亞麻油酸合成20：4△8 , 1 1 , 1 4 , 1 7
，從花生四烯酸合成二十碳五烯酸。所得到之n－3系PUFAs係具有抑制過敏、炎症、血液凝固或血管收縮的作用，因而可有效的利用作為食品或工業製品。
在本說明書中使用時，用語「多肽」可與「肽」或「蛋白質」交換使用。又，多肽之「片段」係意指該多肽之部分片段。本發明之多肽係可從天然供給源單離，亦可化學合成。
用語「經分離」之多肽或蛋白質係意指從其天然的環境所取出之多肽或蛋白質。以宿主細胞中表現之重組產生之多肽及蛋白質認為係藉由任意的適當技術而實質上精製之天然或重組的多肽及蛋白質同樣經單離者。
本發明之多肽包含從天然之精製產物、化學合成程序的產物、及原核生物宿主或真核生物宿主(例如包含細菌、真菌(酵母、絲狀菌等)、高等植物細胞、昆蟲細胞、及哺乳動物細胞)藉重組技術所產生之產物。依存於重組產生程序中所使用之宿主，本發明之多肽可為糖苷化、或非糖苷化者。本發明之多肽於某些情形下，就宿主媒介製程的結果，可含有開始之改變蛋氨酸殘基。
本發明係提供具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽。在一實施形態中，本發明之多肽係由序列編號：1所示之胺基酸序列所構成的多肽，或由序列編號：1所示之胺基酸序列所構成的多肽之突變體且具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽。
突變體可舉例如包含缺失、插入、逆轉、反覆、及取代之突變體。尤其，在多肽中之「中性」胺基酸取代一般係大致不影響其多肽之活性。
多肽之胺基酸序列中的一些胺基酸不會有意義地影響此多肽之構造或功能，而可容易地改變，係於該領域中所公知。此外，不僅人為的改變，在天然之蛋白質中，存在有不會使該蛋白質的構造或功能有意義的變化之突變體亦為公知。
熟悉此技藝者使用習知技術而於多肽之胺基酸序列中可容易地使1或複數個胺基酸突變。例如，依公知之點突變導入法，即可使編碼多肽之聚核苷酸的任意鹼基突變。設計對應於編碼多肽之聚核苷酸之任意部份的引子即可製作缺失突變體或附加突變體。若使用本說明書中記載之方法，可容易地決定是否所製作之突變體具有所希望的活性。
本發明之突變體並無特別限定，但宜為不使本發明之多肽活性改變之突變。具體上，可舉例同義突變(silent mutation)或保存性取代等。
觀察代表性保存性取代時，係脂肪族胺基酸Ala、Val、Leu、及Ile之中的一個胺基酸取代為另一胺基酸；羥基殘基Ser及Thr之交換、酸性殘基Asp及Glu的交換、醯胺基殘基Asn及Gln之間的取代、鹼性殘基Lys及Arg之交換、以及芳香族殘基Phe、Tyr之間的取代。同義取代係即使胺基酸經取代、添加或缺乏，亦為對多肽活性無影響之突變。
如上述詳細所示般，關於任一胺基酸之變化係無義狀表現型(亦即，似不像具有對於功能有意義地損害之效果)之進一步指引記載於Bowie,J.U.等人「Deciphering.the Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino Acid Substitutions」，Science 247：1306－1310(1990)(於本說明書中引用作為參考)。
本實施形態之多肽係具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽，其係以由如下列序列所構成之多肽為佳：(a)序列編號：1所示之胺基酸序列；或(b)於序列編號：1所示之胺基酸序列中，1個或複數個胺基酸被取代、欠缺、插入、或附加之胺基酸序列。
上述「1個或複數個胺基酸被取代、缺乏、插入、或附加」係意指藉由部位專一性突變誘發法等公知的突變多肽製作法，使可取代、缺乏、插入、或附加之程度的數目(宜為10個以下，更宜為7個以下，最宜為5個以下)之胺基酸被取代、缺乏、插入、或附加。如此之突變多肽係如上述般，並非僅限定於藉公知之突變多肽製作法具有人工導入之突變的多肽，亦可為天然存在之多肽經單離精製者。
在本發明中亦包含具有與序列編號：1所示之胺基酸序列之相同性為70%以上，宜為90%以上之胺基酸序列，亦具有ω3脂肪酸不飽和化活性的多肽。此種多肽中的胺基酸序列之相同性只要為70%以上即可，但宜為90%以上，更宜為95%以上，最宜為98%以上，尤宜為99%以上。
又，在本說明書中之上述「相同性」係意指依BLAST(Basic Local alignment Search tool；Altschul,S.F.et al,J.Mol.Biol.,215,403－410,1990)檢索所得到之值，胺基酸序列之相同性可依BLAST檢索計算法決定。具體上，係使用BLAST包裝(sgi32bit版，ver.2.0.12；從NCBI獲得)之b12seq程式(Tatiana.A.Tatusora及Thomas L.Madden,FEMS Microbiol.Lett.,174,247－250 1999)，可依預設參數(default parameter)而算出。
就雙序列比對參數而言，使用程式「blastp」，以Gap插入Cost值作為「O」，以Gap伸長cost值作為「O」，以「SEG」作為Query序列之過濾器，使用「BLOSUM62」作為Matrix。
又，本發明之多肽若為胺基酸進行肽結合之多肽即可，但不限於此，亦可為含有多肽以外之構造的複合多肽。在本說明書中使用時，「多肽以外之構造」可舉例糖鏈或異戊間二烯基等，惟亦無特別限定。
本發明之多肽亦可為含有附加之多肽者。附加之多肽可舉例如His或Myc、Flag等之抗原決定區(epitope)標識多肽。
在其他之實施形態中，本發明之多肽係可以如融合蛋白質經改變之形態重組表現。例如本發明之多肽的附加胺基酸、尤其是荷電性胺基酸之區域為了改善精製期間或繼續操作及保存期間的安定性及持續性，可附加於多肽之N末端。
本實施形態之多肽係例如可將編碼使融合之多肽容易精製之肽的序列即標記標識(tag序列或記號(marker)序列)附加於N末端或C末端。此種序列可於多肽之最終調製前除去。在本發明該情況的特定較佳實施樣式中，標記胺基酸序列係六－組氨酸肽(hexa－histidine peptide)(例如pQE載體(Qiagen,Inc,)所提供之標記)，其他之中其等之許多係可公開地及/或商業地獲得。例如，在Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci,USA 86；821－824(1989)(在本說明書中引用作為參考)所記載般，六組氨酸係提供融合蛋白質之簡單精製。「HA」標記係對應於源自流感紅血球凝集素(HA)蛋白質之抗原決定區的精製有用之另一肽，其係依Wilson等人，Cell 37：767(1984)(在本說明書中引用作為參考)之記載。其他之該類融合蛋白質係含有於N或C末端與Fc融合之本實施形態之多肽或其片段。
又，本發明之多肽係將後述之本發明的聚核苷酸(編碼本發明之多肽的基因)導入於宿主細胞，而可為使該多肽於細胞內表現之狀態，亦可為從細胞、組織等經單離精製之情況。又，本發明之多肽亦可為化學合成者。
重組生成係可使用該領域公知之方法實施，例如，可使用如以下詳述之載體及細胞進行。
合成肽係可使用化學合成之公知方法合成。例如可使用Houghten,R.A.,Proc.Natl.Acod.Sci.USA 82：5131－5135(1985)(在本說明書中引用作為參考)之方法。此「Simultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)」製程另記載於Houghten等人(1986)之美國專利第4,631,211號。於此程序中，用於各種肽之固相合成的各個樹脂係包含於各別之溶劑穿透性封包(packet)，可使固相法相關之許多同一反覆步驟達到最適使用。完全之操作手冊程序係可同時進行500至1000以上之合成(Houghten等人，同前，5134)。此等文獻係在本說明書中引用作為參考。
如下述詳細記載般，本發明之多肽係可用於使脂肪酸之ω3不飽和化而生成n－3系脂肪酸的方法及組套(kit)。
如此地，本發明之多肽係可謂只要至少含有序列編號：1所示之胺基酸序列即可。亦即，序列編號：1所示之胺基酸序列與具有特定功能(例如，標記)之任意的胺基酸序列所構成之多肽亦包含於本發明中。又，序列編號：1所示之胺基酸序列及該任意之胺基酸序列若不阻礙其各別之功能亦可以適當的連接肽進行連結。
(2)聚核苷酸本發明係提供編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之本發明多肽之聚核苷酸。在本說明書中使用時，用語「聚核苷酸」可與「核酸」或「核酸分子」交換使用，意指核苷酸之聚合物。在本說明書中使用時，用語「鹼基序列」可與「核酸序列」或「核苷酸序列」交換使用，而表示去氧核苷酸(省略A、G、C及T)之序列。又，「含有序列編號：2所示之鹼基序列的聚核苷酸或其片段」係意指含有依序列編號：2之各去氧核苷酸A、G、C及/或T所示之序列的聚核苷酸或其片段部分。
本發明之聚核苷酸係可以RNA(例如mRNA)的形態、或DNA之形態(例如cDNA或基因組DNA)存在。DNA可為二條鏈或一條鏈。一條鏈DNA或RNA係可為編碼鏈(亦已知作為有義鏈(sense chain))，或其係可為非編碼鍵(亦已知作為無義鏈(antisense chain))。
在本說明書中使用時，用語「寡核苷酸」係意指核苷酸數個乃至數十個結合者，可與「聚核苷酸」交換使用。寡核苷酸係短者稱為二核苷酸(二聚體)、三核苷酸(三聚體)，長者係如所謂30體或100體般表示聚合之核苷酸的數目。寡核苷酸係可生成為更長之聚核苷酸的片段，亦可為化學合成。
本發明之聚核苷酸的片段係只要依PCR或探針等之用途而適當選擇較佳的大小即可，以至少12nt(核苷酸)為佳，更宜為至少15nt以上，又更宜為15至25nt的範圍內，可為30nt以上，亦可為40nt以上，並無特別限定。依至少20nt長度的片段，例如選擇含有序列編號：2或3所示之鹼基序列的20以上之連續的鹼之片段。若參照本說明書，因可提供序列編號：2或3所示之鹼基序列，而熟悉此技藝者可容易地製作依序列編號：2或3之DNA片段。例如，以限制性核酸內切酶切斷或以超音波之剪斷係可容易地使用於製作各種大小之片段。或，如此之片段可用合成法製作。適當的片段(寡核苷酸)係依Applied Biosystems Incorporated(ABI，850 Lincoln Center Dr.,Foster City CA,CA 94404)392型合成器等而合成。
本發明之聚核苷酸係可於其5’側或3’側與編碼上述標記標識(Tag序列或記號序列)的聚核苷酸融合。
本發明係進一步關於編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的聚核苷酸之突變體，突變體係如天然之等位基因(allelomorph)突變體般，可天然產生。依據「等位基因突變體」係指占有生物之染色體上的特定基因座的基因之數個為可交換形態之一者。天然不存在之突變體係例如使用該領域公知之突變誘發技術即可生成。
如此之突變體係可舉例在編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的聚核苷酸之鹼基序列中，1或複數個鹼基為缺失、取代或附加之突變體。突變體係可在編碼或非編碼區、或其兩者中突變。在編碼區之突變可產生保存性或非保存性之胺基酸缺失、取代或附加。
本發明係進一步提供一種經單離之聚核苷酸，其係於嚴格的雜交條件下，含有編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的聚核苷酸或與該聚核苷酸雜交之聚核苷酸。
在另一實施形態中，本發明之聚核苷酸係編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的聚核苷酸，且宜為如下之任一者：(a)編碼由序列編號：1所示之胺基酸序列所構成的多肽之聚核苷酸；或(b)編碼於序列編號：1所示之胺基酸序列中，1個或複數個胺基酸係被取代、欠缺、插入、或附加之胺基酸序列所構成的多肽之聚核苷酸。
在其他之實施形態中，本發明之聚核苷酸係編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的聚核苷酸，而宜為下述之(c)、(d)、(e)或(f)之任一者：(c)由序列編號：2或3所示之鹼基序列所構成的聚核苷酸；(d)由序列編號：2所示之鹼基序列中第14號至第1366號的鹼基序列所構成的聚核苷酸；(e)與序列編號：2或3所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的聚核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的聚核苷酸；(f)與序列編號：2所示之鹼基序列中由第14號至第1366號的鹼基序列互補的鹼基序列所構成的聚核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的聚核苷酸。
又，所謂上述「嚴格條件」係意指僅於至少90%以上之同一性，較佳係至少95%以上之同一性、最佳係97%之同一性存在於序列間時方產生雜交。
上述雜交係以Sambrook等人，Molecular Coloning；A Laboratory Manual，2d Ed，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)所記載之方法之公知的方法進行。一般，溫度愈高，鹼濃度愈低，嚴格性變高(很難雜交)，可取得更相同之聚核苷酸。雜交之條件係可適宜使用以往公知的條件，無特別限定，但可舉例如42℃、6×SSPE、50%甲醯胺、1%SDS、100μg/ml、鮭魚精子DNA、5×丹哈特(Denhardt)液(但，1×SSPE；0.18M氯化鈉、10mM磷酸鈉、pH7.7、1mM EDTA。5×丹哈特(Denhardt)液；0.1%牛血清白蛋白、0.1%聚蔗糖(Ficoll,蔗糖與環氧氯丙烷之共聚物)、0.1%聚乙烯吡咯烷酮)。
此外於其他實施形態中，本發明之聚核苷酸係以與上述(c)、(d)、(e)或(f)之任一聚核苷酸於嚴格的條件下雜交之聚核苷酸為宜。
在另一實施形態中，本發明之聚核苷酸係以上述聚核苷酸片段之寡核苷酸為宜。
本發明之聚核苷酸或寡核苷酸，係不僅包含雙鏈DNA，亦包含構成其有義(sense)鏈及反義鏈之各1條鏈DNA或RNA。本發明之聚核苷酸或寡核苷酸可使用作為以反義RAN機構表現基因操作用之工具。
反義RAN技術係以導入生成對標的基因為互補之RAN轉錄體的嵌合基因(chimera gene)作為基本原理。其結果所得到之表現型係源自內因性基因之基因產物的減少。藉由導入本發明之聚核苷酸或寡核苷酸而使具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽含量降低，俾可降低生物中之n－3系酸含量。可同時防止成為基質之脂肪酸含量降低。
因此，例如欲產生花生四烯酸類之n－6脂肪酸時，藉降低具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的含量，即可防止因ω3不飽和化引起之花生四烯酸含量的降低。於DNA中含有例如經選殖(cloning)或化學合成技術或其等之組合所得之cDNA或基因組DNA等。進而，本發明之聚核苷酸或寡核苷酸亦可為含有非轉譯區(UTR(un－translated region))序列或載體序列(包含表現載體序列)等序列者。
藉RNA干擾(RNAi)亦可抑制多肽之表現。RNAi係將雙鏈RNA導入細胞內，在細胞內，與該雙鏈RNA之序列相同的mRNA分解，而抑制基因表現之現象。使用此方法，亦可藉降低具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的含量，而降低生物中n－3系酸含量。可同時防止成為基質之脂肪酸含量的降低。具體而言，若欲使編碼上述(a)，(b)之多肽的聚核苷酸，及上述(c)至(f)之聚核苷酸同時在同一細胞內表現，則會產生RNAi。因此，可抑制多肽之表現。
取得本發明之聚核苷酸或寡核苷酸之方法，可列舉如依公知之技術，單離並選殖含有本發明之聚核苷酸或寡核苷酸之DNA片段的方法。例如，調製與本發明聚核苷酸的鹼基序列之一部份進行專一性雜交之探針，並篩檢基因組DNA庫或cDNA庫即可。此種探針若為對本發明之聚核苷酸的鹼基序列或其互補序列之至少一部份可進行專一性雜交之探針即可，亦可使用任一序列及/或長度者。
或，就取得本發明之聚核苷酸的方法，可舉例如使用PCR等增幅手段的方法。例如，本發明之聚核苷酸的cDNA中，從5’側及3’側之序列(或其互補序列)之中分別調製引子，使用此等引子使基因組DNA(或cDNA)等形成鑄模而進行PCR等，使包夾於兩引子間之DNA區域增幅，即可大量取得含本發明之聚核苷酸的DNA片段。
用以取得本發明之聚核苷酸之供給源並無特別限定，除了於碳數18及20之n－6位具有不飽和鏈的脂肪酸外，宜為含此等脂肪酸的ω3位經不飽和化之脂肪酸的生物材料。在本發明中使用時，用語「生物材料」係意指生物學之試樣(從生物體所得到之組織試樣或細胞試樣)。例如，α－次亞麻油酸被認為係從亞麻油酸藉ω3不飽和化反應而生成，十八碳四烯酸被認為係從γ－次亞麻油酸藉ω3不飽和化反應而生成，20：4ρ8 , 1 1 , 1 4 , 1 7
被認為係從高二碳－γ－次亞麻油酸藉ω3不飽和化反應而生成，二十碳五烯酸被認為係從花生四烯酸藉ω3不飽和化反應而生成，因而若為含有此等之基質－生成物對的全部或一部分的生物材料，即可取得編碼催化n－3系脂肪酸之合成反應的多肽之聚核苷酸。在後述之實施例中，係使用Mortierella alpina作為上述供給源，但不限定於此。
又，本發明之目的在於提供一種編碼具有碳數18及/或20之脂肪酸的ω3位不飽和化活性的多肽之聚核苷酸、及與該聚核苷酸進行雜交之聚核苷酸，其並不存在於本發明中具體記載之聚核苷酸及寡核苷酸的製作方法等。因此，依上述各方法以外之方法所取得的編碼具有碳數18及/或20之脂肪酸的ω3位不飽和化活性的多肽之聚核苷酸，必須注意亦屬於本發明之技術範圍內。
(3)抗體本發明係提供一種與具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽專一性結合的抗體。在本說明書中使用時，用語「抗體」係意指免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及此等之Fab片段、F(ab’)2
片段、Fc片段)，可例舉如多株抗體、單株抗體、單鍵抗體、抗遺傳型(anti－idio type)抗體及人體化抗體，但不限於此等。本發明之抗體係可用於選擇可表現具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的生物材料。
「抗體」係依各種公知的方法(例如，Harlow等人，「Antibodies：A laboratory manual，Cold．Spring Habor laboratory，New York(1988)」、岩崎等人，「單株抗體、融合瘤與ELISA、講談社(1991)」)即可製作之。
肽抗體係可依該領域公知的方法製作。例如，參照Chow,M等人、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：910－914及Bittle,F.J.等人、J.Gen.Virol.66：2347－2354(1985)(本說明書中引用作為參考)。一般而言，動物可藉游離肽而免疫化。但，抗肽抗體力價可藉由使肽與高分子擔體(carrier)(例如，KLH鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanine)或破傷風類毒素(toxoid))偶合而追加免疫。例如，含有半胱氨酸之肽係使用如間馬來醯亞胺苯甲醯基－N－羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)之連接體(linker)而偶合於擔體，另外，其他之肽係使用如戊二醛之更一般的連結劑而偶合於擔體。如兔子、大鼠、及老鼠之動物係藉由將游離肽或擔體－偶合肽之任一者，例如含約100μg肽或擔體蛋白質及Freund的佐劑之乳液，注射於腹腔內及/或皮內而免疫化。因一些追加免疫注射係提供例如使用吸附於固體表面之游離肽而藉ELISA分析可檢測出之有用力價之抗肽抗體，故必須間隔約2週。來自免疫化動物之血清中的抗肽抗體的力價，可藉抗肽抗體的選擇，例如藉由於該領域公知之方法可增加被固體支撐體上之肽吸附及經選擇之抗體之溶出。
使用於本說明書時，用語「與具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽專一性結合之抗體」係意指含有可專一性地結合於具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽抗原的完全抗體分子及抗體片段(例如Fab及F(ab’)2
片段)。Fab及F(ab’)2
片段係欠缺完全抗體之Fc部分，藉循環而進一步迅速地被除去，而幾乎不可能有完全抗體之非專一性組織結合(Wahl等人、J.Nucl.Med.24；316－325(1983)(本說明書中引用作為參考)。因此，宜為此等之片段。
再者，可結合於與具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的肽抗原之更進一步之抗體，乃經由抗遺傳型抗體的使用而以二步驟程序即可產生。如此之方法係使用抗體其本身為抗原之事實，因此，可得到結合於二次抗體之抗體。依此方法，與具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽專一性結合之抗體係可用於使動物(較佳係老鼠)免疫。然後，此類動物的脾細胞可用於產生融合瘤細胞，繼而，融合瘤細胞係具有與具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽專一性結合之抗體相結合的能力，乃可藉具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽抗原而產生可被阻斷之抗體的純系(clone)，鑑定該株而被篩檢。如此之抗體係含有對於與具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽專一性結合之抗體的抗遺傳性抗體，繼而，因進一步誘導形成與具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽專一性結合之抗體，而可用於使動物免疫。
Fab及F(ab’)2
以及本發明之抗體的其他片段，係可依本說明書中所揭示之方法而使用已很清楚。此類片段代表性者係藉由使用如木瓜酶(產生Fab片段)或胃蛋白酶(產生F(ab’)2
片段)類酵素的蛋白質分解而切斷所產生的。或，具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽結合片段係可依重組DNA技術的適用或合成化學而產生。
如此，本發明之抗體係可謂只要至少具備辨識具有本發明之ω3脂肪酸不飽和化活性的多肽之抗體片段(例如Fab及F(ab’)2
片段)即可。亦即，辨識具有本發明之ω3脂肪酸不飽和化活性的多肽之抗體片段、與相異抗體分子的Fc片段所構成之免疫球蛋白應注意亦包含於本發明。
亦即，本發明之目的係提供一種可辨識具有本發明之ω3脂肪酸不飽和化活性的多肽之抗體，並未存在於本說明書中具體記載之各個免疫球蛋白的種類(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、嵌合抗體製作方法、肽抗原製作方法等。因此，依上述各方法以外所取得之抗體必須注意亦屬於本發明之技術範圍內。
(4)本發明之多肽及/或聚核苷酸之利用(4－1)載體本發明係提供用以生成具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽所使用之載體。本發明之載體係可為使用於活體外轉譯之載體，亦可為使用於重組表現之載體。
本發明之載體只要為含有上述本發明之聚核苷酸者即可，並無特別限定。例如，可例舉如插入編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽之聚核苷酸的cDNA之重組表現載體等。重組表現載體之製作方法係可舉例如使用質體、噬菌體、或黏接質體(cosmid)等之方法，並無特別限定。
載體之具體種類並特別限定，只要適當選擇在宿主細胞中可表現之載體即可。亦即，依宿主細胞之種類，而為確實地表現本發明之聚核苷酸可選擇適當之啟動子序列，以此與本發明之聚核苷酸組入於各種質體等的載體作為表現載體即可。
表現載體以含有至少一個選擇標記(marker)為佳。如此之標記可使用耐抗生物質性基因、或補充營養要求性株之標記基因(亦即，營養要求性標記)等。具體而言，例如，有關真核生物細胞培養係舉例如耐二氫葉酸還原酶或耐新霉素性等，對於大腸菌(Escherichia Coli)及其他細菌的培養可舉例如耐四環素性基因或耐氨苄青環素(ampicilin)性基因，並無特別限定。
若使用上述選擇標記，即可確認是否為本發明之聚核苷酸導入於宿主細胞。或，亦可使本發明之聚核苷酸表現作為融合肽，例如，使用源自owankurage(腔腸動物)之綠色螢光多肽GFP(Green Fluorescent Protein)作為標記，亦可使本發明之聚核苷酸表現作為GFP融合肽。藉此，可確認導入表現。
又，在植物表現時，使用重組表現載體時，於植物體之轉形(trans formation)所使用的重組表現載體，係只要為可於該植物體內表現本發明之聚核苷酸的載體即可，並無特別限定。如此之載體可舉例如：具有於植物細胞內表現構成聚核苷酸之啟動子(例如花椰菜嵌紋病毒(Cauliflower Mosaic Virus)之35S啟動子)的載體、或具有受外在刺激而誘導性活性化之啟動子的載體。
如此地，本發明之載體係可謂只要至少含有編碼本發明之多肽的聚核苷酸即可。亦即，表現載體以外之載體應注意亦包含於本發明之技術範圍。
亦即，本發明之目的在於提供一種含有編碼本發明之多肽的聚核苷酸的載體，而並未存在於本說明書中具體記載之各個載體種及生物種、以及載體製作方法及細胞導入方法。因此，使用上述以外之載體種以及載體製作方法所取得的載體必須注意亦屬於本發明之技術範圍內。
(4－2)宿主及轉形方法上述之宿主並無特別限定，可使宜以往公知之各種生物。具體言之，可舉例：大腸菌(E.coli)等細菌；酵母(出芽酵母Saccharomyces cervisiase、分裂酵母Schzosaccharomyces pombe)、絲狀菌等真菌；線蟲(Caenor habditis elegans)、非洲爪蛙(Xenopus laevis)之母卵細胞、豬、大鼠、老鼠等哺乳類、其他動物等，但並無特別限定。用於上述宿主細胞之適當培養基及條件在該領域為公知。
在本發明中成為轉形對象的植物，係意指植物體全體、植物器官(例如葉、花卉、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、篩部、軟組織、木部、維管束、柵狀組織、海綿狀組織等)或植物培養細胞、或各種形態之植物細胞(例如懸濁培養細胞)、原生質體、葉的切片、癒合組織等之任一者。轉形所使用之植物並無特別限定，而屬於單子葉植物綱或雙子葉植物綱之植物的任一者均可。
將上述表現載體導入宿主細胞之方法，亦即，轉形法亦無特別限定，可適當使用電穿孔法、磷酸鈣法、核糖體法、DEAE聚葡萄糖法、醋酸鋰法、粒子傳遞法等以往公知的方法。例如，以昆蟲轉移表現本發明之多肽時，只要使用桿狀病毒之表現系即可。
於植物之基因導入中可使用熟悉此技藝者公知之轉形方法(例如、土壤桿菌法、基因鎗、PEG法、電穿孔法等)。例如，介由土壤桿菌之方法與直接導入於植物細胞之方法為習知。使用土壤桿菌法時係將構築之植物用表現載體導入於適當的土壤桿菌(例如，土壤桿菌/根癌(Agrobacterium tumefaciens)，將該株依葉片圓盤法(內宮博文著，植物基因操作手冊，1990，27－31pp，講談社科學，東京)等而於無菌培養葉片感染，可得到轉形植物。又，可使用Nagel等人之方法(Micribiol.Lett.,67,325(1990)。此方法係首先例如將表現載體導入於土壤桿菌，然後，將經轉形之土壤桿菌以記載於Plant Molecular Biology Manual(S.B Gelvin等人，Academic Press Publishers)之方法導入於植物細胞或植物組織之方法，此處，所謂「植物組織」係含有以植物細胞培養所得到之癒合組織。使用土壤桿菌法進行轉形之情形，可使用雙位載體(pBI121或pPZP202等)又，將基因直接導入於植物細胞或植物組織之方法，已知有電穿孔法、基因鎗法。使用基因鎗時，可直接使用植物體、植物器官、植物組織本身，亦可調製切片後使用，亦可調製原生質體而使用。可使用基因導入裝置(例如PDS－1000/He(BIO－RAD公司)等)而處理如此調製之試樣。處理條件係依植物或試樣而異，但一般係在450至2000psi左右的壓力、4至12cm左右的距離實施。
導入基因之細胞或植物組織，係首先選擇耐潮霉素(hygromycin)性等之耐藥劑性，然後，依一定方法使植物體再生。從轉形細胞至植物體之再生，係依據植物細胞之種類而熟悉此技藝者可以公知之方法實施。
使用植物培養細胞作為宿主時，轉形係以基因鎗、電穿孔法等將重組載體導入於培養細胞。轉形之結果所得到的癒合組織或新芽、毛狀根等可直接使用於細胞培養、組織培養或器官培養，使用以往已知之植物組織培養法，可藉適當濃度之植物賀爾蒙(植物激素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、芸苔素內酯(brassinolide)等)之投予等而於植物體再生。
(4－3)轉形株本發明係提供一種導入編碼具有上述ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽的聚核苷酸之轉形株。此處「轉形株」係意指不僅包含細胞、組織或器官，亦包含生物個體。
轉形株之製作方法(生產方法)並無特別限定，但可舉例如將上述重組載體導入於宿主而轉形之方法。又，成為轉形對象之生物亦無特別限定，可舉例如於上述宿主所例示之各種微生物、植物或動物。
本發明之轉形株，係天然具有之脂肪酸，其組成會改變。本發明之轉形株以真菌(酵母、絲狀菌等)、植物或其後代、動物或源自此等之細胞或組織為佳，此類植物尤宜為大豆、油菜仔、芝麻、橄欖、亞麻仁、玉蜀黍、向日葵、紅花等。亦即，在本發明中轉形所使用之植物以使用油脂製造用而栽培之植物為佳。
含有編碼本發明之多肽的聚核苷酸之轉形株係可藉由將含有該聚核苷酸之重組載體以該基因可表現之方式導入於植物中而獲得。
是否已導入基因之確認可依PCR法、南方雜交法、北方雜交法等而實施。例如，從轉形株調製DNA，設計DNA專一性引子而進行PCR。PCR可使用與調製前述質體所使用的相同條件實施。其後，對於增幅產物進行瓊脂凝膠電泳、聚丙烯醯胺凝膠電泳或毛細電泳等，以溴化乙錠(Ethidium Bromide)、SYBR Green液等染色，繼而，增幅產物成為1條帶狀物而檢測出，而可確認已轉形。又，預先使用被螢光色素等標識之引子進行PCR，亦可檢測出增幅產物。此外，亦可採用使增幅產物結合於微盤等固相，而以螢光或酵素反應等確認增幅產物之方法。
若一旦得到本發明之聚核苷酸組入於基因組內之轉形株，即可藉由該生物體之有性生殖或無性生殖而得到後代。又，從該生物體或其後代、或此等之純系，而例如為植物時，可獲得種子、果實、切穗、塊莖、塊根、枝、癒合組織、原生質體等，可以此為基礎而量產該植物體。因此，本發明亦包括於可表現之方式導入本發明聚核苷酸的生物體、或具有與該生物體同一性質之該生物體的後代、或源自此等之組織。
如此，本發明之轉形株係可謂只要至少導入編碼本發明之多肽的聚核苷酸即可。亦即，藉重組表現載體以外之方法所產生的轉形株應注意亦包含於本發明之技術範圍內。
亦即，本發明之目的在於提供一種轉形株，其特徵在於：導入編碼本發明之多肽的聚核苷酸，而不存在於本說明書中具體記載之各個載體種及導入方法。因此，上述以外之載體種及生物種、以及使用載體製作方法及細胞導入方法所取得的轉形株必須注意亦屬於本發明之技術範圍內。
(4－4)多肽之生產方法本發明係提供一種生產本發明之多肽的方法。
在－實施形態中，本發明之多肽的生產方法其特徵係使用含有編碼本發明之多肽的聚核苷酸的載體。
在本實施形態中之一個情形中，本實施形態之多肽的生產方法係宜使用上述載體於無細胞蛋白質合成系。使用無細胞蛋白質合成系時，只要使用各種市售之組套(kit)即可。本實施形態之多肽的生產方法較佳係包含使上述載體與無細胞蛋白質合成系進行培養之步驟。
在本實施例另一情形中，本實施形態之多肽的生產方法係宜使用重組表現系。使用重組表現系時，可採用將本發明之聚核苷酸組入於重組表現載體後，以公知的方法導入可表現的宿主中，將在宿主內轉譯所得之上述多肽精製的方法等。重組表現載體是否為質體均可，只要可將目的聚核苷酸導入於宿主即可。本實施形態之多肽的生產方法，較佳係包括將上述載體導入於宿主之步驟者。
如此，將外來聚核苷酸導入於宿主時，表現載體係以表現外來聚核苷酸的方式於宿主內組入發揮功能之啟動子為佳。將重組而產生之多肽精製的方法，係依所使用之宿主、多肽的性質而異，但可介由標記(Tag)的利用等而可比較容易地精製目的之多肽。
本實施形態之多肽的生產方法以包括從含本發明之多肽的細胞或組織之萃取液精製該多肽的步驟。精製多肽之步驟係宜以公知的方法(例如破壞細胞或組織之後進行離心分離而回收可溶性區分的方法)從細胞或組織調製細胞萃取液後，從此細胞萃取液藉習知之方法(例如，硫銨沉澱或乙醇沉澱、酸萃取，陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、及凝集素層析而精緻之步驟為佳，但不限於此等。最佳係使用高效液體層析(「HPLC」)精製。
在另一實施形態中，本發明之多肽的生產方法其特徵為：自天然表現本發明之多肽的細胞或組織精製該多肽。本發明之多肽的生產方法係以包括使用上述抗體或寡核苷酸而鑑定天然表現本發明之多肽的細胞或組織之步驟。又，本發明之多肽的生產方法宜進一步包括精製上述多肽之步驟。
又另一實施形態中，本發明之多肽的生產方法係其特徵為化學合成本發明之多肽。而容易了解當熟悉此技藝者依據本說明書中記載之本發明的多肽之胺基酸序列，使用公知之化學合成技術，即可化學合成本發明之多肽。
如上述般，依生產本發明之多肽的方法所取得的多肽可為天然存在之突變多肽，亦可為人為製作之突變多肽。
對於製作突變多肽之方法，並無特別限定。例如藉由使用部位專一性突變誘導法(例如參照Hashimoto－Gotoh,Gene 152：271－275(1995))、利用PCR法而於鹼基序列中導入點突變以製作突變多肽之方法，或藉插入轉因子(transposone)而製作突變株之方法等的公知突變多肽製作法，而可製作突變多肽。於突變多肽之製作中亦可利用市售之組套。
如此，本發明之多肽的生產方法可謂只要依據至少具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽之胺基酸序列、或編碼具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽之聚核苷酸的鹼基序列，使用公知慣用技術即可。
亦即，本發明之目的係提供一種具有ω3脂肪酸不飽和化活性之多肽之生產方法，而包括上述各種步驟以外之步驟的生產方法必須注意亦屬於本發明之技術範圍。
(4－5)脂肪酸生產方法本發明係提供一種使用可表現本發明之多肽的生物體或細胞而生產脂肪酸的方法。上述生物體可為天然之未改變生物體，亦可為使用重組表現系之轉形株。
在一實施形態中，本發明之脂肪酸生產方法係使用以編碼本發明之多肽的聚核苷酸轉形之生物體或其組織而生產生脂肪酸。較佳係上述生物體為真菌(酵母、絲狀菌等)、植物或動物。
在本實施形態之較佳情形中，本發明之脂肪酸生產方法係包括將編碼本發明之多肽的聚核苷酸導入於上述生物體之步驟。將聚核苷酸導入於上述生物體之步驟係只要使用上述各種基因導入方法即可。在本實施形態之較佳情形中，上述生物體於轉形之前所產生的脂肪酸與轉形後所產生的脂肪酸之間其組成相異。具體而言，由上述生物體所得到之脂肪酸係例如α－次亞麻油酸、十八碳四烯酸、20：4△8 ， 1 1 ， 1 4 ， 1 7
、二十碳五烯酸等n－3系脂肪酸之含有率會增加。本實施形態之該情形的脂肪酸生產方法係以另包含從上述生物體萃取脂肪酸之步驟為佳。
例如，如上述般，含有從α－次亞麻油酸、十八碳四烯酸、20：4△8 ， 1 1 ， 1 4 ， 1 7
、及/或二十碳五烯酸之含量增加之本發明的轉形株所萃取出之脂肪酸的油，可提供作為α－次亞麻油酸、十八碳四烯酸、20：4△8 ， 1 1 ， 1 4 ， 1 7
、及/或二十碳五烯酸之含量高的食品。又，轉形植物體的情形，不限於所萃取之脂肪酸，亦可提供上述轉形植物體的種子、果實、切穗、塊莖、及/或塊根等，作為含有多量α－次亞麻油酸、十八碳四烯酸、20：4△8 ， 1 1 ， 1 4 ， 1 7
、及/或二十碳五烯酸之食品。改變脂肪酸組成之對象並無特別限定，植物以外亦可以動物、細菌、或真菌(酵母、絲狀菌等)等各種生物作為對象。
在其他實施形態中，本發明之脂肪酸生產方法係包括對天然表現本發明之多肽的上述生物體導入本發明之聚核苷酸或寡核苷酸作為無義核苷酸之步驟。於生物體導入聚核苷酸或寡核苷酸之步驟係只要使用上述無義RNA技術即可。又，亦可利用前述之RNAi的技術。
本實施形態之脂肪酸生產方法以進一步包含使用上述之抗體或寡核苷酸而鑑定天然表現本發明之多肽的上述生物體之步驟為佳。本實施形態之該情形的脂肪酸生產方法以進一步包含自上述生物體萃取出脂肪酸的步驟為佳。
在本實施形態中，上述生物體其導入上述聚核苷酸或寡核苷酸之前所產生的脂肪酸與導入後所產生的脂肪酸之間其組成相異。具體而言，由上述生物體所得到之脂肪酸係天然產生之α－次亞麻油酸、十八碳四烯酸、20：4△8 ， 1 1 ， 1 4 ， 1 7
、二十碳五烯酸等n－3系脂肪酸的含有率減少。又，此等之基質即亞麻油酸、γ－次亞麻油酸、高二碳－γ－次亞麻油酸、花生四烯酸等之含有率減少的程度變小。
如此，本發明之脂肪酸生產方法可謂若至少使用表現本發明之多肽的生物體即可。
亦即，本發明之目的係提供一種藉由以本發明之多肽改變脂肪酸組成之生物體的脂肪酸生產方法，而使用動物、植物或各種微生物作為上述生物體之生產方法必須注意亦屬於本發明之技術範圍內。
(4－6)食品及工業製品本發明係提供一種使用以上述脂肪酸生產方法所得到的脂肪酸所製造的食品及工業製品。本項中記載之食品係例如上述轉形株為植物時，可為其種子、果實、切穗、塊莖及/或塊根等，亦可為使用從上述轉形株所萃取之脂肪酸所製造的食品。又，上述轉形株為微生物時，係可為該微生物本身者，亦可為萃取物等之加工物。進一步，本發明之食品係可為上述之轉形株即動物的肉或奶。
在工業製品中，包含使用從上述轉形株所萃取之脂肪酸所製造的食物補充劑或動物用飲食補充劑。如上述般，n－3系PUFAs已知有EPA的抗血栓作用、血清脂貭改善作用、DHA之學習功能提升作用、制癌作用為代表之許多生理活性，係用以維持活體之恆常性所必須的。然而，以人為代表之動物無法在體內合成n－3系PUFAs，故經口攝取n－3系PUFAs乃非常重要。因此，來自食物之n－3系PUFAs攝取不足時，宜以食物補充劑或動物用飲食補充劑補充。從上述轉形株所萃取之脂肪酸的PUFAs可用於如上述之目的。
又，若補充從上述轉形株所萃取之n－3系PUFAs，則不僅所補充之PUFAs的含有率增加，其後續代謝產物之含有率亦增加。例如若補充α－次亞麻油酸，不僅可增加α－次亞麻油酸，亦可使二十二碳六烯酸(DHA)或前列線素等之後續產物的含有率增加。二十二碳六烯酸係乳幼兒腦部發育所必須，故從上述轉形株所萃取之脂肪酸亦可用來作為嬰兒用奶粉或嬰兒用之食物補充劑。
(4－7)檢測器具本發明係提供各種檢測器具。本發明之檢測器具係本發明之聚核苷酸或片段固定化於基板上者，或，本發明之多肽或抗體固定化於基板上者，在各種條件下，可利用於本發明之聚核苷酸及多肽之表現圖案的檢測/測定等。
於本說明書使用時，用語「基板」係意指可載持目的物(例如，聚核苷酸、寡核苷酸、多肽或蛋白質)之物質，並可與用語「支撐體」交換使用。較佳之基板(支撐體)可舉例如珠粒(例如聚苯乙烯粒)、固相(例如玻璃管、試藥薄片(strip)、聚苯乙烯製之微量滴定盤(Microtiter plate)或胺基結合型的微量滴定盤)等，但不限於此等。將目的物固定化於此等基板之方法，係熟悉此技藝者公知的，例如記載於Nature 357：519－520(1992)(於本說明書中引用作為參考)。
在一實施形態中，本發明之檢測器具其特徵為：本發明之聚核苷酸及/或寡核苷酸係固定化於基板上。在本實施例之較佳情形中，本發明之檢測器具係所謂DNA晶片。於本說明書使用時，用語「DNA晶片」係意指將所合成之寡核苷酸固定化於基板上之合成型DNA晶片，但並無特別限定，而亦包括將PCR產物等之cNDA固定化於基板上之貼黏型DNA微陣列。DNA晶片可舉例如將與本發明之基因專一性雜交之探針(亦即，本發明之寡核苷酸)固定化於基板(載持體)上之DNA晶片。
使用來作為探針之序列可依cDNA序列之中使特徵性序列特定之公知方法(例如，SAGE法(Serial Analysis of Gene Expression法)(Science 276：1268，1997；Cell 88；243，1997；Science 270：484，1995；Nature 389：300,1997；美國專利第5695937號)等，但不限於此等)而決定。
又，在DNA晶片之製造中，只要採用公知之方法即可，例如，使用合成寡核苷酸作為寡核苷酸時，係藉由微影(photolithography)技術與固相法DNA合成技術之組合，在基板上合成寡核苷酸即可。另外，使用cDNA作為寡核苷酸時，只要使用陣列機而黏貼於基板上即可。
例如，亦可配置完全配對探針(寡核苷酸)與在該完全配對探針中一鹼被取代之錯誤配對探針而更提昇寡核苷酸之檢測精度。進一步，為使相異之聚核苷酸並行檢測出，亦可使複數種寡核苷酸固定化於同一基板上而構成DNA晶片。
用於本實施形態之檢測器具的基板材質，係只要可使聚核苷酸或寡核苷酸安定並固定化即可。在上述之基板以外，可舉例如聚碳酸酯或塑膠等之合成樹脂、玻璃等，但不限於此等。基板之形態亦無特別限定，但可適宜使用例如板狀、薄膜狀等之基板。在本實施形態之較佳情形中，本實施形態之檢測器具係可使用於以從各種生物或其組織或細胞所製作之cDNA庫作為標的試樣之檢測。
在其他之實施形態中，本發明之檢測器具其特徵為：本發明之多肽或抗體係固定於基板上。在本實施形態之較佳情形中，本實施形態之檢測器具係所謂蛋白質晶片。
本實施形態之檢測器具用基板的材質，係只要可使多肽或抗體安定而固定化者即可。在上述之基板以外，可舉例如聚碳酸酯或塑膠等之合成樹脂、玻璃等，但不限於此等。基板之形態亦無特別限定，但以使用例如板狀、薄膜狀等之基板為佳。
上述方法以外之多肽或抗體固定化於基板上之方法，係可舉例如於硝基纖維素膜或PDVF聚氟化亞乙烯(polyethylidene difluoride)膜上使多肽或抗體以點墨法(dot blot)的要領進行點滴之物理吸附法、或為減輕多肽或抗體之變性，於載玻片上接合聚丙烯醯胺之墊片，再點滴多肽或抗體之方法。進而，亦可使用一種不僅使多肽或抗體吸附於基板表面，並為強固地結合，而利用醛修飾玻璃的方法(G.MacBeath，S.L.Schreiber，Science，289，1760(2000))。又，可使用使基板上之多肽的序列定向一致而固定化的方法，係介由寡組氨酸標籤，固定化於被鎳錯合物表面修飾之基板的方法(H.Zhu,M.Bilgin,R.Bangham,D.Hall,A.Casamayor,P.Bertone,N.Lan,R.Jansen,S.Bidlingmaier,T.Houfek,T.Mitchell,P.Miller,R.A.Dean,M.Gerstein,M.Snyder,Science,295,2101.(2001))。
在本實施形態之較佳情形中，本實施形態之檢測器具係可使用於以來自各種生物或其組織或細胞之萃取液作為標的試樣之檢測。
如此，本發明之檢測器具係可謂只要至少將本發明之聚核苷酸或寡核苷酸、或本發明之多肽或與該多肽結合之抗體固定化於支撐體上即可。又，本發明之檢測器具係可謂只要具備至少將本發明之聚核苷酸或寡核苷酸、或本發明之多肽或與該多肽結合之抗體固定化的基板即可。亦即，具備此等之支撐體(包含基板)以外之構成構件時，應注意亦包含於本發明之技術範圍中。
亦即，本發明之目的係提供一種器具，其係可檢測本發明之多肽或本發明之聚核苷酸或結合於本發明之抗體的多肽，而並未存在於本說明書中具體記載之各個支撐體的種類、固定化方法。因此，包含上述支撐體以外之構成構件之檢測器具係應注意亦屬於本發明之技術範圍中。
比較Mortierella alpina及Saccharomyces Kluyveri之△1 2
脂肪酸不飽和化酵素以及S.Kluyveri之ω3脂肪酸不飽和化酵素的推論胺基酸序列，設計對應於相同性高之胺基酸序列的引子。於第1圖中表示M.alpina及S.Kluy Veri之△1 2
脂肪酸不飽和化酵素以及S.Kluyveri之ω3脂肪酸不飽和化酵素的推論胺基酸序列。圖中，上段表示M.alpina之△1 2
脂肪酸不飽和化酵素的推論胺基酸序列(序列編碼：10)、中段表示S.Kluyveri之ω3脂肪酸不飽和化酵素的推論胺基酸序列(序列編號：11)、下段表示S.Kluyveri之△1 2
脂肪酸不飽和化酵素的推論胺基酸序列(序列編號：12)。設計對應於圖中之下線所示的相同性高的胺基酸序列之縮聚寡核苷酸所構成的引子ω3－F1及ω3－R1。
ω3－F1(對應之胺基酸序列：WVLAHECGH、引子係順方向)5’－TGGGTIYTBGCICAYGARTGYGGHCA－3’(序列編號：4)ω3－R1(對應之胺基酸序列：TFLQHTDPK、引子係逆方向)5’－TTIGGRTCIGTRTGYTGVARRAAIGT－3’(序列編號：5)
又，在上述引子的鹼基序列中，「I」表示肌苷，「Y」係表示T(胸線嘧啶)或C(胞嘧啶)，「B」表示G(鳥嘌呤)、C或T，「R」係表示G或A(腺嘌呤)，「H」表示A、C、或T，「V」係表示A、G或C。又，上述「I」於序列編號：4及序列編號：5中係以「n」表示。
M.alpina(1S－4株)之基因組DNA係依Sakuradani等人,1999a,△9
－Fatty acid desaturase from arachidonic acid－producing fungus、Unigue gene sequence and its heterologous expression in a fungus，Aspergillus.Eur J.Biochem 260：208－216的方法調製。
以所得到之M.alpina之基因組DNA作為鑄模，使用上述引子ω3－F1及ω3－R1進行PCR。PCR係使用ExTaq(Takara bio)，於94℃3分、(94℃ 1分、55℃ 1分、72℃ 1分)進行30循環，進行72℃ 10分之反應。PCR反應係使用含有1μg基因組DNA、0.25μl之Takara ExTaq聚合酶(Takara bio)、5μl之10×ExTag緩衝液、各200μM之dNTP、各200pmol之引子而全容積為50μl之反應混合液而進行。使PCR產物進行瓊脂凝膠電泳後，可確認出約600bp之片段1條。
在該PCR條件中，以△1 2
脂肪酸不飽和化酵素基因作為鑄模而增幅之DNA片段亦成為約600bp，故咸認在該DNA片段中源自ω3脂肪酸不飽和化酵素基因之序列與源自△1 2
脂肪酸不飽和化酵素基因之片段係混合存在。是故，於鹼基序列明確之△1 2
脂肪酸不飽和化酵素基因中以切斷1處的限制酵素KpnI分解(digest)此DNA片段，再度進行瓊脂凝膠電泳。其結果，顯示可得到原來大小之DNA片段及較其短之2條片段，而於PCR產物中表示出源自△1 2
脂肪酸不飽和化酵素之DNA片段、及與其相異之DNA片段係混合存在。
是故，PCR產物之中，精製未被KpnI分解之片段，再藉ligation high(東洋紡社製)連結於pT7Blue T－vecter(Novagen公司製)，(以後之TA cloning(選殖)亦全部相同地實施)。鹼基序列之解析係以ABI3100(Applied Biosystem公司製)進行。相同性檢索係以blastx相對於GenBank所註冊之胺基酸序列進行。其結果，與源自M.alpina(1S－4株)之△1 2
脂肪酸不飽和化酵素基因顯示最高之相同性，其區域之鹼基序列的一致性為57%。
以所得到之約600bp的鹼基序列設計以下之引子，進行Inverse PCR(逆PCR)。
ω3－IPCRR2 5’－GACCCATCCAAAGATGGTGTTGATC－3’(序列編號：6)ω3－IPCRF2 5’－GACTGTCTTCATGTACTATGGCATC－3’(序列編號：7)
首先，以EcoRI完全地分解從Mortierella alpina所調製之基因組DNA，藉ligation high(東洋紡社製)在15℃下反應一晚，藉自行黏合(self ligation)而閉環。以其作為鑄模，而使用上述引子ω3－IPCRF2及ω3－IPCRR2進行PCR。PCR之反應混合物係除了鑄模的濃度為50ng/ml以外，其餘與實施例1相同。PCR係使用ExTaq(Takara bio)，於94℃ 3分、(94℃ 1分、62℃ 2分、72℃ 3分)進行35循環，再進行72℃ 15分之反應。
所得到之3－4kb的DNA片段係與實施例1相同的方法於載體pT7Blue T－vector(Novagen公司製)進行TA選殖，從插入之約4kb的片段兩端分別決定數百bp的鹼基序列，與先前所得到之部分序列連結。該鹼基序列示於序列編號：2。從與相同序列之比較、及開始密碼或終止密碼之出現等推論ω3脂肪酸不飽和化酵素基因之編碼區域。編碼區域為14至1366，插入序列(intron)存在1處。
ω3脂肪酸不飽和化酵素係藉低溫培養而表現活性甚為明確。是故，首先，M.alpina(1S－4株)以GY液體培養基在28℃、培養7日後，12℃下培養2日，回收菌體。依據Sakuradani等人,1999a,△9
－Fatty acid desaturase from arachidonic acid－producing fungus.Unigue gene sequence and its heterologous expression in a fungus,Aspergillus.Eur J.Biochem 260：208－216的方法萃取全RNA。使用1－strand cDNA Synthesis Kit for RT－PCR(AMV)(Roche Diagnostics Corporation公司)，而以隨機六合體(random hexamer)作為引子進行1μg之全RNA之逆轉印反應，合成cDNA。以所合成之cDNA作為鑄模，使用以下之引子ω3－ExF3及ω3－ExR3進行PCR。PCR反應係使用含有1μg之鑄模cDNA、0.25μl之Takara La Taq聚合酶(Takara bio)、5μl之10×La Taq緩衝液、2mM之MgCl2
、各200μM之dNTP、各100pmol之引子的全容積50μl之反應混合液而進行。PCR之反應條件係使用94℃ 3分、(94℃ 1分、60℃ 2分、72℃ 3分)進行35循環，72℃ 15分。
ω3－ExF3：5’－CAGAGTCATAaagcttAAatgGCCCCCCCT－3’(序列編號：8)、ω3－ExR3：5’－GACgcatgcCGTATTCAAATTGttaTTAATGC－3’(序列編號：9)
又，引子ω3－ExF3係含有ATG開始部位(序列中以小寫表示)、與HindIII選殖部位aagctt(序列中以小寫表示)。又，引子ω3－ExR3係含有TAA終止部位(序列中以小寫表示)與SphI選殖部位gcatgc(序列中以小寫表示)。
所得到之DNA片段藉由與實施例1之方法相同的方法進行TA選殖於載體pT7Blue T－載體(Novagen公司製)而決定鹼基序列。所決定之cDNA的鹼基序列示於序列編號：3。cDNA的鹼基序列係與上述實施例2所決定之基因組DNA的鹼基序列(序列編號：2)之第14號的鹼至第343號的鹼之330bp及從第485號之鹼至第1366號之鹼的882bp所構成之1212bp一致。從此可知，序列編號：2所示之鹼基序列之第14號的鹼至第1366號的鹼之1353bp為ω3脂肪酸不飽和化酵素基因，又該基因係序列編號：2所示之鹼基序列之第345號的鹼至第485號的鹼之141bp所構成之插入序列，而編碼403胺基酸者。
將以該cDNA編碼之胺基酸序列與至今已知之其他生物種的ω3脂肪酸不飽和化酵素及M.alpina的△1 2
脂肪酸不飽和化酵素之胺基酸序列進行比較。於第2圖中從上段依序表示M.alpine的ω3脂肪酸不飽和化酵素(圖中表示為「MAW3」、序列編號：1)、M.alpina之△1 2
脂肪酸不飽和化酵素(圖中表示為「Mor－△12」、序列編號：10)、S.Kluyveri之ω3脂肪酸不飽和化酵素(圖中表示為「Sacw3」、序列編號：11)、大豆之小胞體局部存在之ω3脂肪酸不飽和化酵素(圖中表示為「Soybeanω3(ER)」、序列編號：13)、大豆之葉綠體局部存在之ω3脂肪酸不飽和化酵素(圖中表示為「Soybeanω3(Ch1)」、序列編號：14)之胺基酸序列。M.alpine的ω3脂肪酸不飽和化酵素之胺基酸序列係M.alpina之△1 2
脂肪酸不飽和化酵素、S.kluyveri之ω3脂肪酸不飽和化酵素、大豆之小胞體局部存在之ω3脂肪酸不飽和化酵素、大豆之葉綠體局部存在之ω3脂肪酸不飽和化酵素之胺基酸序列分別具有51%、36%、34%、32%之一致性。如第2圖所示般，M.alpine的ω3脂肪酸不飽和化酵素係ω3脂肪酸不飽和化酵素之中最類似之胺基酸序列之S.kluyveri的ω3脂肪酸不飽和化酵素亦只顯示低至36%之一致性。從此事可知，M.alpine的ω3脂肪酸不飽和化酵素與至今已知之其他生物種之ω3脂肪酸不飽和化酵素之胺基酸序列相較，其與M.alphina本身的△1 2
脂肪酸不飽和化酵素之胺基酸序列較類似。
構築用以酵母表現源自所得到之M.alpina(1S－4株)的ω3脂肪酸不飽和化酵素之cDNA之表現載體。
於實施例3所得到之DNA片段以HindIII－SphI進行處理，連結於酵母表現載體pYES2(Invitrogen公司製)的HindIII－SphI側，構築質體pYMAW3。此pYMAW3係於pYES2之HindIII－SphI側，組入ω3脂肪酸不飽和化酵素之cDNA全長的1212bp。
以此質體pYMAW3，使酵母Sacharomyces cerevisiae INVSc1(Invitrogen公司)進行轉形，得到轉形株ω3－1及ω3－2。轉形係依Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，Moore DD，Seidman JG，Smith JA，Struht k.,(1994)Transformation by electroporation.In current protocols in Molecular Biology.pp13.7.5－13.7.7.,Green Publishing Associates and Wiley－Interscience,New York之方法而使用電穿孔法而進行。轉形株之選擇係以色胺酸營養要求性做為指標，使用YNBD(－Trp)培養基進行。
首先將含有棉子糖2%(Difco)、聚蛋白腖(poIypeptone)2%(Daigo)、酵母萃取物1%(Difco)之液體培養基高壓殺菌後，分別添加可作為測檢ω3脂肪酸不飽和化活性之基質，n－6系脂肪酸之亞麻油酸(LA；18：2△9 , 1 2
)、n－6系脂肪酸之γ－次亞麻油酸(GLA；18：3△6 , 9 . 1 2
)、n－6系脂肪酸之高二碳－γ－次亞麻油酸(DGLA；20：3△8 , 1 1 , 1 4
)、或n－6系脂肪酸之花生四烯酸(AA或ARA；20：4△5 , 8 , 1 1 , 1 4
)之甲基酯0.1%(v/w)。於各別之培養基接種轉形株1白金耳，28℃、300rpm、24小時振動培養。又，對照係使用含有不變更之pYES2載體的酵母INVSC1。
繼而，為表現ω3脂肪酸不飽和化酵素基因，於培養基中添加半乳糖成為最後濃度2%，再於28℃、309rpm、48小時振動培養。
為檢測ω3脂肪酸不飽和化活性，進行細胞全體之脂肪酸分析。脂肪酸分析係依Sakuradani等人,1999a,△9
－Fatty acid desaturase from arachidonic acid－producing fungus.Unigue gene sequence and its heterologous expression in a fungus,Aspergillus.Eur J.Biochem 260：208－216的方法。
藉離心回收酵母細胞，以蒸餾水洗淨後在100℃下乾燥。經乾燥之細胞係添加含10%鹽酸的甲醇而在50℃下放置3小時，直接進行甲基轉移。藉此操作而藉鹽酸甲醇法使菌體細胞內之脂肪酸殘基衍生成甲酯後，以己烷萃取，餾除己烷後，所得到之脂肪酸甲酯以氣相層析進行分析。
結果表示於以下表1中。又，表中「pYES2」所示之株係表示含有未變更之pYES2載體的對照株，「ω3－1」、「ω3－2」係表示使用相異之轉形株進行之2次獨立實驗。「基質(%)」係表示在所檢測出之全脂肪酸中的基質(例如，n－6系脂肪酸之亞麻油酸(LA；18：2△9 , 1 2
))的莫耳組成。「生成物(%)」係表示在所檢測出之全脂肪酸中的ω3不飽和化生成物(例如，基質為LA時係表示n－3系脂肪酸之次亞麻油酸(ALA；18：3△9 , 1 2 , 1 5
)的莫耳組成。又，「轉換率(%)」係使用{(生成物(%))/(基質(%)＋生成物(%))}×100而算出。又，含有未變更之pYES2載體的對照株則添加作為基質之脂肪酸完全未轉換。
如表1所示，可確認若以酵母表現源自M.alpina(1S－4株)的ω3脂肪酸不飽和化酵素基因，則所添加之全部種類的碳數18及20的n－6系脂肪酸之ω3位不飽和化，而可生成n－3系脂肪酸。亦即，n－6系脂肪酸之亞麻油酸(LA；18：2△9 , 1 2
)係轉換成n－3系脂肪酸之α－次亞麻油酸(ALA；18：3△9 , 1 2 , 1 5
)、n－6系脂肪酸之γ－次亞麻油酸(GLA；18：3△6 , 9 , 1 2
)係轉換成n－3系脂肪酸之十八碳四烯酸(18：4△6 , 9 , 1 2 , 1 5
)、n－6系脂肪酸之高二碳－γ－次亞麻油酸(DGLA；20：3△8 , 1 1 , 1 4
)係轉換成n－3系脂肪酸之20：4△8 , 1 1 , 1 4 , 1 7
、n－6系脂肪酸之花生四烯酸(AA或ARA；20：4△5 , 8 , 1 1 , 1 4
)係轉換成n－3系脂肪酸之二十碳五烯酸(EPA；20：4△5 , 8 , 1 1 , 1 4 , 1 7
)。其他之新穎脂肪酸未被檢測出，因而可知此ω3脂肪酸不飽和化酵素基因係不具有△1 2
脂肪酸不飽和化活性、△6
脂肪酸不飽和化活性、及/或△5
脂肪酸不飽和化活性。
從表1顯示出雖源自M.alpina(1S－4株)的ω3脂肪酸不飽和化酵素可使碳數18及20的n－6系脂肪酸之ω3位不飽和化，但相較於碳數20的n－6系脂肪酸，碳數18的n－6系脂肪酸之ω3位可更有效率地不飽和化。
於第3圖至第6圖中表示氣相層析所得到之脂肪酸分析結果。第3圖係表示添加亞麻油酸時之分析結果。第4圖係表示添加γ－次亞麻油酸時之分析結果。第5圖係表示添加高二碳－γ－次亞麻油酸時之分析結果。第6圖係表示添加花生四烯酸時之分析結果。在該等圖中可確認在ω3脂肪酸不飽和化酵素基因表現之酵母細胞中，所添加之n－6系脂肪酸的ω3位不飽和化而生成之n－3系脂肪酸的新穎峯值。又，此等之峯值則未見於同一圖中所示之對照株的分析結果。被確認為新穎峯值之脂肪酸酯係從與標準物質之保持時間之比較、及藉GLC－MS分析所得到之分子離子峯值及片段圖案鑑定之。
使用以實施例4所得之質體pYMAW3使酵母INVSC 1(Invitrogen公司)進行轉形之轉形株ω3－1，在低溫條件下表現ω3脂肪酸不飽和化酵素基因。
將含棉子糖2%(Difco)、聚蛋白腖2%(Daigo)、酵母萃取物1%(Difco)之液體培養基高壓殺菌後，添加與實施例6相同之基質0.05%(v/w)。於各別之培養基接種轉形株1白金耳，28℃、300rpm、24小時振動培養。繼而，於培養基中添加半乳糖成為最後濃度2%，再於20℃或12℃下300rpm、48小時振動培養。
有關對照、脂肪酸甲酯之分析係與實施例5相同。結果示於以下表2中。又，於表中未表示，但以未變更之pYES 2載體進行轉形的對照株係在任一溫度中添加做為基質之脂肪酸均未轉換。有關「基質(%)」、「生成物(%)」、「轉換率(%)」係如實施例7所說明。
如表2所示，在添加任一種基質的情形下，在20℃或12℃低溫條件中，可確認與28℃時相比較，轉換率會高出數倍。由此可知源自M.alpina(IS－4株)之ω3脂肪酸不飽和化酵素係在低溫為更有效率地發揮功能之酵素。
本發明係不限於上述之實施形態，在申請專利範圍所示之範圍可做各種變更。亦即，對於組合在申請專利範圍所示之範圍內適當變更之技術方法所得到之實施型態亦包含於本發明之技術範圍內。
如上述，本發明之多肽及聚核苷酸可用於n－3系脂肪酸之生產。可表現地導入本發明之聚核苷酸的轉形株或細胞係在食品領域、各種工業領域中，就生產n－3系脂肪酸、或使用此等之製品方面極有用。又，尤其上述轉形株為植物體時，可使用植物體本身做為食品，故在農業領域等非常有用。
第1圖係表示Mortierella alpina(高山孢黴菌)及Saccharomyces Kluyveri(克魯弗酵母)之△1 2
脂肪酸不飽和化酵素以及Saccharomyces Kluyveri之ω3脂肪酸不飽和化酵素之推論胺基酸序列、與在此等之間相同性高之胺基酸序列的圖。
第2圖係表示將Mortierella alpina之ω3脂肪酸不飽和化酵素之胺基酸序列，與Mortierella alpina之△1 2
脂肪酸不飽和化酵素、Saccharomyces Kluyveri之ω3脂肪酸不飽和化酵素、大豆之小胞體局部存在之ω3脂肪酸不飽和化酵素、大豆之葉綠體局部存在之ω3脂肪酸不飽和化酵素之胺基酸序列比較之圖。
第3圖係表示添加亞麻油酸作為基質之情形下，於導入pYMAW3之酵母Saccharomyces cerevisiae中，以氣相層析所得到之脂肪酸分析結果。
第4圖係表示添加γ－次亞麻油酸作為基質之情形下，於導入pYMAW3之酵母Saccharomyces cerevisiae中，以氣相層析所得到之脂肪酸分析結果。
第5圖係表示添加高二碳－γ－次亞麻油酸作為基質之情形下，導入pYMAW3之酵母Saccharomyces cerevisiae中，以氣相層析所得到之脂肪酸分析結果。
第6圖係表示添加花生四烯酸作為基質之情形下，導入pYMAW3之酵母Saccharomyces cerevisiae中，以氣相層析所得到之脂肪酸分析結果。
第7圖係表示動物中主要的n－3系及n－6系PUFAs。
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Claims (18)
- 一種多肽，係對C18與C20脂肪酸兩者皆具有ω 3脂肪酸不飽和化活性，且為以下之(a)或(b)之多肽者：(a)由序列編號：1所示之胺基酸序列所構成的多肽、(b)由序列編號：1所示之胺基酸序列中，1至10個胺基酸係被取代、欠缺、插入、或附加之胺基酸序列所構成的多肽。
- 一種抗體，其係與申請專利範圍第1項之多肽結合者。
- 一種聚核苷酸，其係編碼申請專利範圍第1項之多肽者。
- 一種聚核苷酸，其係編碼對C18與C20脂肪酸兩者皆具有ω 3脂肪酸不飽和化活性之多肽的聚核苷酸，且為下述(c)或(d)：(c)由序列編號：2或3所示之鹼基序列所構成的聚核苷酸、(d)由序列編號：2所示之鹼基序列中由第14號至第1366號的鹼基序列所構成的聚核苷酸。
- 一種載體，其係含有申請專利範圍第3或4項之聚核苷酸者。
- 一種真菌轉形株，其係導入申請專利範圍第3或4項之聚核苷酸者。
- 一種真菌轉形株的生產方法，包括將申請專利範圍第3或4項之聚核苷酸導入該真菌之細胞的步驟。
- 一種對C18與C20脂肪酸兩者皆具有ω 3脂肪酸不飽和 化活性之多肽的生產方法，其係使用申請專利範圍第5項之載體者。
- 一種對C18與C20脂肪酸兩者皆具有ω 3脂肪酸不飽和化活性之多肽的生產方法，其係使用申請專利範圍第6項之轉形株者。
- 一種脂肪酸的生產方法，其係使用申請專利範圍第6項之轉形株、或申請專利範圍第5項之載體者。
- 如申請專利範圍第10項之脂肪酸的生產方法，其係包含：使導入上述聚核苷酸之生物或細胞從培養開始，或在最適培養溫度培養以後，於低於最適培養溫度的溫度下進行培養，而生產脂肪酸者。
- 如申請專利範圍第11項之脂肪酸的生產方法，其中，該低於最適培養溫度的溫度為0℃以上、20℃以下。
- 如申請專利範圍第10、11或12項中任一項之脂肪酸的生產方法，其中，上述脂肪酸為α-次亞麻油酸(ALA)、十八碳四烯酸、20：4△8，11，14，17 或二十碳五烯酸(EPA)。
- 一種多肽，其係對C18與C20脂肪酸兩者皆具有ω 3脂肪酸不飽和化活性之多肽，且具有與序列編號：1所示之胺基酸序列相同性為90%或以上的胺基酸序列。
- 一種植物細胞轉形株，其係導入申請專利範圍第3或4項之聚核苷酸者。
- 如申請專利範圍第15項之轉形株，其中該植物細胞係衍生自大豆、油菜籽、芝麻、橄欖、亞麻仁、玉蜀黍、向日葵或紅花者。
- 一種轉形株植物的生產方法，包括將申請專利範圍第3或4項之聚核苷酸導入該植物之細胞的步驟。
- 如申請專利範圍第17項之方法，其中該植物細胞係衍生自大豆、油菜籽、芝麻、橄欖、亞麻仁、玉蜀黍、向日葵或紅花者。
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