CN101006176A

CN101006176A - 具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽及编码其多肽的多核苷酸及其利用

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Publication number: CN101006176A
Application number: CNA2005800279076A
Authority: CN
Inventors: 清水昌; 樱谷英治
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2004-08-20
Filing date: 2005-08-19
Publication date: 2007-07-25
Anticipated expiration: 2025-08-19
Also published as: EP1790720A4; AU2005273230B2; JP4587451B2; TWI396739B; US7615364B2; CA2576953A1; CN101006176B; KR20070043049A; US20080032335A1; TW200613551A; EP1790720A1; DK1790720T3; EP1790720B1; CA2576953C; MY149486A; JP2006055104A; AU2005273230A1; KR101261066B1; WO2006019192A1

Abstract

本发明提供具有广泛的底物特异性，具有在ω3位高效生成不饱和键的ω3脂肪酸去饱和活性的多肽及编码其多肽的多核苷酸。通过使此多核苷酸在生物体内表达，可大量生产n－3系列PUFAs。具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽且是由序列号：1所示的氨基酸序列组成的多肽，编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸且是由序列号：2或3所示的碱基序列组成的多核苷酸等，均对n－3系列脂肪酸的生产起作用。

Description

具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽及编码其多肽的多核苷酸及其利用

技术领域

本发明涉及具有ω3脂肪酸去饱和活性、催化n-3系列不饱和脂肪酸合成反应的多肽及编码其多肽的多核苷酸以及这些的代表性的利用。

背景技术

多不饱和脂肪酸(PUFAs：Polyunsaturated fatty acids)作为细胞膜磷脂的组成成分，且作为前列腺素、血栓素、白三烯等象激素的生理活性物质的前体，在生物体内起着重要的作用。由此PUFAs合成的生理活性物质被称为类花生酸，需要时在体内合成，调节炎症反应、生殖功能、免疫应答、血压等。有报道指出PUFAs还是婴幼儿脑发育的必需物质。

相关的PUFAs，从各生物合成途径可分为n-3系列、n-6系列、n-9系列等。此处，“n-”后接续的数字3、6及9，表示从PUFAs的甲基开始数，最初的双键出现在第几位的碳上。例如，“n-3”系列是指以甲基端的碳为1位碳，向羧基端顺序为2位、3位…时，从甲基开始数最初的双键出现在3位碳的PUFAs，也表示为ω3系列。图7表示动物中主要的n-3系列及n-6系列的PUFAs。作为必需脂肪酸的α-亚麻酸及在生物体内可由α-亚麻酸(ALA)代谢产生的十八碳四烯酸、20：4Δ^{8，11，14，17}、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等属于n-3系列(ω3系列)。作为必需脂肪酸的亚油酸(LA)及在生物体内可由亚油酸代谢产生的γ-亚麻酸(GLA)、二高-γ-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(AA或ARA)等属于n-6系列(ω6系列)。图中例如“18：2Δ^9，12”，其18：2表示碳数为18、双键数为2。而Δ^9，12表示以羧基的碳为1位碳，向甲基端顺序为2位、3位…时双键的位置。因动物不能使超过Δ⁹位甲基端的C-C键去饱和，所以，必须从食物(植物性食物)中摄取作为必需脂肪酸的α-亚麻酸及亚油酸，而且不能进行n-6系列向n-3系列、或n-3系列向n-6系列的相互转化。

已很清楚n-6系列PUFAs和n-3系列PUFAs分别具有不同的功能，在生物体内均起着重要的作用。已知n-3系列PUFAs具有以EPA的抗血栓作用、改善血清脂质的作用、DHA的提高学习能力的作用、抗癌作用为代表的多种生理活性，是用于保持生物体恒常性的必需物质。如上所述，因动物不能在体内合成n-3系列PUFAs，所以，经口摄取n-3系列PUFAs非常重要。

如上所述，为了合成近来被指出重要性的n-3系列PUFAs，需要ω3脂肪酸去饱和酶，其可使从脂肪酸的甲基开始数时的3位和4位、即ω3位和ω4位之间形成不饱和键，且具有生成ω3不饱和脂肪酸的活性。此ω3脂肪酸去饱和酶基因迄今为止已在高等植物、绿藻、线虫、卵菌纲、子囊菌纲等中克隆[例如，参照日本特开2001-95588公报(平成13年(2001)4月10日公开)、国际公开第WO 03/064596号小册子(pamphlet)(平成15年(2003)8月7日公开)、Science258：1353-1355(1992)、Biosci.Biotechnol.Biochem.66：1314-1327(2002)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：1142-1147(1997)、Biochemistry39：11948-11954(2000)、Biochem.J.378：665-671(2004)、Microbiology150：1983-1990(2004)、Biochem.Biophys.Res.Commun.150：335-341(1988)]。

如日本特开2001-95588公报、Science 258：1353-1355(1992)、Biosci.Biotechnol.Biochem.66：1314-1327(2002)所报道，由高等植物、绿藻的ω3脂肪酸去饱和酶基因编码的蛋白质具有如下活性，将亚油酸(18:2)的碳数18的n-6系列脂肪酸转化为n-3系列的α-亚麻酸(18:3)。但是，由高等植物、绿藻的ω3脂肪酸去饱和酶基因编码的蛋白质不能将碳数20的脂肪酸转变为n-3系列。

Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：1142-1147(1997)、Biochemistry39：11948-11954(2000)中报道了由线虫(Caenorhabditis elegans)的ω3脂肪酸去饱和酶基因(FAT-1)编码的蛋白质对碳数16～20的n-6系列脂肪酸起作用，使其ω3位生成不饱和键。但在Biochemistry 39：11948-11954(2000)中也报道了使此ω3脂肪酸去饱和酶基因在酵母中表达时，从n-6系列的花生四烯酸(20:4)向n-3系列的二十碳五烯酸(EPA)(20:5)的转化率非常低，小于1.9％。

国际公开第WO 03/064596号小册子、Biochem.J.378：665-671(2004)中有如下报道，由卵菌纲(Saprolegnia diclina)的ω3脂肪酸去饱和酶基因(SDD17)编码的蛋白质对碳数20的n-6系列脂肪酸起作用，使其ω3位生成不饱和键。但却不能使碳数18的n-6系列脂肪酸的ω3位去饱和。

且Microbiology 150：1983-1990(2004)中报道了从属于子囊菌的Saccharomyces kluyveri中克隆ω3脂肪酸去饱和酶基因。由此基因编码的蛋白质具有将n-6系列的亚油酸(18:2)转变为n-3系列的α-亚麻酸(18:3)的活性。但是此ω3脂肪酸去饱和酶不能使碳数20的n-6系列脂肪酸的ω3位去饱和。

已知作为脂质生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)在低温时生成二十碳五烯酸(EPA)。即以葡萄糖为碳源、在25℃培养M.alpina时不生成二十碳五烯酸，但在11℃培养时则生成二十碳五烯酸[例如，参照Biochem.Biophys.Res.Commun.150：335-341(1988)]。由此可证明，低温下存在诱导基因表达或使其活性化的ω3脂肪酸去饱和酶。

且已知许多Mortierella亚属的菌株在低温下培养时，可在菌体内积累二十碳五烯酸。此时，因未检测出二十碳五烯酸(EPA)以外的n-3系列脂肪酸，所以，可认为在低温条件下，花生四烯酸的ω3位去饱和，从而生成二十碳五烯酸(EPA)[参照J Am Oil Chem Soc 65，1455-1459(1988)]。由此可明确证明，存在着使碳数20的脂肪酸去饱和的ω3脂肪酸去饱和酶。

发明内容

如上所述，ω3脂肪酸去饱和酶基因至今为止已在高等植物、绿藻、线虫、卵菌纲、子囊菌纲等中克隆。但是，至今为止已被报道的ω3脂肪酸去饱和酶基因存在着以下问题，可使ω3位去饱和的底物局限于特定碳数的脂肪酸或即使导入宿主细胞使其表达，其去饱和率也很低等。如果可获得对更大范围的脂肪酸起作用且使脂肪酸ω3位高效生成不饱和键的ω3脂肪酸去饱和酶基因，即可更高效地合成更多种类的n-3系列脂肪酸。

在真菌类中唯一被克隆的来自S.kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶不能使碳数20的脂肪酸去饱和。而如上所述，虽已证明Mortierella亚属的菌株中存在使碳数20的脂肪酸去饱和的ω3脂肪酸去饱和酶，但还未能达到获得此ω3脂肪酸去饱和酶基因的阶段。即使使用通过此种已知的ω3脂肪酸去饱和酶的序列比较而设计的简并引物等，克隆来自M.alpina的ω3脂肪酸去饱和酶基因也非常困难。

本发明鉴于上述的问题点，其目的在于，提供对更大范围的脂肪酸起作用、且具有使脂肪酸ω3位高效生成不饱和键的ω3脂肪酸去饱和活性的多肽、及编码其多肽的多核苷酸。

本发明者为解决上述课题锐意研究的结果，在真菌类的唯一克隆了ω3脂肪酸去饱和酶基因的S.kluyveri中，(i)来自该S.kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列与S.kluyveri自身的Δ¹²脂肪酸去饱和酶的同源性最高(60％)，(ii)S.kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列与来自M.alpina的Δ¹²脂肪酸去饱和酶的同源性高(38.6％)[Microbiology 150：1983-1990(2004)]，由此可推测M.alpina中的ω3脂肪酸去饱和酶和Δ¹²脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列也具有同源性高的可能性。因此，比较M.alpina的Δ¹²脂肪酸去饱和酶、S.kluyveri的Δ¹²脂肪酸去饱和酶及S.kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶的推测氨基酸序列并设计引物，使用此引物，通过PCR，成功地获得了M.alpina的ω3脂肪酸去饱和酶基因。并且，使所得到的ω3脂肪酸去饱和酶基因在生物体内实际表达时，发现其对碳数18及20的n-6系列脂肪酸均起作用，且可使脂肪酸的ω3位高效生成不饱和键，使本发明得以完成。

即本发明所涉及的多肽是具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽，其特征在于，其是以下(a)或(b)：

(a)由序列号：1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)由序列号：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或附加1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽。

根据上述构成，本发明所涉及的多肽可催化ω3不饱和脂肪酸的合成反应。

本发明所涉及的抗体，其特征在于与上述多肽结合。

根据上述构成，本发明所涉及的抗体可鉴定表达具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的生物体或其组织或细胞。

本发明所涉及的多核苷酸，其特征在于编码上述多肽。

且本发明所涉及的多核苷酸是编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸，其优选是以下(c)、(d)、(e)或(f)：

(c)由序列号：2或3所示的碱基序列组成的多核苷酸；

(d)由序列号：2所示的碱基序列中第14位到第1366位的碱基序列组成的多核苷酸；

(e)与由序列号：2或3所示的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸；

(f)与由序列号：2所示的碱基序列中第14位到第1366位的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸；中的任一个。

根据上述构成，为了在转化体中合成具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽，可使用上述多核苷酸。

本发明所涉及的载体，其特征在于含有上述多核苷酸。

根据上述构成，可将上述多核苷酸导入生物或细胞并使具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽重组表达，或可使用无细胞蛋白质合成系统，合成具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽。

本发明所涉及的转化体，其特征在于导入上述多核苷酸。上述转化体优选真菌(酵母、丝状菌等)、动物、或植物或其后代、或来自这些的细胞或组织，上述植物优选大豆、菜籽、芝麻、橄榄、亚麻籽、玉米、向日葵或红花。本发明所涉及的转化体，优选脂肪酸组成被改变的转化体。

本发明所涉及的上述多肽的生产方法，其特征在于使用上述载体。且本发明所涉及的上述多肽的生产方法，还可使用上述转化体。

根据上述构成，可在低成本且对环境低负荷的条件下提供催化ω3脂肪酸去饱和反应的多肽。

本发明所涉及的脂肪酸的生产方法，其特征在于使用上述转化体。

本发明所涉及的上述多肽的生产方法，其包括将导入上述多核苷酸的转化体从培养开始或用最适培养温度培养后，用比最适培养温度低的温度培养，以生产多肽；或将上述多肽的合成系统置于0℃以上、20℃以下的温度条件时，可生产上述多肽。比上述最适培养温度低的温度可为0℃以上、20℃以下。

本发明所涉及的脂肪酸的生产方法，优选包括将导入上述多核苷酸的生物或细胞从培养开始或在最适培养温度培养后，用比最适培养温度低的温度培养，以生产脂肪酸。且比上述最适培养温度低的温度，优选为0℃以上、20℃以下。

根据上述构成，可使催化ω3脂肪酸去饱和反应的多肽更高效地起作用。因此，可高效生产ω3位去饱和的脂肪酸。

且上述脂肪酸的生产方法，优选上述脂肪酸是α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸、20：4Δ^{8，11，14，17}或二十碳五烯酸(EPA)。

本发明所涉及的食品或工业产品，其特征在于，含有通过上述脂肪酸生产方法获得的α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸、20：4Δ^{8，11，14，17}或二十碳五烯酸(EPA)。

根据上述构成，因n-3系列的PUFAs具有抑制过敏、炎症、血液凝固或血管收缩的作用，所以可有效利用于食品或工业产品。

本发明所涉及的获得具有ω3脂肪酸去饱和活性的多核苷酸方法，其特征在于，包括从由生物制备的基因组DNA或cDNA中，通过

(g)杂交，其以与上述多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸或其片段寡核苷酸为探针；或

(h)PCR，其将上述多核苷酸的片段寡核苷酸用作引物；获得编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸的工序。

根据上述构成，可高效获得编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸。

本发明所涉及的多核苷酸，可以是与上述(c)、(d)、(e)或(f)中的任一种多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸。

根据上述构成，将上述多核苷酸作为反义多核苷酸使用，可控制上述生物体或其组织或细胞中具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的表达。只要使编码上述(a)、(b)多肽的多核苷酸及上述(c)～(f)的多核苷酸同时在同一细胞内表达，即可产生RNAi。因此可抑制多肽的表达。

本发明所涉及的多核苷酸，可以是上述多核苷酸的片段。

根据上述构成，上述寡核苷酸可用作检测编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸的杂交探针或用于扩增该多核苷酸的引物。并且，如果使用上述寡核苷酸，即可鉴定表达了具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的生物体或其组织或细胞。以上述寡核苷酸为反义寡核苷酸使用时，可控制上述生物体或其组织或细胞中具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的表达。

本发明所涉及的检测器具，其特征在于，与上述(c)、(d)、(e)或(f)中的任一种多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸及/或作为该核苷酸的片段的上述寡核苷酸固定在基板上。

根据上述构成，检测与所涉及的多核苷酸或所涉及的寡核苷酸杂交的多核苷酸，即可容易地检测出表达具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的生物。

且本发明所涉及的检测器具也可以是上述多肽固定在基板上的检测器具。

根据上述构成，检测与上述多肽相互作用的物质，即可容易地检测出调节上述多肽的ω3脂肪酸去饱和活性的物质。

本发明所涉及的检测器具，也可以是上述抗体固定在基板上的检测器具。

根据上述构成，检测与上述抗体结合的抗原，即可容易地检测出具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽。

在本发明中，多肽是具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽，包括具有与序列号：1所示的氨基酸序列有70％以上同源性的氨基酸序列的多肽及具有与序列号：1所示的氨基酸序列有90％以上同源性的氨基酸序列的多肽。

本发明所涉及的多肽可催化真菌(酵母、丝状菌等)或植物等生物中内源性脂肪酸的ω3去饱和反应，所以，只要使用转化体，该转化体导入了含有编码本发明所涉及的多肽的多核苷酸的重组表达载体，即可用低成本且对环境低负荷的生产工序大量制备α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸、20：4Δ^{8，11，14，17}、二十碳五烯酸(EPA)等的n-3系列脂肪酸。而且，本发明通过大量制备α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸、20：4Δ^{9，11，14，17}、二十碳五烯酸(EPA)等的n-3系列脂肪酸，可提供廉价的食品或工业产品。

附图说明

图1表示Mortierella alpina及Saccharomyces kluyveri的Δ¹²脂肪酸去饱和酶及Saccharomyces kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶的推测氨基酸序列以及其之间同源性高的氨基酸序列。

图2是比较Mortierella alpina的ω3脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列与Mortierella alpina的Δ¹²脂肪酸去饱和酶、Saccharomyces kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶、大豆内质网中局部存在的ω3脂肪酸去饱和酶、大豆叶绿体中局部存在的ω3脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列的比较图。

图3表示添加底物亚油酸时，在导入pYMAW3的酵母Saccharomycescerevisiae中，通过气相色谱法进行脂肪酸分析的结果。

图4表示添加底物γ-亚麻酸时，在导入pYMAW3的酵母Saccharomycescerevisiae中，通过气相色谱法进行脂肪酸分析的结果。

图5表示添加底物二高-γ-亚麻酸时，在导入pYMAW3的酵母Saccharomyces cerevisiae中，通过气相色谱法进行脂肪酸分析的结果。

图6表示添加底物花生四烯酸时，在导入pYMAW3的酵母Saccharomycescerevisiae中，通过气相色谱法进行脂肪酸分析的结果。

图7表示动物中主要的n-3系列及n-6系列PUFAs的示意图。

具体实施方式

以下，详细叙述本发明所涉及的具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽、编码该多肽的多核苷酸及其利用。

(1)多肽

本发明所涉及的多肽是新型ω3去饱和酶，其使脂肪酸的ω3位去饱和，生成n-3系列脂肪酸。本发明所涉及的多肽，只要具有使脂肪酸的ω3位去饱和的活性，无特别限定，ω3脂肪酸去饱和的对象底物优选具有使碳数18及/或20的脂肪酸的ω3位去饱和活性的多肽。更优选具有使碳数18及20的脂肪酸的ω3位去饱和活性的多肽。由于可使ω3位去饱和的底物对象范围非常广泛，所以可生产多种n-3系列脂肪酸。

成为底物的脂肪酸可以是饱和脂肪酸，也可以是不饱和脂肪酸，但更优选不饱和脂肪酸，进一步优选n-6系列脂肪酸。通过使n-6系列脂肪酸的ω3位去饱和，即可在生物的体内生产起重要作用的PUFAs。

本发明所涉及的多肽，优选具有使底物脂肪酸n-6系列脂肪酸的ω3位去饱和活性的多肽，此种脂肪酸只要是n-6位具有不饱和键的脂肪酸即可，其双键的数量和位置无特别限定。其中，本发明所涉及的多肽特别优选具有使亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸的ω3位去饱和活性的多肽。由此可认为，使ω3位去饱和，即可由亚油酸合成α-亚麻酸，由γ-亚麻酸合成十八碳四烯酸，由二高-γ-亚麻酸合成20：4Δ^{8，11，14，17}，由花生四烯酸合成二十碳五烯酸。所得到的n-3系列PUFAs，因具有抑制过敏、炎症、血液凝固或血管收缩的作用，所以可作为食品或工业产品有效利用。

在本说明书中使用时，术语“多肽”可与“肽”或“蛋白质”互换使用。且多肽的“片段”意指该多肽的部分片段。本发明所涉及的多肽可从天然供给源中分离，也可化学合成。

术语“分离”的多肽或蛋白质，意指从其天然环境中获取的多肽或蛋白质。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽及蛋白质，与通过任意适当的技术、实质上被纯化的天然或重组的多肽及蛋白质同样可认为是分离的多肽及蛋白质。

本发明所涉及的多肽，包括天然的纯化产物、化学合成的产物及从原核生物宿主或真核生物宿主[包括例如细菌、真菌(酵母、丝状菌等)、高等植物细胞、昆虫细胞、及哺乳动物细胞]中通过重组技术产生的产物。依赖于在重组产生方法中使用的宿主，本发明所涉及的多肽可进行糖基化或非糖基化。而且本发明所涉及的多肽在一些情况下，作为宿主介导过程的结果，含有起始的改变蛋氨酸残基。

本发明提供具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽。一种实施方式中，本发明所涉及的多肽是由序列号：1所示的氨基酸序列组成的多肽、或是由序列号：1所示的氨基酸序列组成的多肽的突变体且具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽。

突变体可例举为包括缺失、插入、倒位、重复及取代的突变体。特别是多肽中的“中性”氨基酸取代，一般对其多肽的活性基本上无影响。

多肽氨基酸序列中的一些氨基酸可在对此多肽的结构或功能无显著影响的情况下很容易地被改变，这是该领域众所周知的。并且不仅是人为改变，天然蛋白质中存在着不显著改变该蛋白质的结构或功能的突变体也是众所周知的。

本领域技术人员可使用公知技术，很容易地使多肽氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生突变。例如，可根据公知的定点突变法，使编码多肽的多核苷酸的任意碱基发生突变。针对编码多肽的多核苷酸的任意位点设计引物，可制备缺失突变体或附加突变体。而且使用本说明书中所述的方法，可容易地确定所制备的突变体是否具有所需活性。

本发明中的突变体无特别限定，但优选不改变本发明所涉及的多肽活性的突变。具体地说，可为沉默突变、保守性替换等。

代表性的保守性替换，是脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu及Ile中的1个氨基酸向其他氨基酸的取代；羟基残基Ser及Thr的交换、酸性残基Asp及Glu的交换、酰胺残基Asn及Gln之间的取代、碱性残基Lys及Arg的交换以及芳香族残基Phe、Tyr之间的取代。沉默取代是指即使氨基酸取代、添加或缺失，也不影响多肽活性的突变。

如上详述，有关哪种氨基酸的变化是沉默的表现型(即对功能不具有显著有害的作用)的进一步的介绍，可从Bowie，J.U.等《Deciphering the Messagein Protein Sequences：Tolerance to Amino Acid Substitutions》，Science247：1306-1310(1990)(本说明书中作为参考引用)找到。

本实施方式中涉及的多肽是具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽，优选由

(a)序列号：1所示的氨基酸序列；或

(b)序列号：1所示的氨基酸序列中，取代、缺失、插入或附加1个或多个的氨基酸的氨基酸序列组成的多肽。

上述“取代、缺失、插入或附加1个或多个的氨基酸”是指通过定点诱变法等公知的突变多肽制备法，可进行取代、缺失、插入或附加的数量(优选10个以下，更优选7个以下，最优选5个以下)的氨基酸被取代、缺失、插入或附加之意。如上所述，此种突变多肽不限于具有通过公知的突变多肽制备法人为导入的突变的多肽，还可以是分离纯化天然存在的多肽后的产物。

本发明中也包括具有与序列号：1所示的氨基酸序列的同源性为70％以上、优选90％以上的氨基酸序列，且具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽。此种多肽中氨基酸序列的同源性可为70％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为98％以上，特别优选为99％以上。

本说明书中，上述“同源性”是指通过BLAST(Basic local alignment searchtool；Altschul，S.F.et al，J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)检索得到的值，氨基酸序列的同源性可由BLAST检索来确定。具体地说，可使用BLAST软件包(从sgi32bit版、ver.2.0.12；NCBI获得)的b12seq程序(TatianaA.Tatusova及Thomas L.Madden，FEMS Microbiol.Lett.，174，247-250，1999)，根据默认参数算出。双序列比对参数分别使用程序名“blastp”，空位开放罚分(Cost to open a gap)(Gap插入Cost值)为“0”，空位扩展罚分(Cost to extend a gap)(Gap伸長Cost值)为“0”，Query序列的过滤使用“SEG”，“Matrix使用“BLOSUM62”。

本发明所涉及的多肽可以是氨基酸以肽键结合形成的多肽，但不限定于此，也可以是包含多肽以外结构的复合多肽。在本说明书中使用时，“多肽以外的结构”可为糖链、异戊间二烯基等，但无特别限定。

本发明所涉及的多肽也可以是包含附加多肽的多肽。附加多肽可为例如His、Myc、Flag等的表位标记多肽。

其他实施方式中，本发明所涉及的多肽可以象融合蛋白质一样的改变了的形态重组表达。例如，本发明所涉及的多肽的附加氨基酸，特别是带电氨基酸区域，为改善纯化过程中或继续的操作及保存过程中的稳定性及持续性，可附加在多肽的N末端。

在本实施方式中涉及的多肽的N末端或C末端可附加标签标记(tag序列或marker序列)，标签标记例如，是编码使融合多肽容易进行纯化的肽的序列。此种序列可在多肽的最终制备前除去。在本发明的此特定的优选实施方式中，标签(tag)氨基酸序列是六聚组氨酸肽[例如，pQE载体(Qiagen，Inc.)中提供的标签]，其他很多均可由公知的及/或可用商业手段获得。例如，如Gentz等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824(1989)(本说明书中作为参考引用)中所述，六聚组氨酸提供融合蛋白质的简单的纯化。“HA”标签是用于针对来自流感红血球凝集素(HA)蛋白质的表位进行纯化的其他有用的肽，在Wilson等、Cell 37：767(1984)(本说明书中作为参考引用)中有所记载。其他的此种融合蛋白质，包括在N或C末端进行Fc融合的本实施方式所涉及的多肽或其片段。

本发明所涉及的多肽，可以是将后述的本发明所涉及的多核苷酸(编码本发明所涉及的多肽的基因)导入宿主细胞，使其多肽在细胞内表达的状态，也可以是从细胞、组织等中分离纯化的状态。本发明所涉及的多肽还可以是化学合成的多肽。

重组生成的进行可使用该领域中众所周知的方法，例如，可使用以下详述的载体及细胞进行。

合成肽可使用化学合成的公知方法合成。例如，可使用Houghten，R.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135(1985)(本说明书中作为参考引用)中的方法。此“Simultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)”方法还如Houghten等(1986)的美国专利第4,631,211号中记载。此方法中，将用于种种肽的固相合成的各种树脂置于各自的溶剂透过性袋(packet)中，可最佳使用与固相法相关的多数同一的重复工序。完整的操作手册的步骤，可同时进行500～1000以上的合成(Houghten等、前面已出现、5134)。这些文献在本说明书中作为参考引用。

如以下详述，本发明所涉及的多肽在使脂肪酸的ω3位去饱和、以生成n-3系列脂肪酸的方法及试剂盒中非常起作用。

如此可以说，本发明所涉及的多肽至少含有序列号：1所示的氨基酸序列即可。即应该注意的是，由序列号：1所示的氨基酸序列和具有特定功能(例如标签)的任意的氨基酸序列组成的多肽也包括在本发明中。且序列号：1所示的氨基酸序列及该任意的氨基酸序列可在不阻碍各自功能的情况下，用适合的连接肽连接。

(2)多核苷酸

本发明提供编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的本发明所涉及的多肽的多核苷酸。在本说明书中使用时，术语“多核苷酸”可与“核酸”或“核酸分子”互换使用，指核苷酸的聚合体。在本说明书中使用时，术语“碱基序列”可与“核酸序列”或“核苷酸序列”互换使用，用脱氧核糖核酸(省略为A、G、C及T)的序列表示。“含有序列号：2所示的碱基序列的多核苷酸或其片段”是指包含用序列号：2的各脱氧核苷酸A、G、C及/或T表示的序列的多核苷酸或其片段部分。

本发明所涉及的多核苷酸能以RNA(例如mRNA)的形态或DNA的形态(例如cDNA或基因组DNA)存在。DNA可以是双链或单链。单链DNA或RNA可以是编码链(也称作有义链)或也可以是非编码链(也称为反义链)。

在本说明书中使用时，术语“寡核苷酸”是指几个至数十个核苷酸结合的产物，可与“多核苷酸”互换使用。寡核苷酸，短的称为一核苷酸(二聚体)、三核苷酸(三聚体)，长的用30mers或100mers的聚合核苷酸的数量表示。寡核苷酸可作为更长的多核苷酸的片段生成，也可化学合成。

本发明所涉及的多核苷酸的片段，可适当选择与PCR、探针等用途相应的最佳大小，可优选至少为12nt(核苷酸)，更优选至少为15nt以上，更优选在15～25nt的范围内，可以是30nt以上，也可以是40nt以上，无特别限定。至少20nt长度的片段，例如是指包含序列号：2或3所示的碱基序列中20以上连续碱基的片段。参照本说明书，因本说明书已提供序列号：2或3所示的碱基序列，所以，本领域技术人员基于序列号：2或3，可容易地制备DNA片段。例如，使用限制性核酸内切酶切割或通过超音波的剪切，可方便地制备各种大小的片段。或此种片段可合成制备。合适的片段(寡核苷酸)可通过Applied BiosystemsIncorporated(ABI，850 Lincoln Center Dr.，Foster City，CA 94404)392型合成仪等合成。

本发明所涉及的多核苷酸，其5’端或3’端可与编码上述tag标记(tag序列或marker序列)的多核苷酸融合。

本发明还进一步涉及编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸的突变体。突变体，象天然的等位基因突变体一样可天然生成。“等位基因突变体”是指占据生物染色体上指定基因座的基因的一些能交替的形态之一。非天然存在的突变体，例如可使用该领域众所周知的诱变技术生成。

此种突变体，可以是编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸的碱基序列中缺失、取代、或附加了1个或多个碱基的突变体。突变体可在编码或非编码区域、或其两者中产生突变。编码区域的突变，可生成保守或非保守的氨基酸的缺失、取代或附加。

本发明还进一步提供分离后的多核苷酸，该分离后的多核苷酸包括在严谨杂交条件下编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸、或与该多核苷酸杂交的多核苷酸。

一种实施方式中，本发明所涉及的多核苷酸是编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸，且优选是

(a)编码由序列号：1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸；或

(b)编码由序列号：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或附加1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸中的任一个。

其他实施方式中，本发明所涉及的多核苷酸是编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸，优选是以下的(c)、(d)、(e)或(f)中的任一个：

(c)由序列号：2或3所示的碱基序列组成的多核苷酸；

(f)与由序列号：2所示的碱基序列中第14位到第1366位的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸。

且上述“严谨条件”是指只有在序列间存在至少90％以上的同一性、优选至少95％以上的同一性、最优选97％的同一性时所发生的杂交。

上述杂交可使用如Sambrook等、Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中所述的众所周知的方法进行。通常，温度越高，盐浓度越低，其严谨性越高(杂交越难)，可获得更同源的多核苷酸。杂交的条件，可优选使用以往公知的条件，无特别限定，例如，42℃、6×SSPE、50％甲酰胺、1％SDS、100μg/ml 鲑精DNA、5×Denhardt液(1×SSPE；0.18M 氯化钠、10mM磷酸钠、pH 7.7、1mM EDTA。5×Denhardt液；0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚蔗糖、0.1％聚乙烯吡咯烷酮)。

而且在其他的实施方式中，本发明所涉及的多核苷酸优选是与上述(c)、(d)、(e)或(f)中的任一种多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸。

另一实施方式中，本发明所涉及的多核苷酸优选是上述多核苷酸的片段的寡核苷酸。

本发明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸不只是双链DNA，还包括构成它的正义链及反义链的各单链DNA、RNA。本发明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸，可用作通过反义RNA的作用机制进行基因表达操作的工具。

反义RNA技术的基本原理是导入生成与靶基因互补的RNA转录体的嵌合基因。其结果，所得到的表现型是来自内源基因的基因产物的减少。通过导入本发明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸，使具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的含量降低，可降低生物中的n-3系列脂肪酸的含量，同时可防止成为底物的脂肪酸含量的降低。

因此，例如希望生产如花生四烯酸的n-6脂肪酸时，可通过使具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的含量降低，防止由ω3去饱和引起花生四烯酸含量的下降。DNA中，包括通过例如克隆、化学合成技术或其组合得到的cDNA、基因组DNA等。并且本发明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸也可包含非翻译区域(UTR)的序列、载体序列(包含表达载体序列)等的序列。

也可通过RNA干涉(RNAi)抑制多肽的表达。RNAi是指通过将双链RNA导入细胞内，在细胞内部降解与该双链RNA序列同源的mRNA，从而使基因表达受到抑制现象。由于使用此方法也可使具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽含量降低，所以可使生物中n-3系列脂肪酸的含量下降，同时可防止成为底物的脂肪酸的含量下降。具体地说，如果编码上述(a)、(b)多肽的多核苷酸及上述(c)～(f)的多核苷酸能同时在同一细胞内表达，即可产生RNAi，因此可抑制多肽的表达。

获得本发明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸的方法，可以是通过公知的技术，分离含有本发明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸的DNA片段并进行克隆的方法。例如，制备与本发明的多核苷酸的一部分碱基序列特异性杂交的探针，可筛选基因组DNA文库、cDNA文库。此种探针，只要是与本发明所涉及的多核苷酸的碱基序列或其互补序列的至少一部分特异性杂交的探针，任何序列及/或长度的探针均可使用。

获得本发明所涉及的多核苷酸的方法，可以是使用PCR等扩增手段的方法。例如，分别从本发明多核苷酸的cDNA的5’端及3’端序列(或其互补序列)中制备引物，使用这些引物，以基因组DNA(或cDNA)等为模板进行PCR等，通过扩增夹在两引物间的DNA区域，可大量获得含有本发明所涉及的多核苷酸的DNA片段。

用于获得本发明所涉及的多核苷酸的供给源无特别限定，优选是不仅包括碳数18及20的n-6位具有不饱和键的脂肪酸，还包括这些脂肪酸的ω3位发生去饱和的脂肪酸的生物材料。在本说明书中使用时，术语“生物材料”是指生物学样品(从生物体获得的组织样品或细胞样品)。例如，α-亚麻酸由亚油酸经ω3去饱和反应生成，十八碳四烯酸由γ-亚麻酸经ω3去饱和反应生成，20：4Δ^{8，11，14，17}由二高-γ-亚麻酸经ω3去饱和反应生成，二十碳五烯酸由花生四烯酸经ω3去饱和反应生成，所以，例如只要是含有这些底物一生成物对的全部或一部分的生物材料，即可获得编码催化n-3系列脂肪酸合成反应的多肽的多核苷酸。后述实施例中，作为上述供给源使用Mortierella alpina，但不限于此。

本发明的目的在于，提供编码具有使碳数18及/或20的脂肪酸的ω3位去饱和活性的多肽的多核苷酸及与该多核苷酸杂交的寡核苷酸，不在于本说明书中具体叙述的多核苷酸及寡核苷酸的制备方法等。因此，应该注意的是，通过上述各方法以外的方法获得的多核苷酸也属于本发明的技术范围，该多核苷酸编码具有使碳数18及/或20的脂肪酸的ω3位去饱和活性的多肽。

(3)抗体

本发明提供与具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽特异性结合的抗体。在本说明书中使用时，术语“抗体”是指免疫球蛋白[IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及这些的Fab片段、F(ab’)₂片段、Fc片段)，例如多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗独特型抗体及人源抗体，但不限于此。本发明所涉及的抗体对选择表达具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的生物材料非常起作用。

“抗体”可根据各种公知的方法[例如，HarLow等、《Antibodies：Alaboratory manual》、Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)、岩崎等《单克隆抗体杂交瘤和ELISA》讲谈社(1991)]、日语原名；岩崎ら、「单クロ一ン抗体ハイブリド一マとE L I S A、講談社(1991)」]制备。

肽抗体可根据该领域众所周知的方法制备。例如参照Chow，M.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：910-914 及 Bittle，F.J.等、J.Gen.Virol.66：2347-2354(1985)(本说明书中作为参考引用)。一般地，动物可用游离肽免疫。但是，抗肽抗体效价可通过与高分子载体[例如，钥孔血蓝素(KLH)或破伤风类毒素]偶联进行追加免疫。例如，含有半胱氨酸的肽可使用如m-马来酰亚胺苯甲基(maleimide benzoyl)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(hydoxysuccinimide ester)(MBS)的接头与载体偶联，另外，其他的肽可使用如戊二醛的更一般的交联剂与载体偶联。如兔、大鼠及小鼠的动物可用游离肽或与载体偶联的肽的任一种，例如可通过在腹腔内及/或皮内注射含有约100μg的肽或载体蛋白及Freund的佐剂的乳剂来进行免疫。例如为提供使用吸附于固体表面的游离肽、通过ELISA分析可检测出的具有有效效价的抗肽抗体，一些追加免疫注射例如可需间隔约2星期。免疫动物血清中抗肽抗体的效价通过抗肽抗体的选择可增加，其抗肽抗体的选择，例如是根据该领域众所周知的方法，通过固体支持体上的肽吸附及选择后的抗体的洗脱。

在本说明书中使用时，术语“与具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽特异性结合的抗体”包括可与具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽抗原特异性结合的完整的抗体分子及抗体片段[例如，Fab及F(ab’)₂片段]。Fab及F(ab’)₂片段欠缺完整抗体的Fc部分，通过循环进一步迅速地除去，且基本不具有完整抗体的组织的非特异性结合(Wahl等、J.Nucl.Med.24：316-325(1983)(本说明书中作为参考引用)。因此，优选这些片段。

可与具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的肽抗原结合的进一步的抗体，可通过使用抗独特型抗体用两个步骤产生。此种方法使用抗体其自身即是抗原的事实，因此，可获得与二次抗体结合的抗体。根据此方法，使用与具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽特异性结合的抗体免疫动物(优选小鼠)。然后，此种动物的脾细胞用于产生杂交瘤细胞，且筛选杂交瘤细胞是为了鉴定产生抗体的克隆，该抗体与和具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽特异性结合的抗体的结合能力，可被具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽抗原阻断。此种抗体包括与具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽特异性结合的抗体的抗独特型抗体，且可用于进一步诱导与具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽特异性结合的抗体的形成及用于免疫动物。

已很明确，Fab及F(ab’)₂以及本发明所涉及的抗体的其他片段可按照本说明书中公开的方法使用。此种片段可使用代表性的如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶[产生F(ab’)₂片段]的酶，通过蛋白质的分解，切割产生。或具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽结合片段，可通过重组DNA技术的适用或合成化学产生。

如此可以说，本发明所涉及的抗体至少具备识别本发明所涉及的具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的抗体片段即可[例如，Fab及F(ab’)₂片段]。即应注意的是，由识别本发明所涉及的具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的抗体片段和不同抗体分子的Fc片段组成的免疫球蛋白也包括在本发明内。

也就是说，本发明的目的在于，提供识别本发明所涉及的具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的抗体，不在于本说明书中具体记载的各个免疫球蛋白的种类(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、嵌合抗体的制备方法、肽抗原的制备方法等。因此，必须注意的是，通过上述各方法以外的方法获得的抗体也属于本发明的技术范围。

(4)本发明所涉及的多肽及/或多核苷酸的利用

(4-1)载体

本发明提供用于生成具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽而使用的载体。本发明所涉及的载体可以是用于体外翻译的载体，也可以是用于重组表达的载体。

本发明所涉及的载体只要含有上述本发明所涉及的多核苷酸，无特别限定。例如，可以是插入了编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸的cDNA的重组表达载体等。重组表达载体的制备方法可以使用质粒、噬菌体或黏粒等，无特别限定。

载体的具体种类无特别限定，可适当选择在宿主细胞中可表达的载体。即选择与宿主细胞的种类相应的、确实使本发明所涉及的多核苷酸表达的适合的启动子序列，将其与本发明所涉及的多核苷酸整合进各种质粒等的载体，并可以此载体为表达载体使用。

表达载体优选含有至少1个选择性标记。此种标记可使用抗生素抗性基因、经补充了的营养缺陷型株的标记基因(即营养缺陷型标记)等。具体地说，例如，真核生物细胞培养可列举为二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因等，大肠杆菌(Escherichia coli)及其他细菌中的培养可列举为四环素抗性基因或氨苄青霉素抗性基因，但无特别限定。

只要使用上述选择性标记，即可确认宿主细胞中是否导入了本发明所涉及的多核苷酸。也可将本发明所涉及的多肽作为融合多肽使其表达，例如，也可将来自Aequorea coerul escens(Brandt)的绿色荧光多肽GFP(GreenFluorescent Protein)作为标记使用，将本发明所涉及的多肽作为GFP融合多肽使其表达。由此可确认导入表达。

在植物中表达时，使用重组表达载体的情况下，用于植物体转化的重组表达载体只要是在该植物内可使本发明所涉及的多核苷酸表达的载体，无特别限定。此种载体，例如可列举为具有在植物细胞内组成性表达多核苷酸的启动子(例如，花椰菜花叶病毒的35S启动子)的载体、或具有通过外界刺激被诱导活化的启动子的载体。

因此可以说，本发明所涉及的载体至少含有编码本发明所涉及的多肽的多核苷酸即可。即应注意的是，表达载体以外的载体也包含于本发明的技术的范围。

也就是说，本发明的目的在于，提供含有编码本发明所涉及的多肽的多核苷酸的载体，不在于本说明书中具体记载的各个载体种类及生物种、以及载体的制备方法及细胞导入方法。因此，必须注意的是，使用上述以外的载体种类及载体的制备方法获得的载体也属于本发明的技术范围。

(4-2)宿主及转化方法

上述宿主无特别限定，可优选使用以往公知的各种生物。具体地说，例如，可以是大肠杆菌(E.coli)等的细菌；酵母(出芽酵母Saccharomycescerevisiae、裂殖酵母Schzosaccharomyces pombe)、丝状菌等的真菌；线虫(Caenorhabditis elegans)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)的卵母细胞；猪、大鼠、小鼠等的哺乳类；其他动物等，但无特别限定。用于上述宿主细胞的适当的培养培养基及条件是本领域众所周知的。

本发明中成为转化对象的植物，可以指植物体全株、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、柵状组织、海绵组织等)或植物培养细胞或各种形态的植物细胞(例如，悬浮培养细胞)、原生质体、叶片切片、愈伤组织等的任一个。用于转化的植物无特别限定，属于单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物均可。

将上述表达载体导入宿主细胞的方法即转化法也无特别限定，可优选使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、醋酸锂法、粒子轰击法等的以往公知的方法。例如，用昆虫转移表达本发明所涉及的多肽时，可利用使用了杆状病毒的表达系统。

向植物内导入基因，可使用本领域技术人员公知的转化方法(例如，土壤杆菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等)。例如，土壤杆菌介导的方法和直接向植物细胞导入的方法是众所周知的。使用土壤杆菌法时，将构建的用于植物的表达载体导入适合的土壤杆菌[例如，根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)]，此菌株根据叶盘法(内宫博文著，植物基因操作手册，1990，27-31pp，讲谈社scientific，东京)(日语原名；内宫博文著，植物遺伝子操作マニユアル，1990，27-31pp，講談社サイエンテイフイツク，東京)等感染无菌培养叶片，可获得转化植物。还可使用Nagel等的方法(Micribiol.Lett.，67，325(1990)。此方法是如下方法，首先例如将表达载体导入土壤杆菌，然后将转化的土壤杆菌用Plant Molecular BiologyManual(S.B.Gelvin等、Academic Press Publishers)中所述的方法导入植物细胞或植物组织。此处，“植物组织”包括通过植物细胞培养所得到的愈伤组织。使用土壤杆菌法进行转化时，可使用双元载体(pBI121或pPZP202等)。

将基因直接导入植物细胞或植物组织的方法，已知有电穿孔法、基因枪法。使用基因枪时，可直接使用植物体、植物器官、植物组织自身，可在制备切片后使用，也可制备原生质体后使用。可将如此制备的样品使用基因导入装置[例如PDS-1000/He(BIO-RAD公司)等]处理。处理条件因植物或样品的不同而不同，通常用450～2000psi左右的压力、4～12cm左右的距离进行。

导入了基因的细胞或植物组织，首先使用潮霉素抗性等的抗药性选择，其次用常规方法再生植物体。由转化细胞进行的植物体的再生，可用与植物细胞的种类相应的本领域技术人员公知的方法进行。

将植物培养细胞作为宿主使用时，转化是将重组载体用基因枪、电穿孔法等导入培养细胞。转化结果的所得到的愈伤组织、茎、须根等可直接用于细胞培养、组织培养或器官培养，还可使用以往已知的植物组织培养法，通过添加适当浓度的植物激素(生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯等)使植物体再生。

(4-3)转化体

本发明提供导入上述编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸的转化体。在此“转化体”不仅包括细胞、组织或器官，还包括生物个体。

转化体的制备方法(生产方法)无特别限定，例如，可以是将上述重组载体导入宿主后转化的方法。成为转化对象的生物也无特别限定，可以是在上述宿主中举例的各种微生物、植物或动物。

本发明所涉及的转化体的脂肪酸与天然存在的脂肪酸相比，其组成被改变。本发明所涉及的转化体优选是真菌(酵母、丝状菌等)、植物或其后代、动物或来自这些的细胞或组织，所涉及的植物特别优选大豆、菜籽、芝麻、橄榄、亚麻籽、玉米、向日葵或红花。即本发明中用于转化的植物，可优选使用油脂制造用的栽培植物。

通过将含有该多核苷酸的重组载体导入植物中，使该基因可表达，可获得含有编码本发明所涉及的多肽的多核苷酸的转化体。

确认基因是否被导入，可通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等进行。例如，从转化体中制备DNA，设计DNA特异性引物以进行PCR。PCR的条件可用与制备上述质粒所使用的条件同样的条件进行。之后，扩增产物可进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，用溴化乙锭、SYBR Green液等染色，且通过检测扩增产物出现的1条扩增带，可确认进行了转化。使用预先用荧光色素等标记的引物进行PCR，可检测扩增产物。而且也可采用在酶标板等的固相上结合扩增产物，通过荧光或酶反应等确认扩增产物的方法。

一旦获得本发明所涉及的多核苷酸整合进基因组内的转化体，即可通过该生物体的有性生殖或无性生殖得到其后代。从该生物体或其后代、或这些的克隆中，例如为植物时可得到种子、果实、切穗、块茎、块根、植株、愈伤组织、原生质体等，以这些为基础可进行该植物体的量产。因此，本发明中也包括可表达地导入本发明所涉及的多核苷酸的生物体或与该生物体具有同一特性的该生物体的后代或来自它们的组织。

如此可以说，本发明所涉及的转化体至少导入编码本发明所涉及的多肽的多核苷酸即可。即应该注意的是，通过重组表达载体以外的手段生成的转化体也包括在本发明的技术的范围内。

也就是说，本发明的目的在于，提供以导入编码本发明所涉及的多肽的多核苷酸为特征的转化体，不在于本说明书中具体记载的各个载体种类及导入方法。因此，必须注意的是，使用上述以外的载体种类及生物种、以及载体制备方法及细胞导入方法获得的转化体也包括在本发明的技术的范围。

(4-4)多肽的生产方法

本发明提供生产本发明所涉及的多肽的方法。

一种实施方式中，本发明所涉及的多肽的生产方法，其特征在于，使用含有编码本发明所涉及的多肽的多核苷酸的载体。

本实施方式的一个方面，本实施方式中所涉及的多肽的生产方法优选将上述载体用于无细胞蛋白质合成系统。使用无细胞蛋白质合成系统时，可使用各种市售的试剂盒。优选本实施方式中涉及的多肽的生产方法包含培养上述载体和无细胞蛋白质合成液的工序。

本实施方式的其他方面，本实施方式中所涉及的多肽的生产方法优选使用重组表达系统。使用重组表达系统时，可采用如下方法等，将本发明所涉及的多核苷酸整合进重组表达载后，通过公知方法可表达地导入宿主，并纯化在宿主内翻译后得到的上述多肽。重组表达载体可以是质粒，也可以不是，只要能将目的多核苷酸导入宿主即可。本实施方式中涉及的多肽的生产方法优选包含将上述载体导入宿主的工序。

如此在宿主中导入外源多核苷酸时，为使外源多核苷酸可表达，表达载体优选整合能在宿主中起作用的启动子。纯化重组产生的多肽的方法因使用的宿主、多肽的性质不同而不同，可通过标签(tag)的利用等比较容易地纯化目的多肽。

本实施方式中所涉及的多肽的生产方法，优选进一步包含从含有本发明所涉及的多肽的细胞或组织的提取液中纯化该多肽的工序。纯化多肽的工序优选用公知的方法(例如，破坏细胞或组织后离心分离，回收可溶性组分的方法)，从细胞、组织中制备细胞提取液后，再从此细胞提取液中利用公知的方法(例如，硫酸铵沉淀或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水作用色谱法、亲和层析法、羟基磷灰石色谱法、及外源凝集素色谱法)纯化的工序，但不限于此。最优选使用高效液相色谱法(“HPLC”)进行纯化。

另一实施方式中，本发明所涉及的多肽的生产方法，其特征在于，从天然表达本发明所涉及的多肽的细胞或组织中纯化该多肽。本实施方式中所涉及的多肽的生产方法，优选包含使用上述抗体或寡核苷酸，鉴定天然表达本发明所涉及的多肽的细胞或组织的工序。且本实施方式中所涉及的多肽的生产方法还优选进一步包含纯化上述多肽的工序。

其他实施方式中，本发明所涉及的多肽的生产方法，其特征在于，化学合成本发明所涉及的多肽。本领域技术人员应容易理解，只要以本说明书中所述的本发明所涉及的多肽的氨基酸序列为基础，应用公知的化学合成技术，即可化学合成本发明所涉及的多肽。

如上所述，根据生产本发明所涉及的多肽的方法而获得的多肽，可以是天然存在的突变多肽，也可以是人工制备的突变多肽。

制备突变多肽的方法也无特别限定。例如，可通过使用利用定点诱变法[例如参照Hashimoto-Gotoh，Gene 152：271-275(1995)]、PCR法在碱基序列中导入点突变以制备突变多肽的方法、或通过插入转座子的突变株制备法等的公知的突变多肽制备法，制备突变多肽。突变多肽的制备可利用市售的试剂盒。

如此可以说，本发明所涉及的多肽的生产方法，至少使用以编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的氨基酸序列、或具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸的碱基序列为基础的公知常用技术即可。

也就是说，本发明的目的在于，提供具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的生产方法，必须注意的是，包含上述各种工序以外的工序的生产方法也属于本发明的技术范围。

(4-5)脂肪酸的生产方法

本发明提供生产脂肪酸的方法，其使用表达本发明所涉及的多肽的生物体或细胞。上述生物体可以是天然的未经改变的生物体，也可以是使用重组表达系统的转化体。

一种实施方式中，本发明所涉及的脂肪酸生产方法是使用用编码本发明所涉及的多肽的多核苷酸转化的生物体或其组织生产脂肪酸。优选上述生物体是真菌(酵母、丝状菌等)、植物或动物。

本实施方式的优选部分，本发明所涉及的脂肪酸生产方法包含将编码本发明所涉及的多肽的多核苷酸导入上述生物体的工序。将多核苷酸导入上述生物体的工序可使用上述各种基因导入方法。本实施方式的此部分中，上述生物体在转化之前所产生的脂肪酸和转化后所产生的脂肪酸的组成不同。具体地说，从上述生物体得到的脂肪酸，例如α-亚麻酸、十八碳四烯酸、20：4Δ^{8，11，14，17}、二十碳五烯酸等的n-3系列脂肪酸的含有率增加。本实施方式的此部分的脂肪酸生产方法，优选进一步包含从上述生物体中提取脂肪酸的工序。

例如，含有从如上所述的α-亚麻酸、十八碳四烯酸、20：4Δ^{8，11，14，17}、或/及二十碳五烯酸含量增加了的本发明所涉及的转化体中提取的脂肪酸的油，可作为α-亚麻酸、十八碳四烯酸、20：4Δ^{8，11，14，17}、或/及二十碳五烯酸含量高的食品提供。且为转化植物体时，不限于提取的脂肪酸，上述转化植物体的种子、果实、切穗、块茎及/或块根等也可作为富含α-亚麻酸、十八碳四烯酸、20：4Δ^{8，11，14，17}或/及二十碳五烯酸的食品提供。用于改变脂肪酸组成的对象无特别限定，也可将植物以外的动物、细菌、或真菌(酵母、丝状菌等)等所有的生物作为对象。

其他实施方式中，本发明所涉及的脂肪酸生产方法，还包含在天然表达本发明所涉及的多肽的上述生物体中，以本发明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸为反义核苷酸导入的工序。在上述生物体中导入多核苷酸或寡核苷酸的工序，可使用上述的反义RNA技术。另外也可使用前述的RNAi的技术。

本实施方式中所涉及的脂肪酸生产方法，优选进一步包含使用上述抗体或寡核苷酸、鉴定天然表达本发明所涉及的多肽的上述生物体的工序。本实施方式此部分中涉及的脂肪酸生产方法，优选进一步包含从上述生物体中提取脂肪酸的工序。

本实施方式中，上述生物体在导入上述多核苷酸或寡核苷酸之前产生的脂肪酸和导入后产生的脂肪酸的组成不同。具体地说，从上述生物体得到的脂肪酸，其天然产生的α-亚麻酸、十八碳四烯酸、20：4Δ^{8，11，14，17}、二十碳五烯酸等的n-3系列脂肪酸的含有率减少。且这些底物亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸等含有率的减少程度降低了。

如此可以说，本发明所涉及的脂肪酸的生产方法至少使用表达本发明所涉及的多肽的生物体即可。

也就是说，本发明的目的在于，提供以通过本发明所涉及的多肽来改变脂肪酸组成的生物体为基础的脂肪酸生产方法，必须注意的是，使用上述生物体为动物、植物或各种微生物的生产方法也属于本发明的技术范围。

(4-6)食品及工业产品

本发明提供使用通过上述脂肪酸生产方法得到的脂肪酸制造的食品及工业产品。本项中所述的食品，例如上述转化体是植物时，可以是植物的种子、果实、切穗、块茎、及/或块根，也可以是使用从上述转化体中提取的脂肪酸制造的食品。上述转化体是微生物时，可以是该微生物本身，也可以是提取物等的加工物。并且，本发明的食品还可以是上述转化体的动物的肉或乳。

工业产品中包括使用从上述转化体中提取的脂肪酸制造的食品添加剂、动物用饲料添加剂。如上所述，已知n-3系列PUFAs具有以EPA的抗血栓作用、改善血清脂质的作用、DHA的提高学习能力的作用、抗癌作用为代表的多种生理活性，是用于保持生物体恒常性的必需物质。但是，以人为代表的动物不能在体内合成n-3系列PUFAs，所以，经口摄取n-3系列PUFAs非常重要。因此，当从食物中摂取的n-3系列PUFAs不足时，期望用食物添加剂、动物用饲料添加剂补充。所以可将从上述转化体中提取的脂肪酸作为PUFAs用于上述目的。

补充从上述转化体中提取的n-3系列PUFA时，不只是补充的PUFAs的含有率会增加，其下游代谢产物的含有率也会增加。例如，补充α-亚麻酸时，不只使α-亚麻酸的含有率增加，也可使二十二碳六烯酸(DHA)、前列腺素等的下游产物的含有率增加。二十二碳六烯酸是婴幼儿脑发育的必需物质，所以从上述转化体中提取的脂肪酸作为育儿用奶粉、育儿用的食品添加剂也非常有益。

(4-7)检测器具

本发明提供各种检测器具。本发明所涉及的检测器具是本发明所涉及的多核苷酸或片段固定在基板上、或本发明所涉及的多肽或抗体固定在基板上的检测器具，在各种条件下，可用于本发明所涉及的多核苷酸及多肽的表达模式的检测、测定等。

在本说明书中使用时，术语“基板”意指可负载目的物(例如，多核苷酸、寡核苷酸、多肽或蛋白质)的物质，可与术语“支持体”互换使用。优选的基板(支持体)可列举为微球(例如，聚苯乙烯珠)、固相(例如，玻璃管、试剂条、聚苯乙烯制的微孔板或氨基结合型的微孔板)等，但不限于此。将目的物固定在上述基板上的方法可以是本领域技术人员众所周知的方法，例如Nature 357：519-520(1992)(本说明书中作为参考引用)中所述。

一种实施方式中，本发明所涉及的检测器具，其特征在于，本发明所涉及的多核苷酸及/或寡核苷酸固定在基板上。本实施方式的优选部分中，本实施方式中涉及的检测器具是所谓的DNA芯片。在本说明书中使用时，术语“DNA芯片”是指将合成的寡核苷酸固定在基板上的合成型DNA芯片，但不限于此，还包含将PCR产物等的cDNA固定在基板上的粘贴型DNA微阵列。DNA芯片，例如，可以是将与本发明的基因特异性杂交的探针(即本发明所涉及的寡核苷酸)固定在基板(载体)上的DNA芯片。

探针所使用的序列，可根据从cDNA的序列中特定特征性序列的公知的方法[例如可为SAGE法(Serial Analysis of Gene Expression法)(Science276：1268，1997；Cell 88：243，1997；Science 270：484，1995；Nature 389：300，1997；美国专利第5,695,937号)等确定。

DNA芯片的制造可采用公知的方法。例如，寡核苷酸，使用合成寡核苷酸时，可通过fitriography技术和固相法DNA合成技术的组合，在基板上合成寡核苷酸。另外，寡核苷酸使用cDNA时，可使用阵列机在基板上粘贴。

例如，配置完全匹配探针(寡核苷酸)和该完全匹配探针中一个碱基被取代的错配探针，可更加提高多核苷酸的检测精度。而且，为同时检测不同的多核苷酸，也可将多种寡核苷酸固定在同一基板上制成DNA芯片。

用于本实施方式中涉及的检测器具的基板的材质，只要是能稳定固定多核苷酸或寡核苷酸的材质均可。上述基板以外，例如还可列举为聚碳酸酯、塑料等的合成树脂、玻璃等，但不限于此。基板的形态也无特别限定，例如，可优选使用板状、膜状等的基板。本实施方式的优选部分中，本实施方式中所涉及的检测器具可将从各种生物或其组织或细胞中制备的cDNA文库用于目标样品检测。

其他的实施方式中，本发明所涉及的检测器具，其特征在于，本发明所涉及的多肽或抗体固定在基板上。本实施方式的优选部分中，本实施方式中所涉及的检测器具是所谓的蛋白质芯片。

用于本实施方式中所涉及的检测器具的基板的材质，只要是可稳定固定多肽或抗体的材质均可。上述基板以外，例如还可列举为聚碳酸酯、塑料等的合成树脂、玻璃等，但不限于此。基板的形态也无特别限定，例如，可优选使用板状、膜状等的基板。

上述方法以外的将多肽或抗体固定在基板上的方法，例如，在硝酸纤维素膜、PDVF膜上将多肽、抗体按照斑点印迹法的要领点样的物理吸附法、或为了减轻多肽、抗体的变性，在载玻片上结合聚丙烯酰胺凝胶垫，然后在其上将多肽、抗体点样的方法。不仅要使多肽、抗体吸附于基板表面，还要使其牢固结合，也可使用利用了醛基修饰玻片的方法 (G.MacBeath，S.L.Schreiber，Science，289，1760(2000))。在使基板上多肽的取向一致后固定的方法，可使用通过寡聚组氨酸标签，向用镍络合物进行了表面修饰的基板固定的方法(H.Zhu，M.Bilgin，R.Bangham，D.Hall，A.Casamayor，P.Bertone，N.Lan，R.Jansen，S.Bidlingmaier，T.Houfek，T.Mitchell，P.Miller，R.A.Dean，M.Gerstein，M.Snyder，Science，293，2101(2001))。

本实施方式的优选部分中，本实施方式中所涉及的检测器具可将各种生物或其组织或细胞中的提取液作为目标样品用于检测。

如此可以说，本发明所涉及的检测器具至少是本发明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸、或本发明所涉及的多肽或与该多肽结合的抗体固定在支持体上的检测器具。也可以说，本发明所涉及的检测器具只要具备固定本发明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸、或本发明所涉及的多肽或与该多肽结合的抗体的基板即可。即应该注意的是，具备这些支持体(包括基板)以外的构成材料时也包括在本发明的技术范围内。

也就是说，本发明的目的在于，提供检测本发明所涉及的多肽或本发明所涉及的多核苷酸、或与本发明所涉及的抗体结合的多肽的器具，不在于本说明书中具体记载的各个支持体的种类、固定化方法。因此，必须注意的是，包含上述支持体以外的构成材料的检测器具也属于本发明的技术范围。

实施例

〔实施例1：通过PCR的ω3脂肪酸去饱和酶的部分序列的克隆〕

比较Mortierella alpina及Saccharomyces kluyveri的Δ¹²脂肪酸去饱和酶以及S.kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶的推测氨基酸序列，设计对应于同源性高的氨基酸序列的引物。图1表示M.alpina及S.kluyveri的Δ¹²脂肪酸去饱和酶以及S.kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶的推测氨基酸序列。图中，上行表示M.alpina的Δ¹²脂肪酸去饱和酶的推测氨基酸序列(序列号：10)，中行表示S.kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶的推测氨基酸序列(序列号：11)，下行表示S.kluyveri的Δ¹²脂肪酸去饱和酶的推测氨基酸序列(序列号：12)。设计引物ω3-F1及ω3-R1，该引物由对应于图中用下线表示的同源性高的氨基酸序列的简并寡核苷酸组成。

ω3-F1(对应的氨基酸序列：WVLAHECGH，引物为正向)

5’-TGGGTIYTBGCICAYGARTGYGGHCA-3’(序列号：4)

ω3-R1(对应的氨基酸序列：TFLQHTDPK，引物为反向)

5’-TTIGGRTCIGTRTGYTGVARRAAIGT-3’(序列号：5)

在上述引物的碱基序列中，“I”表示肌苷，“Y”表示T(胸腺嘧啶)或C(胞嘧啶)，“B”表示G(鸟嘌呤)、C或T，“R”表示G或A(腺嘌呤)，“H”表示A、C或T，“V”表示A、G或C。且上述“I”在序列号：4及序列号：5中用“n”表示。

M.alpina(1S-4株)的基因组DNA，可根据Sakuradani etal.1999a，Δ⁹-Fatty acid desaturase from arachidonic acid-producingfungus.Unique gene sequence and its heterologous expression in afungus，Aspergillus.Eur J Biochem 260：208-216的方法制备。

以得到的M.alpina的基因组DNA为模板，使用上述引物ω3-F1及ω3-R1进行PCR。PCR使用ExTaq(TAKARA BIO)，进行94℃ 3分钟、(94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟)30个循环、72℃ 10分钟的反应。PCR反应使用含有1μg基因组DNA、0.25μl Takara Ex Taq聚合酶(TAKARA BIO)、5μl10×Ex Taq buffer、各200μM的dNTP、各200pmol的引物的全容积50μl的反应混合液进行。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳时，可确认出1条约600bp的片段。

此PCR条件，因以Δ¹²脂肪酸去饱和酶基因为模板扩增的DNA片段也为约600bp，所以认为此DNA片段中，来自ω3脂肪酸去饱和酶基因的序列和来自Δ¹²脂肪酸去饱和酶基因的片段混合存在。因此，用限制性内切酶KpnI酶切此DNA片段，该酶只切割碱基序列已很明确的Δ¹²脂肪酸去饱和酶基因中的1处，然后再次进行琼脂糖凝胶电泳。其结果，得到原本大小的DNA片段及比其短的2个片段，表明PCR产物中混合存在着来自Δ¹²脂肪酸去饱和酶的DNA片段和与其不同的DNA片段。

因此，纯化PCR产物中用KpnI未能酶切的片段，将其通过ligation high(东洋纺社制)(東洋紡社製)与pT7Blue T-vecter(Novagen公司制)连接(以后的TA cloning也均同样进行)。碱基序列的分析用ABI3100(美国应用生物系统公司制)进行。同源性检索用blastx、针对GenBank中注册的氨基酸序列进行。其结果，显示出与来自M.alpina(1S-4株)的Δ¹²脂肪酸去饱和酶基因有最高的同源性，该区域的碱基序列的同一性为57％。

〔实施例2：ω3脂肪酸去饱和酶基因组DNA序列的确定〕

根据所得到的约600bp的碱基序列设计以下引物，进行Inverse PCR(反向PCR)。

ω3-IPCRR2

5’-GACCCATCCAAAGATGGTGTTGATC-3’(序列号：6)

ω3-IPCRF2

5’-GACTGTCTTCATGTACTATGGCATC-3’(序列号：7)

首先，将由Mortierella alpine制备的基因组DNA用EcoRI完全酶切，通过ligation high(东洋纺社制)在15℃反应一夜，通过自连闭环。以其为模板，使用上述引物ω3-IPCRF2及ω3-IPCRR2进行PCR。PCR的反应混合物除模板浓度为50ng/μl以外，均与实施例1相同。PCR使用ExTaq(TAKARA BIO)，进行94℃ 3分钟、(94℃ 1分钟、60℃ 2分钟、72℃ 3分钟)35个循环、72℃ 15分钟的反应。

使用与实施例1同样的方法，所得到的3-4kb的DNA片段TA克隆到载体pT7Blue T-vector(Novagen公司制)中，从插入的约4kb的片段两端确定各自数百bp的碱基序列，再与之前得到的部分序列连接。此碱基序列如序列号：2所示。从与同源序列的比较和起始密码子、终止密码子的出现等，推测ω3脂肪酸去饱和酶基因的编码区域。编码区域为14～1366，有1处存在内含子。

〔实施例3：ω3脂肪酸去饱和酶cDNA的克隆〕

已很清楚ω3脂肪酸去饱和酶通过低温培养表达活性。因此，首先将M.alpina(1S-4株)在GY液体培养基中28℃、培养7日后，12℃、培养2日，回收菌体。根据Sakuradani et al.1999a，Δ⁹-Fatty acid desaturase fromarachidonic acid-producing fungus.Unique gene sequence and itsheterologous expression in a fungus，Aspergillus.Eur J Biochem260：208-216的方法提取全RNA。将1μg的全RNA使用1st-Strand cDNASynthesis Kit for RT-PCR(AMV)(Roche Diagnostics Corporation公司)，以6碱基随机引物为引物进行反转录反应，合成eDNA。以合成的eDNA为模板，使用以下引物ω3-ExF3及ω3-ExR3进行PCR。PCR反应使用含有1μg模板cDNA、0.25μl Takara LA Taq聚合酶(TAKARA BIG)、5μl10×LA Taq buffer、2mM MgCl₂、各200μM的dNTP、各100pmol的引物的全容积50μl的反应混合液进行。且PCR的反应条件使用94℃ 3分钟、(94℃ 1分钟、60℃ 2分钟、72℃3分钟)35个循环、72℃ 15分钟。

ω3-ExF3：5’-CAGAGTCATAaagcttAAatgGCCCCCCCT-3’(序列号：8)

ω3-ExR3：5’-GACgcatgcCGTATTCAAATTGttaTTAATGC-3’(序列号：9)

引物ω3-ExF3含有ATG起始位点(序列中用小写字母表示)、和HindIII克隆位点aagctt(序列中用小写字母表示)。引物ω3-ExR3含有TAA终止位点(序列中用小写字母表示)、和SphI克隆位点gcatgc(序列中用小写字母表示)。

用与实施例1中所述方法同样的方法，将所得到的DNA片段TA克隆到载体pT7Blue T-vector(Novagen公司制)中，确定碱基序列。确定的cDNA的碱基序列如序列号：3所示。eDNA的碱基序列与由上述实施例2确定的基因组DNA碱基序列(序列号：2)的14位碱基到343位碱基的330bp、及485位碱基到1366位碱基的882bp组成的1212bp一致。由此可知，序列号：2所示的碱基序列的14位碱基到1366位碱基的1353bp是ω3脂肪酸去饱和酶基因，且此基因含有由序列号：2所示的碱基序列的345位碱基到485位碱基的141bp组成的内含子，编码403个氨基酸。

比较由此cDNA编码的氨基酸序列与至今为止已知的其他生物种的ω3脂肪酸去饱和酶、及M.al pina的Δ¹²脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列。图2中从上行开始顺序为：M.alpina的ω3脂肪酸去饱和酶(图中表示为“MAW3”，序列号：1)、M.alpina的Δ¹²脂肪酸去饱和酶(图中表示为“Mor-Δ12”，序列号：10)、S.kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶(图中表示为“Sacω3”，序列号：11)、大豆内质网中局部存在的ω3脂肪酸去饱和酶(图中表示为“Soybeanω3(ER)”，序列号：13)、大豆叶绿体中局部存在的ω3脂肪酸去饱和酶(图中表示为“Soybeanω3(Chl)”，序列号：14)的氨基酸序列。M.alpina的ω3脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列与M.alpina的Δ¹²脂肪酸去饱和酶、S.kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶、大豆内质网中局部存在的ω3脂肪酸去饱和酶、大豆叶绿体中局部存在的ω3脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列分别具有51％、36％、34％、32％的同一性。如图2所示，可知即使M.alpina的ω3脂肪酸去饱和酶与ω3脂肪酸去饱和酶中S.kluyveri的ω3脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列最相似，也只不过显示出36％的较低的同一性。由此可知，与其说M.alpina的ω3脂肪酸去饱和酶与至今为止已知的其它生物种的ω3脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列相似，不如说与M.alpina自身的Δ¹²脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列更相似。

〔实施例4：ω3脂肪酸去饱和酶基因表达载体的构建〕

构建使所得到的来自M.alpina(1S-4株)的ω3脂肪酸去饱和酶的cDNA在酵母中表达的表达载体。

将在实施例3中得到的DNA片段用HindIII-SphI处理后，与酵母表达载体pYES2(Invitrogen公司制)的HindIII-SphI位点连接，构建质粒pYMAW3。此pYMAW3在pYES2的HindIII-SphI位点整合ω3脂肪酸去饱和酶的全长1212bp的cDNA。

〔实施例5：使用表达载体的酵母的转化〕

用此质粒pYMAW3转化酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl(Invitrogen公司)，获得转化体ω3-1及ω3-2。转化根据Ausubel FM，Brent R，KingstonRE，Moore DD，Seidman JG，Smith JA，Struht k.，(1994)Transformation byelectroporation.In Current protocols in Molecular Biology.pp.13.7.5.-13.7.7.，Green Publishing Associates and Wiley-Interscience，New York的方法使用电穿孔法进行。转化体的选择以色氨酸营养缺陷型为指标，使用YNBD(-Trp)培养基进行。

〔实施例6：ω3脂肪酸去饱和酶基因的表达和功能分析〕

首先，将含有棉子糖2％(Difco)、多聚蛋白胨2％(Daigo)、酵母浸膏1％(Difco)的液体培养基高压灭菌后，作为可检测ω3脂肪酸去饱和活性的底物，准备分别添加0.1％(v/w)n-6系列脂肪酸的亚油酸(LA；18：2Δ^9，12)、n-6系列脂肪酸的γ-亚麻酸(GLA；18：3Δ^6，9，12)、n-6系列脂肪酸的二高-γ-亚麻酸(DGLA；20：3Δ^8，11，14)或n-6系列脂肪酸的花生四烯酸(AA或ARA；20：4Δ^{5，8，11，14})的甲酯的底物。在各自的培养基中接种1白金耳转化株，在28℃、300rpm、振荡培养24小时。且作为对照，使用含有未经改变的pYES2载体的酵母INVSC1。

之后，为使ω3脂肪酸去饱和酶基因表达，在培养基中添加半乳糖，使最终浓度为2％，然后在28℃、309rpm、振荡培养48小时。

〔实施例7：ω3脂肪酸去饱和活性的检测〕

为检测ω3脂肪酸去饱和活性，进行全细胞脂肪酸分析。脂肪酸分析按照Sakuradani et al.1999a，Δ⁹-Fatty acid desaturase from arachidonicacid-producing fungus. Unique gene sequence and its heterologousexpression in a fungus，Aspergillus.Eur J Biochem 260：208-216的方法进行。

通过离心回收酵母细胞，用蒸馏水洗涤后在100℃下干燥。干燥后的细胞加入含有10％氯化氢的甲醇，在50℃下放置3小时，直接使甲基转移。如此，通过盐酸甲醇法，将菌体细胞内的脂肪酸残基衍生为甲酯后，用己烷提取，将馏去己烷后所得到的脂肪酸甲酯用气相色谱法分析。

结果如下表1所示。且表中用“pYES2”表示的菌株，表示含有未经改变的pYES2载体的对照株，“ω3-1”、“ω3-2”表示使用不同的转化株进行的2次独立实验。“底物(％)”表示被检测的全脂肪酸中底物[例如，n-6系列脂肪酸的亚油酸(LA；18：2Δ^9，12)]的摩尔组成。“生成物(％)”表示被检测的全脂肪酸中ω3去饱和生成物(例如，底物为LA时，n-3系列脂肪酸是α-亚麻酸(ALA；18：3Δ^9，12，15)的摩尔组成。另外，“转化率(％)”使用{(生成物(％)/(底物(％)+生成物(％))}×100算出。且含有未经改变的pYES2载体的对照株中，作为底物添加的脂肪酸也完全未改变。

〔表1〕

菌株	底物	底物(％)	生成物	生成物(％)	转化率(％)
菌株	底物	底物(％)	生成物	生成物(％)	转化率(％)	pYES2	18：2n-618：3n-620：3n-620：4n-6	13.219.47.08.3	18：3n-318：4n-320：4n-320：5n-3	0.00.00.00.0	0000
ω3-1	18：2n-618：3n-620：3n-620：4n-6	10.817.35.83.9	18：3n-318：4n-320：4n-320：5n-3	1.41.90.30.4	11.69.85.49.1	pYES2	18：2n-618：3n-620：3n-620：4n-6	13.219.47.08.3	18：3n-318：4n-320：4n-320：5n-3	0.00.00.00.0	0000
ω3-1	18：2n-618：3n-620：3n-620：4n-6	10.817.35.83.9	18：3n-318：4n-320：4n-320：5n-3	1.41.90.30.4	11.69.85.49.1	ω3-2	18：2n-618：3n-620：3n-620：4n-6	9.310.37.19.0	18：3n-318：4n-320：4n-320：5n-3	1.92.60.30.2	16.920.14.22.4

如表1所示，可确认，在酵母中表达来自M.alpina(1S-4株)的ω3脂肪酸去饱和酶基因时，可使添加的全部种类的碳数18及20的n-6系列脂肪酸的ω3位去饱和，从而生成n-3系列脂肪酸。即n-6系列脂肪酸的亚油酸(LA；18：2Δ^9，12)转化为n-3系列脂肪酸的α-亚麻酸(ALA；18：3Δ^9，12，15)，n-6系列脂肪酸的γ-亚麻酸(GLA；18：3Δ^6，9，12)转化为n-3系列脂肪酸的十八碳四烯酸(18：4Δ^{6，9，12，15})，n-6系列脂肪酸的二高-γ-亚麻酸(DGLA；20：3Δ^9，11，14转化为n-3系列脂肪酸的20：4Δ^{8，11，14，17}，n-6系列脂肪酸的花生四烯酸(AA或ARA；20：4Δ^{5，8，11，14})转化为n-3系列脂肪酸的二十碳五烯酸(EPA；20：5Δ^{5，8，11，14，17})。从未能检测出其他的新型脂肪酸可判断，此ω3脂肪酸去饱和酶基因不具有Δ¹²脂肪酸去饱和活性、Δ²脂肪酸去饱和活性及/或Δ⁵脂肪酸去饱和活性。

如表1所示，来自M.alpina(1S-4株)的ω3脂肪酸去饱和酶可使碳数18及20的n-6系列脂肪酸的ω3位去饱和，与碳数20的n-6系列脂肪酸相比，可使碳数18的n-6系列脂肪酸的ω3位更高效地去饱和。

图3～图6表示通过气相色谱法的脂肪酸分析的结果。图3表示添加亚油酸时的分析结果，图4表示添加γ-亚麻酸时的分析结果，图5表示添加二高-γ-亚麻酸时的分析结果，图6表示添加花生四烯酸时的分析结果。从这些图中可确认，ω3脂肪酸去饱和酶基因进行了表达的酵母细胞中，有添加的n-6系列脂肪酸的ω3位发生去饱和后生成的n-3系列脂肪酸的新型色谱峰。且在同一图中所示的对照株的分析结果中未发现其色谱峰。有新型色谱峰的脂肪酸酯，由通过与其标准物质的保留时间比较及GLC-MS分析所得到的分子离子峰及片段模式鉴定。

〔实施例8：酵母在低温条件下的ω3脂肪酸去饱和酶基因的表达和功能分析〕

使用实施例4中得到的质粒pYMAW3转化酵母INVSC1(Invitrogen公司)，使用转化体ω3-1，在低温条件下使ω3脂肪酸去饱和酶基因表达。

将棉子糖2％(Difco)、多聚蛋白胨2％(Daigo)、酵母浸膏1％(Difco)的液体培养基高压灭菌后，添加0.05％(v/w)与实施例6同样的底物。在各自的培养基中接种1白金耳转化株，在28℃、300rpm、振荡培养24小时。之后在培养基中添加半乳糖，使最终浓度为2％，再用20℃或12℃、300rpm、振荡培养48小时。

对照、脂肪酸甲酯的分析与实施例5相同。结果如下表2所示。表中虽未显示，但使用未经改变的pYES2载体转化的对照株中，在任一温度下，作为底物添加的脂肪酸也均未改变。“底物(％)”、“生成物(％)”、“转化率(％)”见实施例7的说明。

〔表2〕

反应温度	转化率(％)
	转化率(％)				18：2n-6→18：3n-3	18：3n-6→18：4n-3	20：3n-6→20：4n-3	20：4n-6→20：5n-3
	28℃20℃12℃	2.319.030.1	7.830.945.9	2.48.719.8	18：2n-6→18：3n-3	18：3n-6→18：4n-3	20：3n-6→20：4n-3	20：4n-6→20：5n-3	2.14.614.7

如表2所示，可确认即使加入任一底物，在20℃或12℃的低温条件下均比28℃时的转化率高数倍。从中可知，来自M.alpina(1S-4株)的ω3脂肪酸去饱和酶是在低温下更高效地发挥作用的酶。

本发明不限于上述实施方式，可在权利要求所示的范围内进行种种变更。即在权利要求所示范围内，组合使用适当改变的技术手段后所获得的实施方式也包括在本发明的技术范围内。

综上所述，本发明所涉及的多肽及多核苷酸对n-3系列脂肪酸的生产起作用。且可表达地导入本发明所涉及的多核苷酸的转化体或细胞，在食品领域、各种工业领域中，在生产n-3系列脂肪酸或使用这些的产品上极为起作用。特别是上述转化体是植物体时，因可将植物体自身作为食品使用，所以在农业领域等也非常起作用。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>三得利株式会社(SUNTORY LIMITED)

<120>具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽及编码其多肽的多核苷酸及多肽和多核苷酸的利用

(Polypeptide with desaturating activity for omega 3-fatty acid，

polynucleotide encoding the polypeptide，

and use of the polypeptide and Polynucleotide)

<130>G06 0116CN

<140>PCT/JP2005/015497

<141>2005-08-19

<150>JP 2004-241671

<151>2004-08-20

<160>14

<170>PatentIn Vet.2.1

<210>1

<211>403

<212>PRT

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>1

Met Ala Pro Pro His Val Val Asp Glu Gln Val Arg Arg Arg Ile Val

1 5 10 15

Val Glu Asp Glu Ile Lys Ser Lys Lys Gln Phe Glu Arg Asn Tyr Val

20 25 30

Pro Met Asp Phe Thr Ile Lys Glu Ile Arg Asp Ala Ile Pro Ala His

35 40 45

Leu Phe Ile Arg Asp Thr Thr Lys Ser Ile Leu His Val Val Lys Asp

50 55 60

Leu Val Thr Ile Ala Ile Val Phe Tyr Cys Ala Thr Phe Ile Glu Thr

65 70 75 80

Leu Pro Ser Leu Ala Leu Arg Val Pro Ala Trp Ile Thr Tyr Trp Ile

85 90 95

Ile Gln Gly Thr Val Met Val Gly Pro Trp Ile Leu Ala His Glu Cys

100 105 110

Gly His Gly Ala Phe Ser Asp Ser Lys Thr Ile Asn Thr Ile Phe Gly

115 120 125

Trp Val Leu His Ser Ala Leu Leu Val Pro Tyr Gln Ala Trp Ala Met

130 135 140

Ser His Ser Lys His His Lys Gly Thr Gly Ser Met Thr Lys Asp Val

145 150 155 160

Val Phe Ile Pro Ala Thr Arg Ser Tyr Lys Gly Leu Pro Ala Leu Glu

165 170 175

Lys Pro Ala Val Glu Glu Glu Val Ser Glu Gln Glu His His His His

180 185 190

Glu Glu Ser Ile Phe Ala Glu Thr Pro Ile Tyr Thr Leu Gly Ala Leu

195 200 205

Leu Phe Val Leu Thr Phe Gly Trp Pro Leu Tyr Leu Ile Val Asn Phe

210 215 220

Ser Gly His Glu Ala Pro His Trp Val Asn His Phe Gln Thr Val Ala

225 230 235 240

Pro Leu Tyr Glu Pro His Gln Arg Lys Asn Ile Phe Tyr Ser Asn Cys

245 250 255

Gly Ile Val Ala Met Gly Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Ser Met Val Phe

260 265 270

Ser Pro Leu Thr Val Phe Met Tyr Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Val

275 280 285

Asn Ala Trp Ile Val Cys Ile Thr Tyr Leu Gln His Thr Asp Pro Lys

290 295 300

Val Pro His Phe Arg Asp Asn Glu Trp Asn Phe Gln Arg Gly Ala Ala

305 310 315 320

Cys Thr Ile Asp Arg Ser Phe Gly Thr Ile Val Asn His Leu His His

325 330 335

His Ile Gly Asp Ser His Gln Cys His His Met Phe Ser Gln Met Pro

340 345 350

Phe Tyr Asn Ala Val Glu Ala Thr Lys Tyr Leu Lys Ala Lys Leu Gly

355 360 365

Lys Tyr Tyr Ile Phe Asp Asp Thr Pro Ile Ala Lys Ala Leu Tyr Arg

370 375 380

Asn Trp Arg Glu Cys Lys Phe Val Glu Asp Glu Gly Asp Val Val Phe

385 390 395 400

Tyr Lys His

<210>2

<211>1381

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>2

tcataccgag aaaatggccc cccctcacgt tgtcgacgaa caagttcgac gcaggatcgt 60

cgttgaggac gagatcaagt ctaagaagca atttgagcgc aactatgtgc ccatggactt 120

tacgattaag gagattcgag atgcgatccc tgcccacctc ttcatccgtg ataccacaaa 180

gtcgatcctg catgtcgtca aggatctggt caccatcgcc atcgtctttt actgtgcaac 240

cttcattgag actctgccct cgctcgctct gcgagttcct gcctggatca cctactggat 300

catccaagga actgtcatgg tcggcccctg gatcttggct catggtaagg aaacgaaaaa 360

tcccatgtgt atttctgtac tacagaaggc gaagtttgta cctgaaaaga tcagcgtcgt 420

cccttgattt agaatgtaac taaccttgca atcgtatgac ctaaattttc ttgtgtcaac 480

gacagagtgc ggccacggag ctttctcgga tagcaagacg atcaacacca tctttggatg 540

ggtcctccac tctgctcttt tggtgcccta ccaggcctgg gctatgtcac actccaagca 600

tcacaagggt actggatcga tgaccaaaga tgtcgttttc atccctgcca ctcgttccta 660

caagggcctc ccagcactgg agaagcctgc cgtcgaagag gaggtttcgg agcaggaaca 720

ccaccaccac gaggagtcca tctttgccga aactcccatc tacacgctcg gagcgctttt 780

gttcgtcttg accttcggat ggcccttgta cttgatcgtc aacttttcag gacacgaggc 840

ccctcactgg gtcaaccatt tccagactgt cgctcctctc tatgagcctc accagcgcaa 900

gaacatcttc tactccaact gcggcattgt cgccatgggt tcgatcttga cttacctttc 960

gatggtcttc tcgcccttga ctgtcttcat gtactatggc atcccttacc tcggagtcaa 1020

cgcctggatc gtctgcatta cctatctcca gcacaccgat cccaaggtgc ctcacttccg 1080

tgataacgag tggaacttcc agcgcggtgc tgcctgcact atcgaccgat ccttcggtac 1140

catcgtgaac cacctgcacc accacattgg cgactctcac cagtgccacc atatgttctc 1200

gcagatgccc ttctacaatg ctgtggaggc tacaaagtac ttgaaggcca aacttggcaa 1260

gtactacata tttgacgaca cgcccattgc caaagccctc taccgcaatt ggagagagtg 1320

caaattcgtg gaggacgagg gagatgtagt gttttacaag cattaacaat ttgaatacga 1380

a 1381

<210>3

<211>1212

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>3

atggcccccc ctcacgttgt cgacgaacaa gttcgacgca ggatcgtcgt tgaggacgag 60

atcaagtcta agaagcaatt tgagcgcaac tatgtgccca tggactttac gattaaggag 120

attcgagatg cgatccctgc ccacctcttc atccgtgata ccacaaagtc gatcctgcat 180

gtcgtcaagg atctggtcac catcgccatc gtcttttact gtgcaacctt cattgagact 240

ctgccctcgc tcgctctgcg agttcctgcc tggatcacct actggatcat ccaaggaact 300

gtcatggtcg gcccctggat cttggctcat gagtgcggcc acggagcttt ctcggatagc 360

aagacgatca acaccatctt tggatgggtc ctccactctg ctcttttggt gccctaccag 420

gcctgggcta tgtcacactc caagcatcac aagggtactg gatcgatgac caaagatgtc 480

gttttcatcc ctgccactcg ttcctacaag ggcctcccag cactggagaa gcctgccgtc 540

gaagaggagg tttcggagca ggaacaccac caccacgagg agtccatctt tgccgaaact 600

cccatctaca cgctcggagc gcttttgttc gtcttgacct tcggatggcc cttgtacttg 660

atcgtcaact tttcaggaca cgaggcccct cactgggtca accatttcca gactgtcgct 720

cctctctatg agcctcacca gcgcaagaac atcttctact ccaactgcgg cattgtcgcc 780

atgggttcga tcttgactta cctttcgatg gtcttctcgc ccttgactgt cttcatgtac 840

tatggcatcc cttacctcgg agtcaacgcc tggatcgtct gcattaccta tctccagcac 900

accgatccca aggtgcctca cttccgtgat aacgagtgga acttecagcg cggtgctgcc 960

tgcactatcg accgatcctt cggtaccatc gtgaaccacc tgcaccacca cattggcgac 1020

tctcaccagt gccaccatat gttctcgcag atgcccttct acaatgctgt ggaggctaca 1080

aagtacttga aggccaaact tggcaagtac tacatatttg acgacacgcc cattgccaaa 1140

gccctctacc gcaattggag agagtgcaaa ttcgtggagg acgagggaga tgtagtgttt 1200

tacaagcatt aa 1212

<210>4

<2 1>26

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

(Description of Artificial Sequence：Artificially Synthesized Primer Sequence)

<220>

<221>修饰碱基(Modified base)

<222>6

<223>n是肌苷(n is inosine)

<220>

<221>修饰碱基(Modified base)

<222>12

<223>n是肌苷(n is inosine)

<400>4

tgggtnytbg cncaygartg ygghca 26

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

(Description of Artificial Sequence：Artificially Synthesized Primer Sequence)

<220>

<221>修饰碱基(Modified base)

<222>3

<223>n是肌苷(n is inosine)

<220>

<221>修饰碱基(Modified base)

<222>9

<223>n是肌苷(n is inosine)

<220>

<221>修饰碱基(Modified base)

<222>14

<223>n是肌苷(n is inosine)

<400>5

ttnggrtcng trtgytgvar raangt 26

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

(Description of Artificial Sequence：Artificially Synthesized Primer Sequence)

<400>6

gacccatcca aagatggtgt tgatc 25

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

(Description of Artificial Sequence：Artificially Synthesized Primer Sequence)

<400>7

gactgtcttc atgtactatg gcatc 25

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

(Description of Artificial Sequence：Artificially Synthesized Primer Sequence)

<400>8

cagagtcata aagcttaaat ggccccccct 30

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

(Description of Artificial Sequence：Artificially Synthesized Primer Sequence)

<400>9

gacgcatgcc gtattcaaat tgttaatgc 29

<210>10

<211>400

<212>PRT

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>10

Met Ala Pro Pro Asn Thr Ile Asp Ala Gly Leu Thr Gln Arg His Ile

1 5 10 15

Ser Thr Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ala Lys Pro Ala Phe Glu Arg Asn

20 25 30

Tyr Gln Leu Pro Glu Phe Thr Ile Lys Glu Ile Arg Glu Cys Ile Pro

35 40 45

Ala His Cys Phe Glu Arg Ser Gly Leu Arg Gly Leu Cys His Val Ala

50 55 60

Ile Asp Leu Thr Trp Ala Ser Leu Leu Phe Leu Ala Ala Thr Gln Ile

65 70 75 80

Asp Lys Phe Glu Asn Pro Leu Ile Arg Tyr Leu Ala Trp Pro Ala Tyr

85 90 95

Trp Ile Met Gln Gly Ile Val Cys Thr Gly Ile Trp Val Leu Ala His

100 105 110

Glu Cys Gly His Gln Ser Phe Ser Thr Ser Lys Thr Leu Asn Asn Thr

115 120 125

Val Gly Trp Ile Leu His Ser Met Leu Leu Val Pro Tyr His Ser Trp

130 135 140

Arg Ile Ser His Ser Lys His His Lys Ala Thr Gly His Met Thr Lys

145 150 155 160

Asp Gln Val Phe Val Pro Lys Thr Arg Ser Gln Val Gly Leu Pro Pro

165 170 175

Lys Glu Asn Val Ala Val Ala Val Gln Glu Glu Asp Met Ser Val His

180 185 190

Leu Asp Glu Glu Ala Pro Ile Val Thr Leu Phe Trp Met Val Ile Gln

195 200 205

Phe Leu Phe Gly Trp Pro Ala Tyr Leu Ile Met Asn Ala Ser Gly Gln

210 215 220

Asp Tyr Gly Arg Trp Thr Ser His Phe His Thr Tyr Ser Pro Ile Phe

225 230 235 240

Glu Pro Arg Asn Phe Phe Asp Ile Ile Ile Ser Asp Leu Gly Val Leu

245 250 255

Ala Ala Leu Gly Thr Leu Ile Tyr Ala Ser Met Gln Leu Ser Leu Leu

260 265 270

Thr Val Thr Lys Tyr Tyr Ile Val Pro Tyr Leu Phe Val Asn Phe Trp

275 280 285

Leu Val Leu Ile Thr Phe Leu Gln His Thr Asp Pro Lys Leu Pro His

290 295 300

Tyr Arg Glu Gly Ala Trp Asn Phe Gln Arg Gly Ala Leu Cys Thr Val

305 310 315 320

Asp Arg Ser Phe Gly Lys Phe Leu Asp His Met Phe His Gly Ile Val

325 330 335

His Thr His Val Ala His His Leu Phe Ser Gln Met Pro Phe Tyr His

340 345 350

Ala Glu Glu Ala Thr His His Leu Lys Lys Leu Leu Gly Glu Tyr Tyr

355 360 365

Val Tyr Asp Pro Ser Pro Ile Val Val Ala Val Trp Arg Ser Phe Arg

370 375 380

Glu Cys Arg Phe Val Glu Asp His Gly Asp Val Val Phe Phe Lys Lys

385 390 395 400

<210>11

<211>419

<212>PRT

<213>Saccharomyces kluyveri

<400>11

Met Ser Ile Glu Thr Val Gly Ser Ser Ser Gly Val Ala Ile Asn Ser

1 5 10 15

Lys Ala Val Ser Ser Thr Ala Thr Thr Val Val Gln Pro Lys Thr Ala

20 25 30

Ile Asp Thr Asn Gly Asn Val Phe Lys Val Pro Asp Tyr Thr Ile Lys

35 40 45

Asp Ile Leu Ser Ala Ile Pro Lys Glu Cys Tyr Lys Arg Asp Thr Leu

50 55 60

Trp Ser Leu His Tyr Val Val Arg Asp Ile Ala Ala Ile Leu Val Ile

65 70 75 80

Gly Tyr Leu Gly Thr Asn Tyr Ile Pro Val Leu Phe Pro Asn Ser Ala

85 90 95

Leu Leu Arg Gly Ile Ala Tyr Ala Ile Gln Ser Tyr Leu Ile Gly Leu

100 105 110

Phe Gly Phe Gly Leu Trp Ile Leu Ala His Glu Cys Gly His Ser Ala

115 120 125

Phe Ser Glu Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr Val Gly Trp Val Leu His

130 135 140

Ser Trp Trp Met Val Pro Tyr Phe Pro Trp Lys Phe Ser His Ser Lys

145 150 155 160

His His Lys Ala Thr Gly His Met Thr Arg Asp Met Val Phe Ile Pro

165 170 175

Tyr Thr Lys Asp Glu Phe Ile Thr Met Lys Lys Lys Ser Lys Phe Ala

180 185 190

Glu Ile Thr Glu Glu Ala Pro Val Met Thr Leu Phe Asn Leu Ile Ala

195 200 205

Gln Gln Val Gly Gly Leu Gln Leu Tyr Leu Ala Thr Asn Ala Thr Gly

210 215 220

Gln Pro Tyr Pro Gly Val Lys Lys Phe Phe Lys Ser His Tyr Trp Pro

225 230 235 240

Thr Ser Pro Val Phe Asp Ala Lys Asp Phe Trp Trp Ile Ile Met Ser

245 250 255

Asp Ile Gly Ile Val Ser Thr Leu Leu Ile Asn Tyr Leu Trp Tyr Arg

260 265 270

Ala Tyr Gly Ala His Val Val Leu Ile Asn Trp Phe Ile Pro Trp Leu

275 280 285

Trp Val Asn His Trp Leu Val Phe Val Thr Phe Leu Gln His Thr Asp

290 295 300

Pro Thr Met Pro His Tyr Asp Ala Glu Glu Trp Thr Phe Ala Lys Gly

305 310 315 320

Ala Ala Ala Thr Ile Asp Arg Asn Phe Gly Phe Val Gly Gln His Ile

325 330 335

Phe His Asp Ile Ile Glu Thr His Val Leu His His Tyr Cys Ser Arg

340 345 350

Ile Pro Phe Tyr Asn Ala Arg Lys Ala Thr Ser Ala Ile Lys Glu Val

355 360 365

Met Gly Gln His Tyr Arg Tyr Glu Gly Glu Asn Met Trp Lys Ser Leu

370 375 380

Trp Lys Val Ala Arg Ser Cys Gln Tyr Val Glu Gly Asp Asn Gly Val

385 390 395 400

Arg Met Phe Arg Asn Thr Asn Gly Val Gly Val Lys Pro Glu Asp Gly

405 410 415

Ser Ser Gln

<210>12

<211>416

<212>PRT

<213>Saccharomyces kluyveri

<400>12

Met Ser Ala Val Thr Val Thr Gly Ser Asp Pro Lys Asn Arg Gly Ser

1 5 10 15

Ser Ser Asn Thr Glu Gln Glu Val Pro Lys Val Ala Ile Asp Thr Asn

20 25 30

Gly Asn Val Phe Ser Val Pro Asp Phe Thr Ile Lys Asp Ile Leu Gly

35 40 45

Ala Ile Pro His Glu Cys Tyr Glu Arg Arg Leu Ala Thr Ser Leu Tyr

50 55 60

Tyr Val Phe Arg Asp Ile Phe Cys Met Leu Thr Thr Gly Tyr Leu Thr

65 70 75 80

His Lys Ile Leu Tyr Pro Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Asn Ser Ile

85 90 95

Ile Lys Phe Thr Phe Trp Ala Leu Tyr Thr Tyr Val Gln Gly Leu Phe

100 105 110

Gly Thr Gly Ile Trp Val Leu Ala His Glu Cys Gly His Gln Ala Phe

115 120 125

Ser Asp Tyr Gly Ile Val Asn Asp Phe Val Gly Trp Thr Leu His Ser

130 135 140

Tyr Leu Met Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Gly Lys His

145 150 155 160

His Lys Ala Thr Gly His Met Thr Arg Asp Met Val Phe Val Pro Ala

165 170 175

Thr Lys Glu Glu Phe Lys Lys Ser Arg Asn Phe Phe Gly Asn Leu Ala

180 185 190

Glu Tyr Ser Glu Asp Ser Pro Leu Arg Thr Leu Tyr Glu Leu Leu Val

195 200 205

Gln Gln Leu Gly Gly Trp Ile Ala Tyr Leu Phe Val Asn Val Thr Gly

210 215 220

Gln Pro Tyr Pro Asp Val Pro Ser Trp Lys Trp Asn His Phe Trp Leu

225 230 235 240

Thr Ser Pro Leu Phe Glu Gln Arg Asp Ala Leu Tyr Ile Phe Leu Ser

245 250 255

Asp Leu Gly Ile Leu Thr Gln Gly Ile Val Leu Thr Leu Trp Tyr Lys

260 265 270

Lys Phe Gly Gly Trp Ser Leu Phe Ile Asn Trp Phe Val Pro Tyr Ile

275 280 285

Trp Val Asn His Trp Leu Val Phe Ile Thr Phe Leu Gln His Thr Asp

290 295 300

Pro Thr Met Pro His Tyr Asn Ala Glu Glu Trp Thr Phe Ala Lys Gly

305 310 315 320

Ala Ala Ala Thr Ile Asp Arg Lys Phe Gly Phe Ile Gly Pro His Ile

325 330 335

Phe His Asp Ile Ile Glu Thr His Val Leu His His Tyr Cys Ser Arg

340 345 350

Ile Pro Phe Tyr Asn Ala Arg Pro Ala Ser Glu Ala Ile Lys Lys Val

355 360 365

Met Gly Lys His Tyr Arg Ser Ser Asp Glu Asn Met Trp Lys Ser Leu

370 375 380

Trp Lys Ser Phe Arg Ser Cys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Asn Gly Val

385 390 395 400

Leu Met Phe Arg Asn Ile Asn Asn Cys Gly Val Gly Ala Ala Glu Lys

405 410 415

<210>13

<211>380

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>13

Met Val Lys Asp Thr Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Ala Asn Asn Gly Tyr

1 5 10 15

Gln Gln Lys Gly Ser Ser Phe Asp Phe Asp Pro Ser Ala Pro Pro Pro

20 25 30

Phe Lys Ile Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ile Pro Lys His Cys Trp Val

35 40 45

Lys Asn Pro Trp Arg Ser Leu Ser Tyr Val Leu Arg Asp Val Leu Val

50 55 60

Ile Ala Ala Leu Val Ala Ala Ala Ile His Phe Asp Asn Trp Leu Leu

65 70 75 80

Trp Leu Ile Tyr Cys Pro Ile Gln Gly Thr Met Phe Trp Ala Leu Phe

85 90 95

Val Leu Gly His Asp Cys Gly His Gly Ser Phe Ser Asp Ser Pro Leu

100 105 110

Leu Asn Ser Leu Val Gly His Ile Leu His Ser Ser Ile Leu Val Pro

115 120 125

Tyr His Gly Trp Arg Ile Ser His Arg Thr His His Gln Asn His Gly

130 135 140

His Ile Glu Lys Asp Glu Ser Trp Val Pro Leu Thr Glu Lys Ile Tyr

145 150 155 160

Lys Asn Leu Asp Ser Met Thr Arg Leu Ile Arg Phe Thr Val Pro Phe

165 170 175

Pro Leu Phe Val Tyr Pro Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Ser Pro Gly Lys

180 185 190

Glu Gly Ser His Phe Asn Pro Tyr Ser Asn Leu Phe Pro Pro Ser Glu

195 200 205

Arg Lys Gly Ile Ala Ile Ser Thr Leu Cys Trp Ala Thr Met Phe Ser

210 215 220

Leu Leu Ile Tyr Leu Ser Phe Ile Thr Ser Pro Leu Leu Val Leu Lys

225 230 235 240

Leu Tyr Gly Ile Pro Tyr Trp Ile Phe Val Met Trp Leu Asp Phe Val

245 250 255

Thr Tyr Leu His His His Gly His His Gln Lys Leu Pro Trp Tyr Arg

260 265 270

Gly Lys Glu Trp Ser Tyr Leu Arg Gly Gly Leu Thr Thr Val Asp Arg

275 280 285

Asp Tyr Gly Trp Ile Tyr Asn Ile His His Asp Ile Gly Thr His Val

290 295 300

Ile His His Leu Phe Pro Gln Ile Pro His Tyr His Leu Val Glu Ala

305 310 315 320

Thr Gln Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Asp Tyr Tyr Arg Glu Pro Glu

325 330 335

Arg Ser Ala Pro Leu Pro Phe His Leu Ile Lys Tyr Leu Ile Gln Ser

340 345 350

Met Arg Gln Asp His Phe Val Ser Asp Thr Gly Asp Val Val Tyr Tyr

355 360 365

Gln Thr Asp Ser Leu Leu Leu His Ser Gln Arg Asp

370 375 380

<210>14

<211>453

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>14

Met Ala Thr Trp Tyr His Gln Lys Cys Gly Leu Lys Pro Leu Ala Pro

1 5 10 15

Val Ile Pro Arg Pro Arg Thr Gly Ala Ala Leu Ser Ser Thr Ser Arg

20 25 30

Val Glu Phe Leu Asp Thr Asn Lys Val Val Ala Gly Pro Lys Phe Gln

35 40 45

Pro Leu Arg Cys Asn Leu Arg Glu Arg Asn Trp Gly Leu Lys Val Ser

50 55 60

Ala Pro Leu Arg Val Ala Ser Ile Glu Glu Glu Gln Lys Ser Val Asp

65 70 75 80

Leu Thr Asn Gly Thr Asn Gly Val Glu His Glu Lys Leu Pro Glu Phe

85 90 95

Asp Pro Gly Ala Pro Pro Pro Phe Asn Leu Ala Asp Ile Arg Ala Ala

100 105 110

Ile Pro Lys His Cys Trp Val Lys Asp Pro Trp Arg Ser Met Ser Tyr

115 120 125

Val Val Arg Asp Val Ile Ala Val Phe Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ala

130 135 140

Tyr Leu Asn Asn Trp Leu Val Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Ala Gln Gly

145 150 155 160

Thr Met Phe Trp Ala Leu Phe Val Leu Gly His Asp Cys Gly His Gly

165 170 175

Ser Phe Ser Asn Asn Ser Lys Leu Asn Ser Val Val Gly His Leu Leu

180 185 190

His Ser Ser Ile Leu Val Pro Tyr His Gly Trp Arg Ile Ser His Arg

195 200 205

Thr His His Gln His His Gly His Ala Glu Asn Asp Glu Ser Trp His

210 215 220

Pro Leu Pro Glu Lys Leu Phe Arg Ser Leu Asp Thr Val Thr Arg Met

225 230 235 240

Leu Arg Phe Thr Ala Pro Phe Pro Leu Leu Ala Phe Pro Val Tyr Leu

245 250 255

Phe Ser Arg Ser Pro Gly Lys Thr Gly Ser His Phe Asp Pro Ser Ser

260 265 270

Asp Leu Phe Val Pro Asn Glu Arg Lys Asp Val Ile Thr Ser Thr Ala

275 280 285

Cys Trp Ala Ala Met Leu Gly Leu Leu Val Gly Leu Gly Phe Val Met

290 295 300

Gly Pro Ile Gln Leu Leu Lys Leu Tyr Gly Val Pro Tyr Val Ile Phe

305 310 315 320

Val Met Trp Leu Asp Leu Val Thr Tyr Leu His His His Gly His Glu

325 330 335

Asp Lys Leu Pro Trp Tyr Arg Gly Lys Glu Trp Ser Tyr Leu Arg Gly

340 345 350

Gly Leu Thr Thr Leu Asp Arg Asp Tyr Gly Trp Ile Asn Asn Ile His

355 360 365

His Asp Ile Gly Thr His Val Ile His His Leu Phe Pro Gln Ile Pro

370 375 380

His Tyr His Leu Val Glu Ala Thr Glu Ala Ala Lys Pro Val Phe Gly

385 390 395 400

Lys Tyr Tyr Arg Glu Pro Lys Lys Ser Ala Ala Pro Leu Pro Phe His

405 410 415

Leu Ile Gly Glu Ile Ile Arg Ser Phe Lys Thr Asp His Phe Val Ser

420 425 430

Asp Thr Gly Asp Val Val Tyr Tyr Gln Thr Asp Ser Lys Ile Asn Gly

435 440 445

Ser Ser Lys Leu Glu

450

Claims

1.多肽，其是具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽，其特征在于，其是以下(a)或(b)的多肽：

(a)由序列号：1所示的氨基酸序列组成的多肽；

2.抗体，其与权利要求1中所述的多肽结合。

3.多核苷酸，其编码权利要求1中所述的多肽。

4.多核苷酸，其是编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸，其特征在于，其是以下(c)、(d)、(e)或(f)中的任一种多核苷酸：

(c)由序列号：2或3所示的碱基序列组成的多核苷酸；

5.多核苷酸，其与权利要求4中所述的任一种多核苷酸在严谨条件下杂交。

6.寡核苷酸，其是权利要求3～5中任一项所述的多核苷酸的片段。

7.载体，其含有权利要求3～5中任一项中所述的多核苷酸。

8.载体，其含有权利要求3或4中所述的多核苷酸。

9.转化体，其是导入权利要求3或4中所述的多核苷酸的转化体。

10.权利要求9中所述的转化体，其是真菌、动物、或植物或其后代、或来自这些的细胞或组织。

11.权利要求10中所述的转化体，其中，上述植物是大豆、菜籽、芝麻、橄榄、亚麻籽、玉米、向日葵或红花。

12.权利要求9～11中任一项所述的转化体，其中，脂肪酸组成被改变。

13.多肽的生产方法，其使用权利要求8中所述的载体。

14.多肽的生产方法，其使用权利要求9～12中任一项所述的转化体。

15.脂肪酸的生产方法，其使用权利要求9～12中任一项所述的转化体或权利要求7中所述的载体。

16.权利要求15中所述的脂肪酸的生产方法，其包括将导入上述多核苷酸的生物或细胞从培养开始或用最适培养温度培养后，用比最适培养温度低的温度培养，以生产脂肪酸。

17.权利要求16中所述的脂肪酸的生产方法，其中，比上述最适培养温度低的温度为0℃以上、20℃以下。

18.权利要求15、16或17中所述的脂肪酸的生产方法，其中，上述脂肪酸为α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸、20:4Δ^{8，11，14，17}或二十碳五烯酸(EPA)。

19.食品或工业产品，其含有通过权利要求15、16或17中所述的脂肪酸生产方法获得的α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸、20:4Δ^{8，11，14，17}或二十碳五烯酸(EPA)。

20.方法，其是获得编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸的方法，其包括从由生物制备的基因组DNA或cDNA中，通过

(g)杂交，其以权利要求5中所述的多核苷酸或权利要求5中所述的多核苷酸的片段寡核苷酸为探针；或

(h)PCR，其将权利要求3或4中所述的多核苷酸的片段寡核苷酸用作引物；获得编码具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽的多核苷酸的工序。

21.检测器具，其中，权利要求5中所述的多核苷酸及/或权利要求5中所述的多核苷酸的片段寡核苷酸固定在基板上。

22.检测器具，其中，权利要求1中所述的多肽固定在基板上。

23.检测器具，其中，权利要求2中所述的抗体固定在基板上。

24.多肽，其是具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽，其具有与序列号：1所示的氨基酸序列有70％以上同源性的氨基酸序列。

25.多肽，其是具有ω3脂肪酸去饱和活性的多肽，其具有与序列号：1所示的氨基酸序列有90％以上同源性的氨基酸序列。