CN102803289A

CN102803289A - 用于高水平生产二十碳五烯酸的改善的优化的解脂耶氏酵母菌株

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Publication number: CN102803289A
Application number: CN2010800263327A
Authority: CN
Inventors: S-P·洪; P·L·夏普; Z·薛; N·S·亚达夫; Q·朱
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2009-06-16
Filing date: 2010-06-14
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2030-06-14
Also published as: CN102803289B; AU2010260231B2; JP5893555B2; AU2010260231A8; WO2010147904A1; CA2761589A1; JP2012529913A; AU2010260231A1; DK2475679T3; BRPI1009649A2; EP2475679A4; EP2475679A1; EP2475679B1; CL2011003162A1; CA2761589C

Abstract

本发明描述了含油酵母解脂耶氏酵母的工程化的菌株，所述菌株能够生产包含按总脂肪酸的重量百分比计的[“％TFA”]高于50重量％的二十碳五烯酸[“EPA”](一种ω-3多不饱和脂肪酸)，并且具有至少3.1的EPA％TFA对亚油酸比值(以％TFA测量)的油。这些菌株除其他异源的Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_16/18延伸酶外，还过表达至少一种Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶复合酶，并任选地过表达二酰基甘油胆碱磷酸转移酶、丙二酰-辅酶A合成酶和/或酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶。至少一种过氧化物酶体生物合成因子蛋白的表达被下调。主张了在所述宿主细胞中生产EPA的方法、从所述细胞获得的油、和由此生产的产品。

Description

用于高水平生产二十碳五烯酸的改善的优化的解脂耶氏酵母菌株

本专利申请要求均于2009年6月16日提交的美国临时申请61/187366、61/187368和61/187359的权益，并且这些申请中的每一个均以引用方式全文并入本文。

发明领域

本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及工程化的含油酵母解脂耶氏酵母菌株，该菌株能够有效地生产高浓度的二十碳五烯酸—一种ω-3多不饱和脂肪酸[“PUFA”]。

发明背景

二十碳五烯酸[“EPA”；顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸；ω-3]在临床上和制药上的价值是众所周知的(美国专利申请公布2009-0093543-A1)。类似地，相对于从天然的微生物源或通过分离从鱼油和海洋浮游生物生产EPA，利用重组方法在微生物中生产EPA的优点也是被充分认可的。

尽管文献报道了负责EPA的生产的ω-3/ω-6多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生物合成途径的多个部分在其中被引入植物和非含油酵母的许多最近的实例，申请人的受让人的主要努力聚焦在含油酵母解脂耶氏酵母(美国专利7,238,482；美国专利申请公布2006-0115881-A1；美国专利申请公布2009-0093543-A1)上。将含油酵母定义为那些天然能够合成并积聚油的酵母，其中积聚的油为细胞干重的至少25％。

更具体地讲，美国专利申请公布2006-0115881-A1展示了通过表达下列基因在重组解脂耶氏酵母菌株中占总脂肪酸9％的EPA的生产而无γ-亚麻酸[“GLA”；ω-6]的共合成：Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶和C_16/18延伸酶。

美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了用于生产EPA的优化的重组解脂耶氏酵母菌株，并展示了通过在其天然的过氧化物酶体生物合成因子10蛋白(PEX10)中包含破坏的宿主细胞中表达下列基因，在重组解脂耶氏酵母菌株中占总脂肪酸55.6％的EPA的生产：Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_16/18延伸酶和二酰基甘油胆碱磷酸转移酶。

尽管有以上引用的公开，除高的总脂质含量外，还允许占总脂肪酸的高重量％的EPA生产，同时使中间体脂肪酸如亚油酸[“LA”；ω-6]的生产和最终的油产物中的副产物脂肪酸最小化的EPA商业生产，但是菌株的改善依然是必要的。通过工程化改善的优化的解脂耶氏酵母菌株，申请人已解决了上述问题，其中所述改善允许下列中的至少一种：总油级分中61.8％EPA的生产，按干细胞重量的百分比计39.6％的总脂肪酸的生产，或具有6.1的EPA对LA比值的脂质的生产。

发明概述

在第一个实施方案中，本发明涉及生产油的重组耶氏酵母属宿主细胞，所述油包含：

(a)按总脂肪酸的重量百分比计至少50％的二十碳五烯酸；并且

(b)所述油按总脂肪酸的重量百分比计的二十碳五烯酸与按总脂肪酸的重量百分比计的亚油酸的比值为至少3.1。

在第二个实施方案中，本发明涉及权利要求1的重组耶氏酵母属宿主细胞，其中所述宿主细胞包含：

(a)至少一种包含多肽的复合酶，所述多肽具有连接到至少一种Δ8去饱和酶的至少一种Δ9延伸酶；

(b)至少一种其表达被下调的过氧化物酶体生物合成因子蛋白；和

(c)至少一种重组构建体，所述构建体包含至少一种编码酶的核苷酸序列，所述酶选自丙二酰-辅酶A合成酶和酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶。

优选地，所述丙二酰-辅酶A合成酶基本上由以下序列组成，所述序列选自SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42。

优选地，所述酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶基本上由以下序列组成，所述序列选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32。

优选地，所述复合酶连接子选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

优选地，所述复合酶基本上由以下序列组成，所述序列选自SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13。

在第三个实施方案中，本发明涉及用于制备包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，所述方法包括：

a)培养任何本发明的宿主细胞，其中包含二十碳五烯酸的微生物油被生产；以及，

b)任选地回收步骤(a)的微生物油。

在第四个实施方案中，本发明涉及进一步加工通过本发明的方法制备的油。

在第五个实施方案中，本发明涉及用于生产包含按总脂肪酸的重量百分比计至少50％的二十碳五烯酸的油的重组宿主细胞，所述宿主细胞选自：具有ATCC名称ATCC PTA-10025的解脂耶氏酵母Y8406；具有ATCC名称ATCC PTA-10026的解脂耶氏酵母Y8412；和，具有ATCC名称ATCCPTA-10027的解脂耶氏酵母Y8259。

生物保藏

下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC)(10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)，并且具有下列名称、保藏号和保藏日期。

生物材料	保藏号	保藏日期
			解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8406	ATCC PTA-10025	2009年5月14日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8412	ATCC PTA-10026	2009年5月14日
			解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8259	ATCC PTA-10027	2009年5月14日

上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保藏。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。

附图简述和序列描述

图1A和图1B示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应一起观看。

图2图示了在总脂质级分中生产大于60.9％EPA的解脂耶氏酵母菌株Y9481、Y9497和Y9502的开发。

图3提供了pY116的质粒图谱。

图4提供了下列质粒的图谱：(A)pZKSL-5S5A5；和，(B)pZP3-Pa777U。

图5提供了下列质粒的图谱：(A)pZKUM；和，(B)pZKL2-5mB89C。

图6提供了下列质粒的图谱：(A)pZKL1-2SR9G85；和，(B)pZSCP-Ma83。

图7提供了下列质粒的图谱：(A)pZKL4-398F2；和，(B)pZP2-85m98F。

图8提供了下列质粒的图谱：(A)pZK16-ML8N；和，(B)pZK16-ML。

图9图示了在总脂质级分中生产大于61.8％的EPA的解脂耶氏酵母菌株Y8672的开发。

图10提供了下列质粒的图谱：(A)pZKL2-5m89C；和，(B)pY201，包含嵌合的YAT1::ScAle1S::Lip1基因。

图11提供了下列质粒的图谱：(A)pY168，包含嵌合的YAT1::YlAle1::Lip1基因；和，(B)pY208，包含嵌合的YAT1::MaLPAAT1S::Lip1基因。

图12提供了下列质粒的图谱：(A)pY207，包含嵌合的YAT1::YlLPAAT1::Lip1基因；和，(B)pY175，包含嵌合的YAT1::CeLPCATS::Lip1基因。

图13提供了实施例中所述的每种菌株的EPA％TFA、LA％TFA和EPA％TFA对LA％TFA的比值的比较。

图14提供了下列质粒的图谱：(A)pY222，包含嵌合的YAT1::ScLPAATS::Lip1基因；和，(B)pY177，包含嵌合的YAT1::YlLPAAT1::Lip1基因。

根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。

下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”(“Requirements for PatentApplications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(WorldIntellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(AdministrativeInstructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

SEQ ID NO：1-156是编码启动子、基因或蛋白质(或它们的片段)或质粒的开放阅读框(ORF)，如表1中所述。

表1：基因和蛋白质SEQ ID编号摘要

发明详述

本文描述的是能够生产高于50％的二十碳五烯酸[“EPA”；20:5ω-3]的解脂耶氏酵母生产宿主菌株。通过引入包含具有Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶和C_16/18延伸酶活性的蛋白质的功能性的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，从而使得能够生产EPA并使γ-亚麻酸[“GLA”]最小化，实现这种特定的多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的积累。因此，本公开证明了解脂耶氏酵母能被工程化以允许EPA及其衍生物的商业生产。还主张了生产的方法和由此生产的油。

PUFA如EPA(或其衍生物)被用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品，用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，可以将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可以掺入婴儿代乳品、营养补充剂或其它食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用(人药或兽药)。

为人或动物补充以重组手段产生的PUFA可导致加入的PUFA以及它们的代谢物的水平升高。例如，用EPA处理能够不仅导致EPA水平的升高，而且导致EPA的下游产物如类二十烷酸(即，前列腺素、白三烯、血栓素)、二十二碳五烯酸[“DPA”；顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸；22:5ω-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”；顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸；22:6ω-3]水平的升高。复杂的调控机制使得合并多种PUFA或添加PUFA的不同复合物来预防、控制或克服此类机制，以使特定的PUFA在个体中达到所期望的水平是合乎期望的。

作为另外一种选择，通过本文公开的方法制备的PUFA或其衍生物能应用于动物或水产饲料的合成中，如干饲料、半湿饲料和湿饲料，因为这些制剂一般需要至少1-2％的ω-3和/或ω-6PUFA营养物质组合物。

本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均以引用的方式全文并入本文。

在本公开中，使用了大量的术语和缩写。给出了如下定义。

“开放阅读框”缩写为ORF。

“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。

“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。

“三酰基甘油”缩写为“TAG”。

“辅酶A”缩写为“CoA”。

“总脂肪酸”缩写为“TFA”。

“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。

“细胞干重”缩写为“DCW”。

如本文所用的，术语“发明”或“本发明”旨在指如本文中的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和所有实施方案，并无意于局限于任一具体实施方案或方面。

术语“食物产品”指一般适于人类消耗的任何食物。典型的食物产品包括但不限于：内类产品、谷类产品、烘焙食品、快餐食品、乳制品、饮料等。术语“食物类似物”、“功能性食物”、“医疗食物”和“医疗营养物质”如美国专利申请公布2006-0115881-A1中所定义的。

如本文所用，术语“药物”指一种化合物或物质，如果它在美国售卖，将受Federal Food，Drug and Cosmetic Act的Section 503或505控制。

术语“婴儿代乳品”指设计专用于人类婴儿消耗的食品，因为它模拟人类母乳。婴儿代乳品的典型的商品化实例包括但不限于：Similac

和Isomil

。

术语“饮食补充剂”是指(i)旨在补充饮食并因此不用作常规食品或用作膳食或饮食的单独一项；(ii)包含一种或多种膳食成分(包括例如维生素、矿物质、香草或其它植物制剂、氨基酸、酶和腺体)或它们的组分；(iii)旨在以药丸、胶囊、片剂、或液体形式口服；和(iv)被标记为饮食补充剂的产品。

术语“动物饲料”指旨在专用于动物消耗的饲料，动物包括家畜如宠物、农场动物等，或用于为了生产食品而喂养的动物，如养鱼场。术语“水产养殖饲料”、“水产饲料”和“饲料营养物质”如美国专利申请公布2006-0115881-A1中所定义的。

如本文所用，术语“生物质”具体地讲是指耗费的或使用的酵母细胞物质，其来自以商业上有意义的量生产PUFA的重组生产宿主的发酵，其中优选的生产宿主是含油酵母解脂耶氏酵母的重组菌株。生物质可以是以下形式：全细胞、全细胞溶解产物、匀化细胞、部分水解细胞物质、和/或部分纯化细胞物质(例如微生物产生的油)。

术语“脂质”指任何脂溶性的(即，亲脂的)、天然存在的分子。美国专利申请公布2009-0093543-A1中提供了对脂质的一般综述(参见其中的表2)。

术语“甘油磷脂”是指一大类分子，它们具有甘油核心，在甘油核心的sn-1位和sn-2位有脂肪酸，并且极性的头部基团(例如，磷酸酯、胆碱、胆胺、甘油、肌醇基、丝氨酸、心磷脂)通过磷酸二酯键连接在sn-3位上。甘油磷脂因此包括磷脂酸[“PA”]、磷脂酰胆碱[“PC”]、磷酸酰乙醇胺[“PE”]、磷脂酰甘油[“PG”]、磷脂酰肌醇[“PI”]、磷脂酰丝氨酸[“PS”]和心磷脂[“CL”]。甘油磷脂拥有巨大的多样性，这不仅是可变的磷酰基头部基团所致，而且还因为它们的脂肪酸的不同链长和饱和程度。一般而言，饱和的和单不饱和的脂肪酸在sn-1位被酯化，而多不饱和脂肪酸在sn-2位被酯化。

“溶血磷脂”通过sn-2位脂肪酸的脱酰反应而衍生自甘油磷脂。溶血磷脂包括，例如，溶血磷脂酸[“LPA”]、溶血磷脂酰胆碱[“LPC”]、溶血磷脂酰乙醇胺[“LPE”]、溶血磷脂酰丝氨酸[“LPS”]、溶血磷脂酰甘油[“LPG”]和溶血磷脂酰肌醇[“LPI”]。

术语“油脂”是指在25℃时为液体且通常为多不饱和的脂类物质。在含油生物中，油脂构成了总脂质的主要部分。“油脂”主要由三酰基甘油[“TAG”]组成，但还可包含其他中性脂质、磷脂和游离脂肪酸。油中的脂肪酸组合物和总脂质的脂肪酸组合物一般来讲是相似的；因此，总脂质中的PUFA浓度的提高或降低将对应于油中的PUFA浓度的提高或降低，反之亦然。

“中性脂质”是指那些一般作为贮存脂肪存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们之所以被称为“中性脂质”，是因为在细胞的pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂质一般指脂肪酸的甘油单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。

术语“三酰基甘油”[“TAG”]是指由三个脂肪酰残基酯化一个甘油分子组成的中性脂质。TAG可以包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸。

本文所用术语“总脂肪酸”[“TFA”]是指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定样品中能通过碱酯交换方法(如本领域所已知的)被衍生为脂肪酸甲酯[“FAME”]，所述样品可以是例如生物质或油脂。因此，总脂肪酸包括来自中性脂类级分(包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG)的脂肪酸和来自极性脂质级分(包括，例如，PC和PE级分)的脂肪酸，但是不包括游离脂肪酸。

术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，按干细胞重量[“DCW”]的百分比的形式表示，不过总脂质含量可近似地以FAME占DCW的百分比[“FAME％DCW”]量度。因此，总脂质含量[“TFA％DCW”]等于，例如，每100毫克DCW的脂肪酸毫克数。

本文中总脂质中的脂肪酸浓度表示为TFA的重量％[“％TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非在本文公开内容中另作具体说明，给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于按％TFA计的脂肪酸浓度(例如总脂质的％EPA等同于EPA％TFA)。

在一些情况下，将给定的脂肪酸在细胞中的含量表示为其占干细胞重量的重量％[“％DCW”]是有用的。如此，例如EPA％DCW将根据下式被测定：(EPA％TFA)*(TFA％DCW)]/100。然而，以给定的脂肪酸占干细胞重量的重量％[“％DCW”]表示的给定的脂肪酸在细胞中的含量可以近似计算为：(EPA％TFA)*(FAME％DCW)]/100。

术语“脂质谱”和“脂质组成”是可互换的，并且指在特定脂质级分中，例如在总脂质或油脂中，包含的各种脂肪酸各自的量，其中所述量按TFA的重量％形式表示混合物中存在的各个脂肪酸的总量应当是100。

术语“萃取油”指已经从其他细胞材料中分离的油，例如其能够合成油的微生物。萃取油通过多种方法获得，其中最简单的方法仅涉及物理方法。例如，使用多种挤压构造(例如，螺杆、螺旋压榨机、活塞、珠磨器等)的机械压碎能够从细胞材料分离油。作为另外一种选择，可通过用多种有机溶剂处理(例如己烷)、酶提取、渗透压冲击破碎、超声波提取、超临界流体萃取(例如CO₂萃取)、皂化、以及这些方法的组合进行油萃取。萃取的油不需要进行不必要的纯化或进一步浓缩。本文所述的提取的油将包含至少50EPA％TFA。

术语“混合油”是指通过将本文所述的提取的油与任何组合的或单独的油混合或共混以得到所期望的组成而获得的油。因此，例如，来自不同微生物的各种类型的油能够被混合以得到所期望的PUFA组成。作为另外一种选择或除此之外，本文所公开的包含PUFA的油能够与鱼油、植物油或二者的混合物共混，以得到所期望的组成。

术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为从约₁₂至C₂₂，尽管更长和更短链长的酸都是已知的。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，而Y表示双键的数目。美国专利7,238,482中提供了关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”[“PUFA”]、以及“ω-6脂肪酸”[“ω-6”或“n-6”]对“ω-3脂肪酸”[“ω-3”或“n-3”]之间的区别的更多细节，该专利以引用方式并入本文。

表2提供了用于描述本文的PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及它们的前体的俗名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名称。

表2：多不饱和脂肪酸和前体的命名

术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。该过程在文献中已有很好的描述(如参见美国专利申请公布2006-0115881-A1)。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(称为“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”指与PUFA生物合成相关联的任何以下酶(以及编码所述酶的基因)，所述酶包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和/或C_20/22延伸酶。

术语“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”将指最低程度包括至少一种Δ9延伸酶和至少一种Δ8去饱和酶的PUFA生物合成途径，从而使得能分别从LA和ALA开始，以EDA和/或ETrA作为脂肪酸中间产物来生物合成DGLA和/或ETA。当表达其它去饱和酶和延伸酶时，也可合成ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA和DHA。

术语“去饱和酶”是指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入双键)而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文尤其感兴趣的是：Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶和Δ12去饱和酶。其他有用的去饱和酶能够包括Δ4去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ15去饱和酶和Δ9去饱和酶。

术语“延伸酶”是指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用于其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。该延长过程在与脂肪酸合酶相关的多步骤机制中发生，如国际申请公布WO 2005/047480。延伸酶体系催化反应的实例如GLA转化成DGLA、STA转化成ETA、ARA转化成DTA以及EPA转化成DPA。通常，延伸酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如，C_14/16延伸酶将利用C₁₄底物(例如肉豆蔻酸)，C_16/18延伸酶将利用C₁₆底物(例如棕榈酸)，C_18/20延伸酶将利用C₁₈底物(例如GLA、STA)，而C_20/22延伸酶[也称为Δ5延伸酶或C20延伸酶]将利用C20底物(例如ARA、EPA)。就本文目的而言，能够确定两种不同类型的C_18/20延伸酶：Δ6延伸酶将催化GLA和STA分别转化成DGLA和ETA，而Δ9延伸酶能够催化LA和ALA分别转化成EDA和ETrA。

术语“复合酶”或“融合蛋白”是指具有至少两种独立的和可分离的酶活性的单一多肽，其中第一种酶活性优选与第二种酶活性相连接(美国专利申请公布2008-0254191-A1)。所述至少两种独立的和可分离的酶活性之间的“连接”或“结合”最低限度包含单个多肽键，尽管所述连接也可以由一个氨基酸残基如脯氨酸或包含至少一个脯氨酸残基的多肽组成。优选的连接子选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

术语“DGLA合酶”是指复合酶，其中Δ9延伸酶连接至Δ8去饱和酶。术语“EgD9eS/EgD8M”是指通过连接子序列(即，SEQ ID NO：1[GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS]；美国专利申请公布2008-0254191-A1)将Δ9延伸酶“EgD9eS”(美国专利7,645,604)连接至Δ8去饱和酶“EgD8M”(美国专利7,709,239)而得到的DGLA合酶(SEQ ID NO：8和9)。类似地，术语“EaD9eS/EaD8S”是指通过如SEQ ID NO：1所示的连接子序列将Δ9延伸酶“EaD9eS”(美国专利申请公布2008-0254522-A1)连接至Δ8去饱和酶“EaD8S”(美国专利申请公布2008-0254521-A1)而得到的DGLA合酶(SEQ ID NO：10和11)。并且，术语“E389D9eS/EgD8M”是指通过如SEQ ID NO：1所示的连接子序列将Δ9延伸酶“E389D9eS”(美国专利7,645,604)连接至Δ8去饱和酶“EgD8M”(supra)而得到的DGLA合酶(SEQID NO：12和13)。

术语“转化效率”和“底物转化百分比”是指特定酶(如去饱和酶、延伸酶或复合酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下式测量：([产物]/[底物+产物])*100，其中‘产物’包括直接产物和在该途径中来源于它的所有产物。

术语“C₁₈-C₂₀延伸转化效率”是指C_18//20延伸酶能够将C₁₈底物(即LA、ALA、GLA、STA)转化为C₂₀产物(即EDA、ETrA、DGLA、ETA)的效率。这些C_18//20延伸酶可以或者是Δ9延伸酶或者是Δ6延伸酶。

术语“Δ9延伸转化效率”是指Δ9延伸酶能够将C₁₈底物(即LA、ALA)转化为C₂₀产物(即EDA、ETrA)的效率。

术语“酰基转移酶”是指负责将酰基基团从供体脂质转移至受体脂质分子的酶。

术语“酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶”[“LPLAT”]是指具有使多种溶血磷脂底物在sn-2位酰化的能力的一大类酰基转移酶。更具体地讲，LPLAT包括具有催化LPA至PA的转化的能力的LPA酰基转移酶[“LPAAT”]，具有催化LPC至PC的转化的能力的LPC酰基转移酶[“LPCAT”]，具有催化LPE至PE的转化的能力的LPE酰基转移酶[“LPEAT”]，具有催化LPS至PS的转化的能力的LPS酰基转移酶[“LPSAT”]，具有催化LPG至PG的转化的能力的LPG酰基转移酶[“LPGAT”]，和具有催化LPI至PI的转化的能力的LPI酰基转移酶[“LPIAT”]。LPLAT命名的标准化还未被正式化，因此多种其他的命名也在本领域中被使用(例如，LPAAT也被称为酰基-辅酶A：1-酰基-sn-甘油-3-磷酸2-O-酰基转移酶、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶和/或1-酰基甘油磷酸酰基转移酶[“AGPAT”]，而LPCAT经常被称为酰基-辅酶A：1-酰基溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶)。此外，值得注意的是，一些LPLAT如啤酒糖酵母Ale1(ORF YOR175C；SEQ ID NO：15)，具有广泛的特异性，因此单种酶可能能够催化若干种LPLAT反应，包括LPAAT、LPCAT和LPEAT反应(Tamaki，H.等人，J.Biol.Chem.，282：34288-34298(2007)；

U.等人，FEBS Letters，582：305-309(2008)；Chen，Q.等人，FEBS Letters，581：5511-5516(2007)；Benghezal，M.等人，J.Biol.Chem.，282：30845-30855(2007)；Riekhof，等人，J.Biol.Chem.，282：28344-28352(2007))。

更具体地讲，术语“至少具有溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶[“LPCAT”]活性的多肽”将指那些能够催化下列反应的酶：酰基-辅酶A+1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱→辅酶A+1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(EC 2.3.1.23)。LPCAT活性已被描述于两个结构上不同的蛋白质家族中，即LPAAT蛋白质家族(Hishikawa，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，105：2830-2835(2008)；国际申请公布WO 2004/076617)和ALE1蛋白质家族(Tamaki，H.等人，参见上文；

U.等人，参见上文；Chen，Q.等人，参见上文；Benghezal，M.等人，参见上文；Riekhof，等人，参见上文)。

术语“LPCAT”是指满足下列的ALE1蛋白质家族的蛋白：1)具有LPCAT活性(EC 2.3.1.23)并且基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ IDNO：15(ScAle1)和SEQ ID NO：17(YlAle1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少约45％的氨基酸同一性；和/或，2)具有LPCAT活性(EC 2.3.1.23)并且具有至少一种膜结合O-酰基转移酶[“MBOAT”]蛋白质家族基序，所述基序选自M(V/I)LxxKL(SEQ ID NO：18)、RxKYYxxW(SEQ ID NO：19)、SAxWHG(SEQ ID NO：20)和EX₁₁WNX₂-[T/V]-X₂W(SEQ ID NO：21)。ALE1多肽的实例包括ScAle1和YlAle1。

术语“ScAle1”是指从啤酒糖酵母(ORF“YOR175C”)分离的LPCAT(SEQ ID NO：15)，其被如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列编码。与此相对，术语“ScAle1S”是指来源于啤酒糖酵母的合成的LPCAT，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达(即，SEQ ID NO：22和23)。

术语“YlAle1”是指从解脂耶氏酵母分离的LPCAT(SEQ ID NO：17)，其被如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列编码。

术语“LPCAT”还指具有LPCAT活性(EC 2.3.1.23)，并且基于ClustalW比对方法，在与如SEQ ID NO：25(CeLPCAT)所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少约90％的氨基酸同一性的蛋白质。

术语“CeLPCAT”是指从秀丽隐杆线虫分离的LPCAT酶(SEQ IDNO：25)，其被如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列编码。与此相对，术语“CeLPCATS”是指来源于秀丽隐杆线虫的合成LPCAT，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达(即，SEQ ID NO：26和27)。

术语“至少具有溶血磷脂酸酰基转移酶[“LPAAT”]活性的多肽”将指那些能够催化下列反应的酶：酰基-辅酶A+1-酰基-sn-甘油3-磷酸→辅酶A+1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸(EC 2.3.1.51)。

术语“LPAAT”是指满足下列的蛋白质：1)具有LPAAT活性，并且基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：29(MaLPAAT1)、SEQ IDNO：31(YlLPAAT1)和SEQ ID NO：32(ScLPAAT1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少约43.9％的氨基酸同一性；和/或，2)具有LPAAT活性并且具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序，所述基序选自：NHxxxxD(SEQ ID NO：33)和EGTR(SEQ ID NO：34)。LPAAT多肽的实例包括ScLPAAT、MaLPAAT1和YlLPAAT1。

术语“ScLPAAT”是指从啤酒糖酵母(ORF“YDL052C”)分离的LPAAT(SEQ ID NO：32)。

术语“MaLPAAT1”是指从高山被孢霉分离的LPAAT(SEQ IDNO：29)，其被如SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列编码。与此相对，术语“MaLPAAT1S”是指来源于高山被孢霉的合成的LPAAT，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达(即，SEQ ID NO：35和36)。

术语“YlLPAAT1”是指从解脂耶氏酵母分离的LPAAT(SEQ IDNO：31)，其被如SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列编码。

术语“直系同源物”是指如通过在系统发育树分析中处于一个进化枝上和催化相同的酶反应显示的，从共同的祖先蛋白质进化而来的来自不同物种的同源蛋白质。

术语“二酰基甘油胆碱磷酸转移酶”是指酶(EC 2.7.8.2)，它催化从CDP-胆碱和1，2-二酰基甘油合成磷脂酰胆碱。这种酶是CDP-胆碱途径的组成部分，负责磷脂酰胆碱[“PC”]生物合成。

术语“YlCPT1”是指二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(SEQ ID NO：38)，该酶分离自解脂耶氏酵母，由SEQ ID NO：37编码。YlCPT1描述于国际申请公布WO 2006/052870中(另参见GenBank登录号XM_501703(YALI0C10989g))。

术语“丙二酸”，根据国际纯粹与应用化学联合会[“IUPAC”]系统命名法也被称为丙烷二羧酸，是指如CH₂(COOH)₂所示的化学结构的二元羧酸。丙二酸根或丙烷二羧酸根离子通过失去两个氢离子来源于丙二酸(即，CH₂(COO)₂ ^2-)。丙二酸的盐和酯包括但不限于丙二酸二乙酯[(C₂H₅)₂(C₃H₂O₄)]、丙二酸二甲酯[(CH₃)₂(C₃H₂O₄)]和丙二酸二钠[Na₂(C₃H₂O₄)]。

“丙二酸根”是指丙二酸的电离形式以及它的酯和盐。所有这些在本文中统称为“丙二酸”。

“丙二酸-辅酶A”[CAS编号524-14-1]是指能够通过乙酰-辅酶A向丙二酰-辅酶A的羧化反应形成的酰基硫酯。作为另外一种选择，丙二酰-辅酶A通过丙二酰-辅酶A合成酶从底物丙二酸酶反应地产生。

“丙二酰-辅酶A合成酶”[EC 6.2.1.-]催化下列酶反应：丙二酸+ATP+辅酶A→丙二酰-辅酶A+AMP+焦磷酸(PPi)。该酶首先纯化自丙二酸-生长型荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens)(Kim，Y.S.和S.K.Bang，J.Biol.Chem.，260：5098-5104(1985))，尽管之后又从豆科植物根瘤中的类细菌分离了多种根瘤菌同源物(参见，例如，Kim，Y.S.和H.Z.Chae，Biochem.J.，273：511-516(1991)和Kim，Y.S.和S.W.Kang，Biochem.J.，297：327-333(1994))。

如本文所用，术语“rMCS”是指编码从豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum bv.viciae)3841(GenBank登录号YP_766603)分离的丙二酰-辅酶A合成酶(SEQ ID NO：40)的基因(SEQ ID NO：39)。类似地，术语“MCS”编码来源于豌豆根瘤菌3841的丙二酰-辅酶A合成酶的、针对在解脂耶氏酵母中的表达经过密码子优化的合成的基因(即，SEQ ID NO：41和42)。

术语“过氧化物酶体”是指普遍存在于所有真核细胞中的细胞器。它们具有单独的脂双层膜，该膜将它们的内容物与细胞溶质分离开来，并且包含下文所述功能必需的多种膜蛋白。过氧化物酶体经由“扩展的穿梭机制”选择性输入蛋白。更具体地讲，存在着至少32个已知的过氧化物酶体蛋白(称为peroxin)，它们参与通过ATP水解穿过过氧化物酶体膜输入蛋白的过程。一旦细胞蛋白进入过氧化物酶体，它们通常经过一些方法降解。例如，过氧化物酶体包含氧化酶，例如过氧化氢酶、D-氨基酸氧化酶和尿酸氧化酶，这些酶能够降解对细胞有毒的物质。作为另外一种选择，过氧化物酶体降解脂肪酸分子以生成乙酰-辅酶A游离分子，它们被输回到细胞溶质中，该过程称为β-氧化。

术语“过氧化物酶体生物合成因子蛋白”、“过氧化物酶体蛋白”和“Pex蛋白”是可互换的，并且指涉及过氧化物酶体生物合成的和/或参与通过ATP水解使细胞蛋白穿过过氧化物酶体膜的过程的蛋白。编码任何这些蛋白的基因的首字母缩写是“Pex基因”。基因的命名体系描述于Distel等人，J.Cell Biol.，135：1-3(1996)中。迄今已经在多种真核生物中鉴定了至少32个不同的Pex基因。已经从对突变体的分析中分离了多种Pex基因，所述突变体显示具有异常的过氧化物酶体功能或结构。根据Kiel，J.A.K.W.，等人(Traffic，7：1291-1303(2006))的综述，其中进行了对17种不同的真菌物种基因组序列的计算机分析，鉴定了下列Pex蛋白质：Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21Bp、Pex22p、Pex22p-like和Pex26p。这些蛋白本文将统称为由“Pex基因”编码的“Pex蛋白”。

术语“保守结构域”或“基序”表示进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表明对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。

术语“下调”在至少一种过氧化物酶体生物合成因子蛋白中或与之相关时，是指与野生型蛋白质的活性相比，天然的过氧化物酶体生物合成因子蛋白的活性的降低或消除。下调通常在天然的Pex基因具有“破坏”时发生，“破坏”指在该基因的部分中的插入、缺失、或定向突变，所述破坏导致整个基因敲除使得该基因从基因组中缺失并且不翻译出蛋白质，或者导致翻译的Pex蛋白具有插入、缺失、氨基酸取代或其它定向突变。蛋白中的中断位置可以是在例如蛋白的N-末端部分中或在蛋白的C-末端部分中。中断的Pex蛋白相对于未中断的Pex蛋白将具有减弱的活性，并且可能是无功能的。导致Pex蛋白质的表达降低或缺失的下调还可以通过操纵调控序列、转录和翻译因子和/或信号转导途径，或者通过使用有义、反义或RNAi技术等实现。

术语“含油的”是指倾向于以油的形式贮存它们的能源的那些生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980)。术语“含油酵母”是指那些能够产油并被归类为酵母的微生物。通常，含油微生物的细胞油脂含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。含油酵母的实例包括但不限于以下属：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。

术语“可发酵的碳源”是指微生物将其代谢以获取能量的碳源。典型的碳源包括但不限于：单糖、二糖、低聚糖、多糖、烷烃、脂肪酸、脂肪酸的酯、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸盐和含碳胺类。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”本文可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。核苷酸(通常以它们的5’-单磷酸形式存在)通过单字母命名指代如下：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。

氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包含的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过对所述序列的人工评估进行，或者可以利用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多邻接氨基酸或者30个或更多个核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个连续核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(例如Southern杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)的方法中。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。

“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

“合成基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位装配而成。将这些寡核苷酸基本单位进行退火并随后连接以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏好性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。例如在美国专利公开7,125,672中提供了解脂耶氏酵母的密码子使用谱。

“基因”指能够表达特定蛋白的核酸片段，并且其可单独指编码区或可包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源基因”是指在生物基因组中的天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入至宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因、或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、增强子、沉默子、5′非翻译前导序列(例如在转录起始位点和翻译起始密码子之间的序列)、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整体源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“3′非编码序列”和“转录终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。

术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它可操作地与编码序列连接。即，编码序列处于启动子的转录控制下。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

如本文所用，术语“表达”是指有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

“转化”是指将核酸分子转移进宿主生物。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，例如，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。包含转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化的”生物体或“转化体”。

“稳定转化”是指将核酸片段转移进宿主生物的基因组中(既包括核基因组也包括细胞器基因组)，导致基因稳定遗传(即，该核酸片段被“稳定地整合”)。相反，“瞬时转化”是指核酸片段转移进宿主生物体的胞核中或含DNA的细胞器中，从而导致基因表达而不整合或不稳定遗传。

术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。

术语“表达盒”指DNA片段，所述DNA片段包含：所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于该编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因此，表达盒通常由下列组成：1)启动子序列；2)编码序列(即，ORF)；和3)3′非翻译区(即终止子)，所述非翻译区在真核生物中通常包含多聚腺苷酸化位点。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。只要能针对每种宿主使用正确的调控序列，则可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中。

术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1)GCG程序软件包(Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文中称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory Cold：Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。

通常，含油微生物的脂质蓄积是响应存在于生长培养基中的总的碳氮比而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16:0)的从头合成)在美国专利7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和的和不饱和的脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延伸酶和去饱和酶的作用形成(图1)。

可将多种脂肪酸(包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸)掺入TAG，它是脂肪酸的主要贮藏单位。在本文所述的方法和宿主细胞中，EPA向TAG中的掺入是最合乎期望的，尽管EPA的结构形式是不受限制的(因此，例如，EPA在总脂质中可以作为游离脂肪酸或以酯化形式如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂存在)。

虽然大多数PUFA以中性脂类的形式掺入TAG并贮存于脂质体中，但是重要的是认识到在含油生物中测量总PUFA应至少包括那些位于PC、PE和TAG级分中的PUFA。

其中油酸转化成EPA的代谢过程涉及通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊去饱和酶和延长酶。然而，如在图1中看到的和如下文所述的，存在多个用于EPA生产的替代途径。

具体地讲，图1描述了下文所述的途径。所有途径都需要首先通过Δ12去饱和酶将油酸转化为亚油酸[“LA”]-第一个ω-6脂肪酸。然后，使用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”并用LA作底物，如下形成长链ω6脂肪酸：1)通过Δ9延伸酶将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”]；2)通过Δ8去饱和酶将EDA转化成二高-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4)通过C_20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；以及，5)通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。

“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”也能够利用α-亚麻酸[“ALA”]作为底物生产长链ω-3脂肪酸如下：1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA，第一个ω-3脂肪酸；2)通过Δ9延伸酶将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”]；3)通过Δ8去饱和酶将ETrA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5)通过C_20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，ω-6脂肪酸可转化成ω-3脂肪酸；例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。就本文目的而言，有利t的是Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径能够生产不含显著量的γ-亚麻酸[“GLA”]的EPA油。

ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ6去饱和酶和C_18/20延伸酶，即“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”。更具体地讲，通过Δ6去饱和酶，LA和ALA可分别被转化为GLA和十八碳四烯酸[“STA”]；然后，C_18/20延伸酶将GLA转化为DGLA并且/或者将STA转化为ETA。

EPA在重组耶氏酵母属宿主细胞中经济的商业生产需要考虑多种变量，包括EPA浓度[“EPA％TFA”]和总脂质含量[“TFA％DCW”]。此外，还期望在最终的油产品中降低中间体脂肪酸和副产物脂肪酸的生产，以使所期望的脂肪酸即EPA的生产最大化。

中间体脂肪酸是能够通过其他代谢途径的酶的作用被进一步转化为EPA的那些脂肪酸(例如，油酸、LA、ALA、EDA、DGLA、ETA)。与此相对，副产物脂肪酸(例如，金松烯酸、杜松烯酸)是指所产生的既不是EPA也不是能被进一步转化为EPA的中间体脂肪酸的任何脂肪酸。

美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了具有生产微生物油的能力的优化的重组解脂耶氏酵母菌株，其中所述微生物油包含至少约43.3EPA％TFA，同时具有少于约23.6LA％TFA(EPA∶LA比值为1.83)。优选的菌株是Y4305，其最高产量为55.6EPA％TFA，具有3.03的EPA∶LA比值。一般地，美国专利申请公布2009-0093543-A1的EPA菌株包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的下列基因：

a)至少一种编码Δ9延伸酶的基因；和，

b)至少一种编码Δ8去饱和酶的基因；和，

c)至少一种编码Δ5去饱和酶的基因；和，

d)至少一种编码Δ17去饱和酶的基因；和，

e)至少一种编码Δ12去饱和酶的基因；和，

f)至少一种编码C_16/18延伸酶的基因；和，

g)任选地，至少一种编码二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT1)的基因。

具有上述酶学功能的优选的基因的实例列于表3中(尽管这些基因不应视为对本发明的限制)。

本文提供的是具有生产改善的微生物油能力的优化的重组解脂耶氏酵母菌株，所述改善是基于EPA％TFA和EPA∶LA的比值，相对于美国专利申请公布2009-0093543-A1中所述的那些菌株而言。除了表达如上文所定义的并如美国专利申请公布2009-0093543-A1中所详述的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因外，这些改善的菌株的区别特征还在于：

1)包含至少一种复合酶，所述复合酶包含具有连接到至少一种脂肪酸Δ8去饱和酶的至少一种Δ9延伸酶[“DGLA合酶”]的多肽；

2)任选地包含至少一种编码酶的多核苷酸，所述酶选自丙二酰-辅酶A合成酶或酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶[“LPLAT”]；

3)包含至少一种其表达被下调的过氧化物酶体生物合成因子蛋白；

4)生产至少约50EPA％TFA；和，

5)具有至少约3.1的EPA∶LA比值。

美国专利申请公布2008-0254191-A1，尤其是实施例55和56(这两个实施例以引用方式并入本文)，描述了当在解脂耶氏酵母中异源表达时，相对于它们单独的Δ9延伸酶和/或Δ8去饱和酶对应物具有改善的酶学活性的DGLA合酶。与本公开尤其相关的是，连接子序列(即，SEQ ID NO：1[GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS])被用于使Δ9延伸酶(即，EgD9eS、EaD9eS或E389D9eS)与Δ8去饱和酶(即，EgD8M或EaD8S)融合，从而得到EgD9eS/EgD8M(SEQ ID NO：8和9)、EaD9eS/EaD8S(SEQ ID NO：10和11)和E389D9eS/EgD8M(SEQ ID NO：12和13)。令人意外地，使这两种独立的酶融合为一个由连接子区域分隔的融合蛋白提高了从LA到DGLA的流量，表明在该融合蛋白中，Δ9延伸酶的产物可能作为Δ8去饱和酶的底物被直接输送。

下文的表4提供了对作为基因融合的结果，美国专利申请公布2008-0254191-A1中以转化效率标注的改善的总结。具体而言，以粗体字显示的数字是延伸酶或去饱和酶活性的改善百分比，而括号中显示的细节提供了基因融合中的延伸酶或去饱和酶转化效率对比当该基因被单独表达时的延伸酶或去饱和酶转化效率。

表4：Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶转化作为基因融合结果的改善

基于上述结果，在具有生产改善的EPA％TFA的能力的改善的优化的重组解脂耶氏酵母菌株中，至少一种DGLA合酶(例如上文所述的EgD9eS/EgD8M、EaD9eS/EaD8S和E389D9eS/EgD8M基因融合)的表达是优选的。这种基因融合能够利用适用于在解脂耶氏酵母中的表达的优选的Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶的任何组合而产生；并且，所述连接子可选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

先前的研究已确定，涉及在解脂耶氏酵母中工程化PUFA生产的许多基因突变导致了在发酵过程中副产物丙二酸的增加(丙二酸占所积累的总有机酸的～45％)。异源丙二酰-辅酶A合成酶的表达逆转了这一效应，并导致副产物丙二酸的大幅度减少。

更具体地讲，美国专利申请12/637877(提交于2009年12月15日，代理人案号CL4323)描述了在产物生产过程中，避免在发酵过程中不能被进一步利用的有机酸(具体而言为丙二酸)“副产物”的积累的一般化方法。这避免了生物体内碳和能量的浪费，减少了在发酵过程中维持最佳的pH范围所需的碱的量，并且减少了发酵废蒸汽中需要中和的副产物有机酸的量。

丙二酰-辅酶A合成酶[EC 6.2.1.-]催化下列酶反应：丙二酸+ATP+辅酶A→丙二酰-辅酶A+AMP+焦磷酸(PPi)。通过将副产物(即，丙二酸)转化为丙二酰-辅酶A，该底物变得可用于生物体中的脂肪酸合成。具体而言，脂肪酸合成可概括为下列公式(忽略H⁺和水)：乙酰-辅酶A+7丙二酰-辅酶A+14NADPH→棕榈酸酯+7CO₂+14NADP⁺+8辅酶A。

在美国专利申请12/637877中构建并在解脂耶氏酵母中表达了经密码子优化的丙二酰-辅酶A合成酶。具体而言，基于来自豌豆根瘤菌3841的丙二酰-辅酶A合成酶基因的编码序列(rMCS；SEQ ID NO：39和40，对应于GenBank登录号YP_766603)，设计了经密码子优化的丙二酰-辅酶A合成酶基因(“MCS”，SEQ ID NO：41)。除对翻译起始位点的改变外，还改变了1515bp编码区(包括终止密码子)中的233bp(15.4％)、优化了219个密码子(43.4％)、将GC含量从野生型基因(即，rMCS)中的61.4％降低至合成基因(即，MCS)中的55.6％，并且由于耶氏酵母不能利用“GTG”进行翻译起始，还在rMCS基因(SEQ ID NO：39)前面添加了翻译起始密码子“ATG”。上述经密码子优化的MCS基因(SEQ ID NO：41)为编码505个氨基酸的多肽的1518bp和终止密码子(SEQ ID NO：42)。

MCS(SEQ ID NO：42)在解脂耶氏酵母菌株Y4305U中的表达生产了49EPA％TFA，使丙二酸的总量(g/g DCW)降低了～94％，而既没有影响脂肪酸谱也没有影响总脂质产量(TFA％DCW)。

基于上述结果，至少一种丙二酰-辅酶A合成酶在改善的优化的重组解脂耶氏酵母菌株中的表达，作为减少不需要的副产物的产生并从而降低生产成本的手段是合乎期望的。优选的丙二酰-辅酶A合成酶如SEQ ID NO：40和42所示，但这些不应对本公开构成限制。本领域的技术人员能够容易地辨识适用于在解脂耶氏酵母中的表达的替代性异源丙二酰-辅酶A合成酶。

甘油磷脂是生物酶的主要组分，其包含甘油核心，脂肪酸作为R基连接在甘油核心的sn-1位和sn-2位上，而极性头部基团通过磷酸二酯键连接在sn-3位上。下面的表5概述了最初由Kennedy和Weiss(J.Biol.Chem.，222：193-214(1956))描述的从头生物合成途径的步骤：

表5：甘油磷脂从头生物合成的一般反应

在被从头合成之后，甘油磷脂能够经历sn-2位的脂肪酰成分的快速翻转。这种“重构”，或者“酰基编辑”，被认为是甘油磷脂的脱酰反应和所得到的溶血磷脂随后的再酰化所致。

在Lands循环(Lands，W.E.，J.Biol.Chem.，231：883-888(1958))中，重构通过下列协同的反应发生：1)磷脂酶，例如磷脂酶A₂，从磷脂酰胆碱的sn-2位释放脂肪酸；和，2)酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶[“LPLAT”]，例如溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶[“LPCAT”]，使溶血磷脂酰胆碱[“LPC”]在sn-2位再酰化。其他的甘油磷脂也可以在它们相应的溶血磷脂酰基转移酶活性作用下涉及重构，包括具有溶血磷酸酰乙醇胺酰基转移酶[“LPEAT”]活性、溶血磷脂酰丝氨酸酰基转移酶[“LPSAT”]活性、溶血磷脂酰甘油酰基转移酶[“LPGAT”]活性和溶血磷脂酰肌醇酰基转移酶[“LPIAT”]活性的LPLAT酶。在所有情况下，LPLAT负责从细胞的酰基-辅酶A库中移除酰基-辅酶A脂肪酸和在sn-2位酰化磷脂库中的多种溶血磷脂底物。最后，LPLAT还包括涉及从LPA向PA的从头生物合成的LPAAT酶。

在其他的情况下，这种sn-2位重构被认为是具有LPCAT活性的酶的正向和逆向反应所致(Stymne S.和A.K.Stobart，Biochem J.，223(2)：305-314(1984))。

Shindou等人最近的数篇综述提供了对甘油磷脂生物合成和LPLAT的功能的概述(J.Biol.Chem.，284(1)：1-5(2009)；J.Lipid Res.，50：S46-S51(2009))。并且，基于保守基序的存在，在公开文献和专利文献中已报道了多种LPLAT。

更具体地讲，已提出了多种LPLAT基序，它们根据在被分析的比对中所包括的特定物种存在少量变异。例如，Shindou等人(Biochem.Biophys.Res.Comm.，383：320-325(2009))基于对来自人类(Homo sapiens)、红原鸡(Gallus gallus)、斑马鱼(Danio rerio)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的序列的比对，提出了下列对LPLAT活性重要的膜结合O-酰基转移酶[“MBOAT”]家族基序：WD、WHGxxxGYxxxF(SEQ ID NO：99)、YxxxxF(SEQ ID NO：100)和YxxxYFxxH(SEQ ID NO：101)。这些之中，WD、WHGxxxGYxxxF和YxxxxF基序存在于ScAle(SEQ ID NO：15)和YlAle1(SEQ ID NO：17)中，但YxxxYFxxH基序不是。就Ale1同源物而言，替代性的非植物基序也描述于美国专利申请公布2008-0145867-A1中；具体而言，这些包括：M-[V/I]-[L/I]-xxK-[L/V/I]-xxxxxxDG(SEQ ID NO：102)、RxKYYxxWxxx-[E/D]-[A/G]xxxxGxG-[F/Y]-xG(SEQ ID NO：103)、EX₁₁WNX₂-[T/V]-X₂W(SEQ ID NO：21)和SAxWHGxxPGYxx-[T/F]-F(SEQID NO：104)。

类似地，Lewin，T.W.等人(Biochemistry，38：5764-5771(1999)和Yamashita等人(Biochim.Biophys.Acta，1771：1202-1215(2007))基于对来自细菌、酵母、线虫和哺乳动物的序列的比对，提出了下列对LPLAT活性重要的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶[“LPAAT”]家族基序：NHxxxxD(SEQ ID NO：33)、GxxFI-[D/R]-R(SEQ ID NO：105)、EGTR(SEQ ID NO：34)以及[V/I]-[P/X]-[I/V/L]-[I/V]-P-[V/I](SEQ ID NO：106)和IVPIVM(SEQ IDNO：107)二者之一。上述NHxxxxD和EGTR基序存在于MaLPAAT1(SEQ IDNO：29)、YlLPAAT1(SEQ ID NO：31)和CeLPCAT(SEQ ID NO：25)中，但其他基序不是。

基于可公开获得的Ale1、LPCAT和LPAAT蛋白质序列，包括本文所描述的那些，用于包括在本文改善的优化的重组解脂耶氏酵母菌株中的LPLAT或者具有选自M(V/I)LxxKL(SEQ ID NO：18)、RxKYYxxW(SEQ IDNO：19)、SAxWHG(SEQ ID NO：20)和EX₁₁WNX₂-[T/V]-X₂W(SEQ ID NO：21)的MBOAT家族基序，或者具有选自NHxxxxD(SEQ ID NO：33)和EGTR(SEQ ID NO：34)的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序。

由于脂肪酸的生物合成需要酰基-辅酶A库和磷脂库之间酰基基团的迅速交换，LPLAT对PUFA生产的影响也已被设想。具体而言，去饱和主要在磷脂的sn-2位发生，而延伸在酰基-辅酶A库中发生。

更具体地讲，此前LPCAT已被假设对于解脂耶氏酵母的TAG部分中EPA的积累可能是重要的(美国专利申请公布2006-0115881-A1)。如该文献中所述，这一假设基于下列研究：1)Stymne S.和A.K.Stobart(Biochem.J.，223(2)：305-314(1984))，他们假设酰基-辅酶A库和PC库之间的交换可能是由于LPCAT的正向和逆向反应；2)Domergue，F.等人(J.Bio.Chem.，278：35115(2003))，他们提出GLA在PC的sn-2位的积累和酵母中ARA不能被有效地合成是因为涉及PUFA生物合成的延伸步骤在酰基-辅酶A库中发生，而Δ5和Δ6去饱和步骤主要在PC的sn-2位发生；3)Abbadi，A.等人(The Plant Cell，16：2734-2748(2004))，他们根据在转基因油料种子植物中对PUFA积累限制的分析，提出LPCAT在Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径的成功重构中起着关键作用；和4)Renz，A.等人在国际申请公布WO 2004/076617A2和WO 2004/087902 A2中的工作。

更具体地讲，国际申请公布WO 2004/076617 A2描述了一种LPCAT从秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(克隆T06E8.1)[“CeLPCAT”]的分离，并报道了当这种LPCAT在分别用外源的18:2或α-亚麻酸[“ALA”；18:3]脂肪酸饲养的经生物工程改造的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中表达时，Δ6去饱和和Δ6延伸的效率的提高，以及长链PUFA二十碳二烯酸[“EDA”；20:2]和二十碳四烯酸[“ETA”；20:4]的生物合成分别提高。

国际申请公布WO 2004/087902 A2(实施例16)描述了高山被孢霉(Mortierella alpina)LPAAT-样蛋白质(分别由具有417个氨基酸长度或389个氨基酸长度的蛋白质编码，它们除N端28个氨基酸残基的延伸外是相同的)的分离，并报道了这些蛋白质之一利用与国际申请公布WO2004/076617 A2中的那些相似的方法的表达，表达导致了EDA和ETA生物合成的类似改善。

国际申请公布WO 2004/076617和WO 2004/087902教导了EDA和ETA的生物合成的改善是由于CeLPLAT和一些LPAAT-样蛋白质中可逆的LPCAT活性，尽管不是所有的LPAAT-样蛋白质均具有LPCAT活性。此外，Renz，A.等人推断，LPCAT允许新合成的脂肪酸在磷脂和酰基-辅酶A库之间有效的和持续的交换，因为去饱和酶催化双键向PC-偶联的脂肪酸中的引入而延伸酶专门地催化辅酶A酯化的脂肪酸(酰基-辅酶A)的延伸。

多份其他的参考文献一般地描述了LPLAT与PUFA生物合成基因的共表达对于在转基因生物的油中提高所期望的脂肪酸的量、提高总的油含量或者选择性地提高所期望的脂肪酸的含量的有益效果(例如，国际申请公布WO 2006/069936、WO 2006/052870、WO 2009/001315、WO2009/014140)。

本文中(以及申请人的受让人的共同提交的美国临时专利申请61/187359中，该专利提交于2009年6月16日，代理人案号为CL4361USPRV，以引用方式全文并入本文)证明了LPAAT和LPCAT对于EPA在解脂耶氏酵母的TAG部分中的积累的确是重要的。具体而言，发现了LPLAT的过表达能够导致Δ9延伸酶转化效率的改善。如上文所定义的，术语“转化效率”是指特定的酶例如Δ9延伸酶能够将底物(例如LA)转化为产物(例如EDA)的效率。因此，在经过改造以生产EPA的菌株中，Δ9延伸酶转化效率的改善被证明导致EPA％TFA和/或EPA％DCW的提高。

这些结果以及其他的支持性工作，是下文主张的用于在生产LC-PUFA的重组含油微生物宿主细胞中提高C₁₈-C₂₀延伸转化效率的方法的基础，其中所述方法包括：

a)向所述生产LC-PUFA的重组宿主细胞中导入至少一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码至少具有酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽，其中所述多肽选自：

(i)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：15(ScAle1)和SEQ ID NO：17(YlAle1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少45％的氨基酸同一性的多肽；

(ii)具有至少一种膜结合O-酰基转移酶蛋白家族基序的多肽，其中所述基序选自：M(V/I)LxxKL(SEQ ID NO：18)、RxKYYxxW(SEQ ID NO：19)、SAxWHG(SEQ ID NO：20)和EX₁₁WNX₂-[T/V]-X₂W(SEQ ID NO：21)；

(iii)基于Clustal W比对方法，在与如SEQ ID NO：25(CeLPCAT)所示的氨基酸序列进行比较时，具有至少90％的氨基酸同一性的多肽；

(iv)基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO：29(MaLPAAT1)、SEQ ID NO：31(YlLPAAT1)和SEQ ID NO：32(ScLPAAT1)的氨基酸序列进行比较时，具有至少43.9％的氨基酸同一性的多肽；和

(v)具有至少一种1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶蛋白家族基序的多肽，其中所述基序选自：NHxxxxD(SEQ ID NO：33)和EGTR(SEQ ID NO：34)；

其中所述编码至少具有酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的至少一种分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，所述调控序列是相同的或不同的；以及，

b)使所述含油的微生物宿主细胞生长；

其中所述含油的微生物宿主细胞的C₁₈-C₂₀延伸转化效率相对于对照宿主细胞提高。

优选地，所述编码至少具有酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的多核苷酸是稳定整合的并且所述C₁₈-C₂₀延伸转化效率的提高为至少约4％，

更优选地，与对照宿主细胞相比，所述在至少一种生产LC-PUFA的含油微生物宿主细胞中C₁₈-C₂₀延伸转化效率的提高为至少约4-10％，更优选至少约10-20％，更优选至少约20-40％，以及最优选至少约40-60％或更高。

基于上述C₁₈-C₂₀延伸转化效率的改善，相对于美国专利申请公布2009-0093543-A1中所述的那些菌株，具有生产改善的EPA％TFA的能力的优化的重组解脂耶氏酵母菌株，将任选地包含至少一种如上文所述的方法中所定义的酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶[“LPLAT”]。在优选的实施方案中，所述LPLAT的氨基酸序列选自：SEQ ID NO：15(ScAle1)、SEQ IDNO：16(YlAle1)、SEQ ID NO：25(CeLPCAT)、SEQ ID NO：29(MaLPAAT1)、SEQ ID NO：31(YlLPAAT1)和SEQ ID NO：32(ScLPAAT1)。

美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了在重组耶氏酵母属中有用的多种敲除，包括对转化体的选择有用的那些、减少了脂肪酸的降解和TAG的降解的那些和显得导致表型上“中性”的突变(其中耶氏酵母宿主细胞显得未受影响)的那些。然而，最优选的是导致相对于总脂肪酸的EPA浓度[“EPA％TFA”]升高的那些基因敲除(例如，二酰基甘油酰基转移酶基因敲除，过氧化物酶体生物合成因子蛋白[“PEX”]基因敲除)。

更具体地讲，美国专利申请公布2009-0093543-A1设想，在一些优选的重组耶氏酵母生产宿主中，所述宿主选自下列的缺乏编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因：Pex1p(SEQ ID NO：108)、Pex2p(SEQ IDNO：109)、Pex3p(SEQ ID NO：110)、Pex3Bp(SEQ ID NO：111)、Pex4p(SEQID NO：112)、Pex5p(SEQ ID NO：113)、Pex6p(SEQ ID NO：114)、Pex7p(SEQID NO：115)、Pex8p(SEQ ID NO：116)、Pex10p(SEQ ID NO：117)、Pex12p(SEQ ID NO：118)、Pex13p(SEQ ID NO：119)、Pex14p(SEQ ID NO：120)、Pex16p(SEQ ID NO：121)、Pex17p(SEQ ID NO：122)、Pex19p(SEQ IDNO：123)、Pex20p(SEQ ID NO：124)、Pex22p(SEQ ID NO：125)和Pex26p(SEQ ID NO：126)。更优选的被破坏的过氧化物酶体生物合成因子蛋白是Pex2p、Pex3p、Pex10p、Pex12p和Pex16p，尽管只提供了涉及Pex10p的数据。

国际申请公布WO 2009/046248通过比较解脂耶氏酵母的ΔPex16、ΔPex3和ΔPex10菌株，确认并拓展了美国专利申请公布2009-0093543-A1中提出的假设和研究。该文献中的结果显示，相对于针对EPA的生产工程化的未破坏的菌株，Pex10的破坏导致了EPA％TFA 3.3倍的升高和C₂₀PUFA的量1.7倍的升高。类似地，在针对DGLA的生产工程化的ΔPex16菌株中观察到了DGLA％TFA 1.65倍的升高和C₂₀＞PUFA％TFA 1.3倍的升高。在针对DGLA的生产工程化的ΔPex3菌株中观察到了DGLA％TFA2.0倍的升高和C₂₀PUFA％TFA 1.7倍的升高。

这些结果以及其他的支持性工作，是下文主张的用于在具有总脂质含量、总脂质级分和油级分的含油真核生物体中提高相对于总脂肪酸的重量％的一种PUFA或PUFA的组合的重量％的方法的基础，所述方法包括：

a)提供含油真核生物，所述生物在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中包含破坏，这产生PEX破坏的生物；和编码功能性PUFA生物合成途径的基因；以及

b)使所述PEX破坏的生物在下述条件下生长：当与未破坏其天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白的含油真核生物中的那些的重量％相比较时，PEX破坏的生物的总脂质级分和油级分中的至少一种PUFA的重量％相对于总脂肪酸的重量％增加。

按总脂肪酸的百分比计增加的一定量的PUFA可以是：1)相对于PUFA中间体或副产物，是功能性PUFA生物合成途径所期望的终产物的PUFA；2)C₂₀-C₂₂PUFA；和/或，3)总的PUFA。

除了相对于总脂肪酸重量％提高一种PUFA或PUFA组合的重量％之外，在一些情况下，还可以提高或降低细胞的总脂质含量(TFA％DCW)。这意味着无论PEX基因破坏是否引起PEX破坏细胞中的总脂质量提高或降低，该破坏总是引起一种PUFA或PUFA组合的重量％提高。

基于以上所述，相对于美国专利申请公布2009-0093543-A1中所述的那些菌株，具有生产改善的EPA％TFA的能力的优化的重组解脂耶氏酵母菌株将包含至少一种其表达已被下调的过氧化物酶体生物合成因子蛋白(即，从而产生PEX破坏的生物)。在优选的菌株中，所述下调的过氧化物酶体生物合成因子蛋白是Pex3p(SEQ ID NO：110)、Pex10p(SEQ ID NO：117)、或Pex16p(SEQ ID NO：121)。

尽管对于本领域的技术人员存在多种用以实现天然的耶氏酵母基因的破坏的可用技术，一般而言特定基因的内源活性能够通过下列技术被降低或消除，例如1)通过对靶基因的全部或部分的插入、取代和/或缺失破坏该基因；或，2)操纵控制该基因的表达的调控序列。美国专利申请公布2009-0093543-A1以及国际申请公布WO 2009/046248中对于这些技术均有论及。本领域的技术人员将认识到这些以及其他的方法在现有文献中已有详细描述，并且不受本文所述的方法、宿主细胞、和产品的限制。本领域的技术人员也将认识到用于任何特定的含油酵母的大多数适用的技术。

优化的菌株将生产至少约40-50EPA％TFA，优选至少约50-55EPA％TFA，更优选至少约55-60EPA％TFA，更优选至少约60-70EPA％TFA，以及最优选至少约70-80EPA％TFA。

如对于本领域的技术人员将显而易见的，使用本文所述的方法能够工程化众多生产至少约50EPA％TFA的优化的耶氏酵母菌株。因此，就商业目的而言，优选的菌株的选择将还要考虑工程化的菌株的总脂质含量，因为按总脂肪酸的百分比计的EPA浓度[“EPA％TFA”]和总脂质含量[“TFA％DCW”]均影响按干细胞重量计的细胞EPA含量[“EPA％DCW”]。也就是说，EPA％DCW被计算为：(EPA％TFA)*(TFA％DCW)]/100。例如，生产50EPA％TFA并具有24TFA％DCW的菌株、生产55EPA％TFA并具有21.82TFA％DCW的菌株、生产60EPA％TFA并具有20TFA％DCW的菌株、生产65EPA％TFA并具有18.46TFA％DCW的菌株和生产70EPA％TFA并具有17.14TFA％DCW的菌株均生产12EPA％DCW。在优选的实施方案中，所述改善的优化的解脂耶氏酵母菌株将生产至少约10-12EPA％DCW，优选至少约12-14EPA％DCW，更优选至少约14-16EPA％DCW，更优选至少约16-18EPA％DCW，更优选至少约18-20EPA％DCW，更优选至少约20-22EPA％DCW，更优选至少约22-24EPA％DCW，以及最优选至少约24-26EPA％DCW。

除具有至少约50EPA％TFA外，所述改善的优化的解脂耶氏酵母菌株中、或者来自其的提取的或未浓缩的油中的脂质谱将具有至少约3.1的EPA％TFA对LA％TFA比值。如美国专利申请公布2009-0093543-A1(表23)中所展示的，EPA、LA和油酸构成了生产大于40EPA％TFA的解脂耶氏酵母菌株的脂质谱中存在的脂肪酸的大约76-80％。其中，LA％TFA大约比油酸％TFA高三倍。基于这些观察，本领域的技术人员将会知道，使中间体脂肪酸LA的浓度最小化(导致提高的EPA∶LA比值)，将导致更多的碳被“推”着通过PUFA生物合成途径并允许提高的EPA合成。在优选的实施方案中，EPA∶LA的比值将为至少约3.1-3.5，更优选至少约3.5-4.5，更优选至少约4.5-5.5，以及最优选至少约5.5-6.5。

通过本文所述的改善的优化的重组解脂耶氏酵母菌株生产的脂质将还具有以下特征：当通过GC分析测量时具有少于约0.5％的GLA或DHA(所述GC分析使用具有低至约0.1％的检测水平的设备)和具有少于约8％的饱和脂肪酸含量。这一低百分比的饱和脂肪酸(即，16:0和18:0)导致对人和动物实在的健康有益效果。

含有引导外来蛋白质高水平表达的调控序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员熟知的。任何的这些能被用于构建编码优选的去饱和酶、延伸酶、CPT1、DGLA合酶、丙二酰-辅酶A合成酶和酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶蛋白质的嵌合基因。然后能使用标准转化方法将这些嵌合基因导入解脂耶氏酵母以提供高水平表达的所编码的酶。

可用于转化耶氏酵母属宿主细胞的载体(如构建体、质粒)和DNA表达盒是本领域熟知的。存在于构建体中的序列的具体选择取决于所需的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。然而，通常载体含有至少一个表达盒、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的表达盒通常包含基因控制转录起始的5′区(如启动子)、基因编码序列和控制转录终止的DNA片段3′区(如终止子)。最优选的是当2个控制区都来源于来自转化的宿主细胞的基因，尽管它们无需来源于对生产宿主是天然的基因(例如解脂耶氏酵母)。

如果两种或更多种基因从独立的复制载体表达，则希望每个载体具有不同的选择手段并且应该缺乏与其它构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有导入的基因均以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。

构建体或载体包含受关注的基因，可通过任何标准技术将其导入宿主细胞如耶氏酵母属细胞。这些技术包括转化(例如，醋酸锂转化[Methods inEnzymology，194：186-187(1991)])、基因枪轰击(bolistic impact)、电穿孔、显微注射或将所关注的基因导入宿主细胞中的任何其他方法。本文用于解脂耶氏酵母的更优选的方法是基于DNA线性片段的整合技术，如美国专利4,880,741和美国专利5,071,764中以及Chen，D..C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，48(2)：232-235(1997))所述的。

为方便起见，已经通过任何方法操纵来摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中称为“转化的”、“转化体”、或“重组体”。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达盒，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该表达盒是整合进基因组内还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。转化的宿主细胞可以通过多种选择技术来鉴定，如美国专利7,238,482和美国专利7,259,255所述。

用于本文的优选选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在替代实施方案中，5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”)可用于选择酵母Ura-突变体(美国专利申请公布2009-0093543-A1)，或者赋予磺酰基脲抗除草剂性(国际申请公布WO 2006/052870)的天然的乙酰羟酸合酶(或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18)被用于进行对转化体的选择。一种利用位点特异性重组酶体系的独特方法，“回收利用”一对优选的选择标记用于多次连续转化，美国专利申请公布2009-0093543-A1中也教导了该方法。

如本领域的技术人员所熟知的，仅仅将基因(例如去饱和酶、延伸酶、CPT1、DGLA合酶、丙二酰-辅酶A合成酶和酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶)插入克隆载体不确保它能以所需速率、浓度、量等表达。操纵许多控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和蛋白质位置、氧限制和从宿主细胞的分泌的不同遗传元件可能是合乎期望的。更具体地讲，可通过改变下列来控制基因的表达：相关转录启动子和终止子序列的性质；所克隆基因的拷贝数目；该基因是质粒携带的还是整合进了宿主细胞的基因组中；所合成外源蛋白质的最终细胞定位；蛋白质在宿主生物内的翻译和正确折叠的效率；所克隆基因的蛋白质在宿主细胞中内在的稳定性；和所克隆基因中的密码子使用，以使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。下午将讨论这些过表达方法中的若干种，并且它们作为过表达例如去饱和酶、延伸酶、CPT1蛋白质、DGLA合酶、丙二酰-辅酶A合成酶和酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶的方法在重组耶氏酵母宿主细胞中是有用的。

通过使用更强的启动子(调控型的或组成型的)引起表达增加、通过从mRNA或编码蛋白中移除/删除去稳定化序列、或通过将稳定序列加到mRNA(美国专利4,910,141)上，能在转录水平上提高所需基因的表达。

可用于驱动异源基因或其部分在耶氏酵母属宿主细胞中的表达的转录起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所知。表达能以诱导型或组成型完成。诱导型表达可通过诱导可操作地连接至所关注的基因的可调节启动子的活性来完成，而组成型表达可通过利用可操作地连接至所关注的基因的组成型启动子来实现。几乎任何能够在耶氏酵母中指导去饱和酶、延伸酶、CPT1、DGLA合酶、丙二酰-辅酶A合成酶和酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶基因的表达的启动子(即，天然的、合成的、或嵌合的)都将是适合的，尽管来自该宿主物种的转录和翻译区域是尤其有用的。

终止区通常可源于起始区从其获得的基因的3′区或来自不同的基因。大量的终止区是已知的并且(在用于与它们源自的相同和不同的属和物种两者时)在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止区的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。优选地，终止区来源于酵母基因。3′-区也可以是合成的，因为本领域的技术人员可利用可获得的信息来设计和合成用作转录终止子的3′-区序列。终止位点可以是非必需的，但是是高度优选的。

尽管无意构成限制，在本公开中有用的优选的启动子区域和终止区是美国专利公布2009-0093543-A1中所教导的那些。

PUFA生物合成途径的去饱和酶、延伸酶和DGLA合酶基因和/或CPT1、丙二酰-辅酶A合成酶和酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶基因的附加的拷贝(即一个以上的拷贝)可被导入解脂耶氏酵母以由此提高EPA的生产和积累。具体地讲，另外的基因拷贝可以被克隆到单个表达构建体中；和/或克隆基因另外的拷贝可以通过增加质粒拷贝数或通过将克隆基因多次整合进基因组中来导入宿主细胞中(下文)。

需注意的重要的一点是，当按照本文的方法制备优化的解脂耶氏酵母菌株时，多种去饱和酶、延伸酶、CPT1、DGLA合酶、丙二酰-辅酶A合成酶和酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶的拷贝数是经常被提及的。如果，例如需要2拷贝的Δ9延伸酶，这可以是指：1)从单个物种分离的特定Δ9延伸酶的相同编码序列的两个拷贝；或，2)从物种“A”分离的Δ9延伸酶的一个编码序列和从物种“B”分离的Δ9延伸酶的一个编码序列，如此总共得到两种Δ9延伸酶。

一般来讲，一旦已经获得适用于在含油酵母中表达的DNA盒(例如包含启动子、ORF和终止子的嵌合基因)，则将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或将其直接整合进宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。虽然不依赖本文，如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。

在解脂耶氏酵母中表达基因的优选方法是通过将线性DNA片段整合到宿主基因组中。当期望基因高水平表达时，整合到基因组中的多个位置可以是尤其有用的优选的基因座包括美国专利公布2009-0093543-A1中教导的那些。

Juretzek等人(Yeast，18：97-113(2001)提出在解脂耶氏酵母中的整合DNA片段的稳定性取决于单个转化子、受体菌株和所用的靶向平台。因此，技术人员将认识到必须筛选多个转化子以获取显示所需表达水平和类型的菌株。此类筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。

使转化的微生物宿主细胞在这样的条件下生长：使嵌合基因(例如，编码去饱和酶、延伸酶、CPT1、DGLA合酶、丙二酰-辅酶A合成酶和酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶的)的表达最优化并生产最高和最经济的EPA产量。通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法优化培养基条件。解脂耶氏酵母通常生长在复合培养基(如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基[“YPD”])或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的基本培养基中(如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))。

用于本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源，如在美国专利7,238,482和美国专利申请12/641,929(提交于2009年12月19日)中提出的碳源。尽管预期本发明中利用的碳源可以涵盖许多种含碳源，但优选的碳源是糖类、甘油和/或脂肪酸。最优选的是葡萄糖、蔗糖、转化蔗糖、果糖和/或包含介于10-22个之间的碳原子的脂肪酸。例如，可发酵的碳源可以选自转化蔗糖、葡萄糖、果糖和这些的组合，前提是葡萄糖与转化蔗糖和/或果糖联合使用。

术语“转化蔗糖”，在本文中也称为“转化糖”，是指包含由蔗糖水解而来的相等部分的果糖和葡萄糖的混合物。转化蔗糖可以包含25至50％葡萄糖和25至50％果糖的混合物。转化蔗糖还可以包含蔗糖，蔗糖的量取决于水解度。

氮可以由无机源(如(NH₄)₂SO₄)或有机源如尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳源和氮源，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合高水平EPA生产的含油酵母生长并促进EPA产生的酶促途径的其它组分。特别关注的是促进脂质和PUFA合成的几种金属离子，例如Fe⁺²，Cu⁺²，Mn⁺²，Co⁺²，Zn⁺²和Mg⁺²(Nakahara，T.et al.，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.j.Kyle和R.Colin，编辑，pp 61-97(1992))。

用于本文所述方法和宿主细胞的优选的生长培养基是常规的商业制备培养基，例如酵母氮源基础培养基(Yeast Nitrogen Base，DIFCOLaboratories，Detroit，MI)。也可以使用其它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，且适于解脂耶氏酵母生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH 4.0至pH 8.0之间，其中优选将pH 5.5至pH 7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选微氧条件。

通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要包括两个阶段的过程，由于代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选的是，两个阶段的发酵过程是在解脂耶氏酵母中产生EPA所必需的。这种方法在美国专利7,238,482中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项。

在本文的一些方面中，主要产品是含油酵母生物质。同样地，从生物质中分离和纯化包含EPA的油可能是不必要的(即，其中全细胞生物质是产品)。

然而，某些最终用途和/或产品形式可能需要来自生物质的部分和/或全部分离/纯化的包含EPA的油，以产生部分纯化的生物质、纯化油、和/或纯化EPA。包括EPA在内的PUFA可以以游离脂肪酸或酯化形式如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂形式存在于宿主生物(例如耶氏酵母属)中。这些脂肪酸可通过本领域熟知的多种方法从宿主细胞中提取。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs(Critical Reviews inBiotechnology，12(5/6)：463-491(1992))。A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.，45：271-312(1997))。

一般来讲，用于纯化来自耶氏酵母属生物质的EPA和其它PUFA的手段可包括用有机溶剂萃取(例如美国专利6,797,303和美国专利5,648,564)、超声处理、超临界流体萃取(如使用二氧化碳)、皂化和物理手段例如挤压、珠磨器、或它们的组合。另外的详细信息可参考美国专利7,238,482的教导内容。

包含已经精炼过的和/或纯化过的EPA的油可被氢化，从而产生具有多种熔炼特性和质地的脂肪。多种经加工的脂肪，包括涂脂、糖脂、硬黄油、人造黄油、烘焙起酥油等，需要室温下不同的硬度，并且仅能通过改变来源油的物理特性来制备。这最常见的是通过催化加氢实现(更多细节和参考文献参见国际申请公布WO 2006/052870)。

本文提供包含具有EPA的含油酵母生物质的食品、婴儿代乳品、功能性食物、医疗食物、医疗营养品、饮食补充剂、药物组合物、动物饲料、和个人护理产品。类似地，还提供包含分离自重组含油酵母生物质的EPA或包含EPA的微生物油的食品、婴儿代乳品、功能性食物、医疗食物、医疗营养品、饮食补充剂、药物组合物、动物饲料、和个人护理产品。

食物加工和食物配制领域的技术人员将了解生物质、部分纯化生物质、纯化油、和/或纯化EPA的量和组成是如何根据目的物种和/或最终用途加入特定产品中的。更具体地讲，“有效”量将被掺入产品制剂，然而该量将取决于食物或饲料产品、期望补充该产品的膳食或医疗食物或医疗营养品打算纠正或治疗的医学状况。

最期望的是有效量的EPA将足以提供与ω-3/ω-6PUFA消耗相关的期望健康特性。通常，掺入产品的EPA量考虑了与加工条件、一般处理和贮藏条件、EPA在产品中的稳定性、以及目的物种的生物利用/生物吸收效率相关的损失。

加工和配制领域的技术人员将熟悉浓缩从本文所述的重组耶氏酵母属生产宿主细胞中生产的油、从而提高EPA在总脂质级分中的浓度的方法，该方法使得它包含至少约60％，至少约70％，至少约80％或甚至至少约90％的EPA。本领域的技术人员也熟知混合本文所述的纯化油与其它纯化脂肪酸(例如LA、GLA、EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ALA、STA、ETrA、ETA、DPA和DHA)、或包含优选浓度的替代脂肪酸的油的方法。这些技术使得能够制备包含独特定制的脂肪酸谱的油。

个人护理产品：当涉及个人护理产品时，ω-3脂肪酸在护肤制剂中具有特别的应用，其中它们可用于提高皮肤调理的效果。技术人员应当了解如何向护肤组合物中提供有效量的相关ω-3脂肪酸或包含ω-3脂肪酸的油。除了PUFA油或ω-3脂肪酸之外，护肤组合物还可包含护肤组合物的美容上可接受的介质，其实例描述于Philippe等人的美国专利6,280,747中。例如，美容上可接受的介质可以是无水组合物，该组合物包含的脂肪物质比例一般为按重量计约10％至约90％(相对于组合物总重)，其中的脂相包含至少一种液体、固体或半固体脂肪物质。脂肪物质包括但不限于油、蜡、树胶、和所谓的糊状脂肪物质。作为另外一种选择，组合物可以是稳定的分散体形式如油包水或水包油乳液。此外，所述组合物可包含一种或多种常规化妆品或护肤添加剂或辅剂，包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、芳香剂、增稠剂、润湿剂和阴离子或非离子或两性聚合物、以及染料。

食品：市场目前支持各种掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸(尤其是LA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA)的食物和饲料产品。预期本文所述的酵母生物质、部分纯化的生物质、纯化油、和/或纯化EPA将在食品中发挥功能以赋予本发明制剂的健康有益效果。

食物产品将包括但不限于：食物类似物、饮料、肉制品、谷类制品、烘焙食物、快餐食品和乳制品。

食物类似物能使用本领域技术人员熟知的方法制备。提到的有肉类类似物、干酪类似物、乳品类似物等。由大豆制成的肉类类似物包含大豆蛋白或豆腐以及其它成分，混合在一起以模拟各种肉类。这些肉类替代物以冷冻、罐头或干燥食品的形式销售。通常使用它们的方法与它们替代的食品相同。肉类类似物的实例包括但不限于：火腿类似物、香肠类似物、培根类似物等。

取决于食物类似物的功能和组成特性，可将它们分成仿造品或替代品。例如，仿造干酪仅需类似它设计替代的干酪。然而，仅仅假如一种产品的营养等同于它替代的干酪并符合干酪的最低组成要求时，才能将其称之为替代干酪。因此，替代干酪将通常具有比仿造干酪更高的蛋白水平，并用维生素和矿物质进行强化。

乳类似物或非乳品食物产品包括但不限于：仿造乳品和非乳品冷冻甜点(例如那些由大豆和/或大豆蛋白产品制成的食品)。

肉类产品包括多种产品。在美国“肉类”包括产自牛、猪和羊的“红肉”。除了红肉之外还有家禽类肉产品，包括鸡、火鸡、鹅、珠鸡、鸭和鱼以及贝类。存在一大类调味的和加工的肉制品：新鲜的、熏制并干燥的、和熏制并烹制的。肠和热狗是加工肉制品的实例。因此，如本文所用，术语“肉类产品”包括但不限于加工肉制品产品。

谷类食品是来自谷物加工的食品。谷物包括来自生产可食用谷物(种子)的草本植物家族的任何植物。最常见的谷物是大麦、玉米、小米、燕麦、昆诺阿藜、大米、裸麦、高梁、黑小麦、小麦和野生稻。谷类食物产品的实例包括但不限于：全谷类、压碎的谷类、粗磨粉、面粉、麸皮、胚芽、早餐谷类食物、挤出食品、意大利面食等。

烘焙食物产品包括上文提到的任何谷类食物产品并已被烘焙或用类似于烘焙的方法进行加工，即，通过受热进行干燥或硬化。烘焙食物产品的实例包括但不限于：面包、蛋糕、甜甜圈、巴、意大利面食、面包屑、烘焙零食、迷你小面包、迷你咸饼干、迷你饼干、和迷你椒盐脆饼干。如上文所述，来自重组EPA生产宿主细胞的油可用作一种成分。

小吃食品包括上文或下文所述的任何食品。

油炸食品包括上文或下文所述的任何油炸食品。

饮料可以是液体或干粉形式。例如，可以提及：非碳酸饮料；新鲜的、冷冻的、罐装的或浓缩的果汁；调味奶或原奶饮料等等。成人和婴儿营养代乳品是本领域熟知的和可商购获得的(例如Similac

、Ensure、Jevity

、和Alimentum

，来自Ross Products Division，AbbottLaboratories)。

乳品产品是来源于乳品的产品。乳品类似物或非乳品产品来源于除乳品之外的其它来源，例如上文讨论的豆奶。这些产品包括但不限于：全脂乳、脱脂乳、发酵乳制品如酸奶酪或酸奶、奶油、黄油、炼乳、脱水乳、咖啡冲淡剂、咖啡奶油、冰淇淋、奶酪等。

可将所述耶氏酵母生物质、部分纯化的生物质、纯化的油、和/或纯化的EPA包括于其中的更多的食物产品是，例如：口香糖、糖果和糖霜、凝胶物和布丁、硬糖和软糖、果酱和果子冻、白砂糖、糖替代品、甜沙司、浇头和糖浆、以及干混粉末混合物。

婴儿代乳品：婴儿代乳品是喂给婴儿或儿童的液体或再生粉末。本文将“婴儿代乳品”定义为肠营养产品，它能取代人母乳来喂养婴儿并通常由所需百分比的脂肪与所需百分比的碳水化合物及蛋白质在水溶液中混合组成(例如参见美国专利公开4,670,285)。根据世界范围内的组合物研究，以及专家组指出的水平，平均人母乳通常包含约0.20％至0.40％的总脂肪酸(约占50％的来自脂肪的卡路里)；并且一般DHA对ARA的比值在约1∶1至1∶2的范围内(参见例如来自Enfamil LIPIL^TM[Mead Johnson&Company]和Similac Advance^TM[Ross Products Division，Abbott Laboratories]的制剂)。婴儿代乳品在婴儿饮食中起到特殊作用，因为它们经常是婴儿唯一的营养来源。虽然母乳仍旧是婴儿最好的食物，但婴儿代乳品足以成为使婴儿不仅存活而且健康成长的第二食品。

健康食物产品和药物：本发明的生物质、部分纯化的生物质、纯化的油、和/或纯化的EPA可用于制剂以赋予健康食品健康有益效果，包括功能性食物、医疗食物、医疗营养品和饮食补充剂。此外，耶氏酵母生物质、部分纯化的生物质、纯化的油、和/或纯化的EPA可用于标准药物组合物。能将本发明的解脂耶氏酵母工程化菌株或由此制备的包含EPA的微生物油轻易地掺入上文提到的任何食品以由此制备例如功能性食物或医疗食物。例如，包含EPA的更加浓缩的制剂包括胶囊、粉末、片剂、软凝胶、胶囊锭、液体浓缩物和乳液，它们能在人或除人之外的动物中用作饮食补充剂。

动物饲料产品：动物饲料本文一般定义为旨在用作饲料或混入饲料的产品，用于除人之外的动物。本文所述的耶氏酵母生物质、部分纯化的生物质、纯化的油、和/或纯化的EPA可用作多种动物饲料的成分。

更具体地讲，尽管不应被理解为限制，期望来自重组耶氏酵母宿主细胞的EPA产品能用于宠物食品、反刍动物和家禽的食物产品以及水产养殖的食物产品。宠物食品是那些旨在饲喂给宠物(例如狗、猫、鸟类、爬行动物、和啮齿动物)的食品。这些产品可包括上文的谷类和健康食品、以及肉类和肉类副产品、大豆蛋白产品、草和干草产品(例如苜蓿、梯牧草、燕麦或雀麦草)以及蔬菜。反刍动物和家禽食品是那些旨在饲喂给动物(例如火鸡、鸡、牛、和猪)的食品。关于上文的宠物食物，这些产品可包括上文列出的谷类和健康食品、大豆蛋白产品、肉类和肉类副产品、以及草和干草产品。水产养殖食物产品(或“水产品饲料”)是那些旨在用于水产养殖场的食品，即，涉及在淡水或海水中繁殖、饲养、或养殖水生生物和/或动物的食品。

预期本发明的生产高浓度EPA的工程化解脂耶氏酵母菌株在动物饲料制剂中将是尤其有用的。除了提供必需的ω-3PUFA之外，酵母本身还是有用的蛋白质和其它营养物质来源(例如维生素、矿物质、核酸、络合碳水化合物等)，它能有助于动物的总体健康状态和营养，以及提高制剂的口味。因此预期加入包含重组耶氏酵母生产宿主的酵母生物质将是动物饲料制剂中的饲料营养物质的优异附加来源(更多细节参见美国专利申请公布2009-0093543-A1)。

这样，显然地，本发明的生产高浓度EPA的工程化解脂耶氏酵母菌株在大多数水产品饲料制剂中将是尤其有用的。除了提供必需的ω-3和/或ω-6PUFA之外，酵母本身还是一种有用的蛋白来源，它能提高制剂的适口性。在替代实施方案中，能将由本发明的解脂耶氏酵母菌株制备的油在从细胞群中提取并纯化后直接加入水产品饲料制剂中。

EPA自身就是重要的ω-3脂肪酸这一点正日益被意识到。因此，本文预期，本文所述的重组耶氏酵母生产宿主的富含EPA的油，在多种治疗应用中，例如炎症、心血管疾病、基因表达的营养调节和血脂异常，并且尤其在包括冠心病、高血压、炎性病症、II型糖尿病、溃疡性结肠炎、克隆氏病、神经性厌食症、烧伤、骨关节炎、骨质疏松、抑郁症、和注意力不足/多动症的临床状况的处理中，将具有非常广泛的用途。

美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了关于EPA和炎症、EPA和心血管疾病、ω-3PUFA和基因表达的营养调节、以及ω-3PUFA和血脂异常的更多人类临床研究并应在其中被提及。最近，作为评估油类对心血管疾病危险因素的影响的方法，在110名正常的健康受试者中进行了随机、双盲、安慰剂对照的研究，其中向受试者提供了下列中的一种6周时间：600mg/天EPA、1800mg/天EPA、600mg/天DHA或橄榄油(安慰剂)(Gillies，P.，“The New Science of Omega-3 Fatty Acids：Differential NutritionalPharmacology”Texas Human Nutrition Conference，Texas A&M University，2010年2月。每天600mg EPA的补充被发现维持了已处于正常范围内的健康的胆固醇水平。要注意的是，该研究中的EPA油是来源于工程化的解脂耶氏酵母菌株。

实施例

本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修改，以使其适用于多种用法和条件。

一般方法

实施例中使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且描述于：1)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)(Maniatis)；2)T.j.Silhavy，M.l.开发，Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1984)；和，3)Ausubel，F.M.等人，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。

适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下述实施例的技术可见于Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.g.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，编辑)，American Societyfor Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或者Thomas D.Brock inBiotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版，SinauerAssociates：Sunderland，MA(1989)。除非另外指明，用于生长和维持微生物细胞的所有试剂、限制性酶和材料得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、或Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)，除非另外说明。通常于37℃下在LuriaBertani[“LB”]平板上培养大肠杆菌(E.coli)菌株。

一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。当PCR或定点诱变涉及亚克隆时，测序构建体以确认未将错配导入序列。PCR产物被克隆到Promega的pGEM-T-easy载体(Madison，WI)中。

缩写含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔每升，“mM”表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔每升，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，“kB”表示千碱基，“DCW”表示干细胞重量，“TFA”表示总脂肪酸。

表达盒的命名

表达盒的结构将通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。

解脂耶氏酵母的转化和培养

解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常是在根据下面所示的配方的数种培养基中于28-30℃下培养。根据标准方法，按需要通过将20g/L琼脂添加到每种液体培养基中来制备琼脂平板。

YPD琼脂培养基(每升)：10g酵母提取物[Difco]，20g Bacto蛋白胨

[Difco]；以及20g葡萄糖。

基础的基本培养基[“MM”](每升)：20g葡萄糖，1.7g不含氨基酸的酵母氮源，1.0g脯氨酸，和pH 6.1(无需调节)。

基本培养基+尿嘧啶[“MM+尿嘧啶或MMU”](每升)：如上所述制备MM培养基并加入0.1g尿嘧啶和0.1g尿苷。

基本培养基+尿嘧啶+磺酰脲类[“MMU+SU”](每升)：如上所述制备MMU培养基并加入280mg磺酰脲类。

基本培养基+尿嘧啶+赖氨酸[“MMUraLys”](每升)：如上所述制备MM培养基并加入0.1g尿嘧啶、0.1g尿苷和0.1g赖氨酸。

基础培养基+5-氟乳清酸[“MM+5-FOA”](每升)：20g葡萄糖、6.7g酵母氮源基础、75mg尿嘧啶、75mg尿苷，以及基于对一系列从100mg/L至1000mg/L的浓度的FOA活性试验(因为供应商提供的每批料中会发生改变)，选用适量的FOA(Zymo ResearchCorp.，Orange，CA)。

高葡萄糖培养基[“HGM”](每升)：80葡萄糖、2.58gKH₂PO₄和5.36gK₂HPO₄，pH 7.5(不需要调节)。

无酵母提取物的发酵培养基[“FM无YE”](每升)：6.70g/L酵母氮源，6.00g KH₂PO₄，2.00g K₂HPO₄，1.50g MgSO₄*7H₂O和20g葡萄糖。

发酵培养基[“FM”](每升)：6.70g/L酵母氮源，6.00g KH₂PO₄，2.00gK₂HPO₄，1.50g MgSO₄*7H₂O，20g葡萄糖和5.00g酵母提取物(BBL)。

解脂耶氏酵母的转化如美国专利申请公布2009-0093543-A1中所述进行，该文献以引用方式并入本文。

解脂耶氏酵母的脂肪酸分析

对于脂肪酸[“FA”]分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))所述提取脂质。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”](Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.，第276卷，第1期，第38-46页(1990))并随后将其用配有30m×0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(GC)进行分析。炉温以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升至185℃。

为了进行直接的碱催化酯交换反应，收集耶氏酵母细胞(0.5mL培养物)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲醇钠(100μl，浓度为1％)和已知量的C15:0三酰基甘油(C15:0TAG；目录号T-145，Nu-Check Prep，Elysian，MN)加入样品中，然后将样品涡旋，于温度为50℃下振荡30分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μl己烷后，涡旋并离心样品。移除上层并用GC进行分析。

经由GC分析记录的FAME峰值在与已知脂肪酸进行比较时通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME与已知量的内部标准品(C15:0TAG)的峰面积进行定量。因此，根据下式计算近似量(μg)的任意脂肪酸FAME[“μg FAME”]：(指定脂肪酸的FAME峰面积/标准品FAME峰面积)*(μg标准品C15:0TAG)，根据下式计算一定量(μg)的任意脂肪酸[“μg FA”]：(指定脂肪酸的FAME峰面积/标准品FAME峰面积)*(μg标准品C15:0TAG)*0.9503，因为1μg C15:0TAG等于0.9503μg脂肪酸。注意：0.9503的转换因子是大多数脂肪酸测定的近似值，其范围介于0.95和0.96之间。

概述每种单个脂肪酸以TFA重量％表示的量的脂质特征通过用单个FAME峰面积除以所有FAME峰面积的总数并乘以100进行计算。

通过烧瓶检测法对解脂耶氏酵母中总脂质含量和组成的分析

为了详细分析在解脂耶氏酵母的特定菌株中的总脂质含量和组成，如下进行了烧瓶检测分析。具体而言，一个接种环的新鲜划线的细胞被接种至3mL FM培养基，并于30℃以250rpm培养过夜。测量OD_600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL FM培养基中最终的OD_600nm为0.3。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行脂肪酸分析(同上)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。

就DCW测定而言，通过在Beckman GS-6R离心机的Beckman GH-3.8转子中以4000rpm离心5分钟，收集了10mL培养物。沉淀被重悬于25mL水中，并如上文所述重新收集。将洗涤后的沉淀物重悬在20mL水中并转移到预先称过重的铝盘上。细胞悬浮液在80℃真空炉中干燥过夜。测量细胞重量。

计算了细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]，并将其与用于将按TFA的重量％计的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]和按干细胞重量的百分比计的EPA含量[“EPA％DCW”]制表的数据共同考虑。来自烧瓶检测法的数据将以表的形式显示，该表总结了细胞总的干细胞重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、按TFA的重量％计的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]和按干细胞重量的百分比计的EPA含量[“EPA％DCW”]。更具体地讲，脂肪酸将被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕桐油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA、EPA和其他。

实施例1

生产占总脂肪酸约46％的DGLA的解脂耶氏酵母菌株L135(Ura3+， Leu-，Δpex3)的构建

本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株L135的构建，该菌株能通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质而言约46％的DGLA。

简而言之，如图2中所示，菌株L135通过菌株Y2224(由野生型耶氏酵母菌株ATCC#20362的Ura3基因自主突变而产生的FOA抗性突变体)、菌株Y4001(产生17％EDA，具有Leu-表型)、菌株Y4001U1(Leu-和Ura-)、菌株Y4036(产生18％DGLA，具有Leu-表型)和菌株Y4036U(Leu-和Ura-)的构建，来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362。关于菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036和Y4036U的构建的进一步细节描述于美国专利申请公布2008-0254191的一般方法部分，该文献以引用方式并入本文。

相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362，菌株Y4036U最终的基因型为Ura3-，YAT1::ME3S::Pex16，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::OCT(其中FmD12是串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C_16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成的突变型Δ8去饱和酶[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫[美国专利7,256,033])。

带有Pex3染色体缺失的L135菌株的构建

菌株L135的构建描述于国际申请公布WO 2009/046248的实施例12中，该文献以引用方式并入本文。简而言之，构建体pY157被用于在菌株Y4036U中敲除编码过氧化物酶体生物发生因子3蛋白质[过氧化物酶体装配蛋白质Peroxin 3或“Pex3p”]的染色体基因，从而产生菌株L135(也被称为菌株Y4036(Δpex3))。与菌株Y4036(其天然的Pex3p未被敲除)中相比，菌株L135中染色体Pex3基因的敲除导致了下列结果：更高的脂质含量(TFA％DCW)(大约6.0％对4.7％)，更高的DGLA％TFA(46％对19％)，更高的DGLA％DCW(大约2.8％对0.9％)和降低的LA％TFA(12％对30％)。此外，Δ9延伸酶转化效率百分数从菌株Y4036中的大约48％提高至菌株L135中的83％。

相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362，菌株L135最终的基因型是Ura3+，Leu-，Pex3-，未知1-，YAT1::ME3S::Pex16，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::OCT。

实施例2

生产占总脂肪酸[“TFA”]从约18％至约41％的ARA的解脂耶氏酵母菌株的构建

本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y8006的构建，该菌株能通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质而言约41％的ARA。

菌株Y8006(图2)的开发需要菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U和L135(描述于实施例1中)的构建，以及菌株L135U9和Y8002的构建。

L135U9(Leu-、Ura3-)菌株的产生

通过在菌株L135中瞬时表达质粒pY116(图3；SEQ ID NO：127；描述于国际申请公布WO 2008/073367的实施例7中，该文献以引用方式并入本文)中的Cre重组酶以产生Leu-和Ura-表型，构建了菌株L135U。根据“一般方法”，将质粒pY116用于转化新鲜生长的L135细胞。将转化细胞铺在MMLeuUra上并在30℃下维持3至4天。挑取三个菌落，将其在30℃下接种至3mL液体YPD培养基中并以250rpm/min摇动1天。将培养物用液体MMLeuUra培养基稀释至1∶50,000，将100μL铺至新的YPD平板上并在30℃下维持2天。从三个平板中的每一个挑取八个菌落(总计24个菌落)并划线至MMLeu和MMLeuUra选择平板上。选择在MMLeuUra平板上生长但不在MMLeu平板上生长的菌落并通过GC分析来确定C20:2(EDA)的存在。具有Leu-和Ura-表型的一个菌株被命名为L135U9。

生产占TFA约32％的ARA的Y8002菌株的构建

构建了构建体pZKSL-5S5A5(图4A；SEQ ID NO：128)以将三种Δ5去饱和酶基因整合进菌株L135U9的Lys基因座，由此使得能够生产ARA。pZKSL-5S5A5质粒含有如下组分：

表6：质粒pZKSL-5S5A5(SEQ ID NO：128)的描述

将pZKSL-5S5A5质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株L135U9。将转化细胞铺在MMUraLys平板上并在30℃下维持2至3天。然后将单菌落再次划线至MMUraLys平板上，随后将其在30℃下接种至液体MMUraLys中并以250rpm/min摇动2天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，ARA存在于含有pZKSL-5S5A5的3种嵌合基因的转化体中，但不存在于亲本L135U9菌株中。将生产了占TFA约32.2％、32.9％、34.4％、32.1％和38.6％的ARA的五个菌株(即，#28、#62、#73、#84和#95)分别命名为菌株Y8000、Y8001、Y8002、Y8003和Y8004。进一步的分析显示，pZKSL-5S5A5的三种嵌合基因没有整合进Y8000、Y8001、Y8002、Y8003和Y8004菌株中的Lys5位点。所有菌株都具有Lys+表型。

相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362，菌株Y8000、Y8001、Y8002、Y8003和Y8004最终的基因型为Ura-，Pez3-，未知1-，未知2-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct。

生产占TFA约41％的ARA的Y8006菌株的构建

构建了构建体pZP3-Pa777U(图4B；SEQ ID NO：129；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表9中，该文献以引用方式并入本文)，以将三种Δ17去饱和酶基因整合进菌株Y8002的Pox3基因座(GenBank登录号AJ001301)。

将pZP3-Pa777U质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8002。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持2至3天。然后将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，在所选择的96个包含pZP3-Pa777U的3种嵌合基因的转化体中，大多数中存在占TFA26％至31％的EPA，而在亲本Y8002菌株中不存在。菌株#69生产了占TFA约38％的EPA并被命名为Y8007。有一个菌株(即，菌株#9)没有生产EPA，但是生产了占TFA约41％的ARA。该菌株被命名为Y8006。基于菌株Y8006中EPA生产的缺失，其相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的基因型被假定为Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，Leu+，Lys+，Ura+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct。

与此相对，菌株Y8007相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，Leu+，Lys+，Ura+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco(其中PaD17是瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)Δ17去饱和酶[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌[美国专利7,556,949]。

pZP3-Pa777U的3种嵌合基因在Pox3基因座(GenBank登录号AJ001301)的整合在菌株Y8006和Y8007中未被确认。

实施例3

生产占总脂肪酸[“TFA”]从约24％至约56％的EPA的解脂耶氏酵母菌株的构建

本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y8412的构建，该菌株能通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质而言约56％的EPA。

菌株Y8412(图2)的开发需要菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U和L135(描述于实施例1中)，菌株L135U9和Y8002(描述于实施例2中)，以及菌株Y8006U6、Y8069、Y8069U、Y8154、Y8154U、Y8269和Y8269U的构建。

菌株Y8006U6(Ura3-)的构建

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：130；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中，该文献以引用方式并入本文)被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8006的Ura3基因。

将质粒pZKUM用SalI/PacI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8006。转化后，将细胞铺至MM+5-FOA选择平板上并在30℃下维持2至3天。

挑取在MM+5-FOA平板上生长的总共8个转化体，并且再次分别划线接种到MM平板和MM+5-FOA平板上。所有8个菌株具有Ura-表型(即，细胞能在MM+5-FOA平板上生长，但不能在MM平板上生长)。从MM+5-FOA平板上刮下细胞，并根据“一般方法”对其进行脂肪酸分析。

GC分析显示，在生长于MM+5-FOA平板上的pZKUM-转化体菌株#1、#2、#4、#5、#6和#7中，分别存在22.9％、25.5％、23.6％21.6％、21.6％和25％的ARA。这六个菌株分别被命名为菌株Y8006U1、Y8006U2、Y8006U3、Y8006U4、Y8006U5和Y8006U6(统称为Y8006U)。

生产占TFA约37.5％的EPA的Y8069菌株的构建

构建了构建体pZP3-Pa777U(图4B；SEQ ID NO：129；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表9中，该文献以引用方式并入本文)，以将三种Δ17去饱和酶基因整合进菌株Y8006U6的Pox3基因座(GenBank登录号AJ001301)。

将pZP3-Pa777U质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8006U6。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持2至3天。然后将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，EPA存在于含有pZP3-Pa777U的3种嵌合基因的转化体中，但不存在于亲本Y8006U6菌株中。所择选的24个菌株中大部分产生占TFA24-37％的EPA。将生产了占TFA约37.5％、43.7％、37.9％和37.5％的EPA的四个菌株(即，#1、#6、#11和#14)分别命名为菌株Y8066、Y8067、Y8068和Y8069。pZP3-Pa777U的3种嵌合基因在菌株Y8066、Y8067、Y8068和Y8069的Pox3基因座(GenBank登录号AJ001301)的整合未被确认。

菌株Y8066、Y8067、Y8068和Y8069相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco。

菌株Y8069U(Ura3-)的构建

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：130；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(参见上文)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8069的Ura3基因中。总计3个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在生长于MM+5-FOA平板上的pZKUM-转化体菌株#1、#2和#3中，分别存在22.4％、21.9％和21.5％的EPA。这三个菌株分别被命名为菌株Y8069U1、Y8069U2、和Y8069U3(统称为Y8069U)。

生产占TFA约44.8％的EPA的菌株Y8154的构建

构建了构建体pZKL2-5mB89C(图5B；SEQ ID NO：131)以将一个Δ5去饱和酶基因、一个Δ9延伸酶基因、一个Δ8去饱和酶基因和一个解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因(CPT1)整合到菌株Y8069U3的Lip2基因座(GenBank登录号AJ012632)中，以由此使得能够生产更高水平的EPA。pZKL2-5mB89C质粒含有如下组分：

表7：质粒pZKL2-5mB89C(SEQ ID NO：131)的描述

将pZKL2-5mB89C质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8069U3。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的96个菌株中大多数生产占TFA大约38-44％的EPA。将生产了占TFA约44.7％、45.2％、45.4％、44.8％、46.1％、48.6％和45.9％的EPA的七个菌株(即，#1、#39、#49、#62、#70、#85和#92)分别命名为菌株Y8151、Y8152、Y8153、Y8154、Y8155、Y8156和Y8157。在这些EPA菌株中，Lip2基因的敲除未被确认。

菌株Y8151、Y8152、Y8153、Y8154、Y8155、Y8156和Y8157相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco。

菌株Y8154U1(Ura3-)的构建

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：130；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(参见上文)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8154的Ura3基因中。总计8个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#7中有占TFA23.1％的EPA。该菌株被命名为菌株Y8154U1。

生产占TFA约45.3％的EPA的菌株Y8269的构建

构建了构建体pZKL1-2SR9G85(图6A；SEQ ID NO：132)，以将一个DGLA合酶Δ12去饱和酶酶基因和一个Δ5去饱和酶基因整合到菌株Y8154U1的Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)中，以由此使得能够生产更高水平的EPA。DGLA合酶是复合酶，包括连接到Δ8去饱和酶的Δ9延伸酶

pZKL1-2SR9G85质粒含有如下组分：

表8：质粒pZKL1-2SR9G85(SEQ ID NO:132)的描述

将pZKL1-2SR9G85质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8154U1。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的96个菌株中大多数生产占总脂质40-44.5％的EPA。将生产了占TFA约44.8％、45.3％、47％、44.6％和44.7％的EPA的五个菌株(即，#44、#46、#47、#66和#87)分别命名为菌株Y8268、Y8269、Y8270、Y8271和Y8272。在这些EPA菌株中，Lip1基因座的敲除(GenBank登录号Z50020)未被确认。

菌株Y8268、Y8269、Y8270、Y8271和Y8272相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，YAT1::ME3S::Pex16，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco。

菌株Y8269U(Ura3-)的构建

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：130；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(参见上文)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8269的Ura3基因中。总计8个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#2、#3和#5中分别有占TFA23.0％、23.1％和24.2％的EPA。这些菌株分别被命名为菌株Y8269U1、Y8269U2和Y8269U3(统称为Y8269U)。

生产占TFA约51.2％EPA和55.8％的菌株Y8406和菌株Y8412的构建

构建了构建体pZSCP-Ma83(图6B；SEQ ID NO：133)，以将一种Δ8去饱和酶基因、一种C_16/18延伸酶基因和一种丙二酰-辅酶A合成酶基因整合进菌株Y8269U1的SCP2基因座(GenBank登录号XM_503410)，从而使得能生产较高水平的EPA。pZSCP-Ma83质粒含有如下组分：

表9：质粒pZSCP-Ma83(SEQ ID NO：133)的描述

将pZSCP-Ma83质粒用AscI/SphI消化，根据“一般方法”将其用于分别地转化菌株Y8269U1、Y8269U2和Y8269U3。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

通过GC对来自每种pZSCP-Ma83转化(即转入Y8269U1、Y8269U2和Y8269U3)的总计96个菌株进行了分析。所择选的288个菌株中大部分产生占TFA43-47％的EPA。将生产了占TFA约51.3％、47.9％、50.8％、48％、47.8％、47.8％和47.8％的EPA的用pZSCP-Ma83转化的七个Y8269U1菌株(即，#59、#61、#65、#67、#70、#81和#94)分别命名为菌株Y8404、Y8405、Y8406、Y8407、Y8408、Y8409和Y8410。将生产了占TFA约48.8％、50.8％、和49.3％的EPA的用pZSCP-Ma83转化的三个Y8269U2菌株(即，#4、#13和#17)分别命名为菌株Y8411、Y8412和Y8413。并且，将生产了占TFA约49.3％和53.5％的EPA的用pZSCP-Ma83转化的两个Y8269U3菌株(即，#2和#16)分别命名为菌株Y8414和Y8415。

在任何的这些通过用pZSCP-Ma83转化产生的EPA菌株中，SCP2基因座(GenBank登录号XM_503410)在菌株Y8404、Y8405、Y8406、Y8407、Y8408、Y8409、Y8410、Y8411、Y8412、Y8413、Y8414和Y8415中的敲除未被确认。

菌株Y8404、Y8405、Y8406、Y8407、Y8408、Y8409、Y8410、Y8411、Y8412、Y8413、Y8414和Y8415相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco，YAT1::MCS::Lip1。

解脂耶氏酵母菌株Y8406于2009年5月14日被保藏于美国典型培养物保藏中心，并被命名为ATCC PTA-10025。解脂耶氏酵母菌株Y8412于2009年5月14日被保藏于美国典型培养物保藏中心，并被命名为ATCCPTA-10026。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Y8404、Y8405、Y8406、Y8407、Y8408、Y8409、Y8410、Y8411、Y8412、Y8413、Y8414和Y8415的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。表10总结了所述细胞的总的干细胞重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、以占TFA的重量％[“％TFA”]表示的每种脂肪酸的浓度和以干细胞重量％表示的EPA含量[“EPA％DCW”]。更具体地讲，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA、EPA和其他。

实施例4

生产占总脂肪酸[“TFA”]约53.6％的EPA并具有37.6％的总脂质含量的解脂耶氏酵母菌株Y8647的构建

本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y8647的构建，该菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够生产相对于总脂质而言约53.6％的EPA并具有37.6％的总脂质含量[“TFA％DCW”]。菌株Y8647(图2)的开发需要菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U和L135(描述于实施例1中)，菌株L135U9和Y8002(描述于实施例2中)，菌株Y8006U6、Y8069、Y8069U、Y8154、Y8154U、Y8269和Y8269U(描述于实施例3中)以及菌株Y8412U6的构建。

菌株Y8412U6(Ura3-)的构建

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：130；描述于美国专利申请公布2009-00935433-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(实施例3)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8412(实施例3)的Ura3基因中。总计8个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#4和#6中分别有占TFA 25.9％和26.9％的EPA。这两个菌株分别被命名为菌株Y8412U6和Y8412U8(统称为Y8412U)。

菌株Y8647的构建

构建了构建体pZKL4-398F2(图7A；SEQ ID NO：134)，以将一个C_16/18延伸酶基因、一个DGLA合酶、和一个Δ12去饱和酶基因整合进菌株Y8412U6的耶氏酵母脂肪酶-样基因座(命名为Lip4，GenBank登录号XM_503825)，从而使得能生产较高水平的EPA。pZKL4-398F2质粒含有如下组分：

表11：质粒pZKL4-398F2(SEQ ID NO：134)的描述

将pZKL4-398F2质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8412U6。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的96个转化体菌株中大多数生产占TFA50-52.7％的EPA。将生产了占TFA约52.8％、53.1％、52.8％、53.2％、53.1％、52.8％、和52.9％的EPA的七个菌株(即，#31、#35、#38、#41、#60、#61和#95)分别命名为Y8646、Y8647、Y8648、Y8649、Y8650、Y8651和Y8652。

在这些EPA菌株中，Lip4基因座(GenBank登录号XM_503825)的敲除未被确认。

菌株Y8646、Y8647、Y8648、Y8649、Y8650、Y8651和Y8652相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM:Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco，YAT1::MCS::Lip1。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Y8647、Y8648、Y8649和Y8650的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。表12总结了所述细胞的总的干细胞重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、以占TFA的重量％[“％TFA”]表示的每种脂肪酸的浓度和以干细胞重量％表示的EPA含量[“EPA％DCW”]。脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA、EPA和其他。

实施例5

生产占总脂肪酸[“TFA”]约54.5％的EPA并具有39.6％的总脂质含量的解脂耶氏酵母菌株Y9028的构建

本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y9028的构建，该菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够生产相对于总脂质而言约54.5％的EPA并具有39.6％的总脂质含量[“TFA％DCW”]。菌株Y9028(图2)的开发需要菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U和L135(描述于实施例1中)，菌株L135U9和Y8002(描述于实施例2中)，菌株Y8006U6、Y8069、Y8069U、Y8154、Y8154U、Y8269和Y8269U(描述于实施例3中)、菌株Y8412U6和Y8647(描述于实施例4中)以及菌株Y8467U的构建。

菌株Y8647U(Ura3-)的构建

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：130；描述于美国专利申请公布No.2009-0093543-A1)的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(实施例3)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8647(实施例4)的Ura3基因中。总计12个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#1、#3、#4和#12中分别有占TFA 30.2％、29.2％、28.1％和29.9％的EPA。这四个菌株分别被命名为菌株Y8647U1、Y8647U2、Y8647U3、和Y8647U6(统称为Y8647U)。

菌株Y9028的构建

构建了构建体pZP2-85m98F(图7B；SEQ ID NO：135)，以将一个Δ8去饱和酶基因、一个DGLA合酶和一个Δ5去饱和酶酶基因整合到菌株Y8647U3的耶氏酵母Pox2基因座(GenBank登录号AJ001300)中，以由此使得能够生产更高水平的EPA。pZP2-85m98F质粒含有如下组分：

表13：质粒pZP2-85m98F(SEQ ID NO：135)的描述

将pZP2-85m98F质粒用AscI/SphI消化，根据“一般方法”将其用于分别地转化菌株Y8647U1、Y8647U2、Y8647U3和Y8647U6。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的48个用pZP2-85m98F转化的Y8647U1菌株中大多数生产占TFA49-52％的EPA。并且，将生产了占TFA约52.6％和52.1％的EPA的两个菌株(即，#30和#31)分别命名为菌株Y9024和Y9025。

所选择的60个用pZP2-85m98F转化的Y8647U2菌株中大多数生产占TFA49-51.9％的EPA。菌株#6生产了占TFA约52％的EPA并被命名为Y9026。

所选择的60个用pZP2-85m98F转化的Y8647U3菌株中大多数生产占TFA50-52.2％的EPA。将生产了占TFA约53.2％、53.7％、54.0％、52.9％、53.4％和52.3％的EPA的用六个菌株(即，#5、#6、#14、#15、#20和#34)分别命名为Y9027、Y9028、Y9029、Y9030、Y9031和Y9032。

类似地，GC分析显示，所选择的48个用pZP2-85m98F转化的Y8647U6菌株中大多数生产占TFA 50-52.1％的EPA。将生产了占TFA约52.2％和52.8％的EPA的两个菌株(即，#27和#44)分别命名为菌株Y9033和Y9034。

在任何的这些通过用pZP2-85m98F转化产生的EPA菌株中，Pox2基因座(GenBank登录号AJ001300)在菌株Y9024、Y9025、Y9026、Y9027、Y9028、Y9029、Y9030、Y9031、Y9032、Y9033和Y9034中的敲除未被确认。

这些菌株相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，未知9-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16(2copies)，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::；Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco，YAT1::MCS::Lip1。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Y9028、Y9029和Y9031的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

下面的表14总结了所述细胞的总的干细胞重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、以占TFA的重量％[“％TFA”]表示的每种脂肪酸的浓度和以干细胞重量％表示的EPA含量[“EPA％DCW”]。更具体地讲，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA、EPA和其他。

实施例6

生产占总脂肪酸[“TFA”]至少约57％的EPA并具有至少约35％的总脂质含量的解脂耶氏酵母菌株Y9481和Y9502的构建

本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362并表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的菌株Y9481和Y9502的构建。菌株Y9481能够生产相对于总脂质而言约60.9％的EPA并具有35％的总脂质含量[“TFA％DCW”]，而菌株Y9502能够生产相对于总脂质而言约57％的EPA并具有37.1％的“TFA％DCW”。

菌株Y9481和Y9502(图2)的开发需要菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U和L135(描述于实施例1中)，菌株L135U9和Y8002(描述于实施例2中)，菌株Y8006U6、Y8069、Y8069U、Y8154、Y8154U、Y8269和Y8269U(描述于实施例3中)、菌株Y8412U6和Y8647(描述于实施例4中)、菌株Y8467U和Y9028(描述于实施例5中)以及菌株Y9028U的构建。

菌株Y9028U(Ura3-)的构建

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：130；描述于美国专利申请公布No.2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(实施例3)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y9028(实施例5)的Ura3基因中。总计8个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#1、#3、#4和#5中分别有占TFA 24.1％、24.9％、24.5％和24.5％的EPA。这四个菌株分别被命名为菌株Y9028U1、Y9028U2、Y9028U3、和Y9028U4(统称为Y9028U)。

整合载体pZK16-ML8N的组分

构建了构建体pZK16-ML8N(图8A；SEQ ID NO：136)，以将一个Δ8去饱和酶基因、一个丙二酰-辅酶A合成酶基因、和一个溶血磷脂酸酰基转移酶基因[“LPAAT”]整合进菌株Y9028U2的耶氏酵母YALI0B14795p基因座(GenBank登录号XM_500900)中。pZK16-ML8N质粒含有如下组分：

表15：质粒pZK16-ML8N(SEQ ID NO：136)的描述

整合载体pZK16-ML的组分

构建了构建体pZK16-ML(图8B；SEQ ID NO：137)，以将一个丙二酰-辅酶A合成酶基因和一个溶血磷脂酸酰基转移酶基因[“LPAAT”]整合进菌株Y9028U2的耶氏酵母YALI0B14795p基因座(GenBank登录号XM_500900)中。pZK16-ML质粒的组分与pZK16-ML8N(参见上文)的那些是相同的；但是，pZK16-ML8N的YAT1::EgD8M::Pex20嵌合基因是缺失的。

菌株Y9481和Y9502的构建

用AscI/SphI分别地消化了pZK16-ML8N质粒和pZK16-ML质粒，然后按照一般方法部分用于分别地转化菌株Y9028U2。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的96个用pZK16-ML8N转化的Y9028U2菌株中大多数生产占TFA 50-55.4％的EPA。将生产了占TFA约58.1％、61.4％、56.2％、58.1％、57.5％、57.0％、55.9％、57.6％、57.8％、55.5％、57.6％、58.1％、57.1％、56.2％和58.6％的EPA的十五个菌株(即，#8、#18、#21、#24、#29、#48、#60、#66、#68、#75、#76、#78、#90、#95和#96)分别命名为菌株Y9472、Y9473、Y9474、Y9475、Y9476、Y9477、Y9478、Y9479、Y9480、Y9481、Y9482、Y9483、Y9484、Y9485和Y9486。

这些pZK16-ML8N转化体菌株相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，未知9-，未知10-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，YAT1::EgD8M::Pex20，GPD::EaD8S::Pex16(2copies)，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16。

类似地，GC分析显示，所选择的96个用pZK16-ML转化的Y9028U2菌株中大多数生产占TFA 51-55.5％的EPA。将生产了占TFA约56.5％、57.4％、56.8％、57.0％、56.4％、57.3％、58.2％、55.6％、57.8％、55.6％、57.6％、56.8％、55.8％、56.4％、56.1％和57％的EPA的十六个菌株(即，#4、#8、#15、#16、#39、#44、#46、#63、#66、#80、#85、#86、#88、#89、#90和#96)分别命名为Y9496、Y9497、Y9498、Y9499、Y9500、Y9501、Y9502、Y9503、Y9504、Y9505、Y9506、Y9507、Y9508、Y9509、Y9510和Y9511。

这些pZK16-ML转化体菌株相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，未知9-，未知10-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16(2copies)，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16。

在任何这些通过用pZK16-ML8N或pZK16-ML转化产生的EPA菌株中，YALI0B14795p基因座(GenBank登录号XM_500900)在菌株Y9472、Y9473、Y9474、Y9475、Y9476、Y9477、Y9478、Y9479、Y9480、Y9481、Y94782、Y9483、Y9484、Y9485、Y9486、Y9496、Y9497、Y9498、Y9499、Y9500、Y9501、Y9502、Y9503、Y9504、Y9505、Y9506、Y9507、Y9508、Y9509、Y9510和Y9511中的敲除未被确认。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Y9477、Y9481、Y9486、Y9497、Y9502、Y9504、Y9508和Y9510的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

下面的表16总结了所述细胞的总的干细胞重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、以占TFA的重量％[“％TFA”]表示的每种脂肪酸的浓度和以干细胞重量％表示的EPA含量[“EPA％DCW”]。更具体地讲，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕桐油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA、EPA和其他。

实施例7

生产占总脂肪酸[“TFA”]约61.8％的EPA并具有26.5％的总脂质含量的解脂耶氏酵母菌株Y8672的构建

本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y8672的构建，该菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够生产相对于总脂质而言约61.8％的EPA并具有26.5％的总脂质含量[“TFA％DCW”]。菌株Y8672(图9)的开发需要菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U和L135(描述于实施例1中)，菌株L135U9和Y8002(描述于实施例2中)，菌株Y8006U6、Y8069、Y8069U(描述于实施例3中)以及菌株Y8145、Y8145U、Y8259、Y8259U、Y8367和Y8367U的构建。

生产占TFA约48.5％的EPA的菌株Y8145的构建

构建了构建体pZKL2-5m89C(图10；SEQ ID NO：138)以将一个Δ5去饱和酶基因、一个Δ9延伸酶基因、一个Δ8去饱和酶基因和一个解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因(CPT1)整合到菌株Y8069U3(实施例3)的Lip2基因座(GenBank登录号AJ012632)中，以由此使得能够生产更高水平的EPA。pZKL2-5m89C质粒含有如下组分：

表17：质粒pZKL2-5m89C(SEQ ID NO：138)的描述

将pZKL2-5m89C质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y8069U3。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的96个菌株中大多数生产占TFA 38-44.5％的EPA。将生产了占TFA约45.1％、45.6％、45.0％和45.6％的EPA的四个菌株(即，#10、#50、#70和#89)分别命名为Y8143、Y8144、Y8145和Y8146。在这些EPA菌株中，Lip2基因座的敲除(GenBank登录号AJ012632)未被确认。

菌株Y8143、Y8144、Y8145和Y8146相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，YAT1::EgD5SM::Aco，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，GPD::YlCPT1::Aco。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Y8143、Y8144、Y8145和Y8146的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

菌株Y8145U(Ura3-)的构建

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO:130；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(实施例3)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8145的Ura3基因中。总计8个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#5、#6和#7中分别有占TFA22.5％、22.6％和23.4％的EPA。这三个菌株分别被命名为菌株Y8145U1、Y8145U2、和Y8145U3(统称为Y8145U)。

生产占TFA约53.9％的EPA的Y8259菌株的构建

构建了构建体pZKL1-2SR9G85(实施例3、图6A；SEQ ID NO：132)，以将一个DGLA合酶基因、一个Δ12去饱和酶基因和一个Δ5去饱和酶基因整合进菌株Y8145U的Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)，以由此使得能够生产更高水平的EPA。

用AscI/SphI消化了pZKL1-2SR9G85质粒，然后以与关于pZKL1-2SR9G85对菌株Y8154U1的转化(实施例3)所述的相似的方式，用于转化菌株Y8145U1。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的96个菌株中大多数生产占总脂质40-44.0％的EPA。将生产了占TFA约45.2％、47％、44.4％、44.3％和45.2％的EPA的五个菌株(即，#7、#14、#48、#56和#60)分别命名为Y8255、Y8256、Y8257、Y8258和Y8259。在这些EPA菌株中，Lip1基因座的敲除(GenBank登录号Z50020)未被确认。

这些菌株相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::ACO，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1，EXP1::EgD8M::Pex16，YAT1::E389S/EgD8M::Lip1，FBAIN::EgD5SM::Pex20，YAT1::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5M::Pex16，YAT1::EaD5SM::Oct；YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，GPD::YlCPT1::Aco。

解脂耶氏酵母菌株Y8259于2009年5月14日被保藏于美国典型培养物保藏中心，并被命名为ATCC PTA-10027。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Y8256和Y8259的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

菌株Y8259U(Ura3-)的构建

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO:130；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(实施例3)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8259的Ura3基因中。总计8个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#3中有占TFA 26.6％的EPA。该菌株被命名为菌株Y8259U。

生产占TFA约58.3％的EPA的Y8367菌株的构建

构建了构建体pZP2-85m98F(实施例5，图7B；SEQ ID NO：135)，以将一个Δ8去饱和酶基因、一个DGLA合酶、和一个Δ5去饱和酶基因整合进菌株Y8259U的耶氏酵母Pox2基因座(GenBank登录号AJ001300)，以由此使得能够生产更高水平的EPA。

用AscI/SphI消化了pZP2-85m98F质粒，然后以与关于pZP2-85m98F对菌株Y8647U3的转化(实施例5)所述的相似的方式，用于转化菌株Y8259U。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的96个用pZP2-85m98F转化的Y8259U菌株中大多数生产占TFA 41-46％的EPA。将生产了占TFA约46.7％、46.5％、47.4％和46.9％的EPA的四个菌株(即，#26、#33、#77和#81)分别命名为Y8367、Y8368、Y8369和Y8370。在这些EPA菌株中，Pox2基因座(GenBank登录号AJ001300)的敲除未被确认。

菌株Y8367、Y8368、Y8369和Y8370相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::ACO，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1，EXP1::EgD8M::Pex16，GPD::EaD8S::Pex16，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAIN::EgD5SM::Pex20，YAT1::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5M::Pex16，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，GPD::YlCPT1::Aco。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Y8367、Y8368、Y8369和Y8370的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

菌株Y8367U(Ura3-)的构建

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM(图5A；SEQ ID NO：130；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(实施例3)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8367的Ura3基因中。总计8个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#2、#3和#6中分别有占TFA25.6％、25.5％和25.4％的EPA。这三个菌株分别被命名为菌株Y8367U1、Y8367U2和Y8367U3(统称为Y8367U)。

生产占TFA约61.8％的EPA的Y8672菌株的构建

构建了构建体pZSCP-Ma83(实施例3，图6B；SEQ ID NO：133)，以将一种Δ8去饱和酶基因、一种C_16/18延伸酶基因和一种丙二酰-辅酶A合成酶基因整合进菌株Y8637U的SCP2基因座(GenBank登录号XM_503410)，以由此使得能够生产更高水平的EPA。

用AscI/SphI消化了pZSCP-Ma83质粒，然后以与关于pZSCP-Ma83对菌株Y8269U1的转化(实施例3)所述的相似的方式，用于转化菌株Y8367U1。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的96个用pZSCP-Ma83转化的Y8367U1菌株中大多数生产占TFA 46-52.5％的EPA。将生产了占TFA约53.2％、52.8％、52.7％、52.9％、53.0％、52.6％、53.1％和52.7％的EPA的八个菌株(即，#8、#40、#43、#44、#61、#63、#68和#70)分别命名为Y8666、Y8667、Y8668、Y8669、Y8670、Y8671、Y8672和Y8673。在这些EPA菌株中，SCP2基因座(GenBank登录号XM_503410)的敲除未被确认。

菌株Y8666、Y8667、Y8668、Y8669、Y8670、Y8671、Y8672和Y8673相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::ACO，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1，EXP1::EgD8M::Pex16，GPD::EaD8S::Pex16(2copies)，YA引::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAIN::EgD5SM::Pex20，YAT1::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5M::Pex16，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，GPD::YlCPT1::Aco，YAT1::MCS::Lip1。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Y8666、Y8669、Y8679和Y8672的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

实施例8

包含不同LPLAT开放阅读框的不同表达载体的构建

本实施例描述了一系列载体的构建，每种载体包含适合在解脂耶氏酵母中的表达的LPLAT开放阅读框。LPLAT开放阅读框包括啤酒糖酵母Ale1、解脂耶氏酵母Ale1、高山被孢霉LPAAT1、解脂耶氏酵母LPAAT1和秀丽隐杆线虫LPCAT。实施例9描述了将这些载体转入解脂耶氏酵母菌株Y8406U之后获得的结果。

LPLAT的起源

在专利文献和公开文献中，已有多种LPLAT被鉴定，但这些基因的官能度此前还未被直接比较。表22总结了可公开获得的LPLAT(即，ScAle1、ScLPAAT、MaLPAAT1和CeLPCAT)和本文中鉴定的LPLAT直系同源物(即，YlAle1和YlLPAAT1)，在就在解脂耶氏酵母中的表达对异源基因进行密码子优化之后(参见下文)，这些基因被用于本实施例中。

表22：功能性描述的LPLAT

^*啤酒糖酵母Ale1和秀丽隐杆线虫LPCAT被用作比较实施例。

更具体地讲，ScLPAAT(SEQ ID NO：32)和ScAle1(SEQ ID NO：15)蛋白质序列被用作查询序列，以从公开的解脂耶氏酵母蛋白质数据库“Yeastproject Genolevures”(Center for Bioinformatics，LaBRI，Talence Cedex，France)(另参见Dujon，B.等人，Nature，430(6995)：35-44(2004))鉴定直系同源物。基于对最佳匹配结果的分析，来自解脂耶氏酵母的Ale1和LPAAT直系同源物在本文中分别被鉴定为YlAle1(SEQ ID NO：17)和YlLPAAT(SEQID NO：31)。通过进行反向BLAST，进一步确认了YlAle1和YlLPAAT1分别作为ScAle1和ScLPAAT的直系同源物的鉴定，所述反向BLAST即，用SEQ ID NO：17和31作为查询序列，针对啤酒糖酵母公开的蛋白质数据库，分别找到ScAle1和ScLPAAT作为最佳匹配结果。

利用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的MegAlign^TM程序(版本8.0.2)的Clustal W方法(慢速，准确，Gonnet选项；Thompson等人，Nucleic Acids Res.，22：4673-4680(1994))，比对了以上鉴定为ScAle1(SEQ ID NO：15)，YlAle1(SEQ IDNO：17)、ScLPAAT(SEQ ID NO：32)、MaLPAAT1(SEQ ID NO：29)、YlLPAAT1(SEQ ID NO：31)和CeLPCAT(SEQ ID NO：25)的LPLAT蛋白质。由此得到了表23，其中相似度百分比显示在该表的上方三角形中，而趋异度百分比显示在下方三角形中。

表23：不同LPLAT之间的同一性和趋异度百分比

通过该方法显示的同一性百分比允许每种LPAAT多肽之间最小的同一性百分比和每种Ale1多肽之间最小的同一性百分比的确定。LPAAT多肽之间同一性的范围为34.0％同一性(MaLPAAT1和YlLPAAT1)至43.9％同一性(ScLPAAT和YlLPAAT1)，而ScAle1和YlAle1多肽之间的同一性为45％。

膜结合O-酰基转移酶[“MBOAT”]家族基序：通过用ScAle1(SEQ IDNO：15)作为查询序列，采用默认参数(期望阈值＝10；字长＝3；得分参数矩阵＝BLOSUM62；空位罚分：空位＝11，延伸＝1)针对“nr”蛋白质数据库(包括全部的非冗余GenBank CDS翻译、来源于来自布鲁克海文蛋白质数据库(Brookhaven Protein Data Bank [“PDB”])的3维结构的序列、除来自WGS计划的那些环境样本外的包括在SWISS-PROT蛋白质序列数据库的最新的主要发布、PIR和PRF中的序列)中的真菌蛋白质进行美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information[“NCBI”])BLASTP 2.2.20(蛋白质-蛋白质基本局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997)；和Altschul等人，FEBS J.，272：5101-5109(2005))检索，鉴定了ScAle1蛋白质序列(SEQ ID NO：15)的直系同源物。获得了下列匹配结果：

表24：ScAle1(SEQ ID NO：15)基于BLAST分析的真菌直系同源物

用DNASTAR比对了表24的酵母和真菌蛋白质序列。使用Clustal W比对方法(参见上文)进行了多重序列比对和同一性百分比计算。

更具体地讲，使用Clustal W比对方法进行的多重蛋白质比对的默认参数是：空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟分歧序列(Delay DivergentSeqs)(％)＝30，DNA转换权重(Transition Weight)＝0.5，蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB，采用“慢速-准确(slow-accurate)”选项。对所得到的比对进行了分析，以确定Ale1同源物的非植物基序的存在或不存在，如美国专利申请公布2008-0145867-A1中所鉴定的。具体而言，这些包括：M-[V/I]-[L/I]-xxK-[L/V/I]-xxxxxxDG(SEQ ID NO：102)、RxKYYxxWxxx-[E/D]-[A/G]xxxxGxG-[F/Y]-xG(SEQ ID NO：103)、EX₁₁WNX₂-[T/V]-X₂W(SEQ ID NO：21)和SAxWHGxxPGYxx-[T/F]-F(SEQID NO：104)，其中X编码任何氨基酸残基。SEQ ID NO：104中的His残基已被报道可能是该蛋白中的活性位点残基。

只有一个基序，即，EX₁₁WNX₂-[T/V]-X₂W(SEQ ID NO：21)，在所比对的全部33种生物中是完全保守的。其余的M-[V/I]-[L/I]-xxK-[L/V/I]-xxxxxxDG(SEQ ID NO：102)、RxKYYxxWxxx-[E/D]-[A/G]xxxxGxG-[F/Y]-xG(SEQ ID NO：103)和SAxWHGxxPGYxx-[T/F]-F(SEQ ID NO：104)基序仅为部分保守的。因此，为了本方法的目的，这些基序被适当地截短，以符合0错配(即，SAxWHG[SEQ ID NO：20])、1错配(即，RxKYYxxW[SEQ IDNO：19])、或2错配(即，M(V/I)(L/I)xxK(LVI)[SEQ ID NO：18])。

1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶[“LPAAT”]家族基序：对包括ScLPAAT(SEQ ID NO：18)、MaLPAAT1(SEQ ID NO：15)和YlLPAAT1(SEQID NO：17)的蛋白质比对的分析显示，1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序EGTR(SEQ ID NO：20)存在于每种上述LPAAT直系同源物中。基于此，MaLPAAT1被鉴定为一种可能的LPAAT，其与国际申请公布WO2004/087902中公开的高山被孢霉LPAAT-样蛋白质(即，SEQ ID NO：93和95)有明显的区别。

值得注意的是，EGTR(SEQ ID NO：20)基序尽管在国际申请公布WO2004/087902中的LPCAT序列中不存在，但却存在于CeLPCAT(SEQ IDNO：2)中。似乎是其他残基在LPAAT-样蛋白质中区别了LPAAT和LPCAT序列。一个此类的残基可能是EGTR(SEQ ID NO：20)基序的延伸。具体而言，ScLPAAT(SEQ ID NO：18)、MaLPAAT1(SEQ ID NO：15)和YlLPAAT1(SEQ ID NO：17)中的EGTR基序直接接着的是一个丝氨酸残基，而CeLPCAT中的EGTR基序直接接着的是一个天冬酰胺残基。与此相对，国际申请公布WO 2004/087902中的两种LPCAT在EGTR基序中具有缬氨酸对精氨酸残基的取代，并且该基序直接接着的是缬氨酸残基。

包含经密码子优化的啤酒糖酵母Ale1基因的pY201的构建

通过DNA 2.0(Menlo Park，CA)，对被命名为“ScAle1”的啤酒糖酵母ORF(SEQ ID NO：14)，就在解脂耶氏酵母中的表达进行了优化。除密码子优化外，还将5’Pci1和3’Not1克隆位点引入了该嵌合基因中(即，ScAle1S；SEQ ID NO：22)。在ScAle1S基因中的修改均未改变所编码的蛋白质的氨基酸序列(即，经密码子优化的基因所编码的蛋白质序列[即，SEQ ID NO：23]与野生型蛋白质序列[即，SEQ ID NO：15]是相同的)。ScAle1S被克隆进pJ201(DNA 2.0)，得到pJ201:ScAle1S。

从pJ201:ScAle1S切下了包含ScAle1S的1863bp Pci1/Not1片段，并用于构建pY201(SEQ ID NO：139；表25；图10A)。除包含嵌合的YAT1::ScAle1S::Lip1基因外，pY201还包含解脂耶氏酵母URA3选择标记，所述标记两侧为LoxP位点，必要时其可通过重组酶介导的重组用于随后的移除。YAT1::ScAle1S::Lip1嵌合基因和URA3基因的两侧均与与解脂耶氏酵母Pox3基因的5’和3’区域具有同源性的片段相接，以有利于通过双重同源重组的整合，尽管向解脂耶氏酵母中的整合的发生已知通常不通过同源重组。如此，构建体pY201因此包含以下组分：

表25：对质粒pY201(SEQ ID NO：139)的描述

包含解脂耶氏酵母Ale1基因的pY168的构建

使用PCR引物798和799(SEQ ID NO分别为：141和142)，通过PCR从解脂耶氏酵母ATCC#20362cDNA文库扩增了被命名为“YlAle1”的解脂耶氏酵母开放阅读框(GenBank登录号XP_505624；SEQ ID NO：16)。此外，通过PCR引物800和801(SEQ ID NO分别为：143和144)从pY201(SEQ ID NO：139)扩增了YAT启动子。由于上述引物对被设计为产生两种彼此具有一段重叠的PCR产物，随后使用引物798和801(SEQ ID NO分别为：141和144)并用这两种PCR片段作为模板，通过重叠PCR扩增了YAT1::YlAle1融合片段。PCR采用制造商的推荐规范和Pfu Ultra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene，目录号600380)在RoboCycler Gradient 40PCR仪(Stratagene)中进行。扩增的进行如下：首先于95℃变性4分钟，然后是30个循环的：95℃变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。最后在72℃进行10分钟的延伸循环，随后在4℃终止反应。

凝胶纯化了包含YAT1::Yl Ale1融合片段的PCR产物，并用ClaI/NotI进行了消化。该Cla1-Not1片段被连接至已被类似地消化过(从而移除了YAT1::ScAle1S片段)的pY201，以产生包含嵌合的YAT1::YlAle1::Lip1基因的pY168(SEQ ID NO：145)。通过DNA测序确认了耶氏酵母Ale1开放阅读框的DNA序列。除了pY168中的是YAT1::YlAle1::Lip1基因而pY201(图10A)中是YAT1::ScAle1S::Lip1基因之外，pY168(图10B；SEQ IDNO：145)中存在的组分与pY201中存在的那些是相同的。注意在图10B中YlAle1被标记为“Yl LPCAT”。

包含高山被孢霉LPAAT1基因的pY208的构建

通过DNA 2.0(Menlo Park，CA)，对被命名为“MaLPAAT1”的高山被孢霉开放阅读框(SEQ ID NO：28)，就在解脂耶氏酵母中的表达进行了优化。除密码子优化外，还将5’Pci1和3’Not1克隆位点引入了该嵌合基因中(即，MaLPAAT1S；SEQ ID NO：35)。在MaLPAAT1S基因中的修改均未改变所编码的蛋白质的氨基酸序列(即，经密码子优化的基因所编码的蛋白质序列[即，SEQ ID NO：36]与野生型蛋白质序列[即，SEQ ID NO：29]是相同的)。MaLPAAT1S被克隆进pJ201(DNA 2.0)，得到pJ201:MaLPAAT1S。

从pJ201:MaLPAAT1S切下包含MaLPAAT1S的945bp Pci1/Not1片段，并用于在与pY201(SEQ ID NO：139)的两个片段的3方连接中构建pY208(SEQ ID NO：146)。具体而言，将MaLPAAT1片段与3530bp的Sph-NotI pY201片段和4248bp的NcoI-SphI pY201片段连接，从而得到pY208。除了pY208中的是YAT1::MaLPAAT1S::Lip1基因而pY201(图10A)中是YAT1::Sc Ale1S::Lip1基因之外，pY208(图11A；SEQ IDNO：146)中存在的组分与pY201中存在的那些是相同的。

包含解脂耶氏酵母LPAAT1基因的pY207的构建

在美国专利7,189,559中描述了来自解脂耶氏酵母的推定的LPAAT1(本文中命名为“YlLPAAT1”；SEQ ID NO：30和31)，其GenBank登录号为XP_504127。该蛋白质被注释为“与uniprot|P33333啤酒糖酵母YDL052cSLC1脂肪酰基转移酶相似”。

用解脂耶氏酵母ATCC#20362 cDNA文库作为模板，并使用PCR引物856和857(SEQ ID NO分别为：147和148)通过PCR扩增了YlLPAAT1开放阅读框(SEQ ID NO：30)。PCR使用与上文中关于在合成pY168之前对YAT1::Yl Ale1融合片段的扩增所述的相同的组分和条件进行。

用PciI和NotI消化了包含YlLPAAT1开放阅读框的PCR产物，然后将其用于与来自pY168的两种片段的3方连接中。具体而言，将YlLPAAT1片段与3530bp的Sph-NotI pY168片段和4248bp的NcoI-SphI pY168片段连接，以产生包含YAT1::YlLPAAT1::Lip1嵌合基因的pY207。通过DNA测序确认了解脂耶氏酵母LPAAT1开放阅读框。除了pY207中的是YAT1::YlLPAAT1::Lip1嵌合基因而pY201(图10A)中是YAT1::ScAle1S::Lip1基因之外，pY207(图11B；SEQ ID NO：149)中存在的组分与pY201中存在的那些是相同的。注意YlLPAAT1在图11B中被标记为“Yl LPAT1 ORF”。

包含秀丽隐杆线虫LPCAT基因的pY175的构建

由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)对被命名为“CeLPCAT”(SEQ ID NO：24)的秀丽隐杆线虫开放阅读框，就在解脂耶氏酵母中的表达进行了优化。除密码子优化外，还将5’Nco1和3’Not1克隆位点引入了该嵌合基因中(即，CeLPCATS；SEQ ID NO：26)。在CeLPCATS基因中的修改均未改变所编码的蛋白质的氨基酸序列(即，经密码子优化的基因所编码的蛋白质序列[即，SEQ ID NO：27]与野生型蛋白质序列[即，SEQ ID NO：25]是相同的)。

包含CeLPCATS的Nco1-Not1片段被用于在与来自pY168(SEQ IDNO：145)的两种片段的3方连接中构建pY175(SEQ ID NO：150)。具体而言，将包含CeLPCATS的Nco1-Not1片段与3530bp的Sph-NotI pY168片段和4248bp的NcoI-SphI pY168片段连接，从而得到pY175。除了pY175中的是YAT1::CeLPCATS::Lip1基因而pY201(图10A)中是YAT1::ScAle1S::Lip1基因之外，pY175(图12A；SEQ ID NO：150)中存在的组分与pY201中存在的那些是相同的。注意在图12A中CeLPCATS被标记为“Ce.LPCATsyn”。

实施例9

不同的LPLAT在生产EPA的解脂耶氏酵母菌株Y8406中的功能表征

生产EPA的解脂耶氏酵母菌株Y8406U被用于从功能上表征在啤酒糖酵母Ale1、解脂耶氏酵母Ale1、高山被孢霉LPAAT1、解脂耶氏酵母LPAAT1和秀丽隐杆线虫LPCAT在被稳定整合进耶氏酵母宿主染色体中后，它们的过表达的效应。这与包含其天然的LPLAT(即Ale1和LPAAT1)的宿主构成了比较。

转化和生长

为了破会Ura3基因(实施例3)，构建体pZKUM(图5A；SEQ IDNO：130；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以与关于pZKUM对菌株Y8006的转化所述的(实施例3)相似的方式，被用于将Ura3突变型基因整合进菌株Y8406的Ura3基因中。若干个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在pZKUM-转化体菌株#4和#5中有占FAME 26.1％的EPA。这两个菌株分别被命名为菌株Y8406U1和Y8406U2(统称为Y8406U)。

然后，用实施例8中所述的整合载体的线性SphI-AscI片段，其中每种LPCAT处于耶氏酵母YAT1启动子的控制下，分别地转化了解脂耶氏酵母菌株Y8406U。具体而言，根据“一般方法”转化了载体pY201(YAT1::ScAle1S::Lip1)、pY168(YAT1::YlAle1::Lip1)、pY208(YAT1::MaLPAAT1S::Lip1)、pY207(YAT1::YlLPAAT1::Lip1)和pY175(YAT1::CeLPCATS::Lip1)。

每种转化混合物被铺在MM琼脂平板上。挑取了若干个所得到的URA+转化体，并接种至3mL FM培养基(Biomyx，目录号CM-6681，Biomyx Technology，San Diego，CA)中，上述FM培养基每升包含：6.7g不含氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base(酵母氮源)、5g酵母提取物、6gKH₂PO₄、2g K₂HPO₄、1.5g MgSO₄·7H₂0、1.5mg硫胺素·HCl、和20g葡萄糖。在摇动器上以200rpm和30℃生长2天后，通过离心收集培养物，并重悬于3mL包含0.63％磷酸二氢钾、2.7％磷酸氢二钾、8.0％葡萄糖的HGM培养基(目录号2G2080，Teknova Inc.，Hollister，CA)中，调节至pH 7.5。在摇动器上以200rpm和at 30℃生长5天后，通过离心收集1mL培养物的等分试样并通过GC分析。具体而言，经过培养的细胞通过在13,000rpm下离心1分钟进行收集，提取总脂质并通过酯交换制备脂肪酸甲酯[“FAMEs”]，随后用Hewlett-Packard 6890GC(一般方法)进行分析。

基于所述3mL培养物的脂肪酸组成，进一步表征了经过选择的转化体。具体而言，选择了用表达载体pY201(包含ScAle1S)转化的菌株Y8406U的克隆#5和#11，并分别命名为“Y8406U::ScAle1S-5”和“Y8406U::ScAle1S-11”；选择了用表达载体pY168(包含YlAle1)转化的菌株Y8406U的克隆#16，并命名为“Y8406U::YlAle1”；选择了用表达载体pY208(包含MaLPAAT1S)转化的菌株Y8406U的克隆#8，并命名为“Y8406U::MaLPAAT1S”；选择了用表达载体pY207(包含YlLPAAT1)转化的菌株Y8406U的克隆#21，并命名为“Y8406U::YlLPAAT1”；并且选择了用表达载体pY175(包含CeLPCATS)转化的菌株Y8406U的克隆#23，并命名为“Y8406U::CeLPCATS”。此外，菌株Y8406(作为菌株Y8406U(Ura-)的亲本的Ura+菌株)被用作对照物。

每种经过选择的转化体和对照物被划线至MM琼脂平板上。然后，一个接种环的新鲜划线的细胞被接种至3mL FM培养基，并于30℃以250rpm培养过夜。测量OD_600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL FM培养基中最终的OD_600nm为0.3。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行GC分析(同上)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。

脂质含量、脂肪酸组成和转化效率

在相同条件下进行了总共四次单独的实验。实验1比较了对照菌株Y8406对菌株Y8406U::ScAle1S-5。实验2比较了对照菌株Y8406对菌株Y8406U::YlAle1。实验3比较了对照菌株Y8406对菌株Y8406U::YlAle1、strain Y8406U::ScAle1S-11、和strain Y8406U::MaLPAAT1S。实验4比较了对照菌株Y8406对菌株Y8406U::MaLPAAT1S、strain Y8406U::YlLPAAT1和strain Y8406U::CeLPCATS。

在每个实验中，对于Y8406对照菌株和Y8406U转化体菌株的1个、2个或3个重复的培养物[“重复样品”]，对脂质含量、脂肪酸组成和EPA占DCW的百分比进行了定量。此外，每种Y8406U转化体的数据还被显示为占Y8406对照物的百分比。下面的表26总结了细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、以占TFA的重量％[“％TFA”]表示的每种脂肪酸的浓度和以占干细胞重量的百分比表示的EPA含量[“EPA％DCW”]。更具体地讲，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA和EPA。

表27总结了在PUFA生物合成途径中起作用并且为EPA的生产所需的每种去饱和酶和Δ9延伸酶的转化效率。具体而言，对于每种Y8406对照菌株和Y8406U转化体菌株，提供了Δ12去饱和酶转化效率[“Δ12CE”]、Δ8去饱和酶转化效率[“Δ8CE”]、Δ5去饱和酶转化效率[“Δ5CE”]、Δ17去饱和酶转化效率[“Δ17CE”]和Δ9延伸转化效率[“Δ9e CE”]；每种Y8406U转化体的数据被显示为占Y8406对照物的百分比。转化效率按照下列式子计算：产物/(产物+底物)*100，其中产物既包括产物也包括产物衍生物。

基于表26和27中关于实验1、2和3的数据，LPLAT在EPA菌株Y8406U::ScAle1S-5、Y8406U::ScAle1S-11、Y8406U::YlAle1和Y8406U::MaLPAAT1S中的过表达导致了以占TFA的重量％计的LA(18:2)浓度[“LA％TFA”]的显著降低(达对照物的67％或更低)、以占TFA的重量％计的EPA浓度[“EPA％TFA”]的升高(达对照物的至少12％)、和Δ9延伸酶转化效率的升高(达对照物的至少16％)。与Y8406U::ScAle1S-5和Y8406U::ScAle1S-11相比，Y8406U::YlAle1具有更低的LA％TFA、更高的EPA％TFA、更好的Δ9延伸酶转化效率、和略低的TFA％DCW和EPA％DCW。除MaLPAAT1S的过表达导致了较低的LA％TFA、EPA％TFA、和EPA％DCW外，Y8406U::YlAle1和Y8406U::MaLPAAT1S是相似的。

实验4显示，LPLAT在EPA菌株Y8406U::YlAle1、Y8406U::MaLPAAT1S和Y8406U::CeLPCATS中的过表达导致了LA％TFA的显著降低(达对照物的67％或更低)、EPA％TFA的升高(达对照物的至少9％)、和Δ9延伸酶转化效率的升高(达对照物的至少13％)。与Y8406U::CeLPCATS相比，Y8406U::YlLPAAT1和Y8406U::MaLPAAT1S均具有更低的LA％TFA、更高的EPA％TFA、更高的EPA％DCW、和略好的TFA％DCW。除MaLPAAT1S的过表达导致了较低的LA％TFA、略低的EPA％TFA和EPA％DCW、以及略低的Δ9延伸酶转化效率外，Y8406U::YlLPAAT1和Y8406U::MaLPAAT1S是相似的。

在本领域中众所周知，大多数去饱和发生在磷脂的sn-2位上，而脂肪酸延伸发生在酰基-辅酶A上。此外，预期ScAle1S、YlAle1、MaLPAAT1S和YlLPAAT1仅使酰基基团从酰基-辅酶A库掺入溶血磷脂，例如溶血磷脂酸[“LPA”]和溶血磷脂酰胆碱[“LPC”]的sn-2位。因此，预期ScAle1S、YlAle1、MaLPAAT1S、和YlLPAAT1的表达将由于提高的磷脂底物可用性而导致去饱和的提高，而不导致需要辅酶A库中提高的底物可用性的延伸的提高。我们的数据(参见上文)显示，意外地，ScAle1S、YlAle1、MaLPAAT1S和YlLPAAT1的表达在生产EPA的耶氏酵母菌株中显著提高了Δ9延伸酶转化效率但并未提高(以Δ12去饱和酶转化效率、Δ8去饱和酶转化效率、Δ5去饱和酶转化效率或Δ17去饱和酶转化效率测量的)去饱和。

CeLPCAT此前已被显示在饲喂LA或GLA的啤酒糖酵母中提高Δ6延伸转化效率(国际申请公布WO 2004/076617)。这归因于其使脂肪酸从磷脂释放至辅酶A库的可逆的LPCAT活性。在国际申请公布WO 2004/076617中，并未预期在针对没有饲喂脂肪酸情况下的高水平LC-PUFA生产进行过基因工程改造的含油微生物如解脂耶氏酵母中，Δ9延伸转化效率的改善。

此外，在生产EPA的耶氏酵母菌株中，ScAle1S、YlAle1、MaLPAAT1S、YlLPAAT1和CeLPCATS的表达没有显著改变所积累的PUFA水平或总脂质含量。

在先的研究已显示，由于在磷脂和酰基-辅酶A库之间酰基基团的转移不良，Δ6延伸和Δ9延伸都是长链PUFA生物合成中的瓶颈。基于上文所展示的LPCAT的过表达造成的Δ9延伸酶转化效率的提高，预期本文所述的LPCAT和它们的直系同源物如ScLPAAT，将同样提高Δ6延伸转化效率。

实施例10

包含LPAAT开放阅读框和自主复制序列的表达载体的构建

本实施例描述了适用于在解脂耶氏酵母中没有整合的LPAAT基因表达的、包含自主复制序列[“ARS”]和LPAAT开放阅读框的载体的构建。开放阅读框包括编码SEQ ID NO：32的啤酒糖酵母LPAAT和编码SEQ IDNO：31的解脂耶氏酵母LPAAT1。实施例11描述了将这些载体转入解脂耶氏酵母之后获得的结果。

包含经密码子优化的啤酒糖酵母LPAAT基因的pY222的构建

通过DNA 2.0(Menlo Park，CA)，对被命名为“ScLPAAT”的啤酒糖酵母开放阅读框(SEQ ID NO：32)，就在解脂耶氏酵母中的表达进行了优化。除密码子优化外，还将5’Pci1和3’Not1克隆位点引入了该嵌合基因中(即，ScLPAATS；SEQ ID NO：151)。在ScLPAATS基因中的修改均未改变所编码的蛋白质的氨基酸序列(即，经密码子优化的基因所编码的蛋白质序列[即，SEQ ID NO：152]与野生型蛋白质序列[即，SEQ ID NO：32]是相同的)。ScLPAATS被克隆进pJ201(DNA 2.0)，得到pJ201:ScLPAATS。

包含ScLPAATS的926bp的Pci1/Not1片段被从pJ201:ScLPAATS上切下，并被克隆进NcoI-Not1切割的pYAT-DG2-1中，以构建pY222(SEQ IDNO：153；表28；图14A)。因此，构建体pY222包含下列组分：

表28：对质粒pY222(SEQ ID NO：153)的描述

包含解脂耶氏酵母LPAAT1基因的pY177的构建

使用引物869(SEQ ID NO：154)和引物870(SEQ ID NO：155)，以质粒pYAT-DG2-1作为模板，通过标准PCR扩增了解脂耶氏酵母着丝粒和自主复制序列[“ARS”]。用AscI/AvrII消化了PCR产物，并克隆进AscI-AvrII消化过的pY207(SEQ ID NO：149；实施例8)中，以构建pY177(SEQ IDNO：156；表29；图14B)。因此，除AscI和AvrII之间373bp的pY207序列被包含ARS的1341bp序列替换之外，pY177中存在的组分与pY207(图12A)中的那些是相同的。更具体地讲，pY177包含下列组分：

表29：对质粒pY177(SEQ ID NO：156)的描述

实施例11

不同的LPAAT在生产EPA的解脂耶氏酵母菌株Y8406中的功能表征

生产EPA的解脂耶氏酵母菌株Y8406U被用于从功能上表征在自主复制质粒上的没有整合的啤酒糖酵母LPAATS(SEQ ID NO：151)和解脂耶氏酵母LPAAT1(SEQ ID NO：30)的表达的效应。这与包含其天然的LPAAT的宿主构成了比较。

转化和生长

用来自实施例10的未切割的质粒分别地转化了解脂耶氏酵母菌株Y8406U(实施例9)。具体而言，按照“一般方法”转化了载体pY177(YAT1::YlLPAAT1::Lip1)[SEQ ID NO：156]和pY222(YAT1::ScLPAATS::Lip1)[SEQ ID NO：153]。

每种转化混合物被铺在MM琼脂平板上。挑取了若干个所得到的URA+转化体，并接种至3mL CSM-U培养基(Teknova目录号C8140，Teknova Inc.，Hollister，CA)中，其中CSM-U培养基是指含有葡萄糖减去尿嘧啶的CM肉汤，包含0.13％氨基酸省却成分粉末减尿嘧啶，0.17％酵母氮源，0.5％(NH₄)₂SO₄，和2.0％葡萄糖。在摇动器上以200rpm和30℃生长2天后，通过离心收集培养物，并重悬于3mL HGM培养基(目录号2G2080，Teknova Inc.)中。在摇动器上生长5天后，收集上述培养物的1mL等分试样并通过GC进行分析，如实施例9中所述。

基于所述3mL培养物的脂肪酸组成，通过烧瓶检测法进一步表征了经过选择的转化体。具体而言，选择了用表达载体pY222(包含ScLPAATS)转化的菌株Y8406U的克隆#5和#6，并分别命名为“Y8406U::ScLPAATS-5”和“Y8406U::ScLPAATS-6”；选择了用表达载体pY177(包含YlLPAAT1)转化的菌株Y8406U的克隆#1，并命名为“Y8406U::YlLPAAT1”。

此外，菌株Y8406(作为菌株Y8406U(Ura-)的亲本的Ura+菌株)被用作对照物。

每种经过选择的转化体和对照物被划线至MM琼脂平板上。然后，一个接种环的新鲜划线的细胞被接种至3mL CSM-U培养基，并于30℃以250rpm培养过夜。测量OD_600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL CSM-U培养基中最终的OD_600nm为0.3。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行GC分析(参见上文)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定，如实施例9中所述。

脂质含量、脂肪酸组成和转化效率

对于Y8406对照菌株和Y8406U转化体菌株的2个重复的培养物[“重复样品”]，对脂质含量、脂肪酸组成和EPA占DCW的百分比进行了定量。此外，每种Y8406U转化体的数据还被显示为占Y8406对照物的百分比。下面的表30总结了细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、以占TFA的重量％[“％TFA”]表示的每种脂肪酸的浓度和以占干细胞重量的百分比表示的EPA含量[“EPA％DCW”]。更具体地讲，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA和EPA。

表31以与实施例9中所述的相同的方式总结了在PUFA生物合成途径中起作用并且为EPA的生产所需的每种去饱和酶和Δ9延伸酶的转化效率。

基于以上表30和表31中的数据，ScLPAATS和YlLPAAT1在生产EPA 的菌株Y8406U::YlLPAAT1、Y8406U::ScLPAATS-5和Y8406U::ScLPAATS-6中的表达均导致了按TFA的重量％计的LA(18:2)浓度[“LA％TFA”]的降低(达对照物的76％或更低)和Δ9延伸酶转化效率的升高(达对照物的至少7％)。ScLPAATS和YlLPAAT1对脂质谱具有相似的影响。

然后，将以上获得的结果与实施例9中获得的那些进行了比较，尽管采用了不同的方式来表征LPLAT。具体而言，在实施例9中，由于载体缺少ARS序列，携带LPLAT的线性化的DNA通过染色体整合被转化。这导致了稳定的整合，并且在预培养和被转至HGM之前的2天的生长中，菌株均生长于相对丰富的、非选择性的FM生长培养基中。

在实施例11中，从功能上对YlLPAAT1和ScLPAATS的表征在自我复制的质粒上进行。因此，用携带每种LPAAT和ARS序列的环状DNA转化解脂耶氏酵母菌株Y8406。为了维持这些质粒并检测未整合的基因的表达，在预培养和被转至HGM之前的2天的生长中，必须使转化体在选择培养基(即，CSM-U培养基)上生长。

以上所述的这些差异能够促成脂质谱和含量的差异，如实施例9和11中通过YlLPAAT1的表达所显示的。在实施例9中，基于YlLPAAT的表达，LA％TFA、EPA％TFA和Δ9延伸酶转化效率相对于对照物的变化分别为63％、115％和115％，而在实施例11中，基于YlLPAAT的表达，LA％TFA、EPA％TFA和Δ9延伸酶转化效率相对于对照物的变化分别为76％、101％和107％。因此，与实施例9中所观察到的相比，实施例11中Δ9延伸和LC-PUFA生物合成的改善是最小化的。这些差异可以归因于染色体整合的“位置效应”和/或不同的生长条件。

由于就在自主复制质粒上被转入解脂耶氏酵母菌株Y8406的ScLPAATS和YlLPAAT而言，LC-PUFA生物合成的改善(测量为LA％TFA的降低、EPA％TFA的升高和Δ9延伸酶转化效率的升高)是相似的，预期这两种LPLAAT在稳定整合进宿主染色体时将同样发挥相似的功能。因此，ScLPAATS将很可能以与YlLPAAT1被稳定整合进宿主染色体的实施例9中所观察到的相似的方式改善脂质谱。

Claims

1.生产油的重组耶氏酵母属(Yarrowia sp)宿主细胞，所述油包含：

(a)按总脂肪酸的重量百分比计至少50％的二十碳五烯酸；并且，

2.权利要求1的重组耶氏酵母属宿主细胞，其中所述宿主细胞包含：

(b)至少一种其表达被下调的过氧化物酶体生物合成因子蛋白；和，

3.权利要求2的重组宿主细胞，其中所述丙二酰-辅酶A合成酶基本上由选自SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42的序列组成。

4.权利要求2的重组宿主细胞，其中所述酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶基本上由以下序列组成，所述序列选自SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31和SEQ IDNO：32。

5.权利要求2的重组宿主细胞，其中所述复合酶连接子选自：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

6.权利要求2的重组宿主细胞，其中所述复合酶基本上由以下序列组成，所述序列选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13。

7.用于制备包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，所述方法包括：

a)培养权利要求1-5中任一项的宿主细胞，其中包含二十碳五烯酸的微生物油被生产；以及，

b)任选地回收步骤(a)的微生物油。

8.权利要求7的方法，其中步骤(b)的回收的油被进一步加工。

9.用于生产油的重组宿主细胞，所述油包含按总脂肪酸的重量百分比计至少50％的二十碳五烯酸，所述宿主细胞选自：具有ATCC名称ATCC PTA-10025的解脂耶氏酵母Y8406；具有ATCC名称ATCCPTA-10026的解脂耶氏酵母Y8412；和，具有ATCC名称ATCCPTA-10027的解脂耶氏酵母Y8259。