TWI571510B - 酵母菌菌株的馴化方法及其馴化酵母菌菌株 - Google Patents

Description

酵母菌菌株的馴化方法及其馴化酵母菌菌株

本發明有關於一種酵母菌菌株的馴化方法及其馴化酵母菌菌株，特別是一種耶式解脂酵母菌(Yarrowia Lipolytica)之馴化方法及其馴化菌株。

透過石油提煉出的石油化學產物及燃料帶給人們生活極大的便利，然而在生產或使用的過程中所產生的二氧化碳及其他物質，卻造成地球暖化及環境變遷日益嚴重。為了環境的永續經營，生質燃料逐漸受到國際的重視，許多國家陸續訂立政策目標，提高生質燃料使用量。

以航空產業為例，2010年全球航空燃油的使用量已達到1千億加侖。若航空燃油能採用生質航空燃油作為燃料，不僅可在引擎燃燒時有效降低硫、一氧化碳與多環芳香烴類的產生及減緩二氧化氮之淨產量，亦可降低原油煉解時所產生的汙染，同時分散對石油的依賴。

生質航空燃油主要使用碳鏈長8至16碳的噴射式引擎用燃料。生產生質航空燃油之技術係以耶式解脂酵母菌(Yarrowia Lipolytica)發酵，生產特定碳鏈長脂肪酸，此類脂肪酸可視為轉為完全相容性(Drop in) 生質航空燃油及生質柴油或其他生質化學產品的前驅物。

然而纖維料源在經過蒸氣爆裂處理時，會產生多種的抑制物，如：呋喃甲醛(Furfural)、羥甲基糠醛(5-HMF)及醋酸(Acetic Acid)等，這些物質的濃度升高，將造成菌株的生長遲緩，甚至有導致菌株死亡的可能性。雖然目前已有數種去毒性的化學反應，將纖維水解液經處理後，可降低其含有的抑制物的濃度，但此去毒化的處理程序將會增加生質燃油的生產成本。

此外，透過酵母菌發酵生產游離脂肪酸最大的問題在於脂肪酸的轉化率不高。酵母菌生產游離脂肪酸的發酵條件大都為低氮源的發酵環境，但低氮源之環境容易造成酵母菌菌株不易生長，因此導致單位體積發酵液體裡的菌株所生產的游離脂肪酸總量偏低。而大部分之先前技術均透過基因修改，以增加菌株發酵後的含脂率、產脂量及累積脂肪酸的能力。

本發明之一目的，在於利用低氮源馴化方式培養解脂酵母菌菌株，可提高菌株生成游離脂肪酸的能力，使菌株在高濃度纖維抑制物的環境下具有耐受力，提升醣類轉化脂肪酸的效率。

本發明之一目的，在於提供一種酵母菌菌株的馴化方法，其中馴化酵母菌菌株除可使用第一代生質燃料作為料源，亦可使用第二代生質燃料做為料源。將第二代生質燃料經前處理及水解後，透過解脂酵母菌發酵以生產游離脂肪酸，此類脂肪酸可視為將料源轉為完全相容性的生質航空燃油及生質柴油，或其他生質化學產品的前驅物。此外這些料源為農 業廢棄物，不會因為生質燃料油的製造而造成與民爭糧的問題。

為達到上述目的，本發明提供一種酵母菌菌株的馴化方法，包括以下步驟：以酵母萃取物與蛋白腖配製成一低氮源培養配方，其中低氮源培養配方的碳氮比為10到75；將低氮源培養配方經高溫高壓滅菌，並製成一低氮源培養基；將一菌液接種於該低氮源培養基內培養後，得到一馴化酵母菌菌株。其中菌液包括一未馴化酵母菌菌株，學名為Yarrowia Lipolytica，於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心之寄存編號為BCRC 21252。

為達到上述目的，本發明提供一種藉由上述馴化方法所獲得的馴化酵母菌菌株，其中該未馴化酵母菌菌株係為Yarrowia Lipolytica，於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心之寄存編號為BCRC 21252。

在本發明馴化方法一實施例中，其中該低氮源培養配方之碳氮比為15到60。

在本發明馴化方法一實施例中，其中該低氮源培養配方之碳氮比為15.8到45。

在本發明酵母菌菌株馴化方法一實施例中，包括以下步驟：將該低氮源培養配方經攝氏110度到攝氏150度高壓滅菌15到30分鐘，以製成該低氮源培養基。

在本發明化方法一實施例中，中該馴化酵母菌菌株用以於一第一代生質燃料料源或一第二代生質燃料料源內發酵。

在本發明馴化方法一實施例中，其中該第一代生質燃料料源 包括含油脂、澱粉或糖類的作物。

在本發明馴化方法一實施例中，其中該第二代生質燃料料源包括非糧食纖維原料或農業廢棄物。

在本發明馴化方法一實施例中，其中該馴化酵母菌菌株生產至少一游離脂肪酸，該游離脂肪酸包括C20：0、C18：0、C16：0、C14：0、C12：0或C10：0之游離脂肪酸。。

在本發明馴化酵母菌菌株一實施例中，用以在一第一代生質燃料料源或一第二代生質燃料料源內發酵。

在本發明馴化酵母菌菌株一實施例中，其中該第一代生質燃料料源包括含油脂、澱粉或糖類的作物。

在本發明馴化酵母菌菌株一實施例中，其中該第二代生質燃料料源包括非糧食纖維原料或農業廢棄物。

在本發明馴化酵母菌菌株一實施例中，是用於生產至少一游離脂肪酸，該游離脂肪酸包括C20：0、C18：0、C16：0、C14：0、C12：0或C10：0。

第1圖：為本發明酵母菌菌株之馴化方法一實施例的步驟流程圖。

第2圖：為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株於低氮源發酵條件下之生長濃度的折線圖。

第3圖：為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株於低氮源發酵條件下之葡萄糖代謝量的折線圖。

第4圖：為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株於木片水解液發酵條件下之生長濃度的折線圖。

第5圖：為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株於木片水解液發酵條件下之葡萄糖代謝量的折線圖。

第6圖：為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株分別於木片水解液且未額外添加氮源之發酵條件下及稻稈水解液之發酵條件下的生長濃度折線圖。

第7圖：為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株分別於木片水解液且未額外添加氮源之發酵條件下及稻稈水解液之發酵條件下的葡萄糖代謝量折線圖。

第8圖：為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株分別於低氮源發酵條件、木片水解液、木片水解液且未額外添加氮源及稻稈水解液之發酵條件下的游離脂肪酸產量直條圖。

第9圖：為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株分別於低氮源發酵條件、木片水解液、木片水解液且未額外添加氮源及稻稈水解液之發酵條件下的游離脂肪酸含量比率直條圖。

第10圖：為本發明所述的馴化酵母菌菌株的產物分析圖。

以下提供本發明之實施詳細說明及發明技術特徵，使得熟習本技術領域之通常知識者得以充分了解並據以實施。

請參閱第1圖，為本發明酵母菌菌株之馴化方法一實施例的 步驟流程圖。如圖所示，首先將酵母萃取物(yeast extract)與蛋白腖(peptone)配製成一碳氮比為10到75之低氮源培養配方，如步驟S1所示。

將低氮源培養配方經高溫高壓滅菌，並製成一低氮源培養基，如步驟S2所示。在本發明一實施例中，可將低氮源培養配方經110到150℃高壓滅菌15到30分鐘，待其冷卻後可得到低氮源培養基。

此外，在本發明一實施例中，用以馴化酵母菌菌株的低氮源培養配方，以碳氮比15到60為較佳，並以碳氮比為15.8到45為最佳。而高溫高壓滅菌以121到135℃為佳。

將一菌液接種於低氮源培養基內培養，其中菌液包括未馴化酵母菌菌株，如步驟S3所示，藉此以得到至少一馴化酵母菌菌株，如步驟S4所示。未馴化酵母菌菌株學名為耶式解脂酵母菌菌株(Yarrowia Lipolytica)，於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心之寄存編號為BCRC 21252。在本發明一實施例中，可於一凍管取出含有未馴化酵母菌菌株之菌液，取出菌液體積為待培養低氮源培養基體積之1‰。而後將未馴化酵母菌菌株之菌液接種於低氮源培養基內，並於24℃及轉速200rpm的發酵條件下培養24小時，藉此以得到含經馴化酵母菌菌株的菌液。

在本發明一實施例中，該馴化酵母菌菌株用以發酵第一代生質燃料料源，例如油脂、澱粉或糖類等作物，或者是第二代生質燃料料源，例如木片、稻稈等非糧食纖維原料或農業廢棄物。經前處理及水解後的第一代生質燃料料源或第二代生質燃料料源，經過本發明馴化酵母菌菌株的發酵後，會產生碳鏈長C20：0、C18：0、C16：0、C14：0、C12：0或C10：0之游離脂肪酸。這些游離脂肪酸可進一步轉換為生質航空燃油及生質柴油，或其 他生質化學產品的前驅物。

在本發明第一實施例中，將經低氮源培養配方馴化之馴化酵母菌菌液8ml及未馴化之酵母菌菌液8ml分別置入40ml的發酵體積進行發酵，其中兩個40ml的發酵體積還包含低氮源配方22ml及40%葡萄糖液10ml。而後分別將兩個40ml的發酵體積置於24℃且轉速200rpm的發酵條件下培養至第七天。

請參閱第2圖，為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株於低氮源發酵條件下之生長濃度的折線圖。如圖所示，馴化酵母菌菌液濃度於波長600nm下有吸光值(Optical density,OD)54.1，而未馴化酵母菌菌液的濃度為OD 29，因此馴化酵母菌菌液的OD值相較於未馴化酵母菌菌液提升了86.6%。此外馴化酵母菌菌液發酵後之游離脂肪酸產量達5.99g/L，而未馴化酵母菌菌液之游離脂肪酸產量為1.14g/L，因此馴化酵母菌菌液之游離脂肪酸產量相較於未馴化酵母菌菌液提升4.24倍。馴化酵母菌發酵後之游離脂肪酸含量的比率為50.3%，而未馴化酵母菌之游離脂肪酸含量的比率為17.9%，因此馴化酵母菌菌液之游離脂肪酸含量相較於未馴化酵母菌菌液提升1.81倍。

請參閱第3圖，為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株於低氮源發酵條件下之葡萄糖代謝量的折線圖。如圖所示，馴化酵母菌菌液發酵後之糖代謝量為56.1g/L，而未馴化酵母菌菌液之糖代謝量為44.4g/L，因此馴化酵母菌菌液之糖代謝量相較於未馴化酵母菌菌液提升26.4%。

在本發明第二實施例中，將經低氮源培養配方馴化之馴化酵 母菌菌液1ml及未馴化之酵母菌菌液1ml分別置入40ml的發酵體積進行發酵，其中兩個40ml之發酵體積還包含39ml的木片水解液及0.17g酵母萃取物與0.06克的蛋白腖做為補充氮源。分別置於24℃、轉速200rpm且PH 5.5的發酵條件下培養至第七天。

請參閱第4圖，為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株於木片水解液發酵條件下之生長濃度的折線圖。如圖所示，馴化酵母菌菌液濃度於波長600nm下有OD 58.5，而未馴化酵母菌菌液的濃度為OD 30.2，因此馴化酵母菌菌液的OD值相較於於未馴化酵母菌菌液提升了93.7%。馴化酵母菌菌液發酵後之游離脂肪酸產量達3.85g/L，而未馴化酵母菌菌液之產量為0.55g/L，因此馴化酵母菌菌液的游離脂肪酸產量相較於未馴化酵母菌菌液提升了提升6.0倍。馴化酵母菌菌液發酵後之游離脂肪酸含量比率29.9%，而未馴化酵母菌菌液之游離脂肪酸含量的比率為8.3%，因此馴化酵母菌菌液之游離脂肪酸含量於未馴化酵母菌菌液提升2.6倍。

請參閱第5圖，為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株於木片水解液發酵條件下之葡萄糖代謝量的折線圖。如圖所示，馴化酵母菌菌液發酵後之糖代謝量為62.3g/L，而未馴化酵母菌菌液之糖代謝量為52.2g/L，因此馴化酵母菌菌液之糖代謝量相較於未馴化酵母菌菌液提升19.5%。

在本發明第三實施例中，將經低氮源培養配方馴化之馴化酵母菌菌液1ml及未馴化之酵母菌菌液1ml分別置入40ml的發酵體積進行發酵，其中兩個40ml的發酵體積還包含39ml木片水解液。而後在未額外添加氮源情況下，在30℃、轉速200rpm且PH 5.5的發酵條件下培養至第七天。

請參閱第6圖，為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株分別於木片水解液且未額外添加氮源之發酵條件下及稻稈水解液之發酵條件下的生長濃度折線圖。如圖所示，在木片水解液且未額外添加氮源之發酵條件下，該發酵體積於波長600nm下，馴化酵母菌菌液的濃度為OD 39.3；游離脂肪酸產量2.71g/L；游離脂肪酸含量比率為31.3%。至於未馴化酵母菌菌株則因木片水解液之毒性過強，無法於木片水解液的發酵環境生長，故無數據可供參考。

請參閱第7圖，為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株分別於木片水解液且未額外添加氮源之發酵條件下及稻稈水解液之發酵條件下的葡萄糖代謝量折線圖。如圖所示，在木片水解液且未額外添加氮源之發酵條件下，馴化酵母菌菌液的糖代謝量為77.2g/L。至於未馴化酵母菌菌株則因木片水解液之毒性過強，無法於木片水解液的發酵環境生長，故無數據可供參考。

在本發明第四實施例中，將經低氮源培養配方馴化之馴化酵母菌菌液1ml置入40ml的發酵體積進行發酵，該40ml之發酵體積還包含39ml的稻桿水解液。在未額外添加氮源情況下，於24℃、轉速200rpm且PH 5.5的發酵條件下培養至第七天。

如第6圖所示，在稻稈水解液之發酵條件下，該發酵體積於波長600nm下，馴化酵母菌菌液的濃度為OD 37.2；游離脂肪酸產量2.94g/L；游離脂肪酸含量比率為35.9%。如第7圖所示，在稻稈水解液之發酵條件下，馴化酵母菌菌液的糖代謝量為42.3g/L。

請參閱第8圖，為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴 化酵母菌菌株分別於低氮源發酵條件、木片水解液、木片水解液且未額外添加氮源及稻稈水解液之發酵條件下的游離脂肪酸產量直條圖。第9圖為本發明所述的馴化酵母菌菌株及習用未馴化酵母菌菌株分別於低氮源發酵條件、木片水解液、木片水解液且未額外添加氮源及稻稈水解液之發酵條件下的游離脂肪酸含量比率直條圖。如圖所示，本發明經低氮源培養配方馴化之馴化酵母菌菌株相較於於習知技術利用未馴化之酵母菌菌株，除了菌株生長濃度及糖代謝量較為優異外，游離脂肪酸之產量及游離脂肪酸含量比率均有顯著的提升。此外，本發明經低氮源培養配方馴化之馴化酵母菌菌株，在未額外添加氮源的情況下，也可有效的生產游離脂肪酸，亦即本發明經馴化菌株不須額外添加氮源也可順利進行游離脂肪酸的生產。

請參閱第10圖，為馴化酵母菌菌株的產物分析圖。如圖所示，本發明馴化酵母菌菌株所產生的產物為C20：0、C18：0、C16：0、C14：0、C12：0或C10：0之游離脂肪酸，其中使用之分析儀器為型號Agilent J&W DB-5的氣相層析儀(Gas chromatography)。

說明書中所描述之也許、必須及變化等字眼並非本發明之限制。說明書所使用的專業術語主要用以進行特定實施例的描述，並不為本發明的限制。說明書所使用的單數量詞(如一個及該個)亦可為複數個，除非在說明書的內容有明確的說明。例如說明書所提及之一個裝置可包括有兩個或兩個以上之裝置的結合，而說明書所提之一物質則可包括有多種物質的混合。

以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，並非用來限定本發明實施之範圍，即凡依本發明申請專利範圍所述之形狀、構造、特徵 及精神所為之均等變化與修飾，均應包括於本發明之申請專利範圍內。

Claims (13)

1. 一種酵母菌菌株的馴化方法，包括以下步驟：以酵母萃取物與蛋白腖配製成一低氮源培養配方，其中該低氮源培養配方的碳氮比為10到75；將該低氮源培養配方經高溫高壓滅菌，並製成一低氮源培養基；將一菌液接種於該低氮源培養基內培養，其中該菌液包括一未馴化酵母菌菌株，該未馴化酵母菌菌株學名為Yarrowia Lipolytica，於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心之寄存編號為BCRC 21252；及得到一馴化酵母菌菌株。
2. 如申請專利範圍第1項的馴化方法，其中該低氮源培養配方之碳氮比為15到60。
3. 如申請專利範圍第1項的馴化方法，其中該低氮源培養配方之碳氮比為15.8到45。
4. 如申請專利範圍第1項的馴化方法，包括以下步驟：將該低氮源培養配方經攝氏110度到攝氏150度高壓滅菌15到30分鐘，以製成該低氮源培養基。
5. 如申請專利範圍第1項的馴化方法，其中該馴化酵母菌菌株用以於一第一代生質燃料料源或一第二代生質燃料料源內發酵。
6. 如申請專利範圍第5項的馴化方法，其中該第一代生質燃料料源包括含油脂、澱粉或糖類的作物。
7. 如申請專利範圍第5項的馴化方法，其中該第二代生質燃料料源包括非糧食纖維原料或農業廢棄物。
8. 如申請專利範圍第1項的馴化方法，其中該馴化酵母菌菌株生產至少一游離脂肪酸，該游離脂肪酸包括C20：0、C18：0、C16：0、C14：0、C12：0或C10：0之游離脂肪酸。
9. 一種如申請專利範圍第1項的馴化方法所獲得之馴化酵母菌菌株，其 中該未馴化酵母菌菌株係為Yarrowia Lipolytica，於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心之寄存編號為BCRC 21252。
10. 如申請專利範圍第9項的馴化酵母菌菌株，用以在一第一代生質燃料料源或一第二代生質燃料料源內發酵。
11. 如申請專利範圍第10項的馴化酵母菌菌株，其中該第一代生質燃料料源包括含油脂、澱粉或糖類的作物。
12. 如申請專利範圍第10項的馴化酵母菌菌株，其中該第二代生質燃料料源包括非糧食纖維原料或農業廢棄物。
13. 如申請專利範圍第9項的馴化酵母菌菌株，是用於生產至少一游離脂肪酸，該游離脂肪酸包括C20：0、C18：0、C16：0、C14：0、C12：0或C10：0。