JPH0829112B2 - ａｒａＢプロモーター、および微生物学的方法によるセクロピン類を含むポリペプチド類の製造法 - Google Patents
ａｒａＢプロモーター、および微生物学的方法によるセクロピン類を含むポリペプチド類の製造法Info
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Description
【０００１】関連出願 この出願は、１９８５年１月２８日に出願された米国特
許第６９５,３０９号の一部継続出願である。
許第６９５,３０９号の一部継続出願である。
【０００２】技術分野 本発明は、組換えＤＮＡ工学および、形質転換された宿
主における異種遺伝子の発現にaraＢプロモーターを使
用することに関する。さらに、この特許は、殺菌性ペプ
チドであるセクロピンおよびその類縁物質をコードして
いる遺伝子の修飾、クローニング、および発現に関する
ものである。
主における異種遺伝子の発現にaraＢプロモーターを使
用することに関する。さらに、この特許は、殺菌性ペプ
チドであるセクロピンおよびその類縁物質をコードして
いる遺伝子の修飾、クローニング、および発現に関する
ものである。
【０００３】技術的背景 ＤＮＡ分子にコードされている遺伝情報は、ＤＮＡのm
−ＲＮＡへの転写およびそれに続くm−ＲＮＡのポリペ
プチドまたは蛋白質への翻訳を含む一連の過程で発現さ
れる。ポリペプチドを形成するための、コード化された
情報の発現は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開
始させるＤＮＡ上の領域、即ちプロモーター部位で開始
される。異種遺伝子の発現のための組換えＤＮＡ法に使
用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ(ペニシ
リナーゼ)やラクトース(β−ガラクトシダーゼ)のプロ
モーター系[チャング(Ｃhang)ら、ネイチャー(Ｎatur
e)、２７５:６１５(１９７８); イタクラ(Ｉtakura)
ら、サイエンス(Ｓcience)、１９８:１０５６(１９７
７); ゴーデル(Ｇoeddel)ら、Ｎature。２８１:５４４
(１９７９)]および、トリプトファン(trp)プロモーター
系[Ｇoeddelら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、
８:４０５７(１９８０): ＥＰＯ特許出願公開第００３
６７７６号]が含まれる。他の知られたプロモーターに
は、バクテリオファージλプロモーター、(ＰL)および
(ＰR)、hut、コリシンＥ1、ガラクトース、アルカリフ
ォスファターゼ、キシロースＡおよび、tacなどがあ
る。
−ＲＮＡへの転写およびそれに続くm−ＲＮＡのポリペ
プチドまたは蛋白質への翻訳を含む一連の過程で発現さ
れる。ポリペプチドを形成するための、コード化された
情報の発現は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開
始させるＤＮＡ上の領域、即ちプロモーター部位で開始
される。異種遺伝子の発現のための組換えＤＮＡ法に使
用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ(ペニシ
リナーゼ)やラクトース(β−ガラクトシダーゼ)のプロ
モーター系[チャング(Ｃhang)ら、ネイチャー(Ｎatur
e)、２７５:６１５(１９７８); イタクラ(Ｉtakura)
ら、サイエンス(Ｓcience)、１９８:１０５６(１９７
７); ゴーデル(Ｇoeddel)ら、Ｎature。２８１:５４４
(１９７９)]および、トリプトファン(trp)プロモーター
系[Ｇoeddelら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、
８:４０５７(１９８０): ＥＰＯ特許出願公開第００３
６７７６号]が含まれる。他の知られたプロモーターに
は、バクテリオファージλプロモーター、(ＰL)および
(ＰR)、hut、コリシンＥ1、ガラクトース、アルカリフ
ォスファターゼ、キシロースＡおよび、tacなどがあ
る。
【０００４】araＢ遺伝子とそのプロモーター(araＢ)
は、Ｌ−アラビノースオペロン中に位置している。エシ
エリヒアコリ(大腸菌)(Ｅscherichia coli)およびサル
モネラチフィムリウム(Ｓalmonella typhimurium)のＬ
−アラビノースオペロン(araＢＡＤ)は、研究されてい
る。Ｓ．チフィムリウム中のＬ−アラビノースオペロン
は、特に興味深い。その配列は、以下に開示されてい
る: ホルウィツ（Horwitz,Ａ．)らの“Ｓ．チフィムリ
ウムＬＴ２中のaraＢＡＤ−araＣコントロール領域のＤ
ＮＡ配列"、ジーン(Ｇene)、１４: ３０９−３１９(１
９８１)および、リン(Ｌin, Ｈ．−Ｃ．)らによる
“Ｓ．チフィムリウムＬＴ２のaraＢＡＤオペロン、
Ｉ．araＢのヌクレオチド配列および、その生成物リブ
ロキナーゼの一次構造“Ｇene、３４: １１１−１２２
(１９８５); ＩＩ．" araＡのヌクレオチド配列およ
び、その生成物Ｌ−アラビノースイソメラーゼの一次構
造" Ｇene、３４:１２３−１２８(１９８５); ＩＩＩ．
“araＤとその側面領域のヌクレオチド配列および、そ
の生成物Ｌ−リブロース−５−フォスフェイト−４−エ
ピメラーゼの一次構造" Ｇene、３４: １２９−１３４
(１９８５)などの一連の文献に開示されている。araＢ
ＡＤオペロンは、Ｌ−アラビノースの初期代謝に関与し
ている３つの構造遺伝子を含んでいる[リー、ヤー−ハ
ウ(Ｌee, Ｊar−Ｈow)らの“Ｓ．チフィムリウムＬＴ２
ara 突然変異の遺伝子的特徴付け" 、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー(Ｊ．of Ｂacteriology)、１５
８: ３４４−４６(１９８４)]。Ｌ−アラビノースは、a
raＡ遺伝子産物であるＬ−アラビノースイソメラーゼに
より、まず、Ｌ−リブロースに変換される。それから、
Ｌ−リブロースは、araＢ遺伝子産物であるリブロキナ
ーゼによりＬ−リブロース−５−フォスフェイトにリン
酸化される。araＤ遺伝子産物であるＬ−リブロース−
５−フォスフェイト−４−エピメラーゼは、Ｌ−リブロ
ース−５−フォスフェイトのＤ−キシロース−５−ホス
フェイトへの変換を触媒し、次いでこの後者がペントー
スリン酸化系路に入る。araＢＡＤオペロンは、インジ
ューサー(誘導酵素)であるＬ−アラビノースとaraＣ調
節遺伝子産物によって調和をもってコントロールされ
る。
は、Ｌ−アラビノースオペロン中に位置している。エシ
エリヒアコリ(大腸菌)(Ｅscherichia coli)およびサル
モネラチフィムリウム(Ｓalmonella typhimurium)のＬ
−アラビノースオペロン(araＢＡＤ)は、研究されてい
る。Ｓ．チフィムリウム中のＬ−アラビノースオペロン
は、特に興味深い。その配列は、以下に開示されてい
る: ホルウィツ（Horwitz,Ａ．)らの“Ｓ．チフィムリ
ウムＬＴ２中のaraＢＡＤ−araＣコントロール領域のＤ
ＮＡ配列"、ジーン(Ｇene)、１４: ３０９−３１９(１
９８１)および、リン(Ｌin, Ｈ．−Ｃ．)らによる
“Ｓ．チフィムリウムＬＴ２のaraＢＡＤオペロン、
Ｉ．araＢのヌクレオチド配列および、その生成物リブ
ロキナーゼの一次構造“Ｇene、３４: １１１−１２２
(１９８５); ＩＩ．" araＡのヌクレオチド配列およ
び、その生成物Ｌ−アラビノースイソメラーゼの一次構
造" Ｇene、３４:１２３−１２８(１９８５); ＩＩＩ．
“araＤとその側面領域のヌクレオチド配列および、そ
の生成物Ｌ−リブロース−５−フォスフェイト−４−エ
ピメラーゼの一次構造" Ｇene、３４: １２９−１３４
(１９８５)などの一連の文献に開示されている。araＢ
ＡＤオペロンは、Ｌ−アラビノースの初期代謝に関与し
ている３つの構造遺伝子を含んでいる[リー、ヤー−ハ
ウ(Ｌee, Ｊar−Ｈow)らの“Ｓ．チフィムリウムＬＴ２
ara 突然変異の遺伝子的特徴付け" 、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー(Ｊ．of Ｂacteriology)、１５
８: ３４４−４６(１９８４)]。Ｌ−アラビノースは、a
raＡ遺伝子産物であるＬ−アラビノースイソメラーゼに
より、まず、Ｌ−リブロースに変換される。それから、
Ｌ−リブロースは、araＢ遺伝子産物であるリブロキナ
ーゼによりＬ−リブロース−５−フォスフェイトにリン
酸化される。araＤ遺伝子産物であるＬ−リブロース−
５−フォスフェイト−４−エピメラーゼは、Ｌ−リブロ
ース−５−フォスフェイトのＤ−キシロース−５−ホス
フェイトへの変換を触媒し、次いでこの後者がペントー
スリン酸化系路に入る。araＢＡＤオペロンは、インジ
ューサー(誘導酵素)であるＬ−アラビノースとaraＣ調
節遺伝子産物によって調和をもってコントロールされ
る。
【０００５】本明細書および請求の範囲に記載した１つ
の態様では、araＢプロモーターを、セクロピンをコー
ドしている遺伝子と機能的に連結し、セクロピンタンパ
ク質の発現のため適当な宿主に挿入しているので、セク
ロピンについての背景技術文献を概観することは価値あ
ることである。
の態様では、araＢプロモーターを、セクロピンをコー
ドしている遺伝子と機能的に連結し、セクロピンタンパ
ク質の発現のため適当な宿主に挿入しているので、セク
ロピンについての背景技術文献を概観することは価値あ
ることである。
【０００６】セクロピア蛾と数種の鱗翅類の昆虫の免疫
機構は、主として、最近抗菌ペプチド類として見出され
たセクロピン類が関与している有効な体液性応答によっ
て特徴付けられる[ボーマン、Ｈ．Ｇ．(Ｂoman, Ｈ．
Ｇ．)とステイナー、Ｈ(Ｓteiner, Ｈ．)のカレント・
トピックス・イン・ミクロバイオロジー・アンド・イム
ノロジー(Ｃurrent Ｔopics in Ｍicrobiology and
Ｉmmunology)、９４／９５:７５−９１(１９８１)]。
３つの主要なセクロピン、Ａ、ＢおよびＤが免疫性血液
とリンパから精製されており、それらの配列が明らかに
された[ステイナー(Ｓteiner)らのネイチャー(Ｎatur
e)、２９２:２４６−２４８(１９８１); キュー(Ｑu)ら
のヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(Ｅuropean Ｊournal of Ｂiochemistry)、１２
７:２１９−２２４(１９８２); フルトマルク、Ｄ(Ｈul
tmark, Ｄ)のイビッド(ibid)１２７:２０７−２１７(１
９８２); およびフルトマルクの米国特許第４,３５５,
１０４号]。これらすべてのセクロピンは、互いに高度
の配列ホモロギー(相同性)を持った小さな塩基性ペプチ
ドである。アンセレア・ペルニー(Ａntheraea pernyi)
[Ａ．Ｐ．]とハイロフォラ・セクロピア(Ｈylophora ce
cropia)[Ｈ．Ｃ．]由来のセクロピンＢおよびＤのアミ
ノ酸配列は以下の通りである：
機構は、主として、最近抗菌ペプチド類として見出され
たセクロピン類が関与している有効な体液性応答によっ
て特徴付けられる[ボーマン、Ｈ．Ｇ．(Ｂoman, Ｈ．
Ｇ．)とステイナー、Ｈ(Ｓteiner, Ｈ．)のカレント・
トピックス・イン・ミクロバイオロジー・アンド・イム
ノロジー(Ｃurrent Ｔopics in Ｍicrobiology and
Ｉmmunology)、９４／９５:７５−９１(１９８１)]。
３つの主要なセクロピン、Ａ、ＢおよびＤが免疫性血液
とリンパから精製されており、それらの配列が明らかに
された[ステイナー(Ｓteiner)らのネイチャー(Ｎatur
e)、２９２:２４６−２４８(１９８１); キュー(Ｑu)ら
のヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(Ｅuropean Ｊournal of Ｂiochemistry)、１２
７:２１９−２２４(１９８２); フルトマルク、Ｄ(Ｈul
tmark, Ｄ)のイビッド(ibid)１２７:２０７−２１７(１
９８２); およびフルトマルクの米国特許第４,３５５,
１０４号]。これらすべてのセクロピンは、互いに高度
の配列ホモロギー(相同性)を持った小さな塩基性ペプチ
ドである。アンセレア・ペルニー(Ａntheraea pernyi)
[Ａ．Ｐ．]とハイロフォラ・セクロピア(Ｈylophora ce
cropia)[Ｈ．Ｃ．]由来のセクロピンＢおよびＤのアミ
ノ酸配列は以下の通りである：
【化１】
【０００７】セクロピンは、その構造が蜂毒液であるメ
リチンに似ているが、メリチンよりも広い抗菌スペクト
ラムを有していて、培養肝細胞、羊の赤血球、または、
昆虫細胞を溶解しない。上に示したように、全てのヤク
ロピンのカルボキシ末端は封鎖されていて、ヤクロピン
Ａの場合は、封鎖している基は、１級アミド基である
［アンドリュー(Ａndreu)らのプロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイ
ズ、ＵＳＡ(Ｐroceedings of the ＮationalＡcadem
y of Ｓciences, ＵＳＡ)、８０:６４７５−６４７９
(１９８３)]。ヤクロピンＡとその数種の関連ペプチド
は、近年、固相法によって合成されていて、それらは、
化学的および物理的判定基準では、天然のヤクロピンＡ
と全く識別できない(Ａndreuら、同上)。
リチンに似ているが、メリチンよりも広い抗菌スペクト
ラムを有していて、培養肝細胞、羊の赤血球、または、
昆虫細胞を溶解しない。上に示したように、全てのヤク
ロピンのカルボキシ末端は封鎖されていて、ヤクロピン
Ａの場合は、封鎖している基は、１級アミド基である
［アンドリュー(Ａndreu)らのプロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイ
ズ、ＵＳＡ(Ｐroceedings of the ＮationalＡcadem
y of Ｓciences, ＵＳＡ)、８０:６４７５−６４７９
(１９８３)]。ヤクロピンＡとその数種の関連ペプチド
は、近年、固相法によって合成されていて、それらは、
化学的および物理的判定基準では、天然のヤクロピンＡ
と全く識別できない(Ａndreuら、同上)。
【０００８】興味あることに、カルボキシ末端のテトラ
ペプチドイミドは、Ｅ．コリに対しての抗菌活性にとっ
てさほど重要性を持っていないが、試験した他の３つの
細菌では、抗菌活性はセクロピンＡの抗菌活性より３％
から２０％低下した。
ペプチドイミドは、Ｅ．コリに対しての抗菌活性にとっ
てさほど重要性を持っていないが、試験した他の３つの
細菌では、抗菌活性はセクロピンＡの抗菌活性より３％
から２０％低下した。
【０００９】セクロピンは、グラム陰性菌およびグラム
陽性菌などを含む様々な細菌に対して抗菌性を有してい
る。セクロピンの作用機序に関して得られた資料によ
り、セクロピンは、細菌の細胞質膜を破壊することが判
明した[スタイナー(Ｓteiner)らのＮature、２９２:２
４６−２４８(１９８１)]。その文献より、細菌種が異
なればセクロピンに対する感受性も異なり、各々のセク
ロピンが固有の活性スペクトラムを有することは明白で
ある。たとえば、バシルス・メガテリウム(Ｂacillus
megaterium)は、セクロピンＡとＢに対して高感受性で
あるが、セクロピンＤに対しては比較的耐性である。グ
ラム陰性菌もグラム陽性菌もセクロピンに対して、μモ
ル濃度の範囲で感受性を示すことがわかった。セクロピ
ンに対する感受性の高い細菌は、Ｅ．コリ、シュードモ
ナス・アエルギノサ(Ｐseudomonas areruginosa)、Ｓ．
マルセスセンス(Ｓerratia marsescens)、キセノルハ
ブダス・ネマトフィルス(Ｘenorhabdus nematophilu
s)、Ｂ．メガテリウム(Ｂ．megatherium)および、ミク
ロコッカス・ルテウス(Ｍicrococcus luteus)である。
セクロピンＡおよびＢは全部で１２個のアミノ酸置換を
示すが、９種の異なる細菌種に対する活性は非常に似て
いる。このことは、多くのアミノ酸を、ペプチドの生物
活性を変えることなく置換し得ることを示している。同
様に、中国のオーク絹蛾(Ａ．pernyi)から得られるセク
ロピンＢと南アメリカ絹蛾(Ｈ．cecropia)から得られる
セクロピンＢとは、４つの部位で異なっている。しか
し、その内の３つの置換は、Ｈ．cecropiaＡ形に存在す
る対応アミノ酸の置換である。４番目の置換は、Ｈ．ce
cropiaＡとＢが異なっている部位でのものであり、保存
的置換である。よって、保存的アミノ酸置換によって作
られたセクロピンの特異な誘導体が、その生物活性を持
つ続けることは明らかである。セクロピンＤでみられる
ような非保存的置換は、ペプチドの活性を変えてしまう
可能性がある。セクロピンＤは、セクロピンＡおよびＢ
とほとんど同程度のＥ．コリに対する活性を持っている
が、他の８種の細菌種に対しては、明らかに活性が低く
なっている。
陽性菌などを含む様々な細菌に対して抗菌性を有してい
る。セクロピンの作用機序に関して得られた資料によ
り、セクロピンは、細菌の細胞質膜を破壊することが判
明した[スタイナー(Ｓteiner)らのＮature、２９２:２
４６−２４８(１９８１)]。その文献より、細菌種が異
なればセクロピンに対する感受性も異なり、各々のセク
ロピンが固有の活性スペクトラムを有することは明白で
ある。たとえば、バシルス・メガテリウム(Ｂacillus
megaterium)は、セクロピンＡとＢに対して高感受性で
あるが、セクロピンＤに対しては比較的耐性である。グ
ラム陰性菌もグラム陽性菌もセクロピンに対して、μモ
ル濃度の範囲で感受性を示すことがわかった。セクロピ
ンに対する感受性の高い細菌は、Ｅ．コリ、シュードモ
ナス・アエルギノサ(Ｐseudomonas areruginosa)、Ｓ．
マルセスセンス(Ｓerratia marsescens)、キセノルハ
ブダス・ネマトフィルス(Ｘenorhabdus nematophilu
s)、Ｂ．メガテリウム(Ｂ．megatherium)および、ミク
ロコッカス・ルテウス(Ｍicrococcus luteus)である。
セクロピンＡおよびＢは全部で１２個のアミノ酸置換を
示すが、９種の異なる細菌種に対する活性は非常に似て
いる。このことは、多くのアミノ酸を、ペプチドの生物
活性を変えることなく置換し得ることを示している。同
様に、中国のオーク絹蛾(Ａ．pernyi)から得られるセク
ロピンＢと南アメリカ絹蛾(Ｈ．cecropia)から得られる
セクロピンＢとは、４つの部位で異なっている。しか
し、その内の３つの置換は、Ｈ．cecropiaＡ形に存在す
る対応アミノ酸の置換である。４番目の置換は、Ｈ．ce
cropiaＡとＢが異なっている部位でのものであり、保存
的置換である。よって、保存的アミノ酸置換によって作
られたセクロピンの特異な誘導体が、その生物活性を持
つ続けることは明らかである。セクロピンＤでみられる
ような非保存的置換は、ペプチドの活性を変えてしまう
可能性がある。セクロピンＤは、セクロピンＡおよびＢ
とほとんど同程度のＥ．コリに対する活性を持っている
が、他の８種の細菌種に対しては、明らかに活性が低く
なっている。
【００１０】セクロピンやその類縁体の高い有用性およ
び、組換えＤＮＡ法によってタンパク質を生産できると
いう大きな展望から、遺伝子組換え法によるセクロピン
の生産系を提供することは価値あることであると考えら
れる。
び、組換えＤＮＡ法によってタンパク質を生産できると
いう大きな展望から、遺伝子組換え法によるセクロピン
の生産系を提供することは価値あることであると考えら
れる。
【００１１】
【発明の開示】araＢプロモーターを、生物活性産物を
コードしているヘテロローガス(異種)遺伝子と機能的に
結合させるなどしてaraＢプロモーターを組換えＤＮＡ
分子におけるプロモーターとして使用し得ることがわか
った。ヘテロローガス遺伝子の発現をコントロールする
のにaraＢプロモーターを使用することは、多くの付帯
的な有利さがある。araＢプロモーターコントロール系
はしっかりと統制される。araＢプロモーターはＬ−ア
ラビノースで誘導し得る。例えば、生産されるポリペプ
チド類は培養培地にＬ−アラビノースを添加するまでは
合成されない。即ち、Ｌ−アラビノースの非存在下で
は、ポリペプチドを生成するヘテロローガス遺伝子の発
現はない。Ｌ−アラビノースで誘導されることにより、
araＢプロモーターで開始されるメッセンジャーＲＮＡ
の一部としてポリペプチドが転写される。一旦誘導され
れば、ポリペプチドは迅速に、かつ効率的に生産され
る。さらに、発酵期間は他の系と比較して短い。重要な
ことは発現の程度が増大すること、即ち、ヘテロローガ
スポリペプチドの生産が非常に改良されることであり、
従って、産業上利用することを望ましいものにしてい
る。最後に、発現された融合ポリペプチドは、宿主細胞
内で細胞封入体を形成し、これは、サイズが増大してい
るにもかかわらず非常に安定であり、ヘテロローガスタ
ンパク質の精製が容易である。
コードしているヘテロローガス(異種)遺伝子と機能的に
結合させるなどしてaraＢプロモーターを組換えＤＮＡ
分子におけるプロモーターとして使用し得ることがわか
った。ヘテロローガス遺伝子の発現をコントロールする
のにaraＢプロモーターを使用することは、多くの付帯
的な有利さがある。araＢプロモーターコントロール系
はしっかりと統制される。araＢプロモーターはＬ−ア
ラビノースで誘導し得る。例えば、生産されるポリペプ
チド類は培養培地にＬ−アラビノースを添加するまでは
合成されない。即ち、Ｌ−アラビノースの非存在下で
は、ポリペプチドを生成するヘテロローガス遺伝子の発
現はない。Ｌ−アラビノースで誘導されることにより、
araＢプロモーターで開始されるメッセンジャーＲＮＡ
の一部としてポリペプチドが転写される。一旦誘導され
れば、ポリペプチドは迅速に、かつ効率的に生産され
る。さらに、発酵期間は他の系と比較して短い。重要な
ことは発現の程度が増大すること、即ち、ヘテロローガ
スポリペプチドの生産が非常に改良されることであり、
従って、産業上利用することを望ましいものにしてい
る。最後に、発現された融合ポリペプチドは、宿主細胞
内で細胞封入体を形成し、これは、サイズが増大してい
るにもかかわらず非常に安定であり、ヘテロローガスタ
ンパク質の精製が容易である。
【００１２】従って本発明は、宿主内で発現し得るポリ
ヌクレオチド分子であって、該宿主にとってヘテロロー
ガスな遺伝子と機能的に結合しているaraＢプロモータ
ーの配列を含有しているポリヌクレオチド分子を提供す
るものである。ポリヌクレオチド(類)をコードしている
ヘテロローガス遺伝子は、生物学的に活性である(生物
活性を有する)。本発明はまた、該ポリヌクレオチド分
子を含有している。複製および発現可能なビヒクル、該
ビヒクルで形質転換された宿主、および、最終的な発現
およびヘテロローガスなペプチド(類)を回収するために
該宿主を培養するための発酵法を提供するものである。
ヌクレオチド分子であって、該宿主にとってヘテロロー
ガスな遺伝子と機能的に結合しているaraＢプロモータ
ーの配列を含有しているポリヌクレオチド分子を提供す
るものである。ポリヌクレオチド(類)をコードしている
ヘテロローガス遺伝子は、生物学的に活性である(生物
活性を有する)。本発明はまた、該ポリヌクレオチド分
子を含有している。複製および発現可能なビヒクル、該
ビヒクルで形質転換された宿主、および、最終的な発現
およびヘテロローガスなペプチド(類)を回収するために
該宿主を培養するための発酵法を提供するものである。
【００１３】本発明はまた、組換えＤＮＡ法によりセク
ロピンペプチドおよびその類似体を生産するための方
法、およびその方法に使用する手段を提供するものであ
る。セクロピン(類)は上記araＢプロモーターまたはそ
の他のプロモーターを使って発現させることができる。
ロピンペプチドおよびその類似体を生産するための方
法、およびその方法に使用する手段を提供するものであ
る。セクロピン(類)は上記araＢプロモーターまたはそ
の他のプロモーターを使って発現させることができる。
【００１４】特に本発明は、セクロピン様殺菌作用を有
するペプチドをコードしている遺伝子配列を提供するも
のである。単独で、あるいは他のペプチドまたはアミノ
酸残基と一緒にセクロピンペプチドを含有しているもっ
と長い配列の一部として提供されるこれらの遺伝子配列
は、それらを発現宿主としてのＥ．coli(大腸菌)に最も
受け入れられ易くする様にコンピュータを使った方法で
設計するのが理想的である。
するペプチドをコードしている遺伝子配列を提供するも
のである。単独で、あるいは他のペプチドまたはアミノ
酸残基と一緒にセクロピンペプチドを含有しているもっ
と長い配列の一部として提供されるこれらの遺伝子配列
は、それらを発現宿主としてのＥ．coli(大腸菌)に最も
受け入れられ易くする様にコンピュータを使った方法で
設計するのが理想的である。
【００１５】具体的には、本発明は、異なったポリペプ
チドをコードしている第２遺伝子配列と機能的に結合し
ているセクロピンをコードしている第１遺伝子配列の融
合配列である遺伝子構築物であって、セクロピン感受性
宿主内で発現し得る遺伝子構築物を提供するものである
(ここで、異なったポリペプチドとは、セクロピン感受
性宿主に対する該発現された融合産物の殺菌作用を抑制
し得るものである)。
チドをコードしている第２遺伝子配列と機能的に結合し
ているセクロピンをコードしている第１遺伝子配列の融
合配列である遺伝子構築物であって、セクロピン感受性
宿主内で発現し得る遺伝子構築物を提供するものである
(ここで、異なったポリペプチドとは、セクロピン感受
性宿主に対する該発現された融合産物の殺菌作用を抑制
し得るものである)。
【００１６】本発明のもう１つの目的は、誘導し得るプ
ロモーター配列に機能的に結合しているセクロピンをコ
ードしている遺伝子配列を含有している、セクロピン感
受性宿主内で発現し得る遺伝子構築物を提供するもので
ある。
ロモーター配列に機能的に結合しているセクロピンをコ
ードしている遺伝子配列を含有している、セクロピン感
受性宿主内で発現し得る遺伝子構築物を提供するもので
ある。
【００１７】本発明はまた、上記遺伝子構築物を含有し
ている複製および発現可能なビヒクル、該ビヒクルで形
質転換された宿主、および該ビヒクル、構築物ならびに
宿主を使ってセクロピンを生産する方法を提供するもの
である。
ている複製および発現可能なビヒクル、該ビヒクルで形
質転換された宿主、および該ビヒクル、構築物ならびに
宿主を使ってセクロピンを生産する方法を提供するもの
である。
【００１８】更に本発明は、セクロピンとポリペプチド
との融合タンパク質であって、細菌宿主に対する殺菌作
用が減少したタンパク質を提供するものである。
との融合タンパク質であって、細菌宿主に対する殺菌作
用が減少したタンパク質を提供するものである。
【００１９】セクロピンをコードしている遺伝子配列
は、発現宿主としての大腸菌に最も受け入れられやすく
する様に、好ましくはコンピュータを使った方法で設計
する。また、自己相補性を最小にし、挿入を容易にする
ために配列の内部または外側に制限エンドヌクレアーゼ
部位を避ける様にあるいは設ける様に、そして所望の発
現ビヒクルとの相補性を最小にする様に設計する。ポリ
ヌクレオチド配列をこの様な最適な状態にすることによ
り、本発明は、大抵の場合、セクロピン源として用いら
れる各種の天然の遺伝子とは構造的に異なっている合成
配列を提供する。
は、発現宿主としての大腸菌に最も受け入れられやすく
する様に、好ましくはコンピュータを使った方法で設計
する。また、自己相補性を最小にし、挿入を容易にする
ために配列の内部または外側に制限エンドヌクレアーゼ
部位を避ける様にあるいは設ける様に、そして所望の発
現ビヒクルとの相補性を最小にする様に設計する。ポリ
ヌクレオチド配列をこの様な最適な状態にすることによ
り、本発明は、大抵の場合、セクロピン源として用いら
れる各種の天然の遺伝子とは構造的に異なっている合成
配列を提供する。
【００２０】定義 以下の記載においては、組換えＤＮＡ技術で用いられる
多くの用語が多数使用されている。明細書および請求の
範囲を明瞭にかつ統一的に理解できる様に、またこの様
な用語の範囲を明確にするためにも、以下に用語の定義
を行なう。
多くの用語が多数使用されている。明細書および請求の
範囲を明瞭にかつ統一的に理解できる様に、またこの様
な用語の範囲を明確にするためにも、以下に用語の定義
を行なう。
【００２１】オペロン ポリペプチド発現のための構造
遺伝子およびその発現を調節しているコントロール領域
を含んでいる遺伝子。
遺伝子およびその発現を調節しているコントロール領域
を含んでいる遺伝子。
【００２２】オペレーター 特定のリプレッサーと相互
作用し得るＤＮＡ配列であり、その相互作用により隣接
遺伝子(群)の機能がコントロールされる。
作用し得るＤＮＡ配列であり、その相互作用により隣接
遺伝子(群)の機能がコントロールされる。
【００２３】プロモーター ＲＮＡポリメラーゼが結合
し、隣接遺伝子(群)の転写を開始させる、コントロール
領域内のＤＮＡ配列。
し、隣接遺伝子(群)の転写を開始させる、コントロール
領域内のＤＮＡ配列。
【００２４】アクチベーター ＲＮＡポリメラーゼによ
るＲＮＡ合成の開始に必要なタンパク。
るＲＮＡ合成の開始に必要なタンパク。
【００２５】イニシエーター アクチベーターが相互作
用するＤＮＡ配列であり、これにより隣接遺伝子がコン
トロールされる。
用するＤＮＡ配列であり、これにより隣接遺伝子がコン
トロールされる。
【００２６】ポリヌクレオチド分子 糖と燐酸残基の交
互連結で構成される骨格により互いに連結しているヌク
レオチドの線状配列であり、本明細書においては、ＤＮ
ＡおよびＲＮＡポリマーの両者を含んでいる。
互連結で構成される骨格により互いに連結しているヌク
レオチドの線状配列であり、本明細書においては、ＤＮ
ＡおよびＲＮＡポリマーの両者を含んでいる。
【００２７】構造遺伝子 鋳型またはメッセンジャーＲ
ＮＡを介して、特定のペプチドに特徴的なアミノ酸配列
をコードしているＤＮＡ配列。
ＮＡを介して、特定のペプチドに特徴的なアミノ酸配列
をコードしているＤＮＡ配列。
【００２８】ヘテロローガス(異種)遺伝子 外来性の、
即ち宿主とは異なる供給体に由来する遺伝子であるか、
または化学的に合成された遺伝子であり、宿主とは異な
る種の供給体を含んでいる。この遺伝子は、発現ビヒク
ルによる形質転換を受ける生物によって通常生産されな
いポリペプチドをコードしている。
即ち宿主とは異なる供給体に由来する遺伝子であるか、
または化学的に合成された遺伝子であり、宿主とは異な
る種の供給体を含んでいる。この遺伝子は、発現ビヒク
ルによる形質転換を受ける生物によって通常生産されな
いポリペプチドをコードしている。
【００２９】生物活性(生物学的に活性) 本明細書にお
いては、生物系内で生じる目的の効果を達成する性質ま
たはそのプロセスを意味する。
いては、生物系内で生じる目的の効果を達成する性質ま
たはそのプロセスを意味する。
【００３０】機能的な結合 本明細書では、プロモータ
ーがヘテロローガス遺伝子によってコードされているポ
リペプチドの発現の開始をコントロールすることを意味
している。
ーがヘテロローガス遺伝子によってコードされているポ
リペプチドの発現の開始をコントロールすることを意味
している。
【００３１】発現 構造遺伝子によりポリペプチドが生
産されるプロセスを発現という。これには、遺伝子のメ
ッセンジャーＲＮＡ(mＲＮＡ)への転写とmＲＮＡのポリ
ペプチドへの翻訳が含まれる。
産されるプロセスを発現という。これには、遺伝子のメ
ッセンジャーＲＮＡ(mＲＮＡ)への転写とmＲＮＡのポリ
ペプチドへの翻訳が含まれる。
【００３２】クローニングビヒクル 宿主細胞内で複製
し得るプラスミドまたはファージＤＮＡまたはその他の
ＤＮＡ配列であり、ＤＮＡの必須の生物学的機能を失う
ことなく、決定可能な様にそのＤＮＡ配列を切断し得る
１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ認識部位によ
って特徴づけられ、かつ、形質転換細胞の同定に使用す
るのに適当な表現型選択マーカーを含んでいるものをい
う。マーカーは、例えばテトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン耐性である。「ベクター」という用語がクロー
ニングベクターの代わりに用いられることがある。
し得るプラスミドまたはファージＤＮＡまたはその他の
ＤＮＡ配列であり、ＤＮＡの必須の生物学的機能を失う
ことなく、決定可能な様にそのＤＮＡ配列を切断し得る
１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ認識部位によ
って特徴づけられ、かつ、形質転換細胞の同定に使用す
るのに適当な表現型選択マーカーを含んでいるものをい
う。マーカーは、例えばテトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン耐性である。「ベクター」という用語がクロー
ニングベクターの代わりに用いられることがある。
【００３３】発現コントロール配列 構造遺伝子と機能
的に結合された場合、この構造遺伝子の発現をコントロ
ールまたは調節するヌクレオチド配列。これにはファー
ジラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領
域、lac系、trp系、fd外皮タンパク質のコントロール領
域、および原核性または真核性細胞の遺伝子の発現をコ
ントロールすることが知られているその他の配列が含ま
れる。
的に結合された場合、この構造遺伝子の発現をコントロ
ールまたは調節するヌクレオチド配列。これにはファー
ジラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領
域、lac系、trp系、fd外皮タンパク質のコントロール領
域、および原核性または真核性細胞の遺伝子の発現をコ
ントロールすることが知られているその他の配列が含ま
れる。
【００３４】発現ビヒクル クローニングビヒクルに似
たビヒクルであるが、通常ある種の調節配列のコントロ
ール下で、宿主内において、与えられた構造遺伝子を発
現することができるビヒクルをいう。
たビヒクルであるが、通常ある種の調節配列のコントロ
ール下で、宿主内において、与えられた構造遺伝子を発
現することができるビヒクルをいう。
【００３５】宿主 複製可能な発現ビヒクルの受容体と
なる全ゆる生物を意味し、これには細菌および酵母が含
まれる。
なる全ゆる生物を意味し、これには細菌および酵母が含
まれる。
【００３６】セクロピン 本明細書および請求の範囲を
通じて、当業界で認められている殺菌活性測定法で測定
した場合、インビボまたはインビトロで該活性が認めら
れる、全ゆる昆虫類由来のポリペプチドを含んでいる。
通じて、当業界で認められている殺菌活性測定法で測定
した場合、インビボまたはインビトロで該活性が認めら
れる、全ゆる昆虫類由来のポリペプチドを含んでいる。
【００３７】本発明においてセクロピンという用語は、
適当な系で殺菌活性を示す、天然セクロピンの全ゆる類
似体、同族体、ミュータント、異性体または誘導体につ
いても用いられる。この用語は更に、天然のアミノ酸よ
り少ない数のフラグメント、例えば天然のセクロピンま
たはその類似体の部分的フラグメントをも意味する。更
にまた、この用語は、天然のセクロピンまたはその類似
体の配列と、１またはそれ以上のその周辺アミノ酸、好
ましくはカルボキシ末端のアミノ酸、を含んでいる、セ
クロピン様殺菌活性を有する産物をも意味する。また、
この用語は、天然のアミノ酸より少ない数のセクロピン
であるが、殺菌活性を示すものも含むものとする。
適当な系で殺菌活性を示す、天然セクロピンの全ゆる類
似体、同族体、ミュータント、異性体または誘導体につ
いても用いられる。この用語は更に、天然のアミノ酸よ
り少ない数のフラグメント、例えば天然のセクロピンま
たはその類似体の部分的フラグメントをも意味する。更
にまた、この用語は、天然のセクロピンまたはその類似
体の配列と、１またはそれ以上のその周辺アミノ酸、好
ましくはカルボキシ末端のアミノ酸、を含んでいる、セ
クロピン様殺菌活性を有する産物をも意味する。また、
この用語は、天然のアミノ酸より少ない数のセクロピン
であるが、殺菌活性を示すものも含むものとする。
【００３８】ある種のセクロピンをこの定義の範囲内に
入れるホモロギー(相同性)の程度は、殺菌活性に関与し
ているセクロピンの領域に応じてかわる。この定義の範
囲内に入るためには、殺菌活性を示すのに必須である領
域は高いホモロギーを示すが、殺菌作用を示す構造を維
持したり、リセプター結合を行なうのに関与しない配列
は、比較的低いホモロギーを示すものであってもよい。
更に、機能的に類似している側鎖を置換しても、臨界領
域は殺菌活性を示し、本明細書で定義した意味でホモロ
ーガスである。「機能的に類似」という用語は、側鎖の優
勢な特性、例えば塩基性、中性または酸性、立体障害の
有無などをいう。一般に、セクロピンとして定義される
ペプチドは、本明細書の「技術的背景」の項に示したセク
ロピン類と実質的に相同(ホモローガス)である領域を含
んでいる。カルボキシ末端領域に比較してアミノ末端領
域でのホモロギーはさほど必要ではない。
入れるホモロギー(相同性)の程度は、殺菌活性に関与し
ているセクロピンの領域に応じてかわる。この定義の範
囲内に入るためには、殺菌活性を示すのに必須である領
域は高いホモロギーを示すが、殺菌作用を示す構造を維
持したり、リセプター結合を行なうのに関与しない配列
は、比較的低いホモロギーを示すものであってもよい。
更に、機能的に類似している側鎖を置換しても、臨界領
域は殺菌活性を示し、本明細書で定義した意味でホモロ
ーガスである。「機能的に類似」という用語は、側鎖の優
勢な特性、例えば塩基性、中性または酸性、立体障害の
有無などをいう。一般に、セクロピンとして定義される
ペプチドは、本明細書の「技術的背景」の項に示したセク
ロピン類と実質的に相同(ホモローガス)である領域を含
んでいる。カルボキシ末端領域に比較してアミノ末端領
域でのホモロギーはさほど必要ではない。
【００３９】「殺菌作用(活性)」という用語は、先に定義
した活性を意味し、それは天然のセクロピン種の活性よ
り大きくても、あるいは小さくてもよい。具体的には、
天然種の約１％から、天然のセクロピンの活性より実質
的に高い(例えば１０倍、１００倍またはそれ以上)活性
の範囲の殺菌作用を持ったセクロピンペプチドが含まれ
る。
した活性を意味し、それは天然のセクロピン種の活性よ
り大きくても、あるいは小さくてもよい。具体的には、
天然種の約１％から、天然のセクロピンの活性より実質
的に高い(例えば１０倍、１００倍またはそれ以上)活性
の範囲の殺菌作用を持ったセクロピンペプチドが含まれ
る。
【００４０】本発明を実施する最良の方法 １．araＢプロモーター 本発明は、宿主にとってヘテロローガス(異種)遺伝子に
機能的に結合させたaraＢプロモーターの配列を含んで
いる該宿主内で発現し得るポリヌクレオチド分子を提供
するものである。異種遺伝子は、生物活性をもちポリペ
プチドをコードしている。本発明はまた、araＢプロモ
ーターと関連する構成を提供するものである。araＢプ
ロモーターは、誘導プロモーターである。即ち、コード
されたポリペプチドを生成するための異種遺伝子の発現
は、Ｌ−アラビノースの添加により開始され、誘導され
る。Ｌ−アラビノースは、araＣ遺伝子の産物であるア
クチベーターと相互作用し、araＢの発現を調節する。
これは、lac、trp、λＰL およびtacのようなネガティブ
コントロール系とは逆にポジティブコントロール系であ
る。Ｌ−アラビノースの添加がなければ、異種ポリペプ
チドは発現または合成されない。ひとたび誘導されれ
ば、生物活性ポリペプチドである生産物は、迅速に、能
率的に製造される。これらポリペプチド生産物は、典型
的には、宿主細胞中で細胞封入体として形成される。細
胞封入体は、細胞密度の増加と共に急速に増大する。細
胞封入体は、宿主細胞中では、非常に安定に存在する。
この特徴により、再現性よく高収率で生産され、発酵の
監視が容易になる。進行中の発酵を終わらせるための正
確な決定は、細胞封入体の大きさと飽和した増殖に基づ
いて簡単に行なうことができる。
機能的に結合させたaraＢプロモーターの配列を含んで
いる該宿主内で発現し得るポリヌクレオチド分子を提供
するものである。異種遺伝子は、生物活性をもちポリペ
プチドをコードしている。本発明はまた、araＢプロモ
ーターと関連する構成を提供するものである。araＢプ
ロモーターは、誘導プロモーターである。即ち、コード
されたポリペプチドを生成するための異種遺伝子の発現
は、Ｌ−アラビノースの添加により開始され、誘導され
る。Ｌ−アラビノースは、araＣ遺伝子の産物であるア
クチベーターと相互作用し、araＢの発現を調節する。
これは、lac、trp、λＰL およびtacのようなネガティブ
コントロール系とは逆にポジティブコントロール系であ
る。Ｌ−アラビノースの添加がなければ、異種ポリペプ
チドは発現または合成されない。ひとたび誘導されれ
ば、生物活性ポリペプチドである生産物は、迅速に、能
率的に製造される。これらポリペプチド生産物は、典型
的には、宿主細胞中で細胞封入体として形成される。細
胞封入体は、細胞密度の増加と共に急速に増大する。細
胞封入体は、宿主細胞中では、非常に安定に存在する。
この特徴により、再現性よく高収率で生産され、発酵の
監視が容易になる。進行中の発酵を終わらせるための正
確な決定は、細胞封入体の大きさと飽和した増殖に基づ
いて簡単に行なうことができる。
【００４１】Ｓ．チフィムリウム中のaraＢプロモータ
ーは、以下のヌクレオチド配列を有している：
ーは、以下のヌクレオチド配列を有している：
【化２】
【００４２】ａｒａＢ遺伝子の一部分であるaraＢプロ
モーターは、Ｌ−アラビノースオペロン中に位置してい
る。Ｌ−アラビノースオペロン(araＢＡＤ)は、Ｅ．コ
リとＳ．チフイムリウムで分離された。しかし、本発明
の実施においては、araＢプロモーターの供給源を、こ
れら２つに限定するものではない。他の供給源は、Ｌ−
アラビノースオペロンをコードしている遺伝子を含んだ
どんな細菌にでも求められる。これらaraＢプロモータ
ーの供給源には、シュードモナス、シトロバクター、キ
サントモナスおよび、エルウイニアの細菌群が含まれ
る。
モーターは、Ｌ−アラビノースオペロン中に位置してい
る。Ｌ−アラビノースオペロン(araＢＡＤ)は、Ｅ．コ
リとＳ．チフイムリウムで分離された。しかし、本発明
の実施においては、araＢプロモーターの供給源を、こ
れら２つに限定するものではない。他の供給源は、Ｌ−
アラビノースオペロンをコードしている遺伝子を含んだ
どんな細菌にでも求められる。これらaraＢプロモータ
ーの供給源には、シュードモナス、シトロバクター、キ
サントモナスおよび、エルウイニアの細菌群が含まれ
る。
【００４３】更に、araＢプロモーターは、天然起源よ
りもむしろ、例えば実験室での操作によって合成されて
もよい。換言すれば、この概念は、人工的に合成された
もの、あるいは、人工的に減成された産物をも意味して
いる。このように、天然のaraＢプロモーターの完全な
配列が、ある生物種のゲノムＤＮＡ中に組込まれて存在
していても、その生物のゲノムＤＮＡから分離されたar
aＢプロモーターに相当する分離された配列は、先導ポ
リペプチドに相当する隣接配列、および開始並びに停止
信号が付いていようといまいと、天然に存在するもので
はなく、“合成"されたものと考える。その上、遺伝子
コードには同義性があるので、そのアミノ酸配列がわか
っていても、必ずしも、また、決定的には、それをコー
ドしている天然の遺伝子配列を決める訳にはいかない。
りもむしろ、例えば実験室での操作によって合成されて
もよい。換言すれば、この概念は、人工的に合成された
もの、あるいは、人工的に減成された産物をも意味して
いる。このように、天然のaraＢプロモーターの完全な
配列が、ある生物種のゲノムＤＮＡ中に組込まれて存在
していても、その生物のゲノムＤＮＡから分離されたar
aＢプロモーターに相当する分離された配列は、先導ポ
リペプチドに相当する隣接配列、および開始並びに停止
信号が付いていようといまいと、天然に存在するもので
はなく、“合成"されたものと考える。その上、遺伝子
コードには同義性があるので、そのアミノ酸配列がわか
っていても、必ずしも、また、決定的には、それをコー
ドしている天然の遺伝子配列を決める訳にはいかない。
【００４４】どんな合成配列を作成する場合でも、最善
の方法は４つかまたはそれ以上の過程からなり、それ
は、araＢプロモーターの合成に適用できると共に、異
種ポリペプチドを含むペプチド配列の合成にも適用でき
る。まず、所望の配列に対し、その配列中の各アミノ酸
に対する可能なＤＮＡコドンのリストをつくる。そし
て、これらコドンを、細菌または酵母で使用される頻度
に従って順番に並べる。コドンの予備的順序は、酵母に
ついては、ベネッシェン(Ｂennetzen)とハル(Ｈall)と
のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry)、２５７:
３０２６−３０３１(１９８２)、細菌については、フィ
ールス(Ｆiers)、Ｗ．ネイチャー(Ｎature)、２６０、
５００(１９７６)の文献に基づいて行なってよい。さら
に、これら文献の技術以上の精密な配列化を推薦する。
の方法は４つかまたはそれ以上の過程からなり、それ
は、araＢプロモーターの合成に適用できると共に、異
種ポリペプチドを含むペプチド配列の合成にも適用でき
る。まず、所望の配列に対し、その配列中の各アミノ酸
に対する可能なＤＮＡコドンのリストをつくる。そし
て、これらコドンを、細菌または酵母で使用される頻度
に従って順番に並べる。コドンの予備的順序は、酵母に
ついては、ベネッシェン(Ｂennetzen)とハル(Ｈall)と
のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry)、２５７:
３０２６−３０３１(１９８２)、細菌については、フィ
ールス(Ｆiers)、Ｗ．ネイチャー(Ｎature)、２６０、
５００(１９７６)の文献に基づいて行なってよい。さら
に、これら文献の技術以上の精密な配列化を推薦する。
【００４５】どのコドンを選択するかに影響する第２の
要因は、クローニング過程において制限酵素の使用を容
易になる様な、遺伝子クローニング過程で使用する制限
酵素部位が存在するか存在しないかという点である。公
知であるエンドヌクレアーゼ部位の配列(ひとつの部位
が４〜６個のヌクレオチドで成り立っている)を“宿主
に好まれる"一次配列と比較することで、この要因を最
も適正化できる。制限酵素であるエンドヌクレアーゼ部
位のリストは、たとえば、ロバート(Ｒoberts)、Ｒ．
Ｊ．のヌクレイック・アシッド・リサーチ(Ｎucleic
Ａcid Ｒesearch)、１１:１(１９８３)、r１３５−r１
３７に開示されている。
要因は、クローニング過程において制限酵素の使用を容
易になる様な、遺伝子クローニング過程で使用する制限
酵素部位が存在するか存在しないかという点である。公
知であるエンドヌクレアーゼ部位の配列(ひとつの部位
が４〜６個のヌクレオチドで成り立っている)を“宿主
に好まれる"一次配列と比較することで、この要因を最
も適正化できる。制限酵素であるエンドヌクレアーゼ部
位のリストは、たとえば、ロバート(Ｒoberts)、Ｒ．
Ｊ．のヌクレイック・アシッド・リサーチ(Ｎucleic
Ａcid Ｒesearch)、１１:１(１９８３)、r１３５−r１
３７に開示されている。
【００４６】特定のコドンの選択に影響を与える３番目
の要因は、合成されたＤＮＡフラグメントの内部の二次
構造を最小限にする必要があることである。それは、折
り畳まれてしまい、近接したＤＮＡフラグメントとのア
ニーリングが阻止されることを避けるためである。この
要因には、意図した遺伝子中の互いに隣接し合っている
セグメントを除き、セグメントが、互いに過度に相補的
となることを避ける様に配列設計を検索することであ
る。相補性を調べること(即ち、その回避)は、設計され
た遺伝子配列と提供される複製ビヒクル(プラスミドや
ファージ)の間でも実施することができる。
の要因は、合成されたＤＮＡフラグメントの内部の二次
構造を最小限にする必要があることである。それは、折
り畳まれてしまい、近接したＤＮＡフラグメントとのア
ニーリングが阻止されることを避けるためである。この
要因には、意図した遺伝子中の互いに隣接し合っている
セグメントを除き、セグメントが、互いに過度に相補的
となることを避ける様に配列設計を検索することであ
る。相補性を調べること(即ち、その回避)は、設計され
た遺伝子配列と提供される複製ビヒクル(プラスミドや
ファージ)の間でも実施することができる。
【００４７】最適化させる４番目の要因は、転写が早く
終わるのを避けるために、特に、ＧＣ塩基対の豊富な配
列が前にある場合は、ＡＴ塩基対の豊富な配列(約５ま
たはそれ以上)を回避することである。
終わるのを避けるために、特に、ＧＣ塩基対の豊富な配
列が前にある場合は、ＡＴ塩基対の豊富な配列(約５ま
たはそれ以上)を回避することである。
【００４８】コドンの選択に影響を与える５番目の要因
は、情報を安定させるためにRＮase部位を避けることで
ある。
は、情報を安定させるためにRＮase部位を避けることで
ある。
【００４９】最後に、もし、２つの可能なコドンのいず
れを使用してもよい場合は、微生物ゲノム中で発現を最
大にするものを使用するのが適当である[たとえば、フ
ィールス(Ｆiers)らのＮature２６０、５００、(１９７
６); 米国特許第４,３６６,２４６号、６巻、を参照]。
れを使用してもよい場合は、微生物ゲノム中で発現を最
大にするものを使用するのが適当である[たとえば、フ
ィールス(Ｆiers)らのＮature２６０、５００、(１９７
６); 米国特許第４,３６６,２４６号、６巻、を参照]。
【００５０】細菌や酵母での発現を最も効果的にするた
めに、必要な比較を行うようコンピュータにプログラム
することも最も好ましい。
めに、必要な比較を行うようコンピュータにプログラム
することも最も好ましい。
【００５１】本発明の具体例をひとつ挙げれば、誘導ar
aＢプロモーターを生物活性をもつポリペプチドをコー
ドしている遺伝子配列に機能的に連結させる。そして、
得られた遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入するか、ま
たは、その一部とする。次いで、発現ビヒクルを適当な
宿主を形質転換するために使用する。その宿主を、発育
を最適にするように選ばれた培養条件下で発酵する。ar
aＢプロモーターは、異種遺伝子の発現を開始させる様
にプロモーターを誘導するＬ−アラビノースで処理され
るまでは不活性である。その働きの順序は、mＲＮＡへ
の遺伝子の転写とそれに続くポリペプチド産物への翻訳
である。
aＢプロモーターを生物活性をもつポリペプチドをコー
ドしている遺伝子配列に機能的に連結させる。そして、
得られた遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入するか、ま
たは、その一部とする。次いで、発現ビヒクルを適当な
宿主を形質転換するために使用する。その宿主を、発育
を最適にするように選ばれた培養条件下で発酵する。ar
aＢプロモーターは、異種遺伝子の発現を開始させる様
にプロモーターを誘導するＬ−アラビノースで処理され
るまでは不活性である。その働きの順序は、mＲＮＡへ
の遺伝子の転写とそれに続くポリペプチド産物への翻訳
である。
【００５２】本発明におけるもう一つの具体例では、ar
aＢプロモーターを生物活性をもつ異種ポリペプチドを
コードしている遺伝子配列に機能的に連結し、そして、
この遺伝子配列をもう一つのポリペプチドをコードして
いる２番目の遺伝子配列に連結させる。発現により、融
合体、即ち２番目のポリペプチドのアミノ酸配列と所望
の異種ポリペプチドのアミノ酸配列を含む前駆体タンパ
ク質であって所望のアミノ酸配列に隣接した選択的開裂
部位を含有しているタンパク質が得られる。
aＢプロモーターを生物活性をもつ異種ポリペプチドを
コードしている遺伝子配列に機能的に連結し、そして、
この遺伝子配列をもう一つのポリペプチドをコードして
いる２番目の遺伝子配列に連結させる。発現により、融
合体、即ち２番目のポリペプチドのアミノ酸配列と所望
の異種ポリペプチドのアミノ酸配列を含む前駆体タンパ
ク質であって所望のアミノ酸配列に隣接した選択的開裂
部位を含有しているタンパク質が得られる。
【００５３】開裂部位は、従来技術で知られている好ま
しいいずれの部位でもよいが、メチオニンが好ましい。
所望の異種遺伝子は、実際に選ばれた開裂部位に相当す
る開裂部位を、その内部に持っていないことが好まし
い。他の知られている開裂部位には、Ａsn−Ｇly、Ａsp
−Ｐro、Ｌys、Ａrg、およびＬys−Ａrgがある。
しいいずれの部位でもよいが、メチオニンが好ましい。
所望の異種遺伝子は、実際に選ばれた開裂部位に相当す
る開裂部位を、その内部に持っていないことが好まし
い。他の知られている開裂部位には、Ａsn−Ｇly、Ａsp
−Ｐro、Ｌys、Ａrg、およびＬys−Ａrgがある。
【００５４】融合または前駆体タンパク質の選択的開裂
は、主として、発現ビヒクルの複製環境の外で行う。こ
の翻訳後の段階で、選択的処理により融合または前駆体
タンパク質が切断される。たとえば、メチオニンを開裂
部位とする場合、融合または前駆体タンパク質は、所望
の異種ポリペプチドを切断するために、臭化シアノジエ
ンで処理される。他の知られた開裂部位の場合、切断の
ための処置にはヒドロキシルアミン、酸、トリプシンお
よび、Ｌys−Ａrg開裂酵素などが使用される。
は、主として、発現ビヒクルの複製環境の外で行う。こ
の翻訳後の段階で、選択的処理により融合または前駆体
タンパク質が切断される。たとえば、メチオニンを開裂
部位とする場合、融合または前駆体タンパク質は、所望
の異種ポリペプチドを切断するために、臭化シアノジエ
ンで処理される。他の知られた開裂部位の場合、切断の
ための処置にはヒドロキシルアミン、酸、トリプシンお
よび、Ｌys−Ａrg開裂酵素などが使用される。
【００５５】融合した、機能的に連結した遺伝子を調製
する方法、および、細菌中でそれを発現させる方法は公
知のもので、たとえば、米国特許第４,３６６,２４６号
(その引用は割愛する)に開示されている。
する方法、および、細菌中でそれを発現させる方法は公
知のもので、たとえば、米国特許第４,３６６,２４６号
(その引用は割愛する)に開示されている。
【００５６】本明細書に記載された遺伝子構築物と方法
は、細菌宿主において異種ポリペプチドを発現させるの
に使用できる。
は、細菌宿主において異種ポリペプチドを発現させるの
に使用できる。
【００５７】たとえば、Ｅ．coli Ｋ１２ ２９４株
(ＡＴＣＣ３１４４６)およびＭＣ１０６１株(ＡＴＣＣ
３９４５０)は特に有用である。使用し得るその他の微
生物株としてＥ．coli Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３
７)が挙げられるが、これに限られない。上記の株の
他、Ｅ．coli Ｗ３１１０(Ｆ-, ラムダ-, プロトトロ
フィック(ＡＴＣＣ２７３２５))およびその他の腸内細
菌群、たとえばＳ．typhimuriumまたはＳerrati marce
scens、および各種のシュードモナド種を用いることも
できる。
(ＡＴＣＣ３１４４６)およびＭＣ１０６１株(ＡＴＣＣ
３９４５０)は特に有用である。使用し得るその他の微
生物株としてＥ．coli Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３
７)が挙げられるが、これに限られない。上記の株の
他、Ｅ．coli Ｗ３１１０(Ｆ-, ラムダ-, プロトトロ
フィック(ＡＴＣＣ２７３２５))およびその他の腸内細
菌群、たとえばＳ．typhimuriumまたはＳerrati marce
scens、および各種のシュードモナド種を用いることも
できる。
【００５８】一般に、宿主細胞と相容性(適合性)のある
種由来のレプリコンおよびコントロール配列を含んでい
るプラスミドベクターが、これらの宿主との関連で用い
られる。ベクターは通常、複製部位と共に、形質転換さ
れた細胞に表現型選択性を付与し得る特定の遺伝子を持
っている。たとえば、Ｅ．coliは通常、Ｅ．coli種由来
のプラスミド、pＢＲ３２２[ボリバー(Ｂolivar)ら、ジ
ーン(Ｇene)、２:９５(１９７７)]を使って形質転換さ
れる。pＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性の遺伝子を含んでおり、形質転換された細胞を
同定するための容易な手段となる。このpＢＲ３２２プ
ラスミドまたはその他の微生物プラスミドは、微生物に
よって、それ自身のタンパク質を発現するのに使用し得
るプロモーターを含んでるか、あるいは含む様に改良さ
れなければならない。
種由来のレプリコンおよびコントロール配列を含んでい
るプラスミドベクターが、これらの宿主との関連で用い
られる。ベクターは通常、複製部位と共に、形質転換さ
れた細胞に表現型選択性を付与し得る特定の遺伝子を持
っている。たとえば、Ｅ．coliは通常、Ｅ．coli種由来
のプラスミド、pＢＲ３２２[ボリバー(Ｂolivar)ら、ジ
ーン(Ｇene)、２:９５(１９７７)]を使って形質転換さ
れる。pＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性の遺伝子を含んでおり、形質転換された細胞を
同定するための容易な手段となる。このpＢＲ３２２プ
ラスミドまたはその他の微生物プラスミドは、微生物に
よって、それ自身のタンパク質を発現するのに使用し得
るプロモーターを含んでるか、あるいは含む様に改良さ
れなければならない。
【００５９】araＢプロモーターは、生物活性を有する
ヘテロローガス(異種)ポリペプチドまたはタンパク質を
コードしている遺伝子配列と機能的に結合することがで
きる。この様なポリペプチドまたはタンパク質の例には
酵素、ホルモン、ヘモグロビン、抗体、構造タンパク
質、α−、β−およびγ−インターフェロン、インター
ロイキン、インスリンおよび組織プラスミノーゲンアク
チベーターなどが含まれる。特定の例としてヒト腫瘍成
長因子、カルシトニンおよびセクロピンが挙げられる。
ヘテロローガス(異種)ポリペプチドまたはタンパク質を
コードしている遺伝子配列と機能的に結合することがで
きる。この様なポリペプチドまたはタンパク質の例には
酵素、ホルモン、ヘモグロビン、抗体、構造タンパク
質、α−、β−およびγ−インターフェロン、インター
ロイキン、インスリンおよび組織プラスミノーゲンアク
チベーターなどが含まれる。特定の例としてヒト腫瘍成
長因子、カルシトニンおよびセクロピンが挙げられる。
【００６０】形質転換された宿主を、当技術分野で知ら
れている方法に従って発酵し、培養して最適の細胞増殖
を達成することができる。下記の本発明による好ましい
発酵法および生産方法を使ってヘテロローガスポリペプ
チドを大量に生産することができる。さらに、ヘテロロ
ーガス遺伝子と機能的に結合させたaraＢプロモーター
を使うことにより、ヘテロローガス遺伝子の発現程度が
増大する。
れている方法に従って発酵し、培養して最適の細胞増殖
を達成することができる。下記の本発明による好ましい
発酵法および生産方法を使ってヘテロローガスポリペプ
チドを大量に生産することができる。さらに、ヘテロロ
ーガス遺伝子と機能的に結合させたaraＢプロモーター
を使うことにより、ヘテロローガス遺伝子の発現程度が
増大する。
【００６１】好ましい発酵法は以下の通りである。形質
転換された宿主、好ましくは細菌、より好ましくはＥ．
coliを、細菌の増殖に必要な栄養物質を含んでいる培養
培地に入れる。この様な物質には、炭素および窒素源、
鉱物、アミノ酸、プリン類、ピリミジン類およびビタミ
ン類などが含まれる。好ましい培養培地はまた、表現型
マーカー耐性に必要な量の代謝産物を含んでおり、この
様な代謝産物としては、たとえばテトラサイクリンまた
はアンピシリンが挙げられる。最大増殖率が得られる様
に選択した培養条件下で宿主を増殖させる。温度条件は
宿主によるが、通常最適範囲は約３０℃〜約４０℃であ
り、形質転換されたＥ．coliについては３７℃が最も好
ましい。酵素も培地に供給する。後期指数的成長相まで
宿主を増殖させてから新しい培養培地に移す。
転換された宿主、好ましくは細菌、より好ましくはＥ．
coliを、細菌の増殖に必要な栄養物質を含んでいる培養
培地に入れる。この様な物質には、炭素および窒素源、
鉱物、アミノ酸、プリン類、ピリミジン類およびビタミ
ン類などが含まれる。好ましい培養培地はまた、表現型
マーカー耐性に必要な量の代謝産物を含んでおり、この
様な代謝産物としては、たとえばテトラサイクリンまた
はアンピシリンが挙げられる。最大増殖率が得られる様
に選択した培養条件下で宿主を増殖させる。温度条件は
宿主によるが、通常最適範囲は約３０℃〜約４０℃であ
り、形質転換されたＥ．coliについては３７℃が最も好
ましい。酵素も培地に供給する。後期指数的成長相まで
宿主を増殖させてから新しい培養培地に移す。
【００６２】次いで、宿主を生産(production)培養培地
に接種する。この工程中、細菌は、もはや分裂しないが
生存している飽和密度濃度に達するまで分裂と生長をつ
づける。飽和密度に達するのに十分な時間は培地、宿主
の遺伝子型、温度および空気導入度によってかわる。
に接種する。この工程中、細菌は、もはや分裂しないが
生存している飽和密度濃度に達するまで分裂と生長をつ
づける。飽和密度に達するのに十分な時間は培地、宿主
の遺伝子型、温度および空気導入度によってかわる。
【００６３】当初、生産工程での発酵および培養条件
は、先に培養工程で述べた条件と同じである。ただし、
溶存酸素が増殖中に消費されるので、最小溶存酸素
(Ｄ．Ｏ．)を３０％に維持するために、撹拌と空気導入
率を増大させる。好ましいpＨ域は約６〜８である。上
記の生産培地のpＨは、Ｅ．coliの増殖に最適な６．５
−６．８に絶えず自己調節される。従って、Ｅ．coli宿
主の場合は、培地pＨの酸および塩基調節は不要であ
る。しかし、他の宿主については、培地pＨの調節は必
要となろう。最適細胞密度に達したら(Ｅ．coliについ
ては光学密度ＯＤ10 600)、ヘテロローガス遺伝子を誘導
してポリペプチドが生産される様に、Ｌ−アラビノース
を添加する。既述した様に、ポリペプチドは、宿主内に
おいて細胞封入体を形成する。このペプチドは、濾過ま
たは沈澱の様な既知の方法で回収する。得られた、発現
されたヘテロローガスペプチドが融合タンパク質である
場合は、その融合タンパク質を回収し、形質転換後工程
で処理し、所望のヘテロローガスポリペプチドを分離す
ることができる。次いで、このヘテロローガスポリペプ
チドを回収し、既知の方法で精製する。
は、先に培養工程で述べた条件と同じである。ただし、
溶存酸素が増殖中に消費されるので、最小溶存酸素
(Ｄ．Ｏ．)を３０％に維持するために、撹拌と空気導入
率を増大させる。好ましいpＨ域は約６〜８である。上
記の生産培地のpＨは、Ｅ．coliの増殖に最適な６．５
−６．８に絶えず自己調節される。従って、Ｅ．coli宿
主の場合は、培地pＨの酸および塩基調節は不要であ
る。しかし、他の宿主については、培地pＨの調節は必
要となろう。最適細胞密度に達したら(Ｅ．coliについ
ては光学密度ＯＤ10 600)、ヘテロローガス遺伝子を誘導
してポリペプチドが生産される様に、Ｌ−アラビノース
を添加する。既述した様に、ポリペプチドは、宿主内に
おいて細胞封入体を形成する。このペプチドは、濾過ま
たは沈澱の様な既知の方法で回収する。得られた、発現
されたヘテロローガスペプチドが融合タンパク質である
場合は、その融合タンパク質を回収し、形質転換後工程
で処理し、所望のヘテロローガスポリペプチドを分離す
ることができる。次いで、このヘテロローガスポリペプ
チドを回収し、既知の方法で精製する。
【００６４】araＢプロモーターは、便宜上、セクロピ
ンを含んでいる本発明の各種態様に関連して記載されて
いるが、araＢプロモーターは、生物活性を有する全ゆ
るポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝
子配列に機能的に結合させてもよいと理解されなければ
ならない。
ンを含んでいる本発明の各種態様に関連して記載されて
いるが、araＢプロモーターは、生物活性を有する全ゆ
るポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝
子配列に機能的に結合させてもよいと理解されなければ
ならない。
【００６５】２．セクロピン感受性宿主を使用するセク
ロピンの微生物学的製造法 本発明の１つの目的は、セクロピン感受性宿主を使用し
てセクロピンを微生物学的に製造する方法を提供するこ
とにある。本発明の１つの思想は、セクロピンをコード
している遺伝子配列を発現させると共に、その生産物の
殺菌作用を回避する、または遅らせることにある。
ロピンの微生物学的製造法 本発明の１つの目的は、セクロピン感受性宿主を使用し
てセクロピンを微生物学的に製造する方法を提供するこ
とにある。本発明の１つの思想は、セクロピンをコード
している遺伝子配列を発現させると共に、その生産物の
殺菌作用を回避する、または遅らせることにある。
【００６６】１つの態様においては、セクロピンをコー
ドしている遺伝子配列を誘導し得るプロモーターに連結
し、得られた遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入する。
次いで、この発現ビヒクルを使って適当な宿主を形質転
換し、この宿主を、プロモーターが活性化されない通常
の条件下で発酵させる。適当な時期が経過したら、たと
えば細胞が定常期になったら、たとえば塩濃度、光、代
謝産物の存在または非存在、金属などの外部環境因子を
変えることによりプロモーターを誘導する。この変化に
より、セクロピン遺伝子配列のmＲＮＡへの転写、次い
でその翻訳が起こり殺菌性のセクロピンが得られる。得
られたセクロピンは殺菌性があり、細菌宿主を破壊する
が、この様な破壊は発酵サイクルの後期まで起こらな
い。調節されたプロモーターの例は、ラムダ−ＰLおよ
びＰR、lac、gal、trp、ara、hutなどである。
ドしている遺伝子配列を誘導し得るプロモーターに連結
し、得られた遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入する。
次いで、この発現ビヒクルを使って適当な宿主を形質転
換し、この宿主を、プロモーターが活性化されない通常
の条件下で発酵させる。適当な時期が経過したら、たと
えば細胞が定常期になったら、たとえば塩濃度、光、代
謝産物の存在または非存在、金属などの外部環境因子を
変えることによりプロモーターを誘導する。この変化に
より、セクロピン遺伝子配列のmＲＮＡへの転写、次い
でその翻訳が起こり殺菌性のセクロピンが得られる。得
られたセクロピンは殺菌性があり、細菌宿主を破壊する
が、この様な破壊は発酵サイクルの後期まで起こらな
い。調節されたプロモーターの例は、ラムダ−ＰLおよ
びＰR、lac、gal、trp、ara、hutなどである。
【００６７】第２の好ましい態様においては、セクロピ
ンをコードしている遺伝子配列を機能的に、該セクロピ
ン以外のポリペプチドに結合させ、セクロピンおよび付
加したポリペプチドの両アミノ酸配列から成り、かつ目
的のセクロピンアミノ酸配列に隣り合って選択的な切断
部位を含有する、融合あるいは前駆体タンパク質が発現
によって得られるようにするならば、得られた融合タン
パク質は殺菌性ではないということが見出された。次い
で、殺菌活性のセクロピンを翻訳後に選択切断して単離
することができる。
ンをコードしている遺伝子配列を機能的に、該セクロピ
ン以外のポリペプチドに結合させ、セクロピンおよび付
加したポリペプチドの両アミノ酸配列から成り、かつ目
的のセクロピンアミノ酸配列に隣り合って選択的な切断
部位を含有する、融合あるいは前駆体タンパク質が発現
によって得られるようにするならば、得られた融合タン
パク質は殺菌性ではないということが見出された。次い
で、殺菌活性のセクロピンを翻訳後に選択切断して単離
することができる。
【００６８】最も一般的には、発現担体の複製環境外
で、たとえば微生物培養物を集めた後に切断を行う。従
って、この付加的なポリペプチドは、細胞外切断まだの
間、セクロピンからその殺菌効果を失なわしめ、十分長
期にわたって宿主を生存させて高レベルの目的生産物を
生じさせる。このセクロピンは、余分のポリペプチドを
切り落とす際に用いる選択的切断部位に対応する内部切
断部位を欠いていることが好ましいが、これは必ずしも
絶対条件ではない。セクロピンはメチオニンを含有して
いないので、セクロピン配列に隣り合ったメチオニンの
ところで臭化シアン切断するのが有効である。
で、たとえば微生物培養物を集めた後に切断を行う。従
って、この付加的なポリペプチドは、細胞外切断まだの
間、セクロピンからその殺菌効果を失なわしめ、十分長
期にわたって宿主を生存させて高レベルの目的生産物を
生じさせる。このセクロピンは、余分のポリペプチドを
切り落とす際に用いる選択的切断部位に対応する内部切
断部位を欠いていることが好ましいが、これは必ずしも
絶対条件ではない。セクロピンはメチオニンを含有して
いないので、セクロピン配列に隣り合ったメチオニンの
ところで臭化シアン切断するのが有効である。
【００６９】この余分のポリペプチドをコードしている
遺伝子配列をセクロピンの構造遺伝子より先に転写させ
るのが好ましいが、セクロピンのＣ末端に隣り合った位
置で余分のポリペプチドを発現させることも可能である
ので、必ずしもこうである必要はない。
遺伝子配列をセクロピンの構造遺伝子より先に転写させ
るのが好ましいが、セクロピンのＣ末端に隣り合った位
置で余分のポリペプチドを発現させることも可能である
ので、必ずしもこうである必要はない。
【００７０】この余分の隣接ポリペプチドの性質には限
定はなく、既知の構造、酵素、ホルモンまたはその他の
生理学的な関連タンパク質の一部、全部または繰り返し
単位のいずれであってもよい。また、非機能的なポリペ
プチドであってもよい。いずれの特定の理論に拘束され
ることもなく、融合タンパク質を長くすると全体のポリ
ペプチドの立体配置を変えることによってセクロピンの
殺菌性をどういうわけか“遮蔽する"ものと本発明者等
は考えている。余分な隣接ポリペプチドをコードしてい
る遺伝子配列は、好ましくはその長さが少なくとも約３
００塩基対以上であるべきであり、より好ましくは約４
００bp〜５kbであり、最も好ましくは４００bp〜２kbで
ある。これは、好ましくは約１００〜１７００アミノ酸
残基の余分のポリペプチドに対応する。
定はなく、既知の構造、酵素、ホルモンまたはその他の
生理学的な関連タンパク質の一部、全部または繰り返し
単位のいずれであってもよい。また、非機能的なポリペ
プチドであってもよい。いずれの特定の理論に拘束され
ることもなく、融合タンパク質を長くすると全体のポリ
ペプチドの立体配置を変えることによってセクロピンの
殺菌性をどういうわけか“遮蔽する"ものと本発明者等
は考えている。余分な隣接ポリペプチドをコードしてい
る遺伝子配列は、好ましくはその長さが少なくとも約３
００塩基対以上であるべきであり、より好ましくは約４
００bp〜５kbであり、最も好ましくは４００bp〜２kbで
ある。これは、好ましくは約１００〜１７００アミノ酸
残基の余分のポリペプチドに対応する。
【００７１】多数の余分のポリペプチドを所望のセクロ
ピンペプチド配列に融合することができる。このポリペ
プチド遺伝子配列は、有機合成によって(この場合、最
適方法が推奨されるであろう)調製することができる
が、適当なmＲＮＡの逆転写のような方法によって調製
されることもあるであろう。ポリペプチドの遺伝子配列
と構造セクロピンペプチドの遺伝子配列との酵素的結合
をcＤＮＡの調製後に行う。酵素的結合は、制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位の２本鎖の１つからなる接着末端
を供給するか、あるいは平滑ライゲーションのどちらか
によって行うことができる。余分のポリペプチドの例は
ベーターガラクトシダーゼあるいはリブロキナーゼ(ara
Ｂ遺伝子によってコードされている)である。酵素およ
び構造タンパク質が好ましい。用いることが可能なその
他の産物は、以下に挙げる遺伝子によってコードされて
いる産物である: aceＡあるいはaceＢ、araＡ、araＢ、
araＣ、araＤ、argＧ、aroＢ、lacＡ、serＡ、purＡ、t
rpＡ、trpＢ、trpＣ、trpＤ、trpＥ、tyrＡ等。この余
分のポリペプチドは普通グリコシル化されていない。ar
aＢプロモーターが好ましいプロモーターであるが、ラ
ムダＰLおよびＰR、lac、gal、trp、hutおよびその他の
araプロモーターなどのその他のプロモーターを用いる
ことができる。
ピンペプチド配列に融合することができる。このポリペ
プチド遺伝子配列は、有機合成によって(この場合、最
適方法が推奨されるであろう)調製することができる
が、適当なmＲＮＡの逆転写のような方法によって調製
されることもあるであろう。ポリペプチドの遺伝子配列
と構造セクロピンペプチドの遺伝子配列との酵素的結合
をcＤＮＡの調製後に行う。酵素的結合は、制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位の２本鎖の１つからなる接着末端
を供給するか、あるいは平滑ライゲーションのどちらか
によって行うことができる。余分のポリペプチドの例は
ベーターガラクトシダーゼあるいはリブロキナーゼ(ara
Ｂ遺伝子によってコードされている)である。酵素およ
び構造タンパク質が好ましい。用いることが可能なその
他の産物は、以下に挙げる遺伝子によってコードされて
いる産物である: aceＡあるいはaceＢ、araＡ、araＢ、
araＣ、araＤ、argＧ、aroＢ、lacＡ、serＡ、purＡ、t
rpＡ、trpＢ、trpＣ、trpＤ、trpＥ、tyrＡ等。この余
分のポリペプチドは普通グリコシル化されていない。ar
aＢプロモーターが好ましいプロモーターであるが、ラ
ムダＰLおよびＰR、lac、gal、trp、hutおよびその他の
araプロモーターなどのその他のプロモーターを用いる
ことができる。
【００７２】本発明のさらに別の態様においては、セク
ロピン遺伝子配列を、融合産物においてセクロピンの殺
菌活性を阻害あるいは不活性化することができる余分の
ポリペプチドの配列に機能的に結合させ、さらに誘導プ
ロモーターに結合させる。この方法では、融合タンパク
質法で得られる効果と誘導プロモーターの使用で得られ
る効果の両方を都合よく、かつ同時に利用することがで
きる。
ロピン遺伝子配列を、融合産物においてセクロピンの殺
菌活性を阻害あるいは不活性化することができる余分の
ポリペプチドの配列に機能的に結合させ、さらに誘導プ
ロモーターに結合させる。この方法では、融合タンパク
質法で得られる効果と誘導プロモーターの使用で得られ
る効果の両方を都合よく、かつ同時に利用することがで
きる。
【００７３】本発明はセクロピン感受性の宿主(たとえ
ば、細菌宿主)においてセクロピンを産生させる方法に
関するものであるが、本発明で調製した遺伝子構築物お
よびその関連方法を、その他の非セクロピン感受性宿主
においてセクロピンを発現させるために用いることもで
きる。これらの非セクロピン感受性宿主には酵母および
哺乳動物細胞培養物が含まれる。有用な酵母、哺乳動物
宿主およびベクターは当業界ではよく知られており、言
及がなされている(たとえば、欧州特許公開００９３６
１９、１９８３年１１月９日発行)。細菌性宿主には、a
raＢプロモーターを有する既述の宿主、並びにシュード
モナス(Ｐseudomonas)、シトロバクター(Ｃitrobacte
r)、クサントモナス(Ｘanthomonas)およびエルビニア
(Ｅrwinia)などの属の細菌宿主が含まれる。araＢプロ
モーターを有する上記のような宿主と共存しうるすべて
のプラスミドベクターを用いることができる。
ば、細菌宿主)においてセクロピンを産生させる方法に
関するものであるが、本発明で調製した遺伝子構築物お
よびその関連方法を、その他の非セクロピン感受性宿主
においてセクロピンを発現させるために用いることもで
きる。これらの非セクロピン感受性宿主には酵母および
哺乳動物細胞培養物が含まれる。有用な酵母、哺乳動物
宿主およびベクターは当業界ではよく知られており、言
及がなされている(たとえば、欧州特許公開００９３６
１９、１９８３年１１月９日発行)。細菌性宿主には、a
raＢプロモーターを有する既述の宿主、並びにシュード
モナス(Ｐseudomonas)、シトロバクター(Ｃitrobacte
r)、クサントモナス(Ｘanthomonas)およびエルビニア
(Ｅrwinia)などの属の細菌宿主が含まれる。araＢプロ
モーターを有する上記のような宿主と共存しうるすべて
のプラスミドベクターを用いることができる。
【００７４】別の好ましいセクロピン用プロモーターは
ラムダ(ＰL)である。セクロピン用遺伝子構築物および
余分のポリペプチドを、バクテリオファージラムダ
(ＰL)の左側のプロモーターの制御下に置くことができ
る。このプロモーターは制御されうる最も強力な既知プ
ロモーターの１つである。制御はラムダリプレッサーに
よって発揮され、隣接制限部位が知られている。ＣＩ遺
伝子の温度感受性対立遺伝子を、セクロピンの完全配列
を含有するベクターあるいは別のベクター上に配置する
ことができる。温度が４２℃まで上昇したときに、この
リプレッサーは不活性化され、プロモーターはその最大
レベルで発現される。これらの条件下で産生したmＲＮ
Ａ量は、ＰLプロモーター由来の新しく合成したＲＮＡ
を約１０％含有する細胞を生じるに十分であるはずであ
る。この方法において、機能的なセクロピン融合構築物
配列がリボソーム結合配列に隣接し、そしてラムダＰL
プロモーターから種々の距離にあるクローンバンクを作
成することが可能である。次いで、これらのクローンを
スクリーニングし、最大の収量を与えるクローンを選別
することができる。
ラムダ(ＰL)である。セクロピン用遺伝子構築物および
余分のポリペプチドを、バクテリオファージラムダ
(ＰL)の左側のプロモーターの制御下に置くことができ
る。このプロモーターは制御されうる最も強力な既知プ
ロモーターの１つである。制御はラムダリプレッサーに
よって発揮され、隣接制限部位が知られている。ＣＩ遺
伝子の温度感受性対立遺伝子を、セクロピンの完全配列
を含有するベクターあるいは別のベクター上に配置する
ことができる。温度が４２℃まで上昇したときに、この
リプレッサーは不活性化され、プロモーターはその最大
レベルで発現される。これらの条件下で産生したmＲＮ
Ａ量は、ＰLプロモーター由来の新しく合成したＲＮＡ
を約１０％含有する細胞を生じるに十分であるはずであ
る。この方法において、機能的なセクロピン融合構築物
配列がリボソーム結合配列に隣接し、そしてラムダＰL
プロモーターから種々の距離にあるクローンバンクを作
成することが可能である。次いで、これらのクローンを
スクリーニングし、最大の収量を与えるクローンを選別
することができる。
【００７５】また、このセクロピン配列の発現を、形質
転換されていない状態では微生物にホモローガス“相
同"であってもよい他のレギュロンの制御下で行うこと
もできる。たとえば、Ｅ．コリの染色体ＤＮＡはラクト
ースあるいはlacオペロンを含有し、これは酵素ベータ
ーガラクトシダーゼを同化することによってラクトース
消化を仲介する。このlac制御要素を、Ｅ．コリに感染
するバクテリオファージラムダplac５から得ることがで
きる。このファージのlacオペロンを、同一の細菌種か
ら形質導入して得ることができる。本発明の方法に用い
るのに適したレギュロンを、微生物本来のプラスミドＤ
ＮＡから得ることができる。このlacプロモーター−オ
ペレーター系をＩＰＴＧで誘起することができる。
転換されていない状態では微生物にホモローガス“相
同"であってもよい他のレギュロンの制御下で行うこと
もできる。たとえば、Ｅ．コリの染色体ＤＮＡはラクト
ースあるいはlacオペロンを含有し、これは酵素ベータ
ーガラクトシダーゼを同化することによってラクトース
消化を仲介する。このlac制御要素を、Ｅ．コリに感染
するバクテリオファージラムダplac５から得ることがで
きる。このファージのlacオペロンを、同一の細菌種か
ら形質導入して得ることができる。本発明の方法に用い
るのに適したレギュロンを、微生物本来のプラスミドＤ
ＮＡから得ることができる。このlacプロモーター−オ
ペレーター系をＩＰＴＧで誘起することができる。
【００７６】本発明において特に興味深いことは、セク
ロピンペプチドをコードしている合成ポリヌクレオチド
配列を提供することである。本発明の好ましい態様にお
いては、セクロピンペプチドの合成配列(隣接配列があ
ってもなくても)を、その発現体が種々の宿主(たとえ
ば、酵母および細菌、特に後者)と共存しうるように最
適なものにする。特に、Ｅ．コリにおいて供与配列すべ
ての発現を最適化することは極めて重要である。従っ
て、上記のような最適化操作を行った後には、隣接配列
を有するかあるいは有しないセクロピンペプチドの実際
の遺伝子配列は、通常、元の種における天然の配列とは
異なっている。
ロピンペプチドをコードしている合成ポリヌクレオチド
配列を提供することである。本発明の好ましい態様にお
いては、セクロピンペプチドの合成配列(隣接配列があ
ってもなくても)を、その発現体が種々の宿主(たとえ
ば、酵母および細菌、特に後者)と共存しうるように最
適なものにする。特に、Ｅ．コリにおいて供与配列すべ
ての発現を最適化することは極めて重要である。従っ
て、上記のような最適化操作を行った後には、隣接配列
を有するかあるいは有しないセクロピンペプチドの実際
の遺伝子配列は、通常、元の種における天然の配列とは
異なっている。
【００７７】さらに、融合産物のための所望の遺伝子の
設計には、メチオニン(臭化シアンで切断可能)、トリプ
トファン(o−ヨードソ安息香酸で切断可能)、グルタミ
ン酸[スタフ(Ｓtaph．)プロテアーゼで切断可能]等の切
断部位のアミノ酸のためのコドンを導入するのが好まし
い。
設計には、メチオニン(臭化シアンで切断可能)、トリプ
トファン(o−ヨードソ安息香酸で切断可能)、グルタミ
ン酸[スタフ(Ｓtaph．)プロテアーゼで切断可能]等の切
断部位のアミノ酸のためのコドンを導入するのが好まし
い。
【００７８】本発明のある態様においては、融合産物の
所望のＤＮＡ配列におけるコドンのすべてについて、特
定部位の突然変異誘発によって意図したところで突然変
異誘発を行うことができる。従って、所望のＤＮＡ配列
を合成した後に、切断しうる部位をこの配列に導入する
ことができる。特定部位の突然変異誘発は既知であり、
ワレイス等が言及している[(Ｗallace et al．)、サ
イエンス(Ｓcienc)、２０９: １３９６〜１４００(１９
８０)、参考のために本明細書中に入れた]。
所望のＤＮＡ配列におけるコドンのすべてについて、特
定部位の突然変異誘発によって意図したところで突然変
異誘発を行うことができる。従って、所望のＤＮＡ配列
を合成した後に、切断しうる部位をこの配列に導入する
ことができる。特定部位の突然変異誘発は既知であり、
ワレイス等が言及している[(Ｗallace et al．)、サ
イエンス(Ｓcienc)、２０９: １３９６〜１４００(１９
８０)、参考のために本明細書中に入れた]。
【００７９】セクロピンペプチドにおいて潜在的なＣ−
末端残基に続いているアミノ酸残基あるいは残基群に
は、上記のように、先導ポリペプチド(それが存在する
場合)と同一または異なる構造および種々の長さのさら
に別のポリペプチド(“トレイリング(trailing)"ポリペ
プチド)が続いていてもよい。このような場合、Ｃ−末
端アミノ酸残基とトレイリングポリペプチド配列の間に
同一または異なる選択切断部位を与えるのが都合よい。
これらの切断部位は、先導ポリペプチドとセクロピンペ
プチドの構造遺伝子との間に存在するものと同一であっ
て、同一でなくてもよい。
末端残基に続いているアミノ酸残基あるいは残基群に
は、上記のように、先導ポリペプチド(それが存在する
場合)と同一または異なる構造および種々の長さのさら
に別のポリペプチド(“トレイリング(trailing)"ポリペ
プチド)が続いていてもよい。このような場合、Ｃ−末
端アミノ酸残基とトレイリングポリペプチド配列の間に
同一または異なる選択切断部位を与えるのが都合よい。
これらの切断部位は、先導ポリペプチドとセクロピンペ
プチドの構造遺伝子との間に存在するものと同一であっ
て、同一でなくてもよい。
【００８０】換言すれば、余分のポリペプチドは先導ポ
リペプチド、トレイリングポリペプチドまたはその両者
として存在することができる。
リペプチド、トレイリングポリペプチドまたはその両者
として存在することができる。
【００８１】所望のセクロピンペプチドの構造遺伝子を
そのまま発現用担体に挿入しようとする場合は、この遺
伝子の前には“開始"コドンが存在し、そしてトレイリ
ング配列が続いている場合には、１またはそれ以上の終
止あるいは停止コドンが存在する。発現産物がセクロピ
ンペプチドおよびポリペプチドの一部あるいは全体の両
者からなる融合タンパク質であるときには、この開始コ
ドンはポリペプチドのＮ−末端の前に置かれていてよい
(ポリペプチドが先導である場合)。
そのまま発現用担体に挿入しようとする場合は、この遺
伝子の前には“開始"コドンが存在し、そしてトレイリ
ング配列が続いている場合には、１またはそれ以上の終
止あるいは停止コドンが存在する。発現産物がセクロピ
ンペプチドおよびポリペプチドの一部あるいは全体の両
者からなる融合タンパク質であるときには、この開始コ
ドンはポリペプチドのＮ−末端の前に置かれていてよい
(ポリペプチドが先導である場合)。
【００８２】ポリヌクレオチドの合成法は当業界でよく
知られている。参照文献としては、たとえばイタクラ等
[Ｉtakura et al．、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサエティ(Ｊournal of Ａmerican Ｃ
hemical Ｓociety)、９７:３７２７(１９７５)のトリ
エステル法がある。
知られている。参照文献としては、たとえばイタクラ等
[Ｉtakura et al．、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサエティ(Ｊournal of Ａmerican Ｃ
hemical Ｓociety)、９７:３７２７(１９７５)のトリ
エステル法がある。
【００８３】本発明方法によって得たセクロピンを、特
定の応用分野に向けられた広範な抗微生物剤として用い
ることができる。このような応用分野には、たとえば加
工食品製品の防腐剤[対象微生物: (１)クロストリジウ
ム・ボツリナム(Ｃlostridiumbotulinum)、(２)ラクト
バシリ(Ｌactobacilli)、(３)ミクロコッチ(Ｍicrococc
i)]; 口腔内衛生製品の抗カリエス剤[対象微生物: スト
レプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptcoccus mutan
s)]; 膣酵母感染の治療に有用な薬物[対象微生物: カン
ジダ・アルビカンス(Ｃandida albicans)]および防臭
剤中の抗微生物剤[対象微生物: (１)ミクロコッチ(Ｍic
rococci)、(２)ジフテロイズ(Ｄiphtheroids)]としてセ
クロピンを使用することが含まれる。上記の応用分野に
ついてセクロピン様ペプチドの相対的な効果を、セクロ
ピンペプチドの１つに対するいずれかの微生物の感受性
を測定することによって、当業者は容易に概算すること
ができる。試験管内で用いられる同一の細菌スクリーニ
ングを用いて投与量および濃度を決めることができる。
定の応用分野に向けられた広範な抗微生物剤として用い
ることができる。このような応用分野には、たとえば加
工食品製品の防腐剤[対象微生物: (１)クロストリジウ
ム・ボツリナム(Ｃlostridiumbotulinum)、(２)ラクト
バシリ(Ｌactobacilli)、(３)ミクロコッチ(Ｍicrococc
i)]; 口腔内衛生製品の抗カリエス剤[対象微生物: スト
レプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptcoccus mutan
s)]; 膣酵母感染の治療に有用な薬物[対象微生物: カン
ジダ・アルビカンス(Ｃandida albicans)]および防臭
剤中の抗微生物剤[対象微生物: (１)ミクロコッチ(Ｍic
rococci)、(２)ジフテロイズ(Ｄiphtheroids)]としてセ
クロピンを使用することが含まれる。上記の応用分野に
ついてセクロピン様ペプチドの相対的な効果を、セクロ
ピンペプチドの１つに対するいずれかの微生物の感受性
を測定することによって、当業者は容易に概算すること
ができる。試験管内で用いられる同一の細菌スクリーニ
ングを用いて投与量および濃度を決めることができる。
【００８４】ここまで、本発明を一般的に記載したが、
特定の実施例について言及することにより本発明はさら
によく理解されるであろう。この実施例は説明のために
だけ挙げたものであって、他に指定がない限り本発明を
限定しようとするものではない。
特定の実施例について言及することにより本発明はさら
によく理解されるであろう。この実施例は説明のために
だけ挙げたものであって、他に指定がない限り本発明を
限定しようとするものではない。
【００８５】方法 アミノ酸組成 減圧下、１１０℃で２４時間、５．５ＭのＨＣl[ピアー
ス(Ｐierce)]を用いてセクロピンポリペプチドの加水分
解を行った。試料を減圧下、４０℃で乾燥し、ベックマ
ン・モデル６３００試料緩衝液(Ｂeckman Ｍodel、低p
Ｈクエン酸塩)２００μl中に再懸濁した。
ス(Ｐierce)]を用いてセクロピンポリペプチドの加水分
解を行った。試料を減圧下、４０℃で乾燥し、ベックマ
ン・モデル６３００試料緩衝液(Ｂeckman Ｍodel、低p
Ｈクエン酸塩)２００μl中に再懸濁した。
【００８６】ベックマン・モデル６３００分析機を用い
てアミノ酸分析を行った。ポストカラム(Ｐostcolumn)
ニンヒドリンを検知に用いた。ヒューレット・パッカー
ド(Ｈewlet Ｐackard、ＨＰ)積分器モデル３３９０を
用いてデータを記録した。個々のピークを５４０および
４４０nmにおけるシグナルの合計として記録した。それ
ぞれのアミノ酸を含有するベックマン標準を用いて積分
器を補正し、マッコウクジラミオグロビン[アプライド
・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosystems)]を用いて
検量が正確であることを確認した。
てアミノ酸分析を行った。ポストカラム(Ｐostcolumn)
ニンヒドリンを検知に用いた。ヒューレット・パッカー
ド(Ｈewlet Ｐackard、ＨＰ)積分器モデル３３９０を
用いてデータを記録した。個々のピークを５４０および
４４０nmにおけるシグナルの合計として記録した。それ
ぞれのアミノ酸を含有するベックマン標準を用いて積分
器を補正し、マッコウクジラミオグロビン[アプライド
・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosystems)]を用いて
検量が正確であることを確認した。
【００８７】タンパク質の配列決定 アプライド・バイオシステムズ・モデル４７０Ａタンパ
ク質シークエネーター(アミノ酸配列分析装置)を、すべ
てのタンパク質配列決定に用いた。配列決定法の細目は
フンカピラー−フッド(Ｈunkapiller−Ｈood)のプログ
ラムに従った。この系には、メタノール性ＨＣlによる
切断を用いる非減圧プログラムを用いた。
ク質シークエネーター(アミノ酸配列分析装置)を、すべ
てのタンパク質配列決定に用いた。配列決定法の細目は
フンカピラー−フッド(Ｈunkapiller−Ｈood)のプログ
ラムに従った。この系には、メタノール性ＨＣlによる
切断を用いる非減圧プログラムを用いた。
【００８８】ＰＴＨの測定 データ供与用のＨＰモデル３３９０Ａ積分器を備えたＨ
Ｐモデル１０９０ＡＨＰＬＣを用いてＰＴＨの測定を行
った。ＩＢＭシアノ−プロピルカラムをＰＴＨアミノ酸
の分離に用いた。緩衝液は５％テトラヒドロフランを含
有する３０mＭのＮaＨＡc(pＨ５．１)であった。流速は
１ml／分、温度は３７℃であった。減圧下で乾燥した
後、試料を３３％アセトニトリル水溶液３０μlで３０
分間溶解した。使用したＰＴＨ標準はピアース・ケミカ
ル社(Ｐierce Ｃhemical Ｃo．)から入手した。
Ｐモデル１０９０ＡＨＰＬＣを用いてＰＴＨの測定を行
った。ＩＢＭシアノ−プロピルカラムをＰＴＨアミノ酸
の分離に用いた。緩衝液は５％テトラヒドロフランを含
有する３０mＭのＮaＨＡc(pＨ５．１)であった。流速は
１ml／分、温度は３７℃であった。減圧下で乾燥した
後、試料を３３％アセトニトリル水溶液３０μlで３０
分間溶解した。使用したＰＴＨ標準はピアース・ケミカ
ル社(Ｐierce Ｃhemical Ｃo．)から入手した。
【００８９】実施例１ 合成セクロピンＡ(ＣＡ)遺伝子の合成およびクローニン
グ Ａ．ＣＡ遺伝子の合成 ＣＡをコードする遺伝子を、高度に発現されたイー・コ
リ蛋白に通常みられるコドンを導入するようにコンピュ
ータでデザインした。該遺伝子の末端に４bp分の突出部
を入れ、それぞれＳalＩおよびＥcoＲＩ部位リゲート
(結合)できるようにした。各種サイズの融合蛋白を構築
できるように、ＳalＩ部位のつぎにＢamＨＩ部位を含め
た。さらに、コンピュータープログラムを用いて、前述
したような最適の方法を採択した。その遺伝子を２３〜
３７塩基長さの８個のオリゴヌクレオチドに分割した。
グ Ａ．ＣＡ遺伝子の合成 ＣＡをコードする遺伝子を、高度に発現されたイー・コ
リ蛋白に通常みられるコドンを導入するようにコンピュ
ータでデザインした。該遺伝子の末端に４bp分の突出部
を入れ、それぞれＳalＩおよびＥcoＲＩ部位リゲート
(結合)できるようにした。各種サイズの融合蛋白を構築
できるように、ＳalＩ部位のつぎにＢamＨＩ部位を含め
た。さらに、コンピュータープログラムを用いて、前述
したような最適の方法を採択した。その遺伝子を２３〜
３７塩基長さの８個のオリゴヌクレオチドに分割した。
【００９０】その８個の１本線ＤＮＡフラグメントを、
イトウらの固相ホスホトリエステル法[Ｎucleic Ａcid
s Ｒesearch ８巻、５４９１(１９８２)]によって合
成した。
イトウらの固相ホスホトリエステル法[Ｎucleic Ａcid
s Ｒesearch ８巻、５４９１(１９８２)]によって合
成した。
【００９１】下記のような種々の変更および改良を行っ
た。 (１)カップリング反応をゆるやかに振盪させながら３７
℃で４０分間行った。
た。 (１)カップリング反応をゆるやかに振盪させながら３７
℃で４０分間行った。
【００９２】(２)最終カップリング反応後、ＤＮＡの脱
保護基を行うために、ＤＮＡ樹脂(１０mg)を０．５Ｍ２
−ピリジンアルドキシム−テトラメチルグアニジニウム
のピリジン−水(８:２v／v)溶液(２ml)と振盪させなが
ら３７℃で６０分間反応させた。溶液を合わせ、蒸発さ
せたのち、密封アンプル中でＮＨ4ＯＨ(２８％、３ml)
にて６０℃で３６時間処理した。アンモニアを蒸発させ
たのち、溶液をエーテルで３回抽出し、次いで蒸発させ
た。ＤＮＡを精製するために、その残渣を５０mＭトリ
エチルアンモニウム重炭酸塩pＨ７．５(ＴＥＡＢ)０．
１mlに溶かし、セファデックスＧ−５０のカラム(１×
５０cm)に通した。１mlずつのフラクションを採取し
た。主に２６０nmに鋭い吸収ピークを有する最初の数フ
ラクションに目的物質が含まれていた。これらのフラク
ションを蒸発させ、次いで高速液体クロマトグラフィ
(ＨＰＬＣ)にてさらに精製した。このＨＰＬＣ精製は、
ボンダパック(Ｂondapak)Ｃ１８(Ｗaters社)カラムにて
１０mＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(pＨ７．８)
中アセトニトリル(１０〜４０％)のリニアグラジエント
を用いて５５℃で行った。そのＤＭＴ基を８０％酢酸
(０．１ml)にて室温で２５分間処理して加水分解し、次
いで蒸発、さらに水０．１mlを加えて蒸発させて酢酸を
完全に除去した。
保護基を行うために、ＤＮＡ樹脂(１０mg)を０．５Ｍ２
−ピリジンアルドキシム−テトラメチルグアニジニウム
のピリジン−水(８:２v／v)溶液(２ml)と振盪させなが
ら３７℃で６０分間反応させた。溶液を合わせ、蒸発さ
せたのち、密封アンプル中でＮＨ4ＯＨ(２８％、３ml)
にて６０℃で３６時間処理した。アンモニアを蒸発させ
たのち、溶液をエーテルで３回抽出し、次いで蒸発させ
た。ＤＮＡを精製するために、その残渣を５０mＭトリ
エチルアンモニウム重炭酸塩pＨ７．５(ＴＥＡＢ)０．
１mlに溶かし、セファデックスＧ−５０のカラム(１×
５０cm)に通した。１mlずつのフラクションを採取し
た。主に２６０nmに鋭い吸収ピークを有する最初の数フ
ラクションに目的物質が含まれていた。これらのフラク
ションを蒸発させ、次いで高速液体クロマトグラフィ
(ＨＰＬＣ)にてさらに精製した。このＨＰＬＣ精製は、
ボンダパック(Ｂondapak)Ｃ１８(Ｗaters社)カラムにて
１０mＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(pＨ７．８)
中アセトニトリル(１０〜４０％)のリニアグラジエント
を用いて５５℃で行った。そのＤＭＴ基を８０％酢酸
(０．１ml)にて室温で２５分間処理して加水分解し、次
いで蒸発、さらに水０．１mlを加えて蒸発させて酢酸を
完全に除去した。
【００９３】Ｂ．ＣＡ遺伝子のリゲイションによる組立
て 化学的に合成したフラグメント１〜８の５'ＯＨ末端
を、別々に、下記組成の溶液(１０μl)中でリン酸化し
た。 ７０mＭトリス−ＨＣl(pＨ７．６) １０mＭ ＭgＣl2 ５mＭジチオスレイトール ６６μＭガンマー32Ｐ−ＡＴＰ(１μＣi) ＤＮＡ４００ngおよび Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ２単位
て 化学的に合成したフラグメント１〜８の５'ＯＨ末端
を、別々に、下記組成の溶液(１０μl)中でリン酸化し
た。 ７０mＭトリス−ＨＣl(pＨ７．６) １０mＭ ＭgＣl2 ５mＭジチオスレイトール ６６μＭガンマー32Ｐ−ＡＴＰ(１μＣi) ＤＮＡ４００ngおよび Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ２単位
【００９４】この反応は２５℃で１５分間行い、１０m
Ｍ非標識ＡＴＰ１mlを加えてさらに１５分間反応を続け
た。純度をチェックするために、リン酸化ＤＮＡ１０％
を、７Ｍ尿素の存在下にポリアクリルアミドゲル(１５
％)電気泳動にて標準的な方法で分析した。
Ｍ非標識ＡＴＰ１mlを加えてさらに１５分間反応を続け
た。純度をチェックするために、リン酸化ＤＮＡ１０％
を、７Ｍ尿素の存在下にポリアクリルアミドゲル(１５
％)電気泳動にて標準的な方法で分析した。
【００９５】リン酸化ＤＮＡフラグメント２、３、４、
５、６および７の４００ngを９５℃で５分間加熱してＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを不活化した。次いでこれ
に、非リン酸化フラグメント１および８の４００ngを加
え、９５℃でさらに５分間加熱し、次いで２５℃までゆ
っくり(１０分間当り１℃)と冷却した。この８個のＤＮ
Ａフラグメントを全量１００μlにて６６mＭトリス−Ｈ
Ｃl(pＨ７．５)、６．６mＭ ＭgＣl2、１０mＭジチオ
スレイトール、０．４mＭ ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ２単位の存在下に２５℃で２時間リゲートした。
５、６および７の４００ngを９５℃で５分間加熱してＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを不活化した。次いでこれ
に、非リン酸化フラグメント１および８の４００ngを加
え、９５℃でさらに５分間加熱し、次いで２５℃までゆ
っくり(１０分間当り１℃)と冷却した。この８個のＤＮ
Ａフラグメントを全量１００μlにて６６mＭトリス−Ｈ
Ｃl(pＨ７．５)、６．６mＭ ＭgＣl2、１０mＭジチオ
スレイトール、０．４mＭ ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ２単位の存在下に２５℃で２時間リゲートした。
【００９６】Ｃ．プラスミドpＩＮＧ１、pＣＡ１Ａ、p
ＣＡ１ＢおよびpＣＡ１'の構築 その構築工程を図２に示す。pＭＨ６はホルビッツらの
文献[Ｈorwitz, Ａ．Ｈ．et al, Ｇene, ３０９−３１
９(１９８１)]に記載されており、Ｍ１３mp９は市販さ
れている。
ＣＡ１ＢおよびpＣＡ１'の構築 その構築工程を図２に示す。pＭＨ６はホルビッツらの
文献[Ｈorwitz, Ａ．Ｈ．et al, Ｇene, ３０９−３１
９(１９８１)]に記載されており、Ｍ１３mp９は市販さ
れている。
【００９７】１．上記Ｂ工程で得られたＣＡ遺伝子のフ
ラグメントを、予め制限酵素エンドヌクレアーゼＳalＩ
およびＥcoＲＩで処理したプラスミドpＩＮＧ１にリゲ
ートし、次いで制限酵素エンドヌクレアーゼＳmaＩで消
化してpＩＮＧ１を保持する形質転換体を減じた。
ラグメントを、予め制限酵素エンドヌクレアーゼＳalＩ
およびＥcoＲＩで処理したプラスミドpＩＮＧ１にリゲ
ートし、次いで制限酵素エンドヌクレアーゼＳmaＩで消
化してpＩＮＧ１を保持する形質転換体を減じた。
【００９８】２．ＳmaＩ処理プラスミドをイ−・コリＭ
Ｃ１０６１に導入(形質転換)した。
Ｃ１０６１に導入(形質転換)した。
【００９９】３．ＣＡ遺伝子フラグメントを保有するプ
ラスミドを含むコロニーを、合成ＤＮＡフラグメント７
(図１)をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼ
ーションにより同定した。ＣＡフラグメントを含む３個
の別々のコロニーが１０００コロニー中に見付かった。
単離したプラスミドを各々ＳalＩおよびＥcoＲＩで消化
し切り取ったフラグメントのサイズをチェックした。Ｃ
Ａ挿入体の塩基配列分析を、サンジャーら[Ｓanger et
al, ＰＮＡＳ, ７４, ５４６３−５４６７(１９７
７)]のジデオキシ鎖末端法の変法[Ｗallace et al,
Ｇene, １６, ２１−２６(１９８１)]によって行った。
２個の配列を決定し、図７(２)および図７(３)に示し
た。これらの配列を含むプラスミドをpＣＡ１Ａおよびp
ＣＡ１Ｂ(図２)と命名した。これらの配列はそれぞれ図
７(２)および図７(３)中に矢印で示す位置で天然のＣＡ
配列とは異なっていた。
ラスミドを含むコロニーを、合成ＤＮＡフラグメント７
(図１)をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼ
ーションにより同定した。ＣＡフラグメントを含む３個
の別々のコロニーが１０００コロニー中に見付かった。
単離したプラスミドを各々ＳalＩおよびＥcoＲＩで消化
し切り取ったフラグメントのサイズをチェックした。Ｃ
Ａ挿入体の塩基配列分析を、サンジャーら[Ｓanger et
al, ＰＮＡＳ, ７４, ５４６３−５４６７(１９７
７)]のジデオキシ鎖末端法の変法[Ｗallace et al,
Ｇene, １６, ２１−２６(１９８１)]によって行った。
２個の配列を決定し、図７(２)および図７(３)に示し
た。これらの配列を含むプラスミドをpＣＡ１Ａおよびp
ＣＡ１Ｂ(図２)と命名した。これらの配列はそれぞれ図
７(２)および図７(３)中に矢印で示す位置で天然のＣＡ
配列とは異なっていた。
【０１００】天然体の配列を生ぜしめるために種々の方
法、例えばpＣＡ１ＡおよびpＣＡ１Ｂをin vivoまたはi
n vitroで組換える方法、または追加の独立したクロー
ンをスクリーニングする方法などを用いることができ
る。所望の天然型配列を含むプラスミドをpＣＡ１'(図
２)と命名した。
法、例えばpＣＡ１ＡおよびpＣＡ１Ｂをin vivoまたはi
n vitroで組換える方法、または追加の独立したクロー
ンをスクリーニングする方法などを用いることができ
る。所望の天然型配列を含むプラスミドをpＣＡ１'(図
２)と命名した。
【０１０１】以下の記載において、プライム符号(')を
付したプラスミドは天然型ＣＡ配列のものを意味し、プ
ライム符号のないプラスミドはミュータントpＣＡ１Ａ
またはpＣＡ１Ｂから誘導されたものを意味する。
付したプラスミドは天然型ＣＡ配列のものを意味し、プ
ライム符号のないプラスミドはミュータントpＣＡ１Ａ
またはpＣＡ１Ｂから誘導されたものを意味する。
【０１０２】Ｄ．プラスミドpＣＡ２'、pＣＡ２Ａ、pＣ
Ａ３'、pＣＡ３ＡおよびpＣＡ３Ｂの構築 これを図３に示す。pＣＡ１(またはpＣＡ１ＡまたはpＣ
Ａ１Ｂ)をＢamＨＩで消化し、ポリメラーゼおよびdＴＮ
Ｐで処理したのち、ＳstＩ消化に付して、フラグメント
１を得る。このものは一方の端が平滑末端で他の末端に
ＳstＩ突出部を担持している。このフラグメントを、p
ＭＨ６をＮarＩ消化、平滑末端形成およびＳstＩ処理に
付して得られるフラグメントＴ４リゲーションにて結合
させ、pＣＡ３'(またはpＣＡ３ＡまたはpＣＡ３Ｂ)を得
る。このフラグメント１をまた、pＭＨ６をＨgiＡＩ消
化、平滑末端形成およびＳstＩ処理に付して得られるフ
ラグメントとＴ４リゲーションにて結合させ、pＣＡ２'
(またはpＣＡ２Ａ)を得る。
Ａ３'、pＣＡ３ＡおよびpＣＡ３Ｂの構築 これを図３に示す。pＣＡ１(またはpＣＡ１ＡまたはpＣ
Ａ１Ｂ)をＢamＨＩで消化し、ポリメラーゼおよびdＴＮ
Ｐで処理したのち、ＳstＩ消化に付して、フラグメント
１を得る。このものは一方の端が平滑末端で他の末端に
ＳstＩ突出部を担持している。このフラグメントを、p
ＭＨ６をＮarＩ消化、平滑末端形成およびＳstＩ処理に
付して得られるフラグメントＴ４リゲーションにて結合
させ、pＣＡ３'(またはpＣＡ３ＡまたはpＣＡ３Ｂ)を得
る。このフラグメント１をまた、pＭＨ６をＨgiＡＩ消
化、平滑末端形成およびＳstＩ処理に付して得られるフ
ラグメントとＴ４リゲーションにて結合させ、pＣＡ２'
(またはpＣＡ２Ａ)を得る。
【０１０３】上記結合生成物を用いてイー・コリＭＣ１
０６１を形質転換させて所望の生成物を得る。前記ミニ
分解法によりプラスミドを単離する。単離プラスミドを
それぞれＢamＨＩおよびＰstＩで消化する。ＢamＨＩフ
ラグメントの正しいサイズおよび方向を有する各グルー
プのプラスミドをpＣＡ２(またはpＣＡ２Ａ)およびpＣ
Ａ３'(またはpＣＡ３ＡまたはpＣＡ３Ｂ)と命名する。
０６１を形質転換させて所望の生成物を得る。前記ミニ
分解法によりプラスミドを単離する。単離プラスミドを
それぞれＢamＨＩおよびＰstＩで消化する。ＢamＨＩフ
ラグメントの正しいサイズおよび方向を有する各グルー
プのプラスミドをpＣＡ２(またはpＣＡ２Ａ)およびpＣ
Ａ３'(またはpＣＡ３ＡまたはpＣＡ３Ｂ)と命名する。
【０１０４】Ｅ．araＢ−ＣＡ融合蛋白の発現 プラスミドpＣＡ１Ａ、pＣＡ２Ａ、pＣＡ３Ａ、pＣＡ３
ＢおよびpＣＡ３Ｄ(注: pＣＡ３Ｄは、以下、野生型Ｃ
Ａ含有プラスミドpＣＡ３'を示すためにも用いる)中にa
raＢ−ＣＡ融合遺伝子を含有するイー・コリ細胞を、
１．５％トリプトン、１．０％酵母エキスおよび０．５
％ＮaＣl(ＴＹＥ)並びにアンピシリン５０μg／mlを含
む培地中３７℃で生育させた。細胞密度ＯＤ600＝０．
２にて培養物をＬ−アラビノース最終濃度０．５％にて
処理し、araＢ−ＣＡ融合蛋白の発現をもたらし、細胞
密度がＯＤ600＝１．５〜１．７に達したときに、ベッ
クマンＪＳ−４．２ローター中４℃、４０００rpmにて
２０分間遠心分離により収集した。該細胞を原培養液量
の半分倍量の５０mＭリン酸緩衝液(pＨ６．６)に再懸濁
させて洗浄した。プラスミドpＣＡ１Ａ、pＣＡ２Ａおよ
びpＣＡ３Ａを含有する洗浄した細胞ペレットを１／１
０量のリン酸緩衝液および１％ドデシル硫酸ナトリウム
(ＳＤＳ)で抽出し、１０％ポリアクリルアミドＳＤＳ変
性ゲルにて分析した。この分析により、プラスミドpＣ
Ａ３Ａ含有イー・コリ培養液はpＣＡ１ＡまたはpＣＡ２
Ａで形質転換した培養液のいずれよりも多量のaraＢ−
ＣＡ蛋白の生成が認められた。
ＢおよびpＣＡ３Ｄ(注: pＣＡ３Ｄは、以下、野生型Ｃ
Ａ含有プラスミドpＣＡ３'を示すためにも用いる)中にa
raＢ−ＣＡ融合遺伝子を含有するイー・コリ細胞を、
１．５％トリプトン、１．０％酵母エキスおよび０．５
％ＮaＣl(ＴＹＥ)並びにアンピシリン５０μg／mlを含
む培地中３７℃で生育させた。細胞密度ＯＤ600＝０．
２にて培養物をＬ−アラビノース最終濃度０．５％にて
処理し、araＢ−ＣＡ融合蛋白の発現をもたらし、細胞
密度がＯＤ600＝１．５〜１．７に達したときに、ベッ
クマンＪＳ−４．２ローター中４℃、４０００rpmにて
２０分間遠心分離により収集した。該細胞を原培養液量
の半分倍量の５０mＭリン酸緩衝液(pＨ６．６)に再懸濁
させて洗浄した。プラスミドpＣＡ１Ａ、pＣＡ２Ａおよ
びpＣＡ３Ａを含有する洗浄した細胞ペレットを１／１
０量のリン酸緩衝液および１％ドデシル硫酸ナトリウム
(ＳＤＳ)で抽出し、１０％ポリアクリルアミドＳＤＳ変
性ゲルにて分析した。この分析により、プラスミドpＣ
Ａ３Ａ含有イー・コリ培養液はpＣＡ１ＡまたはpＣＡ２
Ａで形質転換した培養液のいずれよりも多量のaraＢ−
ＣＡ蛋白の生成が認められた。
【０１０５】Ｆ．プラスミドpＣＡ３Ａ、pＣＡ３Ｂおよ
びpＣＡ３Ｄを含有する誘導イー・コリ細胞の分画 工程Ｅで得られた洗浄ペレットを原量の１／１０量のリ
ン酸緩衝液に再懸濁し、０℃に冷却し、フレンチ圧力セ
ル中で細胞を破砕した。ローター中で４℃、４０００rp
mで２０分間遠心分離して細胞中の成分を分離した。得
られた上清液および４０００rpm分離ペレットを１０％
ポリアクリルアミドＳＤＳ変性ゲルにて分析したとこ
ろ、pＣＡ３Ａ、３Ｂおよび３ＤのaraＢ−ＣＡ融合蛋白
のすべて４Ｋペレット中に見出された。
びpＣＡ３Ｄを含有する誘導イー・コリ細胞の分画 工程Ｅで得られた洗浄ペレットを原量の１／１０量のリ
ン酸緩衝液に再懸濁し、０℃に冷却し、フレンチ圧力セ
ル中で細胞を破砕した。ローター中で４℃、４０００rp
mで２０分間遠心分離して細胞中の成分を分離した。得
られた上清液および４０００rpm分離ペレットを１０％
ポリアクリルアミドＳＤＳ変性ゲルにて分析したとこ
ろ、pＣＡ３Ａ、３Ｂおよび３ＤのaraＢ−ＣＡ融合蛋白
のすべて４Ｋペレット中に見出された。
【０１０６】Ｇ． 合成ＣＡの精製 (a)臭化シアンによる開裂 １．上記最終工程で得られたaraＢ−ＣＡ融合蛋白を含
有する該４Ｋペレットフラクションを９０％ギ酸と混合
し、蛋白含量０．７〜１．１mg／mlの７０％ギ酸溶液を
得た。１０倍量(重量)の臭化シアン(アセトニトリル中
１gm／ml含有液)を加えた。その反応液を窒素でフラッ
シュし、室温で一夜培養した。
有する該４Ｋペレットフラクションを９０％ギ酸と混合
し、蛋白含量０．７〜１．１mg／mlの７０％ギ酸溶液を
得た。１０倍量(重量)の臭化シアン(アセトニトリル中
１gm／ml含有液)を加えた。その反応液を窒素でフラッ
シュし、室温で一夜培養した。
【０１０７】２．ギ酸および臭化シアンを窒素気流下に
除去した。残渣を７０％ギ酸に溶かし、さらに２回、窒
素気流下で乾燥した。
除去した。残渣を７０％ギ酸に溶かし、さらに２回、窒
素気流下で乾燥した。
【０１０８】３．０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を加
え、開裂したＣＡを、タンパク質１mg／mlの濃度で完全
に溶解した。
え、開裂したＣＡを、タンパク質１mg／mlの濃度で完全
に溶解した。
【０１０９】(b)臭化シアンフラグメントの高速液体ク
ロマトグラフィー 臭化シアン開裂融合タンパク質をＨＰＬＣでクロマトグ
ラフし、分子のＣＡ部分由来のフラグメントを回収し
た。Ｃ−１８逆相カラム[ウォーターズ(Ｗaters)]を用
いた。水中０．１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)(バッフ
ァーＡ)およびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ(バッフ
ァーＢ)により、グラデイエントを行った。開始溶出液
は２０％バッファーＢを含有していた; 試料注入から２
分後に、６０分間に及ぶ２０％Ｂから６０％Ｂへのグラ
デイエントを開始した。流速は１ml／分であった。溶離
像(プロフィール)を２８０nmにおいて監視した。溶離し
た臭化シアン開裂融合タンパク質のクロマトグラムにお
ける種々のピークを集めて後述(実施例４)の細菌活性試
験に付した。
ロマトグラフィー 臭化シアン開裂融合タンパク質をＨＰＬＣでクロマトグ
ラフし、分子のＣＡ部分由来のフラグメントを回収し
た。Ｃ−１８逆相カラム[ウォーターズ(Ｗaters)]を用
いた。水中０．１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)(バッフ
ァーＡ)およびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ(バッフ
ァーＢ)により、グラデイエントを行った。開始溶出液
は２０％バッファーＢを含有していた; 試料注入から２
分後に、６０分間に及ぶ２０％Ｂから６０％Ｂへのグラ
デイエントを開始した。流速は１ml／分であった。溶離
像(プロフィール)を２８０nmにおいて監視した。溶離し
た臭化シアン開裂融合タンパク質のクロマトグラムにお
ける種々のピークを集めて後述(実施例４)の細菌活性試
験に付した。
【０１１０】Ｈ．突然変異セクロピンポリペプチドをコ
ードするpＣＡ３Ａ
ードするpＣＡ３Ａ
【表１】 表１ イー・コリ内でpＣＡ３Ａによって産生されたセクロピン−Ａのアミノ酸組成 突然変異体Ａ アミノ酸 実験値 理論値＊ ＡＳＰ ２．９ ３ Ｔhr ０．１ ０ Ｇlu ２．７ ２ Ｐro ２．４ ２ Ｇly ６．３ ４ Ａla ３．０ ３ Ｖal ３．６ ４ Ｉle ２．９ ４ Ｌeu １．２ １ Ｐhe １．１ １ Ｌys ６．２ ６ Ａrg ２．１ ２ Ｔrp ＮＤ １ Ｓer １．３ １ Ｃys ０ ０ Ｍet ０ ０ Ｔyr ０．１ ０ Ｈis ０．４ ０ Ｎ.Ｄ.＝測定せず。 ＊理論値: 各突然変異体クローンのＤＮＡ配列決定によ
り得た値。 核酸配列およびアミノ酸配列は図７に示されている。
り得た値。 核酸配列およびアミノ酸配列は図７に示されている。
【０１１１】実施例２ 他の突然変異体セクロピンポリペプチドの例示 実施例１、Ｆ−Ｇに記載の如く、プラスミドpＣＡ３Ｂ
の細胞を分画し、ＣＡ配列を検出し、合成ＣＡを精製、
分析した。表２に示したアミノ酸組成および配列データ
ーは、第２のクローンも突然変異体セクロピンをコード
しているＣＡ遺伝子配列を含有していることを示してい
る。
の細胞を分画し、ＣＡ配列を検出し、合成ＣＡを精製、
分析した。表２に示したアミノ酸組成および配列データ
ーは、第２のクローンも突然変異体セクロピンをコード
しているＣＡ遺伝子配列を含有していることを示してい
る。
【表２】
【０１１２】 表２ イー・コリ内でpＣＡ３Ｂによって産生されたセクロピン−Ａのアミノ酸組成 突然変異体Ｂ アミノ酸 実験値 理論値＊ ＡＳＰ ２．３ ２ Ｔhr １．０ １ Ｇlu ４．２ ４ Ｐro １．０ １ Ｇly ４．１ ３ Ａla ５．０ ５ Ｖal ３．６ ４ Ｉle ３．９ ５ Ｌeu １．１ １ Ｐhe ０．９ １ Ｌys ６．６ ７ Ａrg １．０ １ Ｔrp ＮＤ １ Ｓer １．１ １ Ｃys ０ ０ Ｍet ０ ０ Ｔyr ０ ０ Ｈis ０．１ ０ Ｎ.Ｄ.＝測定せず。 ＊理論値: 各突然変異体クローンのＤＮＡ配列決定によ
り得られた値。 核酸配列およびアミノ酸配列は図７に示されている。
り得られた値。 核酸配列およびアミノ酸配列は図７に示されている。
【０１１３】実施例３ 野生型セクロピンＡをコードしているプラスミドpＣＡ
３Ｄの組立て 組立て図は図４および図５に示されている。
３Ｄの組立て 組立て図は図４および図５に示されている。
【０１１４】Ａ．p１９Ｃの組立て １．プラスミドpＩＮＧ１をエンドヌクレアーゼＦok
１、次いでＢamＨＩで完全消化した： 生じた消化をフ
ェノール／クロロホルム(比１:１)抽出によって停止さ
せ、水性残渣をエーテルで洗浄した後、バイオ−ゲル
(Ｂio−ＧelR)ｐ−１０カラムに通してフェノール／ク
ロロホルムを除去した。Ｆok１消化の結果、“ＣＴＡ
Ｃ"５'突出部(オーバーハング)が生じた。この７６塩基
対のＢamＨＩ、Ｆok１フラグメントはaraＢプロモータ
ーを含有している。
１、次いでＢamＨＩで完全消化した： 生じた消化をフ
ェノール／クロロホルム(比１:１)抽出によって停止さ
せ、水性残渣をエーテルで洗浄した後、バイオ−ゲル
(Ｂio−ＧelR)ｐ−１０カラムに通してフェノール／ク
ロロホルムを除去した。Ｆok１消化の結果、“ＣＴＡ
Ｃ"５'突出部(オーバーハング)が生じた。この７６塩基
対のＢamＨＩ、Ｆok１フラグメントはaraＢプロモータ
ーを含有している。
【０１１５】２．Ｎ末端に“ＧＡＴＧ"５'突出部、Ｃ末
端にＡＴＴＴの突出したＥcoＲＩ部位を生成させるため
に、２個のＤＮＡフラグメントＮo．１およびＮo．５を
Ｎo．nn−１およびnn−５(配列は図６に記載)で置き換
える外は実施例１、ステップＢに記載の方法と同様の方
法を用いて新規なＣＡ遺伝子フラグメント(図６参照)を
組立てた。
端にＡＴＴＴの突出したＥcoＲＩ部位を生成させるため
に、２個のＤＮＡフラグメントＮo．１およびＮo．５を
Ｎo．nn−１およびnn−５(配列は図６に記載)で置き換
える外は実施例１、ステップＢに記載の方法と同様の方
法を用いて新規なＣＡ遺伝子フラグメント(図６参照)を
組立てた。
【０１１６】３．pＢＲ３２２をエンドヌクレアーゼＢa
mＨＩおよびＥcoＲＩで完全に消化した。生じた消化を
前記の如くにして停止させた。
mＨＩおよびＥcoＲＩで完全に消化した。生じた消化を
前記の如くにして停止させた。
【０１１７】４．上記ステップ１で得たＢamＨＩ−Ｆok
１フラグメントと、上記ステップ２で得た新規なＣＡ遺
伝子を、pＢＲ３２２の大きい方のＢamＨＩ−ＥcoＲＩ
フラグメントにリゲートさせた。
１フラグメントと、上記ステップ２で得た新規なＣＡ遺
伝子を、pＢＲ３２２の大きい方のＢamＨＩ−ＥcoＲＩ
フラグメントにリゲートさせた。
【０１１８】５．リゲート産物をエンドヌクレアーゼＨ
indＩＩＩで消化し、pＢＲ３２２を担っている形質転換
体の数を減じた。
indＩＩＩで消化し、pＢＲ３２２を担っている形質転換
体の数を減じた。
【０１１９】６．このＨindＩＩＩ処理プラスミドでイ
ー・コリＭＣ１０６１を形質転換した。
ー・コリＭＣ１０６１を形質転換した。
【０１２０】７．ＣＡ遺伝子フラグメントを担っている
プラスミドを含有するコロニーを、合成ＤＮＡフラグメ
ント７(図６)をプローブとして用いるコロニーハイブリ
ダイゼーションにより同定した。１０００個のコロニー
中に、ＣＡフラグメントを含有している３個の独立した
コロニーが見出された。単離した各プラスミドをＢamＨ
ＩおよびＥcoＲＩ消化に付し、正しいフラグメントを放
出し得るプラスミドをp１９Ｃと命名した。サンガーら
(Ｓanger et al．)のジデオキシ鎖末端決定法[ＰＮＡ
Ｓ、７４: ５４６３−６４６７(１９７７)]を幾分改良
した方法[ワラスら(Ｗallace et al．)、ジーン(Ｇen
e)１６: ２１−２６(１９８１)]により、ＣＡ挿入体の
ヌクレオチド配列を分析したp１９ＣはＣＡ遺伝子の正
確な配列を含有していた。ＣＡ遺伝子は、araＢプロモ
ーターの下流側に直結しており、両者の間にはaraＢ暗
号配列が存在していなかった。
プラスミドを含有するコロニーを、合成ＤＮＡフラグメ
ント７(図６)をプローブとして用いるコロニーハイブリ
ダイゼーションにより同定した。１０００個のコロニー
中に、ＣＡフラグメントを含有している３個の独立した
コロニーが見出された。単離した各プラスミドをＢamＨ
ＩおよびＥcoＲＩ消化に付し、正しいフラグメントを放
出し得るプラスミドをp１９Ｃと命名した。サンガーら
(Ｓanger et al．)のジデオキシ鎖末端決定法[ＰＮＡ
Ｓ、７４: ５４６３−６４６７(１９７７)]を幾分改良
した方法[ワラスら(Ｗallace et al．)、ジーン(Ｇen
e)１６: ２１−２６(１９８１)]により、ＣＡ挿入体の
ヌクレオチド配列を分析したp１９ＣはＣＡ遺伝子の正
確な配列を含有していた。ＣＡ遺伝子は、araＢプロモ
ーターの下流側に直結しており、両者の間にはaraＢ暗
号配列が存在していなかった。
【０１２１】Ｂ．pＣＡＯの組立て １．過剰量の制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩおよびＢ
amＨＩにより消化することによってp１９ＣのＢamＨＩ
−ＥcoＲＩフラグメントを切り取った。また、このプラ
スミドをＰvuＩ消化に付し、次のリゲーション工程にお
いて、切り取ったフラグメントがプラスミドとリリゲー
ト(再結合)する機会を減少させた。
amＨＩにより消化することによってp１９ＣのＢamＨＩ
−ＥcoＲＩフラグメントを切り取った。また、このプラ
スミドをＰvuＩ消化に付し、次のリゲーション工程にお
いて、切り取ったフラグメントがプラスミドとリリゲー
ト(再結合)する機会を減少させた。
【０１２２】２．ステップＡ．７で得たＢamＨＩ−Ｅco
ＲＩフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩ
およびＥcoＲＩで予め処理しておいたプラスミドpＩＮ
Ｇにリゲートさせた後、pＩＮＧ１を担っている形質転
換体の数を減少させるために制限エンドヌクレアーゼＳ
maＩで消化した。
ＲＩフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩ
およびＥcoＲＩで予め処理しておいたプラスミドpＩＮ
Ｇにリゲートさせた後、pＩＮＧ１を担っている形質転
換体の数を減少させるために制限エンドヌクレアーゼＳ
maＩで消化した。
【０１２３】３．ＳmaＩ−処理プラスミドをイー・コリ
ＭＣ１０６１に導入(トランスホーム)した。
ＭＣ１０６１に導入(トランスホーム)した。
【０１２４】４．ＣＡ遺伝子フラグメントを担っている
プラスミドを含有するコロニーをプラスミドの特性化に
よって同定した。単離した各プラスミドをＢamＨＩおよ
びＥcoＲＩで消化し、切り取ったフラグメントのサイズ
を調べた。正しいサイズを有するプラスミドをpＣＡＯ
と命名した。ジデオキシ鎖末端決定法によりＣＡ挿入体
のヌクレオチド配列決定を行った。pＣＡＯはＣＡ遺伝
子の正しい配列を含有していた。このpＣＡＯは完全なa
raＢ制御遺伝子を含有しており、ＣＡ遺伝子は、セクロ
ピンＡをaraＢ−ＣＡ融合タンパク質を生成させずに直
接発現する様、araＢプロモーターの後方に直結して存
在していた。
プラスミドを含有するコロニーをプラスミドの特性化に
よって同定した。単離した各プラスミドをＢamＨＩおよ
びＥcoＲＩで消化し、切り取ったフラグメントのサイズ
を調べた。正しいサイズを有するプラスミドをpＣＡＯ
と命名した。ジデオキシ鎖末端決定法によりＣＡ挿入体
のヌクレオチド配列決定を行った。pＣＡＯはＣＡ遺伝
子の正しい配列を含有していた。このpＣＡＯは完全なa
raＢ制御遺伝子を含有しており、ＣＡ遺伝子は、セクロ
ピンＡをaraＢ−ＣＡ融合タンパク質を生成させずに直
接発現する様、araＢプロモーターの後方に直結して存
在していた。
【０１２５】Ｃ．プラスミドpＣＡ３Ａ−−１の組立て この組立ての目的は、１個のＸmn１部位を除くために、
pＣＡ３ＡからＡvaＩ−ＰvuＩＩ領域を欠失させること
にある。この欠失により、イー・コリ細胞内でのプラス
ミドのコピー数を増加させることもできる。
pＣＡ３ＡからＡvaＩ−ＰvuＩＩ領域を欠失させること
にある。この欠失により、イー・コリ細胞内でのプラス
ミドのコピー数を増加させることもできる。
【０１２６】１．pＣＡ３ＡをエンドヌクレアーゼＡva
ＩおよびＰvuＩＩで消化した後、dＮＴＰの存在下、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで充填し、
平滑末端を形成させた。
ＩおよびＰvuＩＩで消化した後、dＮＴＰの存在下、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで充填し、
平滑末端を形成させた。
【０１２７】２．ステップ１で得たプラスミドを再リゲ
ートし、元のpＣＡ３Ａを含む形質転換体の数を減少さ
せるためにＡvaＩとＰvuＩＩで消化した。
ートし、元のpＣＡ３Ａを含む形質転換体の数を減少さ
せるためにＡvaＩとＰvuＩＩで消化した。
【０１２８】３．このＡvaＩ、ＰvuＩＩ処理プラスミド
をイー・コリＭＣ１０６１に導入した。
をイー・コリＭＣ１０６１に導入した。
【０１２９】４．ＡvaＩ−ＰvuＩＩ領域を欠失したプラ
スミドを含有しているコロニーを、合成ＤＮＡフラグメ
ント５'−ＴＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧ−３'をプロ
ーブとして用いるコロニーハイブリダイゼーションによ
って同定した。５０コロニー中に、ＡvaＩ−ＰvuＩＩ欠
失を伴った４６個の独立のコロニーが見出された。単離
した各プラスミドＸmaＩで消化し、切除フラグメントの
サイズを調べた。正しいサイズを有するプラスミドの１
つをpＣＡ３Ａ−−１と命名した。
スミドを含有しているコロニーを、合成ＤＮＡフラグメ
ント５'−ＴＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧ−３'をプロ
ーブとして用いるコロニーハイブリダイゼーションによ
って同定した。５０コロニー中に、ＡvaＩ−ＰvuＩＩ欠
失を伴った４６個の独立のコロニーが見出された。単離
した各プラスミドＸmaＩで消化し、切除フラグメントの
サイズを調べた。正しいサイズを有するプラスミドの１
つをpＣＡ３Ａ−−１と命名した。
【０１３０】Ｄ．プラスミドpＣＡ３Ｄの最終的な組立
て p１９Ｃは野生型セクロピンＡ配列を含有しているが、a
raＢとの融合タンパク質を生成するために、そのＮ末端
における通常の制限部位を欠除されている。
て p１９Ｃは野生型セクロピンＡ配列を含有しているが、a
raＢとの融合タンパク質を生成するために、そのＮ末端
における通常の制限部位を欠除されている。
【０１３１】pＣＡ３Ａは突然変異体araＢ−ＣＡ融合タ
ンパク質を生成させるためにＣＡ遺伝子のＣ末端付近に
存在している２個の塩基対が欠失されている。
ンパク質を生成させるためにＣＡ遺伝子のＣ末端付近に
存在している２個の塩基対が欠失されている。
【０１３２】これらの２個のプラスミドを結合させ、ar
aＢと融合した野生型ＣＡ遺伝子を有するプラスミドを
組立て、araＢ−ＣＡ融合タンパク質を生産する。
aＢと融合した野生型ＣＡ遺伝子を有するプラスミドを
組立て、araＢ−ＣＡ融合タンパク質を生産する。
【０１３３】この組立て模式図を図５に示す。 １．プラスミドp１９Ｃ(1μg)をエンドヌクレアーゼＸm
n１で完全に消化し、６５℃で１０分間加熱することに
より消化を停止させた。
n１で完全に消化し、６５℃で１０分間加熱することに
より消化を停止させた。
【０１３４】２．プラスミドpＣＡ３Ａ−−１(０．１μ
g)をエンドヌクレアーゼＸmn１で完全に消化し、６５℃
で１０分間加熱することにより消化を停止させた。
g)をエンドヌクレアーゼＸmn１で完全に消化し、６５℃
で１０分間加熱することにより消化を停止させた。
【０１３５】３．ステップＤ．１およびＤ．２で得たＤ
ＮＡを混合し、リゲートさせた。
ＮＡを混合し、リゲートさせた。
【０１３６】４．リゲート産物をＰvuＩＩで消化し、p
１９Ｃを担った形質転換体の数を減少させた。
１９Ｃを担った形質転換体の数を減少させた。
【０１３７】５．ＰvuＩＩ−処理プラスミドをイー・コ
リＭＣ１０６１に導入した。
リＭＣ１０６１に導入した。
【０１３８】６．野生型araＢ−ＣＡ遺伝子を担ったプ
ラスミドを含有しており、araＢ−ＣＡ融合タンパク質
を生産し得るコロニーを、前記の如きＤＮＡ配列決定法
により同定した。分析した７個のコロニーの内、野生型
の配列を有する１個のコロニーを得、pＣＡ３Ｄと命名
した。
ラスミドを含有しており、araＢ−ＣＡ融合タンパク質
を生産し得るコロニーを、前記の如きＤＮＡ配列決定法
により同定した。分析した７個のコロニーの内、野生型
の配列を有する１個のコロニーを得、pＣＡ３Ｄと命名
した。
【表３】
【０１３９】 表３ イー・コリ内においてpＣＡ３Ｄにより生産された野生型セクロピン−Ａのアミ ノ酸組成 アミノ酸 実験値 予測値 Ａsp ２．２ ２ Ｔhr １．０ １ Ｇlu ４．１ ４ Ｐro １．１ １ Ｇly ４．４ ４ Ａla ５．２ ５ Ｖal ３．４ ４ Ｉle ４．３ ５ Ｌeu ０．７ １ Ｐhe １．１ １ Ｌys ７．３ ７ Ａrg １．０ １ Ｔrp ＮＤ １ Ｓer ０．３ ０ Ｃys ０ ０ Ｍet ０ ０ Ｔyr ０ ０ Ｈis ０ ０ Ｎ.Ｄ.＝測定せず。 核酸配列およびアミノ酸配列を図７に示す。
【０１４０】実施例４ 殺菌活性の検定 被検生物の生存し得る細胞約１０7を含有するＴＹＥ培
地６mlを用いて寒天平板(直径８cm)を調製した。この平
板に、直径２mmのウエルをパンチ形成した。被検物質を
５０mＭリン酸バッファー(pＨ６．６)に溶かし、各ウエ
ルに３μlづつ適用した。２５℃で一夜インキュベーシ
ョンした後、ウエル周囲の阻止帯またはかさ(halo)の直
径を測定した。かさ形成の標準を求めるために、ＣＡ１
−３３タンパク質を用いた。ウエルにＣＡ１−３３を１
μgおよび３μg入れると、イー・コリ株ＪＦ５６８を注
入した培地上でそれぞれ、直径８mmおよび１１mmのかさ
が生じた。臭化シアン消化pＣＡ３ＡaraＢ−ＣＡ融合タ
ンパク質１０μgおよび３０μgはそれぞれ、直径７mmお
よび１８mmのかさを形成した。
地６mlを用いて寒天平板(直径８cm)を調製した。この平
板に、直径２mmのウエルをパンチ形成した。被検物質を
５０mＭリン酸バッファー(pＨ６．６)に溶かし、各ウエ
ルに３μlづつ適用した。２５℃で一夜インキュベーシ
ョンした後、ウエル周囲の阻止帯またはかさ(halo)の直
径を測定した。かさ形成の標準を求めるために、ＣＡ１
−３３タンパク質を用いた。ウエルにＣＡ１−３３を１
μgおよび３μg入れると、イー・コリ株ＪＦ５６８を注
入した培地上でそれぞれ、直径８mmおよび１１mmのかさ
が生じた。臭化シアン消化pＣＡ３ＡaraＢ−ＣＡ融合タ
ンパク質１０μgおよび３０μgはそれぞれ、直径７mmお
よび１８mmのかさを形成した。
【０１４１】ＨＰＬＣで分画した臭化シアン消化融合タ
ンパク質をもこの検定法に適用した。様々なピークを試
験したところ、１つの特異的なピークが生物活性を示し
た。他の細菌株および酵母株もこの検定法により試験し
た。臭化シアンで消化した、あるいは消化していない融
合タンパク質試料をイー・コリ株ＪＦ５６８の試験にお
いて記載した量で適用し、形成されたかさの直径を測定
した。得られたセクロピン全てに関して得られた結果を
表４に示す。
ンパク質をもこの検定法に適用した。様々なピークを試
験したところ、１つの特異的なピークが生物活性を示し
た。他の細菌株および酵母株もこの検定法により試験し
た。臭化シアンで消化した、あるいは消化していない融
合タンパク質試料をイー・コリ株ＪＦ５６８の試験にお
いて記載した量で適用し、形成されたかさの直径を測定
した。得られたセクロピン全てに関して得られた結果を
表４に示す。
【表４】
【０１４２】 表４ かさ形成作用として測定した、種々の細菌株に対するＣＮＢr消化pＣＡ３Ａ、 pＣＡ３Ｂ、pＣＡ３Ｄ融合タンパク質単離体(５μg)およびアンピシリン(７５０ ng)の生物活性 かさ形成(mm) 細菌株 pCA3A\ pCA3B\ pCA3D* アンピシリン スタフィロコッカス・アウレウス ＮＥ ＮＥ ＮＥ １１.５ (Staphylococcus aureus) ストレプトコッカス・フエカリス ＮＥ ＮＥ ＮＥ ７.０ (Streptococcus faecalis) サルモネラ・デルビイ ５.０ ５.０ ５.０ ６.０ (Salmonella derby) シュードモナスＰＳ−９ ２.０ ２.２５ ２.０ ＮＥ (Pseudomonas PS-9) クレブシーラ・ニューモニエ ４.５ ４.０ ４.５ ＮＥ (Klebsiella pneumoniae) エルウイニア・カロトボーラＥＣ ５.０ ４.５ ４.７５ ６.５ (Erwinia carotovora EC) ストレプトコッカス・ピオゲネス ＮＥ ＮＥ ＮＥ １２.５ (Streptococcus pyogenes) キセノハブダス・ネマトフイラス ３.５ ３.０ ２.７５ １２.５ (Xenohabdus nematophillus) セラチア・マーセッセンス １.０ １.０ １.０ ＮＥ (Serratia marcesens) イー・コリ ５５０６ ５.０ ４.５ ５.０ ４.５ (E.coli 5506) イー・コリ ５５０６ＤＲ ７.０ ７.０ ６.５ ４.５(E.coli 5506DR)
【０１４３】実施例５ セクロピンおよび腫瘍増殖因子の発酵による生産 この実施例では、大腸菌内における、araＢプロモータ
ーのコントロール下でのα−ＴＧＦ(腫瘍増殖因子)およ
びセクロピンの発酵による製造について記載する。イー
・コリ株ＭＣ１０６１はaraＢ−α−ＴＧＦを制御する
プラスミドに支持されたaraＢプロモーター(pＴＧＦ５
８)、あるいは、araＢ−セクロピン融合遺伝子を制御す
るプラスミドに支持されたaraＢプロモーター(pＣＡ３
Ｄ)を含有している。培養を、アンピシリン(０．１g／
l)含有ＴＹＥ培養培地１００ml中、３７℃、２５０rpm
において増殖させた。培養を指数的生長相(約２００Ｋl
ett単位、赤色フィルター)まで増殖させた。次いで培養
を調製したてのＴＹＥ培地９００mlの入った４lの遮断
(バッフル)振盪フラスコに移した。さらに３時間インキ
ュベーションを続けた後、生産培地９lに接種した。生
産培地は表５に記載した成分を含有している。
ーのコントロール下でのα−ＴＧＦ(腫瘍増殖因子)およ
びセクロピンの発酵による製造について記載する。イー
・コリ株ＭＣ１０６１はaraＢ−α−ＴＧＦを制御する
プラスミドに支持されたaraＢプロモーター(pＴＧＦ５
８)、あるいは、araＢ−セクロピン融合遺伝子を制御す
るプラスミドに支持されたaraＢプロモーター(pＣＡ３
Ｄ)を含有している。培養を、アンピシリン(０．１g／
l)含有ＴＹＥ培養培地１００ml中、３７℃、２５０rpm
において増殖させた。培養を指数的生長相(約２００Ｋl
ett単位、赤色フィルター)まで増殖させた。次いで培養
を調製したてのＴＹＥ培地９００mlの入った４lの遮断
(バッフル)振盪フラスコに移した。さらに３時間インキ
ュベーションを続けた後、生産培地９lに接種した。生
産培地は表５に記載した成分を含有している。
【表５】
【０１４４】 表５ 基礎培地 添加物 成分 レベル(g／l) 成分 レベル(g／l) カゼイン加水分解物 ３０ グリセリン １６ 酵母エキス １ ＣaＣl2:２Ｈ2Ｏ ０.０２２ ＫＨ2ＰＯ4 ３ ＭgＳＯ4:７Ｈ2Ｏ ０.２５ Ｎa2ＨＰＯ4 ６ チアミン−ＨＣl ０.０１ ＮaＣl ０.５ アンピシリン ０.１ＮＨ4Ｃl ４
【０１４５】最初、生産用発酵条件を３７℃、８００rp
m、および１vvm(１分間当りの容器容量)にセットした。
増殖時期には溶存酸素が消費されるので、それに応じ
て、最少溶存酸素(Ｄ.Ｏ.)を３０％に維持するために撹
拌速度と通気率を増加した。この培地のpＨは終始、イ
ー・コリの増殖に適したpＨ６．５−６．８に自律調節
されていたので、培地のpＨを酸または塩基で調節する
必要はなかった。生産培地への接種から約４時間後、細
胞密度はＯ.Ｄ.600＝１０となり、この時点でＬ−アラ
ビノース(５０g)を加えてセクロピン融合タンパク質の
合成を誘導した。発現ベクターの安定性をさらに確かな
ものとするために、Ｏ.Ｄ.600＝２０の時点でブロス中
にアンピシリン１gを補給した。
m、および１vvm(１分間当りの容器容量)にセットした。
増殖時期には溶存酸素が消費されるので、それに応じ
て、最少溶存酸素(Ｄ.Ｏ.)を３０％に維持するために撹
拌速度と通気率を増加した。この培地のpＨは終始、イ
ー・コリの増殖に適したpＨ６．５−６．８に自律調節
されていたので、培地のpＨを酸または塩基で調節する
必要はなかった。生産培地への接種から約４時間後、細
胞密度はＯ.Ｄ.600＝１０となり、この時点でＬ−アラ
ビノース(５０g)を加えてセクロピン融合タンパク質の
合成を誘導した。発現ベクターの安定性をさらに確かな
ものとするために、Ｏ.Ｄ.600＝２０の時点でブロス中
にアンピシリン１gを補給した。
【０１４６】α−ＴＧＦおよびセクロピン−araＢ融合
タンパク質は、いずれもイー・コリ細胞の不溶性画分中
にのみ位置していた。顕微鏡的検査により、この不溶性
の封入体は、誘導後１時間後に細胞内に形成され、発酵
の間中安定的に維持されることが分かった。９５％以上
の細胞が、細胞密度が増加し続けるのに伴い、迅速に大
きくなる封入体を少なくとも１個含有していた。細胞塊
の収率は１l当り１３．１g(乾重量)であった。細胞塊の
約３０％が融合タンパク質であった。
タンパク質は、いずれもイー・コリ細胞の不溶性画分中
にのみ位置していた。顕微鏡的検査により、この不溶性
の封入体は、誘導後１時間後に細胞内に形成され、発酵
の間中安定的に維持されることが分かった。９５％以上
の細胞が、細胞密度が増加し続けるのに伴い、迅速に大
きくなる封入体を少なくとも１個含有していた。細胞塊
の収率は１l当り１３．１g(乾重量)であった。細胞塊の
約３０％が融合タンパク質であった。
【０１４７】実施例６ araＢ −hＴＧＦ融合タンパク質の発現がＳ．チフイムリ
ウムaraＢプロモーターの制御下に起こるイー・コリベ
クターの組立てaraＢ プロモーターはaraＣ遺伝子産物により、正の制御
を受ける。Ｌ−アラビノースとaraＣタンパク質との相
互反応によりaraＢプロモーターの発現に必要な活性化
因子(アクティベーター)が生成される。Ｓ．チフイムリ
ウム(Ｓ．typhimurium)araＢおよびaraＣの遺伝子を含
有するプラスミドを用いてaraＢ−hＴＧＦ(ヒト腫瘍増
殖因子α)発現ベクターを組立てた。プラスミドの組立
て方法を図８に示す。最終的なプラスミドphＴＧＦ５は
５４８アミノ酸のタンパク質をコードしているaraＢ−h
ＴＧＦ融合物を含有している。phＴＧＦ５を含有してい
るイー・コリ株ＭＣ１０６１をカゼイン加水分解物
(０．５％)とチアミン(１μg／ml)を補充した最小グリ
セリン(１％)培地中で増殖させた。培地の密度がＡ６０
０＝０．２に達したとき、Ｌ−アラビノースを１％にな
る様に加え、５時間インキュベーションを続けた後、培
養物を収集(収穫)した。全細胞性タンパク質の約１０％
を表わす５５ＫＤalタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って検出された。
ウムaraＢプロモーターの制御下に起こるイー・コリベ
クターの組立てaraＢ プロモーターはaraＣ遺伝子産物により、正の制御
を受ける。Ｌ−アラビノースとaraＣタンパク質との相
互反応によりaraＢプロモーターの発現に必要な活性化
因子(アクティベーター)が生成される。Ｓ．チフイムリ
ウム(Ｓ．typhimurium)araＢおよびaraＣの遺伝子を含
有するプラスミドを用いてaraＢ−hＴＧＦ(ヒト腫瘍増
殖因子α)発現ベクターを組立てた。プラスミドの組立
て方法を図８に示す。最終的なプラスミドphＴＧＦ５は
５４８アミノ酸のタンパク質をコードしているaraＢ−h
ＴＧＦ融合物を含有している。phＴＧＦ５を含有してい
るイー・コリ株ＭＣ１０６１をカゼイン加水分解物
(０．５％)とチアミン(１μg／ml)を補充した最小グリ
セリン(１％)培地中で増殖させた。培地の密度がＡ６０
０＝０．２に達したとき、Ｌ−アラビノースを１％にな
る様に加え、５時間インキュベーションを続けた後、培
養物を収集(収穫)した。全細胞性タンパク質の約１０％
を表わす５５ＫＤalタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って検出された。
【０１４８】実施例７ araＢ −hＴＧＦ遺伝子に付加した転写ターミネーター
３' 転写ターミネーターは、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終
了させるＤＮＡ配列である。araＢ−hＴＧＦ遺伝子の
３'末端に転写ターミネーターを置くことにより、その
転写ターミネーターから下流の所望しない遺伝子産物の
発現が阻止される。図９に示したプラスミド構築法参
照。最終的なプラスミドphＴＧＦ５８は、araＢ−hＴＧ
Ｆ遺伝子の３'−末端に挿入されたイー・コリrrnＢ遺伝
子転写ターミネーターを含んでいる。phＴＧＦ５８また
はphＴＧＦ５(親プラスミド)のいずれかを含んでいるイ
ー・コリＭＣ１０６１株から分離された、部分的に純化
したaraＢ−hＴＧＦタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動した後比較すると、主要な夾雑
タンパク質、ベーターラクタマーゼ、はphＴＧＦ５８−
含有細胞において、有意に減少していた。
３' 転写ターミネーターは、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終
了させるＤＮＡ配列である。araＢ−hＴＧＦ遺伝子の
３'末端に転写ターミネーターを置くことにより、その
転写ターミネーターから下流の所望しない遺伝子産物の
発現が阻止される。図９に示したプラスミド構築法参
照。最終的なプラスミドphＴＧＦ５８は、araＢ−hＴＧ
Ｆ遺伝子の３'−末端に挿入されたイー・コリrrnＢ遺伝
子転写ターミネーターを含んでいる。phＴＧＦ５８また
はphＴＧＦ５(親プラスミド)のいずれかを含んでいるイ
ー・コリＭＣ１０６１株から分離された、部分的に純化
したaraＢ−hＴＧＦタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動した後比較すると、主要な夾雑
タンパク質、ベーターラクタマーゼ、はphＴＧＦ５８−
含有細胞において、有意に減少していた。
【０１４９】実施例８ araＢ プロモーターおよびカルシトニン Ａ．ヒトカルシトニン遺伝子(hＣＴ) カルシトニンまたはチロカルシトニン(ＣＴ)は、甲状腺
から分泌される低カルシウムホルモンにつけられた名称
である。ＣＴは、骨吸収活性を減少させる。ＣＴはま
た、腎臓に作用して尿中カルシウムを増大させ、燐酸を
減少させる。血中カルシウムが高まるとＣＴが急速に放
出されるのは、ＣＴの主目的は、高等動物を急性高カル
シウム症状から保護することにあることを示している。
ＣＴにおける研究は、ペゲット病(Ｐaget's disease)
のコントロール、促進された骨改造の問題、における使
用を調べることである。カルシトニンのヒト遺伝子の配
列は、次の通りである[クレイグ(Ｃraig)ら、ネーチャ
ー(Ｎature)、２９５ ３４５−３４７(１９８２)]。 Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly TGC GGT AAT CTG AGT ACT TGC ATC CTG GGC Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His ACA TAC ACG CAG GAC TTC AAC AAG TTT CAC Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly ACG TTC CCC CAA ACT GCA ATT GGG GTT GGA Ala Pro Gly GCA CCT GGA
から分泌される低カルシウムホルモンにつけられた名称
である。ＣＴは、骨吸収活性を減少させる。ＣＴはま
た、腎臓に作用して尿中カルシウムを増大させ、燐酸を
減少させる。血中カルシウムが高まるとＣＴが急速に放
出されるのは、ＣＴの主目的は、高等動物を急性高カル
シウム症状から保護することにあることを示している。
ＣＴにおける研究は、ペゲット病(Ｐaget's disease)
のコントロール、促進された骨改造の問題、における使
用を調べることである。カルシトニンのヒト遺伝子の配
列は、次の通りである[クレイグ(Ｃraig)ら、ネーチャ
ー(Ｎature)、２９５ ３４５−３４７(１９８２)]。 Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly TGC GGT AAT CTG AGT ACT TGC ATC CTG GGC Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His ACA TAC ACG CAG GAC TTC AAC AAG TTT CAC Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly ACG TTC CCC CAA ACT GCA ATT GGG GTT GGA Ala Pro Gly GCA CCT GGA
【０１５０】Ｂ．誘導領域、araＢ構造遺伝子およびhＣ
Ｔ遺伝子を保持しているプラスミドの構築 図１０にその構築を示したプラスミドp１１５は、正し
いカルシトニン遺伝子配列を含んでいる。このプラスミ
ドを、図１１に示す様に、エンドヌクレアーゼＭstＩお
よびＰstＩで消化し、カルシトニン遺伝子を切り取っ
た。切り取ったフラグメントをaraＢ構造遺伝子を保持
しているプラスミド(プラスミドpＩＮＧ１、図１２参
照)に結合させた。
Ｔ遺伝子を保持しているプラスミドの構築 図１０にその構築を示したプラスミドp１１５は、正し
いカルシトニン遺伝子配列を含んでいる。このプラスミ
ドを、図１１に示す様に、エンドヌクレアーゼＭstＩお
よびＰstＩで消化し、カルシトニン遺伝子を切り取っ
た。切り取ったフラグメントをaraＢ構造遺伝子を保持
しているプラスミド(プラスミドpＩＮＧ１、図１２参
照)に結合させた。
【０１５１】pＩＮＧ１構築の出発物質として、無傷のa
raＣおよびaraＢを含んでいるプラスミドpＭＨ６[ホル
ビッツ(Ｈorwitz)ら、ジーン(Ｇene)、１４、３０９−
３１９(１９８１)]を使用した。構築法を図１２に示し
た。このプラスミドpＭＨ６を制限エンドヌクレアーゼ
ＥcoＲＩおよびＳalＩで消化し(これは、それぞれaraＢ
およびaraＡ遺伝子を切断する)、１．９kbのＳalＩ−Ｅ
coＲＩフラグメントをＭ１３mp９[ビエイラ(Ｖieira)お
よびメッシング(Ｍessing)、ジーン(Ｇene)、１９ ２
５９−２６８(１９８２)]からの１６塩基対のＳalＩ−
ＥcoＲＩフラグメントで置換し、pＩＮＧ１を生成させ
た。araＢ遺伝子のリーディングフレームは、pＩＮＧ１
のＥcoＲＩ部位へlacＺ遺伝子を融合することにより決
定された。ＳmaＩおよびＭstＩ制限エンドヌクレアーゼ
は共に平滑末端フラグメントを生成するので、pＩＮＧ
１の７６０塩基対フラグメントをプラスミド＃１１５か
らのＭstＩ−ＰstＩフラグメントで置き換えてphＣＴ１
を生成させた。プラスミド＃１１５は、ＭstＩ−ＰstＩ
フラグメント内に位置する化学合成されたhＣＴを持っ
ている。ＭstＩおよびＳmaＩ末端の結合でhcＴ遺伝子を
araＢ遺伝に融合し、araＢ−hＣＴタンパク質融合物を
作成した。
raＣおよびaraＢを含んでいるプラスミドpＭＨ６[ホル
ビッツ(Ｈorwitz)ら、ジーン(Ｇene)、１４、３０９−
３１９(１９８１)]を使用した。構築法を図１２に示し
た。このプラスミドpＭＨ６を制限エンドヌクレアーゼ
ＥcoＲＩおよびＳalＩで消化し(これは、それぞれaraＢ
およびaraＡ遺伝子を切断する)、１．９kbのＳalＩ−Ｅ
coＲＩフラグメントをＭ１３mp９[ビエイラ(Ｖieira)お
よびメッシング(Ｍessing)、ジーン(Ｇene)、１９ ２
５９−２６８(１９８２)]からの１６塩基対のＳalＩ−
ＥcoＲＩフラグメントで置換し、pＩＮＧ１を生成させ
た。araＢ遺伝子のリーディングフレームは、pＩＮＧ１
のＥcoＲＩ部位へlacＺ遺伝子を融合することにより決
定された。ＳmaＩおよびＭstＩ制限エンドヌクレアーゼ
は共に平滑末端フラグメントを生成するので、pＩＮＧ
１の７６０塩基対フラグメントをプラスミド＃１１５か
らのＭstＩ−ＰstＩフラグメントで置き換えてphＣＴ１
を生成させた。プラスミド＃１１５は、ＭstＩ−ＰstＩ
フラグメント内に位置する化学合成されたhＣＴを持っ
ている。ＭstＩおよびＳmaＩ末端の結合でhcＴ遺伝子を
araＢ遺伝に融合し、araＢ−hＣＴタンパク質融合物を
作成した。
【０１５２】Ｃ．phＣＴ１を含有するイー・コリ細胞の
増殖 phＣＴ１を含んでいる、形質転換イー・コリ細胞を、振
盪しながら、１０8−１０9／ml密度になるまで、３７℃
で増殖させ、さらに１〜６時間増殖させる間、Ｌ−アラ
ビノース(１％wt／vol)を添加することにより、araＢ−
カルシトニン融合タンパク質の合成を誘導した。収集し
た細胞を超音波処理(５秒、３回)し、araＢ−カルシト
ニンの濃度を、抗−hＣＴ抗体を使ってＥＬＩＳＡ法に
より分析した。
増殖 phＣＴ１を含んでいる、形質転換イー・コリ細胞を、振
盪しながら、１０8−１０9／ml密度になるまで、３７℃
で増殖させ、さらに１〜６時間増殖させる間、Ｌ−アラ
ビノース(１％wt／vol)を添加することにより、araＢ−
カルシトニン融合タンパク質の合成を誘導した。収集し
た細胞を超音波処理(５秒、３回)し、araＢ−カルシト
ニンの濃度を、抗−hＣＴ抗体を使ってＥＬＩＳＡ法に
より分析した。
【０１５３】上記の発明は、理解を助ける目的で例示に
よって詳しく述べたが、請求の範囲によって限定されこ
そすれ、その発明の範囲内においてそれを変換および改
良し得ることは言うまでもない。
よって詳しく述べたが、請求の範囲によって限定されこ
そすれ、その発明の範囲内においてそれを変換および改
良し得ることは言うまでもない。
【図１】 図１は大腸菌内での発現に使用する合成遺伝
子およびセクロピンＡのヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を示す図である。
子およびセクロピンＡのヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を示す図である。
【図２】 図２はプラスミドpＭＨ６およびＭ１３mp９
からのプラスミドpＩＮＧ１の組立てを示し、pＩＮＧ１
はaraＢおよびaraＣ遺伝子の両者を持っている。この図
はまた、プラスミドpＩＮＧ１からのプラスミドpＣＡ１
Ａ、pＣＡ１ＢおよびpＣＡ１'の組立てをも示している
図である。
からのプラスミドpＩＮＧ１の組立てを示し、pＩＮＧ１
はaraＢおよびaraＣ遺伝子の両者を持っている。この図
はまた、プラスミドpＩＮＧ１からのプラスミドpＣＡ１
Ａ、pＣＡ１ＢおよびpＣＡ１'の組立てをも示している
図である。
【図３】 図３はpＭＨ６およびpＣＡ１Ａ、pＣＡ１Ｂ
並びにpＣＡ１'からのプラスミドpＣＡ３'、pＣＡ３
Ａ、pＣＡ３ＢおよびpＣＡ２'並びにpＣＡ２Ａの組立て
を示している図である。pＣＡ１(またはpＣＡ１Ａおよ
び１Ｂ)、pＣＡ２'(またはpＣＡ２Ａ)およびpＣＡ３'
(またはpＣＡ３ＡおよびpＣＡ３Ｂ)間の違いは、セクロ
ピンＡ遺伝子と、ara遺伝子間のＢamＨＩ部位との間の
種々の長さにあり、pＣＡ１'(またはpＣＡ１Ａおよび１
Ｂ)では５００bp、pＣＡ２'(またはpＣＡ２Ａ)では１２
５３bp、およびpＣＡ３'(またはpＣＡ３Ａおよび３Ｂ)
では１５５０bpである。
並びにpＣＡ１'からのプラスミドpＣＡ３'、pＣＡ３
Ａ、pＣＡ３ＢおよびpＣＡ２'並びにpＣＡ２Ａの組立て
を示している図である。pＣＡ１(またはpＣＡ１Ａおよ
び１Ｂ)、pＣＡ２'(またはpＣＡ２Ａ)およびpＣＡ３'
(またはpＣＡ３ＡおよびpＣＡ３Ｂ)間の違いは、セクロ
ピンＡ遺伝子と、ara遺伝子間のＢamＨＩ部位との間の
種々の長さにあり、pＣＡ１'(またはpＣＡ１Ａおよび１
Ｂ)では５００bp、pＣＡ２'(またはpＣＡ２Ａ)では１２
５３bp、およびpＣＡ３'(またはpＣＡ３Ａおよび３Ｂ)
では１５５０bpである。
【図４】 図４はプラスミドp１９Ｃの組立てを示して
いる図である。
いる図である。
【図５】 図５はpＣＡ３ＡからのプラスミドpＣＡ３Ａ
−−１の組立てを示している図である。この図はまた、
pＣＡ３Ａ−−１およびp１９Ｃ(図４)からのプラスミド
pＣＡ３Ｄの組立てをも示している。
−−１の組立てを示している図である。この図はまた、
pＣＡ３Ａ−−１およびp１９Ｃ(図４)からのプラスミド
pＣＡ３Ｄの組立てをも示している。
【図６】 図６はセクロピンＡ、大腸菌内で発現させる
ための第２の化学的に合成された遺伝子のヌクレオチド
配列およびアミノ酸配列を示している。
ための第２の化学的に合成された遺伝子のヌクレオチド
配列およびアミノ酸配列を示している。
【図７】 図７は野生型およびミュータント(突然変異)
セクロピンＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を
示している: ここで、(１)はＣＡ野生型(pＣＡ３Ｄ)、
(２)はＣＡミュータントＡ(pＣＡ３Ａ)であり、(３)は
ＣＡミュータントＢ(pＣＡ３Ｂ)であり、ミューテーショ
ンの位置を示している図である。
セクロピンＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を
示している: ここで、(１)はＣＡ野生型(pＣＡ３Ｄ)、
(２)はＣＡミュータントＡ(pＣＡ３Ａ)であり、(３)は
ＣＡミュータントＢ(pＣＡ３Ｂ)であり、ミューテーショ
ンの位置を示している図である。
【図８】 図８はaraＢ−hＴＧＦ融合体を含有している
プラスミドphＴＧＦ５の組立てを示す図である。
プラスミドphＴＧＦ５の組立てを示す図である。
【図９】 図９はプラスミドpＴＧＦ５８の組立てを示
す図である。
す図である。
【図１０】 図１０はヒトの合成カルシトニン遺伝子を
持っている２つのプラスミドp１１５およびp３１８の組
立てを示している図である。
持っている２つのプラスミドp１１５およびp３１８の組
立てを示している図である。
【図１１】 図１１は融合ポリペプチド、リブロキナー
ゼ−ヒトカルシトニン(hＣＴ)の遺伝子を含んでいるプ
ラスミドpＨＣＴ１の組立てを示す図である。
ゼ−ヒトカルシトニン(hＣＴ)の遺伝子を含んでいるプ
ラスミドpＨＣＴ１の組立てを示す図である。
【図１２】 図１２はカルシトニン−ペプチド遺伝子の
クローニングおよび発現のためのビヒクルとして用いら
れるプラスミドpＩＮＧ１の組立てを示している。pＩＮ
Ｇ１はaraＢおよびaraＣ遺伝子を含んでいる図である。
クローニングおよび発現のためのビヒクルとして用いら
れるプラスミドpＩＮＧ１の組立てを示している。pＩＮ
Ｇ１はaraＢおよびaraＣ遺伝子を含んでいる図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャー−ホウ・リー アメリカ合衆国カリフォルニア90064、ロ スアンジェルス、グレンドン・アベニュー 2840番 (72)発明者 ユン−ロン・リン アメリカ合衆国カリフォルニア90064、ロ スアンジェルス、クラークソン・ロード 11446番 (72)発明者 ダン・レイ アメリカ合衆国カリフォルニア91316、エ ンシノ、リンドリー・アベニュー4610番 (72)発明者 ゲイリー・ウィルコックス アメリカ合衆国カリフォルニア90265、マ リブ、シーホーン・ドライブ3637番 (56)参考文献 特表 昭61−501186（ＪＰ，Ａ)
Claims (6)
- 【請求項１】 生物活性を有するヘテロローガスペプチ
ドを発現する様に形質転換された細菌内で該ペプチドを
生産する方法であって、 a)以下の塩基配列を有するaraＢプロモーターの配列で
あって、該プロモーターは、 （１）酵素、ホルモン、抗体、ヘモグロビン、構造タン
パク質、α、β又はγインターフェロン、インターロイ
キン、インスリン又は組織プラスミノーゲンアクチベー
ターからなる群から選ばれるポリペプチドであるが、タ
ウマチンではない、生物活性を有するポリペプチド、又
は （２）該生物活性を有するポリペプチドと付加的なポリ
ペプチドからなる融合タンパク質であって、両ペプチド
が隣接する位置に選択的開裂部位を有する融合前駆体タ
ンパク質 をコードしている遺伝子であって該プロモーターに対し
てヘテロローガスな遺伝子と機能的に結合しているara
Ｂプロモーターを含有しているポリヌクレオチド分子を
複製可能な発現ビヒクルに挿入し、 b)該ポリヌクレオチド分子を含有している発現ビヒクル
で、該ペプチドを発現し得る細菌を形質転換し、 c)形質転換された細菌を培養条件下で培養し、 d)該培養から該ペプチドを回収することからなる方法。 【化３】 - 【請求項２】 該細菌培養工程が、 a)該細菌にとってヘテロローガスな遺伝子に機能的に結
合しているaraＢプロモーターを含有しており、生物活
性を有するペプチドをコードしているポリヌクレオチド
分子で形質転換した細菌を培養培地中、選択的増殖条件
下、指数的成長期に達するまでインキュベートし、 b)工程a)の培養を新たな培養培地に移し、十分な時間該
培養をインキュベートして更に増殖させ、 c)工程b)の培養を生産培地に接種し、最大細菌増殖を達
成するための発酵条件下、選択された細胞密度を達成す
るに十分な時間該培養をインキュベートし、 d)有意な量の該ヘテロローガスペプチドを該培地中で生
産させるのに有効な量のＬ−アラビノースを添加し、そ
して e)該ヘテロローガスペプチドを回収することからなる請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該発現ビヒクルが、プラスミド又はバク
テリオファージである第１項又は第２項に記載の方法。 - 【請求項４】 該生物活性を有するポリペプチドが、ヒ
トのカルシトニン、ヒト腫瘍成長因子又はセクロピンで
ある第１項ないし第３項の内のいずれか１つに記載の方
法。 - 【請求項５】 該開裂部位が、メチオニン、アスパラギ
ン−グリシン、アスパラギン酸−プロリン、リジン、ア
ルギニン又はリジン−アルギニンである第１項ないし第
４項の内のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項６】 該形質転換された細菌が大腸菌、ネズミ
チフス菌（サルモネラ・チフイムリウム）又は霊菌（セ
ラチア・チフイムリウム）である第１項ないし第５項の
内のいずれか１つに記載の方法。
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