FI94774B - Menetelmiä sekropiinin ja muiden heterologisten polypeptidien tuottamiseksi bakteeri-isännässä araB-promoottoria käyttäen sekä menetelmissä käyttökelpoisia replikoituvia ekspressiovälineitä, geneettisiä muodostelmia ja bakteereja - Google Patents

Description

1 94774

Menetelmiä sekropiinin ja muiden heterologisten polypepti-dien tuottamiseksi bakteeri-isännässä araB-promoottoria käyttäen sekä menetelmissä käyttökelpoisia replikoituvia ekspressiovälineitä, geneettisiä muodostelmia ja bakteere-5 ja

Tekniikan ala Tämä keksintö koskee menetelmiä sekropiinin ja muiden heterologisten polypeptidien tuottamiseksi bakteeri-10 isännässä araB-promoottoria käyttäen sekä menetelmissä käyttökelpoisia replikoituvia ekspressiovälineitä, geneettisiä muodostelmia ja bakteereja. Kuvataan myös bakterisi-distä peptidiä sekropiiniä ja sen analogeja koodittavien geenien suunnittelua, kloonausta ja ekspressoimista.

15 Tausta DNA-molekyylien sisältämä geneettien tieto ekspres-soidaan vaihesarjan avulla, joka käsittää DNA:n transkription lähetti-RNA:ksi (mRNA) ja sitä seuraavan mRNA:n translaation polypeptideiksi tai proteiineiksi. Koodimuo-20 dossa olevan tiedon ekspressio polypeptideiksi aloitetaan promoottorikohdalla, joka on se DNA-molekyylin alue, johon RNA-polymeraasi kiinnittyy ja aloittaa transkription. Yh-distelmä-DNAmenetelmissä heterologisten geenien ekspres-soimisessa käytettyjä promoottoreita ovat beeta-laktamaa-• 25 si-(penisillinaasi-) ja laktoosi- (beeta-galaktosidaasi-) promoottorisysteemit (Chang et ai., Nature 275 (1978) 615, Itakura et ai., Science 198 (1977) 1056, Goeddel et ai., Nature 281 (1979) 544) ja tryptofaani- (trp) promoottori-systeemi (Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 30 4057, EP-hakemusjulkaisu 36776). Muita tunnettuja promoot toreita ovat bakteriofaagi lambda -promoottorit (PJ ja (Pr) i hut. kolisiini E,, galaktoosi, alkaalinen fosfataasi, ksyloosi A ja tae.

araB-qeeni ja sen promoottori (araB) sijaitsevat L-35 arabinoosi-operonissa. Escherichia colin ja Salmonella a - 94774 tvph imuri uitiin L-arabinoosi-operonia (araBAD) on tutkittu. Erityisen mielenkiintoinen on S. tvphimurjumin L-arabinoo-si-operoni; Horwitz, A. et. ai., "DNA Sequence of the araBAD-araC Controlling Region in Salmonella tvphimurium 5 LT2", Gene H (1981) 309-319, Lin, H.-C. et al., The araBAD Operon of Salmonella tvphimurium LT2, I. Nucleotide Sequence of araB and Primary Structure of Its Product, Ribulokinase", Gene 34 (1985) 111-122, II. "Nucleotide

Sequence of araA and Primary Structure of Its Product, L-10 Arabinose Isomerase", Gene 34 (1985) 123-128, III. "Nuc leotide Sequence of araD and Its Flanking Regions, and Primary Structure of Its Product, L-Ribulose-5-Phosphate- 4-Epimerase", Gene 34 (1985) 129-134. araBAD-operoni si sältää kolme rakennegeeniä, jotka ovat vastuussa L-arabi-15 noosin alkuaineenvaihdunnasta. Lee, Jar-How et ai., "Genetic Characterization of Salmonella tvphimurium LT2 ara Mutations", J. of Bacteriology 158 (1984) 344-46. araA- geenin tuote L-arabinoosi-isomeraasi muuttaa ensin L-arab-inoosin L-ribuloosiksi. Sitten araB-geenin tuote, ribulo-20 kinaasi, fosforyloi L-ribuloosin L-ribuloosi-5-fosfaatik-si. araD-geenin tuote, L-ribuloosi-5-fosfaatti-4-epimeraa-si, katalysoi L-ribuloosi-5-fosfaatin muuttamisen D-ksy-loosi-5-fosfaatiksi, joka sitten liittyy mukaan pentoosi-fosfaattireittiin. araBAD-operonia kontrolloivat tasaver-25 taisesti induktori L-arabinoosi ja araC-säätelygeenin tuote .

Koska tässä julkaistun ja patentoitavaksi vaaditun keksinnön eräässä suoritusmuodossa araB-promoottori kytketään toimivasti sekropiiniä koodittavaan geeniin ja liite-30 tään sopivaan isäntään sekropiini-proteiinin ekspressoin-tia varten, kannattaa luoda yleiskatsaus sekropiineja koskeviin taustaviitteisiin.

Cecropia-yöperhosen ja useiden perhosiin kuuluvien hyönteisten immuunisysteemille on ominaista tehokas humo-35 raalinen vaste, joka pääasiassa liittyy sekropiineihin, · - «a t MH r : 3 94774 äskettäin löydettyyn antibakteeristen peptidien perheeseen (Boman, H. G. ja Steiner, H., Current Topics in Microbiology and Immunology 94/95 (1981) 75-91). Kolme pääsekro-piinia, A, B ja D, on puhdistettu immuunista veri-imunes-5 teestä (immune hemolymph) ja niiden sekvenssit on selvitetty (Steiner et al., Nature 292 (1981) 246-248, Qu et al., European Journal of Biochemistry 127 (1982) 219-224, Hultmark, D., sama julkaisu 127 (1982) 207-217, ja Hult-mark, US-patenttijulkaisu 4 355 104). Kaikki sekropiinit 10 ovat pieniä, emäksisiä peptidejä, jotka ovat keskenään hyvin homologisia. Antheraea pernvi'stä (A.p.) ja Hvlopho-ra cecropia/sta (H.c.) peräisin olevien sekropiinien B ja D aminohapposekvenssit ovat seuraavanlaiset: 4 94774 15 ίο

A.p. Sekro- H2N-Lys-Trp-Lys-Ile-Phe-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Val-Gly-Arg-piini B

5 H.c. Sekro- H2N-Lys-Trp-Lys-Val-Phe-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Met-Gly-Arg-piini B

H.c. Sekro- H2N-Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Val-Gly-Gln-piini A

H.c. Sekro- H2N-Trp-Asn-Prp-Phe-Lys-Glu-Leu-Glu-Lys-Val-Gly-Gln-piini D

10 A.p. Sekro- H2N-Trp-Asn-Pro-Phe-Lys-Glu-Leu-Glu-Arg-Ala-Gly-Gln-piini D

15 20 25

A.p. Sekro- Asn-Ile-Arg-Asn-Gly-Ile-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-Ala-Val-Ala-piini B

15 H.c. Sekro- Asn-Ile-Arg-Asn-Gly-Ile-Val-Lys-Ala-Gly-Pro-Ala-Ile-Ala-piini B

H.c. Sekro- Asn-Ile-Arg-Asp-Gly-Ile-lle-Lys-Ala-Gly-Pro-Ala-Val-Ala-piini A

H.c. Sekro- Arg-Val-Arg-Asp-Ala-Val-Ile-Ser-Ala-Gly-Pro-Ala-Val-Ala-piini D

20

A.p. Sekro- Arg-Val-Arg-Asp-Ala-Ile-Ile-Ser-Ala-Gly-Pro-Ala-Val-Ala-piini D

30 35 A.p. Sekro- Val-Leu-Gly-Glu-Ala-tuntematon C-pääte

• piini B

25 H.c. Sekro- Val-Leu-Gly-Glu-Ala-Lys-Ala-Ile-Leu-Ser-CO-R

piini B

H.c. Sekro- Val-Val-Gly-Gln-Ala-Thr-Gln-Ile-Ala-Lys-CO-R

piini A

H.c. Sekro- Thr-Val-Ala-Gln-Ala-Thr-Ala-Leu-Ala-Lys-CO-R

30 piini D

H.c. Sekro- Thr-Val-Ala-Gln-Ala-Thr-Ala-Leu-Ala-Lys-co-R

piini D

,1 *»·* **« i>*»*-* s £4774

Sekropiinit ovat rakenteeltaan samantapaisia kuin mehiläisen myrkyn toksiini, mellitiini, mutta niiden anti-bakteriaalinen spektri on laajempi kuin mellitiinin eivätkä ne hajoita viljeltyjä maksasoluja, lampaan punasoluja 5 eivätkä hyönteissoluja. Kuten yllä olevasta näkyy, kaikkien sekropiinien karboksipää on suojattu ja sekropiini A:n tapauksessa ryhmä on primaarinen amidi (Andreu et ai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 80 (1983) 6475-6479). Sekropiini A ja monet sukulaispeptidit 10 on äskettäin syntetisoitu kiinteä faasi -menetelmiä käyttäen ja niiden on osoitettu olevan täysin erottamattomia luonnon sekropiini A:sta kemiallisia ja fysikaalisia kriteereitä käytettäessä (Andreu et ai., yllä).

Mielenkiintoista oli, ettei karboksipään tetrapep-15 tidi-imidin havaittu olevan tärkeä antibakteeriselle aktiivisuudelle E. colia kohtaan, mutta kolmella muulla testatulla bakteerilla aktiivisuus väheni 3-20 %:iin sekropiini A:n aktiivisuudesta.

Sekropiinit ovat antibakteerisia lukuisille baktee-20 reille, mukaanlukien sekä Gram-negatiivisia että Gramposi-tiivisia bakteereja. Sekropiinien vaikutustapaaa koskevat saatavissa olevat tiedot osoittavat, että ne tuhoavat bakteerien sytoplasman membraaneja (Steiner et ai., Nature 292 (1981) 246-248). Kirjallisuuden perusteella on ilmeis-25 tä, että eri bakteerilajien herkkyydet sekropiineille ovat erilaisia ja että jokaisen sekropiinin aktiivisuusspektri on erilainen. Esimerkiksi Bacillus meqaterium on hyvin herkkä sekropiini A:lie ja sekropiini B:lle, mutta suhteellisen resistentti sekropiini D:lle. Sekä Gram-negatii-30 visten että Gram-positiivisten organismien on osoitettu i olevan herkkiä sekropiineille käytettäessä mikromolaarista pitoisuusaluetta. Organismit, jotka ovat hyvin herkkiä sekropiineille, ovat E. coli. Pseudomonas aeruginosa. Ser-ratia marsescens. Xenorhabdus nematophilus. B. megatherium 35 ja Micrococcus luteus. Vaikka sekropiineissa A ja B esiin- 6 54774 tyykin kaikkiaan 12 aminohapon korvaantumista, niiden aktiivisuudet yhdeksää eri bakteerilajia kohtaan ovat hyvin samanlaiset, mikä viittaa siihen, että monet aminohappo-substituutiot voidaan sietää ilman, että peptidin biologi-5 nen aktiivisuus muuttuu. Samalla tavalla Kiinan silkkikeh-rääjästä (A. pernvi) peräisin oleva sekropiini B eroaa pohjoisamerikkalaisista silkkikehrääjistä (H. cecrogia) peräisin olevasta sekropiini B:stä neljässä asemassa; kolme muutoksista on kuitenkin H. cecropia'n A-muodosta löy-10 tyvien vastaavien aminohappojen korvaantumisia. Neljäs muutos on asemassa, jossa H. cecropia'n A- ja B-muodot eroavat toisistaan ja muutos on säilyttävä eli konservatiivinen. Siten on ilmeistä, että konservatiivisillä ami-nohapposubstituutioilla saadut sekropiinien ainutlaatuiset 15 johdannaiset säilyttäisivät biologisen aktiivisuutensa.

Ei-säilyttävien eli ei-konservatiivisten muutosten, kuten sekropiini D:ssä havaittujen muutosten, voisi odottaa muuttavan peptidin aktiivisuutta. Sekropiini D:n aktiivisuus E. colia kohtaan on lähes yntä suuri kuin sekropii-20 nien A ja B aktiivisuudet, mutta sen aktiivisuus muita kahdeksaa bakteerilajia kohtaan on huomattavasti pienempi.

Sekropiinien ja niiden analogien käytön ja yhdis-telmä-DNA-menetelmien proteiinien tuottamiselle tarjoamien suurten lupausten valossa vaikutti toivottavalta luoda 25 systeemi sekropiinien tuottamiseksi tällaisen teknologian keinoin.

Keksinnön kuvaus

Nyt on havaittu, että araB-promoottoria voidaan käyttää promoottorina yhdistelmä-DNA-molekyyleissä siten, 30 että araB-promoottori kytketään toimivasti biologisesti aktiivista tuotetta koodittavaan heterologiseen geeniin. araB-promoottorin käyttämiseen kontrolloimaan heterologis-ten geenien ilmentymistä liittyy monia etuja. araB-promoottorin kontrollointisysteemi on tiukan säätelyn alai-35 nen. araB-promoottori indusoituu L-arabinoosilla; esimer-

Il i - IM·» Kilit I t i *» .

94774 7 kiksi tuotetut polypeptidit eivät syntetisoidu ennen L-arabinoosin lisäystä viljelyväliaineeseen. Siten, kun L-arabinoosia ei ole läsnä, heterologisten geenien ilmentymistä polypeptidien muodostamiseksi ei tapahdu. L-arabi-5 noosilla indusoitaessa polypeptidi kopioidaan osana lähet-ti-RNA:ta, joka alkaa araB-promoottorikohdasta. Kun promoottori on indusoitu, polypeptidejä tuotetaan nopeasti ja tehokkaasti. Edelleen fermentointiaika on lyhyt verrattuna muihin systeemeihin. Mikä tärkeää, ilmentymisen aste li-10 sääntyy, tämä tarkoittaa, että heterologista polypeptidä tuotetaan huomattavasti enemmän, jolloin se sopii kaupalliseen käyttöön. Lopuksi ekspressoituneet fuusiopolypepti-dit muodostavat isäntäsolujen sisällä jyväsiä (inclusion bodies), jotka ovat hyvin pysyviä lisääntyneestä koosta 15 huolimatta ja ovat hyödyllisiä heterologisen proteiinin puhdistamisen suhteen.

Tämä keksintö koskee siten replikoituvaa ekspres-siovälinettä, jolle on tunnusomaista, että se sisältää polynukleotidisekvenssin, joka voidaan ekspressoida bak-20 teeri-isännässä ja joka sisältää araB-promoottorin sekvenssin, joka on toimivasti kytketty bakteeri-isännälle heterologiseen geeniin, jolloin geeni koodittaa biologisesti aktiivista polypeptidiä, joka ei ole bakteriofagin geenituote. Keksintö koskee myös replikoituvalla ekspres-25 siovälineellä transformoituja bakteereja ja menetelmää biologisesti aktiivisen, heterologisen peptidin tuottamiseksi bakteerissa, joka on transformoitu ekspressoimaan mainittu peptidi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että 30 (a) lisätään polynukleotidimolekyyli, joka sisältää • araB-promoottorin, joka on toimivasti kytketty mainittua biologisesti aktiivista peptidiä, joka ei ole bakteriofagin geenituote, koodittavaan heterologiseen geeniin, rep-likoituvaan ekspressiovälineeseen, β 94774 (b) transformoidaan peptidin ekspressointiin kykenevä bakteeri ekspressiovälineellä, joka sisältää mainitun polynuk1eotidimo1ekyy1in, (c) viljellään transformoitua bakteeria viljely- 5 olosuhteissa, ja (d) otetaan talteen mainitut peptidit viljelmästä.

Tämä keksintö koskee myös menetelmää ja menetelmäs sä käytettäviä välineitä sekropiinipeptidien ja niiden analogien tuottamiseksi yhdistelmä-DNA-menetelmien avulla.

10 Sekropiinit ekspressoidaan käyttäen aikaisemmin mainittua araB-promoottoria.

Erityisesti keksintö antaa käyttöön siten geenisekvenssit, jotka koodittavat peptidejä, joilla on sekropii-nin kaltainen bakteereja tappava aktiivisuus. Nämä geeni-15 sekvenssit, jotka voidaan tuottaa yksin tai osana pitempiä sekvenssejä, jotka sisältävät sekropiinipeptidin yhdessä muiden peptidien tai aminohappotähteiden kanssa, suunnitellaan ideaalisesti tietokoneroenetelmillä, jotta optimoitaisiin se, että ekspressioisäntänä käytetty E. coli hy-20 väksyisi ne.

Erityisesti keksintö koskee siten geneettistä muodostelmaa, joka ekspressoituu sekropiinille herkässä isännässä, ja jolle on tunnusomaista, että se sisältää sekro-piiniä koodittavan geneettisen sekvenssin, joka on toimi-25 vasti kytketty araB-promoottoriin.

Toisessa suoritusmuodossa keksintö koskee geneettistä muodostelmaa, joka ekspressoituu sekropiinille herkässä isännässä ja joka edellä mainitun lisäksi sisältää geneettisen sekvenssin, joka koodittaa polypeptidiä, joka 30 pystyy estämään saadun fuusioproteiinin bakteereja tappa van vaikutuksen muuten sekropiinille herkässä bakteerissa, ja joka sekvenssi on toimivasti kytketty sekropiiniä koo-dittavaan geneettiseen sekvenssiin.

Keksintö koskee myös replikaatioon ja ekspressioon 35 kykeneviä välineitä, jotka sisältävät edellä mainitut ge- il i Uitiin lii i a • » 9 . 94774 neettiset muodostelmat, mainituilla välineillä transformoituja bakteeri-isäntiä samoin kuin menetelmiä sekropii-nien tuottamiseksi edellä mainittuja välineitä, muodostelmia ja isäntiä käyttäen. Keksinnön mukaiselle menetelmälle 5 sekropiinin tuottamiseksi mikrobiologisia menetelmiä käyt täen on tunnusomaista, että toimivasti kytketään araB-promoottori, sekropiiniä koodittava ensimmäinen geneettinen sekvenssi ja toinen geneettinen sekvenssi, joka koodittaa eri polypeptidiä, fuu-10 sioidun geenimuodostelman muodostamiseksi, transformoidaan fuusioitu geenimuodostelma sekro-piinille herkkään bakteeri-isäntään, viljellään transformoitua bakteeri-isäntää, jolloin tuotetaan proteiinikonjugaatti, joka ei ole myrkyllinen 15 bakteeri-isännälle, ja tämän jälkeen otetaan talteen sekropiini proteiinikon jugaatista .

Edelleen keksintö koskee sekropiinin ja polypepti-din muodostamia fuusioproteiineja, joille on tunnusomais-20 ta, että ne sisältävät ensimmäisen sekropiiniä koodittavan segmentin ja toisen eri polypeptidiä koodittavan segmentin siten, että fuusioproteiinista oleellisesti puuttuvat sekropiinin bakteereja tappavat ominaisuudet.

Edullisesti sekropiiniä koodittavat geneettiset 25 sekvenssit suunnitellaan tietokonemenetelmien avulla, jot ta voidaan optimoida niiden hyväksyttävyys käytettäessä E. colia ekspressioisäntänä. Suunnittelun optimointi suoritetaan myös sekvenssin sisäisen komplementaarisuuden minimoimiseksi, restriktioendonukleaasikohtien välttämiseksi 30 tai luomiseksi sekvenssissä tai sen ulkopuolella ja siten insertion helpottamiseksi ja komplementaarisuuden haluttujen ekspressiovälineiden kanssa minimoimiseksi. Optimoitaessa polynukleotidimolekyyli tällä tavalla keksintö antaa käyttöön synteettisiä sekvenssejä, jotka useimmissa 35 tapauksissa ovat rakenteellisesti erilaisia kuin sekropii- 10 94774 nilähteinä käytettyjen lukuisten lajien luonnollisten geenien sekvenssit.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää sekropiini A:n aminohappo- ja nuk-5 leotidisekvenssit ja JE. colissa ekspressointiin käytetyn synteettisen geenin.

Kuvio 2 esittää plasmidi pING l:n muodostamisen plasmidi pMH6:sta ja M13mp9:stä. pING 1 sisältää sekä araB:n että araC:n geenit. Kuvio esittää myös plasmidien 10 pCAlA, pCAlB ja pCAl' muodostamisen plasmidi pINGlrstä (araB:n ja araCrn geenien lähteenä).

Kuvio 3 esittää plasmidien pCA3', pCA3A, pCA3B ja pCA2' ja pCA2A muodostamisen pMH6:sta ja pCAlA:sta, pCAlB:stä ja pCAl':sta. Erot pCAl:n (tai pCAlA:n ja lB:n), 15 pCA2':n (tai pCA2A:n) ja pCA3':n (tai pCA3A:n ja pCA3B:n) välillä ovat sekropiini A -geenin ja molempien ara-geenien välisen BamHI-kohdan välin vaihtelevassa pituudessa ja tämä väli on 500 emäsparia pCAl':ssa (tai pCAlArssa ja lB:ssä), 1253 emäsparia pCA2':ssa (tap pCA2A:ssa) ja 1550 20 emäsparia pCA3':ssa (tai pCA3A:ssa ja 3B:ssä).

Kuvio 4 esittää plasmidin pl9C muodostamisen.

Kuvio 5 esittää plasmidin pCA3A- -1 muodostamisen pCA3A:sta. Kuvio esittää myös plasmidi pCA3D:n muodostamisen pCA3A- -l:stä ja pl9C:stä (kuvio 4).

25 Kuvio 6 esittää sekropiini A:n, toisen £. colissa ekspressointia varten kemiallisesti syntetisoidun geenin, aminohappo- ja nukleotidisekvenssit.

Kuvio 7 esittää villityyppisen sekropiini A:n ja mutantti-sekropiini A:n aminohappo- ja nukleotidisekvens-30 sit, jossa (1) nimeää villityyppistä CA:ta (pCA3D), (2) nimeää mutantti A -CA:ta (pCA3A), ja (3) nimeää mutantti B -CA:ta (pCA3B), kohdat nimeävät mutaatiokohdan.

Kuvio 8 esittää araB-hTGF-fuusion sisältävän plas-35 midin phTGF5 muodostamisen.

ia ·« t anti i t t m < 11 94774

Kuvio 9 esittää plasmidin pTGF58 muodostamisen.

Kuvio 10 esittää kahden ihmisen synteettisen kaisi-toniinigeenin sisältävän plasmidin, pll5:n ja p318:n, muodostamisen.

5 Kuvio 11 esittää fuusioidun polypeptidin, ribuloki- naasi-ihmisen kalsitoniini (hCT), geenin sisältävän plasmidin pHCTl muodostamisen.

Kuvio 12 esittää kalsitoniini-peptidi-geenien kloonauksessa ja ekspressiossa välineenä käytetyn plasmidin 10 pINGl muodostamisen; pINGl kantaa araB-ja araC-geenejä.

Määritelmät

Seuraavassa kuvauksessa käytetään lukuisia yhdistelmä DNA-teknologiassa erittäin paljon käytettyjä termejä. Jotta näitä termejä käyttäen annettavat selitys ja 15 vaatimukset, mukaanlukien keksinnön piiri, voidaan ymmärtää selvemmin ja johdonmukaisesti, annetaan käyttöön seu-raavat määritelmät.

Operoni. Geeni, joka sisältää polypeptidin ekspres-soimiseen tarvittavan rakennegeenin (tarvittavat rakenne-20 geenit), ja tätä ekspressiota säätelevän kontrollialueen.

Operaattori. DNA-sekvenssi, joka pystyy olemaan vuorovaikutuksessa spesifisen repressorin kanssa kontrolloiden siten viereis(t)en geeni(e)n toimintaa.

Promoottori. Säätelyalueella oleva DNA-sekvenssi, • 25 johon RNA-polymeraasi sitoutuu ja aloittaa viereis(t)en geeni(e)n kopioinnin.

Aktivaattori. Proteiini, joka tarvitaan RNA-polyme-raasin suorittaman RNA-synteesin aloittamiseen.

Initiaattori. DNA-sekvenssi, jonka kanssa aktivaat-30 tori on vuorovaikutuksessa viereisten geenien kontrolloimiseksi.

Polvnukleotidimolekvvli. Lineaarinen, vuorottele-vien sokeri- ja fosfaattitähteiden muodostaman rungon toisiinsa kytkevien nukleotidien sekvenssi, joka tässä käy-35 tettynä voi sisältää DNA- ja RNA-polymeerit.

12 - 94774

Rakenneaeeni. DNA-sekvenssi, joka templaattinsa eli lähetti-RNAsnsa kautta koodittaa tietylle peptidille ominaista aminohapposekvenssiä.

Heteroloainen geeni. Vieras geeni, tämä tarkoittaa, 5 että geeni on peräisin luovuttajasta, joka on erilainen kuin isäntä tai että geeni on kemiallisesti syntetisoitu geeni ja voi sisältää erilajisen luovuttajan kuin isäntä. Geeni koodittaa polypeptidejä, joita ekspressiovälineen avulla suoritettavalle transformoinnille altis organismi 10 ei tavallisesti tuota.

Biologisesti aktiivinen. Tässä käytettynä termi tarkoittaa kykyä tai prosessia saada aikaan biologisessa systeemissä esiintyvä, tarkoitettu vaikutus.

Toimivasti kytketty. Tässä käytettynä termi tar-15 koittaa, että promoottori kontrolloi heterologisen geenin koodittaman polypeptidin ekspression aloittamista.

Ilmentyminen fekspressio). Ilmentyminen on prosessi, jolla rakennegeeni tuottaa polypeptidin. Se käsittää geenin transkription lähetti-RNArksi (mRNA) ja tämän 20 mRNA:n translaation polypeptid(e)iksi.

Kloonausväline. Plasmidi- tai faagi-DNA-sekvenssit tai muut DNA-sekvenssit, jotka pystyvät monistumaan isän-täsolussa ja joille on ominaista yksi tai muutama endonuk-leaasin tunnistuskohta, jossa nämä DNA-sekvenssit voidaan 25 katkaista määrätyllä tavalla ilman, että DNA:n itsenäinen biologinen funktio häviää, ja joka sisältää fenotyyppisen valikoimismarkkerin, jota voidaan käyttää transformoitujen solujen identifioinnissa. Markkerit ovat esimerkiksi tet-rasykliiniresistenssi tai ampisilliiniresistenssi. Kloo- 30 nausvälineestä käytetään joskus sanaa "vektori".

Ilmentymisen kontrollointisekvenssi. Nukleotidisek-venssi, joka kontrolloi tai säätelee rakennegeenien ilmentymistä, kun se on toimivasti kytketty näihin geeneihin. Niitä ovat lac-svsteemi. trp-systeemi. lambda-faagin tär-35 keimmät operaattori- ja promoottorialueet, fd-vaippapro- 13 94774 teiinin Jcontrollointialue ja muut sekvenssit, joiden tiedetään kontrolloivan tumattomien tai tumallisten solujen geenien ilmentymistä.

Ekspressioväline. Samantapainen väline kuin kloo-5 nausväline, mutta joka pystyy ekspressoimaan tietyn raken-negeenin isännässä tavallisesti tiettyjen säätelysekvens-seiden kontrolloinnin alaisena.

Isäntä. Mikä tahansa organismi, joka ottaa vastaan replikoitavan ekspressiovälineen, mukaanlukien bakteerit 10 ja hiiva.

Sekropiini. Tällä termillä, jota käytetään kaikkialla selityksessä ja vaatimuksissa, tarkoitetaan mistä tahansa hyönteislajista peräisin olevaa polypeptidiä, jolla on bakteereita tappava vaikutus alalla tällaisen vaiku-15 tuksen mittaamiseen hyväksyttävässä in vivo - tai in vitro -systeemissä.

Termi sekropiini sisältää myös tässä keksinnössä käytettynä minkä tahansa luonnossa esiintyvän sekropiinin analogin, homologin, mutantin, isomeerin tai johdannaisen, 20 jolla on bakteereja tappava vaikutus sopivassa systeemis sä. Termi sisältää myös fragmentit, jotka sisältävät vähemmän aminohappoja kuin luonnossa esiintyvä aminohappojen luku, kuten luonnollisten sekropiinien tai niiden analogien osafragmentit. Termiä käytetään myös mistä tahansa 25 tuotteesta, joka sisältää luonnossa esiintyvän sekropiinin tai sen analogin sekvenssin yhdessä yhden tai useamman reunustavan, edullisesti karboksipäässä olevan aminohapon kanssa, ja jolla on sekropiininkaltaista bakteereja tappavaa vaikutusta. Termillä tarkoitetaan myös sekropiineja, 30 jotka sisältävät vähemmän aminohappoja kuin luonnossa esiintyvä aminohappojen luku, mutta joilla kuitenkin on bakteereja tappava vaikutus.

Homologia-aste, joka saattaa sekropiinin tämän määritelmän piiriin, vaihtelee riippuen niistä sekropiinin 35 alueista, joista bakteereja tappava vaikutus johtuu; bak- 14 94774 teereja tappavan vaikutuksen kannalta elintärkeillä alueilla esiintyy korkea-asteista homologiaa, jotta ne sisältyisivät määritelmään, kun taas sekvenssit, jotka eivät ota osaa bakterisidisen konformaation ylläpitoon 5 eivätkä vaikuta reseptorin sitomiseen, saattavat sisältää suhteellisen vähän homologiaa. Lisäksi elintärkeät alueet voivat olla bakterisidisesti aktiivisia ja silti olla tässä määritellyllä tavalla homologisia, jos substituutiossa käytetään funktionaalisesti samantapaisia sivuketjuja si-10 sältäviä tähteitä. "Funktionaalisesti samantapaiset" viittaa sivuketjujen dominoiviin ominaisuuksiin, kuten emäksisyyteen, neutraalisuuteen tai happamuuteen tai steerisen massan läsnätai poissaoloon. Yleisesti sekropiiniksi määritelty peptidi sisältää alueita, jotka ovat oleellisesti 15 homologisia tämän julkaisun kohdassa "Tausta" esitettyjen sekropiinien alueiden kanssa. Aminoterminaalisella alueella vaaditaan vähemmän homologiaa kuin karboksiterminaali-sella alueella.

"Bakteereja tappavalla (bakterisidisella) vaikutuk-20 sella" tarkoitetaan aikaisemmin määriteltyä vaikutusta, joka voi olla joko suurempi tai pienempi kuin luonnossa esiintyvien sekropiinilajien vaikutus. Mukaan luetaan erityisesti sekropiinipeptidit, joiden bakteereja tappava vaikutus vaihtelee noin 1 %:sta luonnossa esiintyvien la-25 jien vaikutuksesta bakteereja tappaviin vaikutuksiin, jotka voivat olla oleellisesti suurempia (esim. 10-kertaisia, 100-kertaisia tai suurempia) kuin luonnossa esiintyvien sekropiinien vaikutukset.

Parhaat tavat keksinnön suorittamiseksi 30 1. araB-promoottori ‘ Tämä keksintö antaa käyttöön polynukleotidiraolekyy- lin, joka voidaan ekspressoida annetussa isännässä ja joka sisältää mainitulle isännälle heterologiseen geeniin toimivasti kytketyn araB-promoott ori sekvenssin. Heterologinen 35 geeni koodittaa biologisesti aktiivista polypeptidiä (ak- • (I I IH-l f li< f I * #t 1 15 94774 tiivisia polypeptidejä). Keksintö antaa käyttöön myös araB-promoottoriin liittyvät muodostelmat. araB-promootto-ri on indusoituva promoottori, tämä tarkoittaa, että hete-rologisen geenin ilmentyminen muodostamaan kooditettu po-5 lypeptidi aloitetaan eli indusoidaan lisäämällä L-arabi-noosia. L-arabinoosi on vuorovaikutuksessa aktivaattorin, araC-geenin tuotteen, kanssa araB:n ilmentymisen säätelemiseksi. Tämä on positiivinen kontrollointisysteemi vastakohtana negatiiviselle kontrollointisysteemille, esimer-10 kiksi lac-, trp-. lambda PL- ja tac-promoottorisysteemeil-le. Ilman L-arabinoosilisäystä heterologista polypeptidiä ei ekspressoida eikä syntetisoida. Kun promoottori on indusoitu, biologisesti aktiivinen polypeptidituote (aktiiviset polypeptidituotteet) tuotetaan nopeasti ja tehok-15 kaasti. Tämä polypeptidituote/nämä polypeptidituotteet muodostavat jyväsiä isäntäsoluissa. Jyväset kasvavat nopeasti solutiheyden lisääntyessä. Jyväset ovat hyvin pysyviä isäntäsoluissa. Tämä luonteenomainen piirre johtaa toistettavaan, korkeaan saantoon ja tekee fermentoinnin 20 monitoroinnin helpoksi. Käynnissä olevan fermentointiajon pysäyttämisestä voidaan tehdä tarkka päätös, joka yksinkertaisesti perustuu jyvästen kokoon ja kyllästyneeseen kasvuun.

S. tvphimurjumin araB-promoottorin nukleotidisek-25 venssi on seuraava: • 1 16 94774 +30 +20 +10 +1 -10 • · · · ·

5'-CAATTGCCATCGTCTTACTCCATCCAGAAAAACAGGTATGGAGAAACAGTA

5 -20 -30 -40 -50 -60 • · · · ·

GAGAGTCGCGGCAAAAACCGTCAGGCAGGATCCGCTAATCTTATGGACAAAAAT

-70 -80 -90 -100 -110 -120 10 .

GCTAATGCTTTGCAAAGTGTGACGCTGTGCAAATATTCAATGTGGACATTCCAG

-130 -140 -150 -160 -170 • « · « ♦

15 CCATAGTTATAGACACTTCTGTTACTTAATTTTATCGCCTGAACTGTACGCTTT

-180 -190 -200 -210 -220 -230 « # · · · «

TGTTACAAAGCGCTTTTCACAAGCGGGGTTGATACGTGCTTTCATCAAGCTGCAA

20 -240 -250 -260 -270 -280 • · · · · AGTCTTGCGGAGACGGAAGCTCTGTCGTCCTGGTCGATATGGACAATTTGTTT -290 -300 -310 25 ...

CTTCTCTGAACATCGGGGGGTAGAGAAATC-3' araB-promoottori osana araB-geeniä sijaitsee L-ara-binoosioperonissa. L-arabinoosioperoni (araBAD) on eris-30 tetty E. colista ja S. tvphimurjumista. Tämän keksinnön käytännön suoritus ei kuitenkaan rajoitu näihin kahteen araB-promoottorilähteeseen. Muita lähteitä voivat olla mikä tahansa organismi, joka sisältää L-arabinoosioperonia koodittavia geenejä. Tällaisia araB-promoottorilähteitä 35 voivat olla suvut Pseudomonas. Citrobacter. Xanthomonas ja Erwinia.

17 94774

Lisäksi araB-promoottori voi pikemminkin olla syntetisoitu, esimerkiksi laboratoriossa geeniteknisesti saatu, kuin luonnosta peräisin oleva. Toisin sanoen käsite sisältää keinotekoisesti muodostetun tai jopa keinotekoi-5 sesti hajoitetun tuotteen. Siten vaikka tietty, luonnossa esiintyvän araB-promoottorin täydellinen sekvenssi saattaakin esiintyä tietyn organismilajin genomiseen DNA:hän integroituna, organismin genomisesta DNA:sta erotettu araB-promoottoria vastaava, eristetty sekvenssi, olivatpa 10 pääpolypeptideitä vastaavat viereiset sekvenssit, aloitus- tai lopetussignaalit mukana tai eivät, ei ole luonnossa esiintyvä, vaan sitä voitaisiin pitää "synteettisenä”. Lisäksi geneettisen koodin degeneraation huomioon ottaen aminohapposekvenssin tietäminen ei välttämättä eikä pe-15 ruuttamattomasti johda sitä koodittavaan, luonnossa esiintyvään geneettiseen sekvenssiin.

Minkä tahansa synteettisen sekvenssin optimointi sisältää neljä tai useampia mahdollisia vaiheita ja sitä voidaan soveltaa araB-promoottorin synteesiin samoin kuin 20 peptidisekvenssien, mukaanlukien heterologiset polypepti- dit synteesiin. Ensiksi luodaan mille tahansa annetulle, halutulle sekvenssille luettelo jokaiselle tällaisessa sekvenssissä olevalle aminohapolle mahdollisista DNA-kodo-neista, asettaen nämä kodonit järjestykseen sen mukaises-25 ti, kuinka usein niitä käytetään bakteereissa tai hiivassa. Kodonien alkujärjestely saattaisi perustua Bennetzen' in ja Hall'in artikkeliin, Journal of Biological Chemistry 257 (1982) 3026-3031 (hiiva) tai W. Fiers'n artikkeliin,

Nature 260 (1976) 500, (bakteerit), jotka on liitetty tä-30 hän viitteeksi. Näissä artikkeleissa käytettyjen menetelmien lisäksi suositellaan myös sekvenssin lisäerittelyä.

Toinen minkä tahansa tietyn kodonin valintaan vaikuttava tekijä on sellaisten restriktioentsyymikohtien läsnä-tai poissaolo, joita voitaisiin käyttää geenin kloonauk-35 sessa siten, että näiden entsyymien käyttö kloonauksen

• I

18 94774 aikana helpottuisi. Tämän tekijän optimoinnissa verrataan tunnettuja endonukleaasikohtien sekvenssejä (jotka sisältävät neljästä kuuteen nukleotidia kohtaa kohti) primaariseen "isännän suosimaan" sekvenssiin. Luettelo restriktio-5 endonukleaasikohdista voidaan löytää esimerkiksi artikkelista Roberts, R. J., Nucleic Acid Research .11 (1983) 1, rl35-rl37.

Kolmas tiettyjen kodonien valintaan vaikuttava tekijä on tarve minimoida syntetisoitujen DNA-fragmenttien 10 sisäinen sekundaarinen rakenne, jotta estetään niiden itsensä kokoonpuristuminen ja inhiboidaan viereisiin DNA-fragmentteihin liittymisreaktiot. Tämä tekijä sisältää tietyn suunnittelusekvenssin etsimisen, jotta vältetään sen segmenttien sopimaton komplementaarisuus keskenään, 15 jolloin vierekkäiset segmentit säästyvät tarkoitetussa geenissä. Komplementaarisuuden etsiminen (tämä tarkoittaa, sen välttäminen) voidaan suorittaa suunnitellun geenisekvenssin ja ehdotettujen replikaatiovälineiden, kuten plas-midien tai faagien, välillä.

20 Neljäs optimointiin liittyvä tekijä on sellaisten sekvenssien välttäminen, jotka sisältävät runsaasti AT-emäspareja (noin 5 tai enemmän), erityisesti silloin, kun niitä edeltää sekvenssi, jossa on runsaasti GC-emäspareja, jotta vältetään kopioinnin ennenaikainen lopetus.

25 Viides kodonien valintaan vaikuttava tekijä on RN- aasi-kohtien välttäminen, jotta tieto on pysyvää.

Viimeiseksi, jos olisi mahdollista käyttää kumpaa tahansa kahdesta mahdollisesta kodonista, on edullista käyttää sitä, joka maksimoi ilmentymisen mikrobisissa ge-30 nomeissa (katso esimerkiksi Fiers et ai., Nature 260 • (1976) 500; Grosjean et ai., Gene (1982) 199-209, ja

Riggs, US-patenttijulkaisu 4 366 246, sarake 6, jotka kaikki on liitetty tähän viitteeksi).

Edullisimmin optimoinnissa käytetään tarpeellisten 35 vertailujen tekemiseen suunniteltua tietokoneohjelmaa op- .. timoimaan ilmentyminen bakteeri-isännissä.

is 54774 Tämän keksinnön eräässä suoritusmuodossa indusoitava araB-promoottori kytketään toimivasti biologisesti aktiivista polypeptidiä koodittavaan geneettiseen sekvenssiin ja saatu geneettinen muodostelma viedään ekspressio-5 välineeseen tai se muodostaa osan siitä. Sitten ekspres-siovälinettä käytetään transformoimaan sopiva isäntä. Isäntää fermentoidaan valikoiduissa viljelyolosuhteissa optimikasvun aikaansaamiseksi. araB-promoottori ei ole aktiivinen, ennenkuin sitä käsitellään L-arabinoosilla, 10 joka indusoi promoottorin aloittamaan heterologisen geenin ekspressoinnin. Toimintojen järjestys sisältää geenin transkription mRNA:ksi ja tämän translaation polypeptidi-tuotteeksi (-tuotteiksi).

Tämän keksinnön mukaisessa toisessa suoritusmuodos-15 sa araB-promoottori kytketään toimivasti biologisesti aktiivista, heterologista polypeptidiä koodittavaan geneettiseen sekvenssiin ja tämä geneettinen sekvenssi kytketään toimivasti toiseen toista polypeptidiä koodittavaan geneettiseen sekvenssiin. Ilmentyminen tuottaa fuusio- tai 20 esiasteproteiinin, joka sisältää sekä toisen polypeptidin aminohapposekvenssin että halutun heterologisen polypeptidin aminohapposekvenssin sekä selektiivisen pilkkoutumis-kohdan halutun aminohapposekvenssin vieressä.

Pilkkoutumiskohta on edullisesti metioniini, vaikka 25 kohta voi olla mikä tahansa alalla tunnettu edullinen kohta. Halutun heterologisen polypeptidin ei edullisesti tulisi sisältää sisäisiä pilkkoutumiskohtia, jotka vastaavat todella valittua pilkkoutumiskohtaa. Muita tunnettuja pilkkoutumiskohtia ovat Asn-Gly, Asp-Pro, Lys, Arg ja Lys-3 0 Arg.

* Fuusio- tai esiasteproteiinin selektiivinen pilkkominen tehdään tyypillisesti ekspressiovälineen replikoivan ympäristön ulkpuolella. Tässä translaation jälkeisessä vaiheessa fuusio- tai esiasteproteiini katkaistaan selek- 35 tiivisella käsittelyllä. Esimerkiksi kun metioniini on • 20 94774 pilkkoutumiskohta, fuusio- tai esiasteproteiinia käsitellään syanogeenibromidilla halutun heterologisen polypepti-sin irrottamiseksi. Muita tunnettuja pilkkoutumiskohtia käytettäessä leikkauskäsittely sisältää hydroksyyliamii-5 nin, hapon, trypsiinin ja Lys-Arg-sidoksen pilkkovan entsyymin.

Menetelmät fuusioitujen, toimivasti kytkettyjen geenien valmistamiseksi ja niiden ekspressoimiseksi bakteereissa, ovat tunnettuja ja ne esitetään esimerkiksi US-10 patenttijulkaisussa 4 366 246, joka on liitetty tähän viitteeksi.

Tässä kysymyksessä olevia geneettisiä muodostelmia ja menetelmiä voidaan käyttää heterologisten polypeptidien ekspressoimisessa bakteeri-isännissä.

15 Esimerkiksi E. coli K12 kanta 294 (ATCC 31446) ja kanta MC1061 (ATCC 39450) ovat erityisen käyttökelpoisia. Muita mikrobikantoja, joita voidaan käyttää, niihin rajoittumatta siihen, on JS. coli X1776 (ATCC 31537) . Yllämainittuja kantoja samoin kuin E. coli W3110 -kantaa [F , 20 lambda , prototrofinen (ATCC 27325)], ja muita Enterobac-teriaceaeheimoon kuuluvia bakteereja, kuten S. typhimurium tai Serratia marcescens. sekä lukuisia Pseudomonas-lajeja voidaan käyttää.

Yleensä näiden isäntien yhteydessä käytetään plas-25 midivektoreita, jotka sisältävät isäntäsolun kanssa yhteensopivasta lajista peräisin olevat replikoni- ja kont-rollisekvenssit. Tavallisesti vektori kantaa replikaatio-kohdan samoin kuin spesifiset geenit, joiden avulla transformoitujen solujen fenotyypin mukainen valikointi voidaan 30 suorittaa. Esimerkiksi £. coli transformoidaan tyypillisesti käyttäen pBR322:ta, 12. coli -lajeista peräisin olevaa plasmidia (Bolivar et ai., Gene 2 (1977) 95). pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasykliini-resistenssigeenit ja antaa siten käyttöön helpon keinon transformoitujen 35 solujen identifioimiseksi. pBR322-plasropidin tai muiden 21 54774 mikrobeista peräisin olevien plasmidien tulee sisältää myös tai ne tulee modifioida sisältämään promoottori, jota mikrobi-isäntä voi käyttää omien proteiiniensa ekspressoi-miseen.

5 araB-promoottori voidaan toimivasti kytkeä mitä tahansa biologisesti aktiivista, heterologista polypepti-diä tai proteiinia koodittavaan geneettiseen sekvenssiin. Esimerkkejä näistä polypeptideistä tai proteiineista ovat, niihin rajoittumatta, entsyymit, hormonit, hemoglobiini, 10 vasta-aineet, rakenneproteiinit, alfa-, beeta- ja gamma-interferonit, interleukiinit, insuliini ja kudosplasmino-geenin aktivaattorit. Spesifisiä esimerkkejä ovat ihmisen kasvainten kasvutekijä, kalsitoniini ja sekropiini.

Transformoitua isäntää voidaan fermentoida ja vil-15 jellä alalla tunnettuja menetelmiä käyttäen optimaalisen solukasvun aikaansaamiseksi. Alla kuvattua tämän keksinnön mukaista edullista fermentointi- ja tuotantomenetelmää voidaan käyttää heterologisten polypeptidien laajan mittakaavan tuotannon aikaansaamiseksi. Lisäksi käyttämällä he-20 terologiseen geeniin toimivasti kytkettyä araB-promootto-ria lisääntyy heterologisen geenin ilmentymisen aste.

Edullinen fermentointimenetelroä on seuraavanlainen: Transformoitu isäntä, edullisemmin E. coli. viedään vilje-lyväliaineeseen, joka sisältää bakteerin kasvuvaatimukset • 2 5 täyttävät ravintoaineet. Tällaisia aineita voivat olla hiili- ja typpilähteet, mineraalit, aminohapot, puriinit, pyri-midiinit ja vitamiinit. Edullinen villyväliaine sisältää myös riittävän määrän metaboliittia fenotyyppimarkkerire-sistenssille tällaisen metaboliitin ollessa esimerkiksi 30 tetrasykliini tai ampisilliini. Isäntää kasvatetaan viljelyolosuhteissa, jotka on valittu maksimikasvunopeuden saavuttamiseksi. Lämpötilaolosuhteet riippuvat isännästä, mutta tyypillisesti optimialue on välillä noin 30 °C - 40° C lämpötilan 37 °C ollessa edullisin transformoidulle E.

35 colille. Myös happea viedään väliaineeseen. Isännän anne- 22 9 4 7 7 4 taan kasvaa myöhäis-eksponentiaaliseen vaiheeseen asti, jonka jälkeen se siirretään tuoreeseen väliaineeseen.

Sitten isännät siirrostetaan tuotantoviljelyväli-aineeseen. Tämän vaiheen aikana bakteerit jakautuvat ja 5 kasvavat edelleen, kunnes bakteerit saavuttavat pitoisuuden, kyllästystiheyden, jossa bakteerit eivät enää jakaudu, mutta jossa ne vielä ovat eläviä. Kyllästystiheyden saavuttamiseen kuluva aika riippuu väliaineesta, isännän genotyypistä, lämpötilasta ja ilmastuksen asteesta.

10 Aluksi tuotantovaiheen fermentointi- ja viljelyolo suhteet ovat samoja kuin yllä viljelyvaiheelle annetut olosuhteet paitsi, että koska liuennutta happea kuluu kasvun aikana, sekoitus- ja ilmastusnopeutta lisätään sen mukaisesti liuenneen hapen (D. O.) minimipitoisuuden pitämi-15 seksi 30 %:ssa. Edullinen pH-alue on välillä noin 6-8. Yllä kuvatun tuotantoväliaineen pH säätyy jatkuvasti itsestään pH:hon 6,5 - 6,8, mikä on E. colin kasvulle optimi. Siten väliaineen pH:n happo- ja emäskontrollointi on tarpeetonta E. coli -isäntää käytettäessä; muita isäntiä 20 käytettäessä saattaa kuitenkin olla tarpeen säätää väliaineen pH:ta. Kun optimaalinen solutiheys on saavutettu; E. colille optimaalisesti OD^10 lisätään L-arabinoosia sellainen määrä, joka riittää indusoimaan heterologisen geenin synteesin polypeptidin muodostamiseksi. Kuten yllä on ku-' 25 vattu, polypeptidi muodostaa jyväsiä isännän sisään. Sit ten peptidi otetaan talteen alalla tunnettuja keinoja, kuten suodattamista tai saostamista, käyttäen. Jos saatu, ekspressoitu heterologinen peptidi on fuusioproteiini, se otetaan talteen, jonka jälkeen sitä voidaan translaation 30 jälkeisessä vaiheessa käsitellä halutun heterologisen polypeptidin eristämiseksi. Sitten heterologinen polypeptidi voidaan ottaa talteen ja puhdistaa tunnettuja keinoja käyttäen.

Mukavuussyistä kuvataan araB-promoottorin käyttö 35 keksinnön mukaisten sekropiinin käsittävien lukuisten suo- • · !« ta tilli lii H i 23 9 4 7 7 4 ritusmuotojen yhteydessä, vaikka tulee ymmärtää, että a^aB-promoottori voidaan toimivasti kytkeä mitä tahansa biologisesti aktiivista polypeptidä tai proteiinia koodattavaan geneettiseen sekvenssiin.

5 2. Menetelmät sekropiinien tuottamiseksi mikrobio logisesti sekropiinille herkkiä isäntiä käyttäen Tämän keksinnön eräs osa antaa käyttöön menetelmät sekropiinien tuottamiseksi mikrobiologisesti käyttäen sekropiinille herkkiä isäntiä. Keksinnön yksi käsite on sek-10 ropiinia koodittavan geenisekvenssin ekspressio samalla, kun samanaikaisesti vältetään tuotteen bakteereja tappavat vaikutukset tai viivästytetään niitä.

Eräässä suoritusmuodossa sekropiiniä koodittava geneettinen sekvenssi kytketään indusoitavaan araB-promoot-15 toriin ja saatu geneettinen muodostelma viedään ekspres-siovälineeseen. Sitten ekspressiovälinettä käytetään sopivan isännän transformoimiseen ja isäntää fermentoidaan normaaleissa olosuhteissa, joissa promoottori ei ole aktiivinen. Sopivan aikavälin kuluttua kuten esimerkiksi 20 sinä aikana kun solut ovat stationaarisessa vaiheessa, promoottori indusoidaan muuttamalla ulkonaista ympäristötekijää, kuten suolapitoisuutta, valoa, metaboliitin, metallin tai vastaavan läsnä- tai poissaoloa, tämän muutoksen johtaessa sekropiinin geneettisen sekvenssin trans-25 kriptioon mRNA:ksi ja sitten sen translaatioon bakteereja tappavaksi sekropiiniksi. Vaikka saatu sekropiini on bak-terisidinen ja tuhoaa bakteeri-isännän, tällaista tuhoutumista ei tapahdu kuin vasta myöhäisessä käymissyklin vaiheessa.

30 Toisessa edullisessa suoritusmuodossa on keksitty, • että jos sekropiiniä koodittava geneettinen sekvenssi kyt ketään toimivasti muuhun polypeptidiin kuin mainittuun sekropiiniin siten, että ilmentyminen johtaa sekä sekropiinin aminohapposekvenssin että toisen polypeptidin ami-35 nohapposekvenssin sisältävään fuusio- tai esiasteproteii- 24 94774 niin, joka sisältää selektiivisen pilkkoutumiskohdan halutun sekropiinin aminohapposekvenssin vieressä, saatu fuu-sioproteiini ei ole bakterisidinen. Bakterisidisesti aktiivinen sekropiini voidaan sitten eristää translaation 5 jälkeisellä selektiivisellä pilkkomisella.

Useimmiten pilkkominen tehdään ekspressiovälineen replikoituvan ympäristön ulkopuolella, kuten esimerkiksi mikrobiviljelmän talteenkorjäämisen jälkeen, siten toinen polypeptidi vie sekropiiniltä sen bakteereja tappavan vai-10 kutuksen, kunnes solun ulkopuolinen pilkkominen tehdään, josta syystä isäntä pysyy elossa niin kauan, että saadaan suuria määriä haluttua tuotetta. Edullisesti sekropiinista puuttuvat sisäiset pilkkoutumiskohdat, jotka vastaavat ylimääräisen polypeptidin poistamiseksi käytettyä selek-15 tiivistä pilkkoutumiskohtaa, vaikka tämä ei välttämättä olekaan absoluuttinen ehto. Koska sekropiinit eivät sisällä metioniinia, pilkkominen syanogeenibromidilla sekropii-nisekvenssin viereisen metioniinin kohdalla on tehokas.

Edullisesti ylimääräistä polypeptidiä koodattava 20 geneettinen sekvenssi kopioidaan ennen sekropiinin raken-negeeniä, mutta näin ei välttämättä tarvitse tehdä, sillä ylimääräinen polypeptidi voidaan myös ekspressoida sekropiinin C-terminaalisen pään viereiseen asemaan.

Ylimääräisen viereisen polypeptidin luonne ei ole 25 kriittinen. Se voisi olla joko osa tunnetusta rakenteellisesta, entsymaattisesta tai hormonaalisesta proteiinista tai muista fysiologisesti asianmukaisista proteiineista, kokonainen tällainen proteiini tai sen toistuva yksikkö. Vaihtoehtoisesti se voisi olla ei-toiminnallinen polypep-30 tidi. Sitoutumatta mihinkään erityiseen teoriaan keksijät spekuloivat, että fuusioproteiinin lisääntynyt pituus jotenkin "naamioi" sekropiinin bakteereja tappavat ominaisuudet, mikä johtuu kokonaispolypeptidin muuttuvasta kon-formaatiosta. Edullisesti viereistä ylimääräistä polypep-35 tidiä koodittavan geneettisen sekvenssin tulisi pituudel- 94774 25 taan olla vähintään suurempi kuin noin 300 emäsparia, edullisesti välillä noin 400 - 5000 emäsparia, edullisimmin välillä 400 - 2000 emäsparia. Tämä vastaa ylimääräistä polypeptidiä, joka sisältää noin 100 - 1700 aminohappotäh-5 dettä.

Mikä tahansa suuresta joukosta ylimääräisiä polypeptide jä voidaan fuusioida haluttuun sekropiinipeptidin sekvenssiin. Polypeptidigeenisekvenssi voidaan valmistaa joko orgaanisen synteesin avulla, jossa tapauksessa suo-10 siteltaisiin optimointimenetelmiä, tai voitaisiin valmistaa sellaisilla menetelmillä kuin sopivan mRNArn käänteis-kopiointi. Polypeptidin geenisekvenssin entsymaattinen kytkentä rakenteellisen sekropiinipeptidin geenisekvenssiin voisi sitten seurata cDNA:n valmistusta. Entsymaatti-15 nen kytkentä voidaan tehdä joko tylppäligaatiolla (blunt ligation) tai kohesiivisten päiden muodostamisella, mikä käsittää toisen restriktioendonukleaasin tunnistuskohdan kahdesta säikeestä. Esimerkkejä ylimääräisistä polypepti-deistä ovat beeta-galaktosidaasi tai ribulokinaasi (araB-20 geenin koodittamia). Entsyymit ja rakenneproteiinit ovat edullisia. Muita tuotteita, joita voidaan käyttää, ovat seuraavien geenien koodittamat tuotteet: aceA tai aceB. araA. araB, araC, araD, argG, aroB. IacA, serA, purA. trpA. trpB. trpC. trpD. trpE. tvrA ja vastaavat. Ylimää-25 räinen polypeptidi on tavallisesti glykosyloitumaton.

Vaikka tämä keksintö johtaakin menetelmiin sekro-piinien tuottamiseksi sekropiinille herkissä bakteeri-isännissä, tässä valmistettuja geneettisiä muodostelmia ja kyseessä olevia menetelmiä voidaan käyttää myös sekropii-30 nin ekspressioon muissa, sekropiinille ei-herkissä isännissä. Näitä sekropiinille ei-herkkiä isäntiä voivat olla hiivat tai imettäväissoluviljelmät. Käyttökelpoiset hiiva-ja imettäväisisännät ja -vektorit ovat alan asinatuntijoiden hyvin tuntemia, ja viitataan esimerkiksi EP-patentti-35 julkaisuun 93 619, joka on julkaistu marraskuun 9. päivä- -· · 26 94774 nä, 1983. Bakteeri-isäntiä voivat olla yllä araB-promoot-torin yhteydessä mainitut bakteerit samoin kuin sellaiset bakteeri-isännät kuten heimot Pseudomonas. Citrobacter. Xanthomonas ja Erwinia. Mikä tahansa plasmidivektori, joka 5 on sopiva näiden isäntien kanssa, kuten yllä on kuvattu araB-promoottorin yhteydessä, voidaan käyttää.

Sekropiinisekvenssin ilmentyminen voidaan viedä myös toisten regulonien, jotka voivat olla "homologisia" transformoimattomassa muodossaan olevalle organismille, 10 alaiseen kontrolliin. Esimerkiksi £. colin kromosomaalinen DNA sisältää laktoosi- eli lac-operonin. joka välittää laktoosin hajottamista beeta-galaktosidaasi-entsyymiä muokkaamalla. Lac-kontrollielementit voidaan saada bakte-riofaagista lambda plac5, joka infektoi E. colin.

15 Faagin lac-operoni voidaan saada siirtämällä se sa masta bakteerilajista. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi sopivat regulonit voivat olla peräisin organismin luonnollisesta plasmidi-DNA:sta. lac-promoottori-operaattorisysteemi voidaan indusoida IPTG:llä.

20 Tässä keksinnössä on erityisenä tarkoituksena antaa käyttöön sekropiinipeptidejä koodittavat synteettiset po-lynukleotidisekvenssit. Tämän keksinnön mukaisessa edullisessa suoritusmuodossa sekropiinipeptidin synteettinen sekvenssi (joko viereisten sekvenssien kanssa tai ilman 25 niitä) optimoidaan siten, että sen ilmentyminen sopii lukuisille isännille. Erityisen tärkeää on minkä tahansa annetun sekvenssin ilmentymisen £. colissa optimointi. Siten, kun nämä optimointitoimenpiteet on suoritettu yllä osoitetulla tavalla, sekropiinipeptidien todellinen ge-30 neettinen sekvenssi, joko viereisten sekvenssien kanssa tai ilman niitä, tavallisesti eroaa alkuperäisissä lajeissa luonnossa esiintyvästä sekvenssistä.

Lisäksi fuusiotuotteen halutun geenin suunnittelun tulisi edullisesti sisältää ködonit pilkkoutumiskohdassa 35 oleville aminohapoille, kuten metioniinille (joka voidaan 1 ψ· > - Ukit UH I M ** 27 '94774 katkaista syanogeenibromidilla), tryptofäänille (joka voidaan katkaista o-jodosobentsoehapolla), glutamiinihapolle (joka voidaan katkaista Staph.-proteaasilla) ja vastaaville.

5 Keksinnön eräässä suoritusmuodossa fuusiotuotteen halutussa DNA-sekvenssissä oleva mikä tahansa annettu ko-doni voidaan mutagenisoida haluttaessa pistemutaatio. Siten on mahdollista halutun DNA-sekvenssin synteesin jälkeen viedä sekvenssiin pilkkoutuva kohta. Paikkamutaatio 10 on tunnettu, ja viitataan artikkeliin Wallace et ai., Science 209 (1980) 1396-1400, joka on liitetty tähän viitteeksi .

Sekropiinipeptidin potentiaalisesta C-terminaalista tähdettä seuraavaa aminohappotähdettä tai -tähteitä voi 15 seurata vielä toinen polypeptidi ("perässä seuraava" poly-peptidi), jonka pituus vaihtelee ja joka voi olla rakenteeltaan samanlainen tai erilainen kuin edeltävä polypeptidi, jos sellainen on läsnä, kuten yllä on kuvattu. Tällaisessa tapauksessa on sopivaa antaa käyttöön samanlaiset 20 tai erilaiset selektiiviset pilkkoutumiskohdat C-terminaa-lisen aminohappotähden ja perässä seuraavan polypeptidi-sekvenssin välille. Nämä pilkkoutumiskohdat voivat olla tai eivät ole samoja kuin johtavan polypeptidin ja sekropiinipeptidin rakennegeenin väliset pilkkoutumiskohdat.

25 Toisin sanoen ylimääräinen polypeptidi voi esiintyä joko edeltävänä peptidinä, perässä seuraavana polypeptidi-nä tai molempina.

Kun halutun sekropiinipeptidin rakennegeeni on liitettävä ekspressiovälineeseen sellaisenaan, geeniä tulisi 30 edeltää "aloitus"kodoni, ja jos sitä seuraavat perässä seuraavat sekvenssit, yksi tai useampia terminaatio- eli lopetuskodoneita. Kun ekspressiotuote on fuusioproteiini, joka sisältää sekä sekropiinipeptidin että osan polypepti-diä tai sen kokonaan, aloituskodoni voidaan sijoittaa en-35 nen polypeptidin, jos se on johtava, N-päätä.

'94774

Menetelmät polynukleotidien synteeseille ovat alan asiantuntijan hyvin tuntemia. Viitataan esimerkiksi Itaku-ra et al.'n triesterimenetelmään, Journal of American Chemical Society 97 (1975) 3727.

5 Keksinnön mukaisilla menetelmillä tuotettuja sekro- piinejä voidaan käyttää tiettyihin sovellutuksiin kohdistuvina laajakirjoisina antimikrobisina aineina. Tällaisia sovellutuksia ovat esimerkiksi sekropiinien käyttö säilöntäaineina prosessoiduissa lihatuotteissa (kohdeorganismit: 10 (1) Clostridium bolulinium. (2) Lactobacilli. (3) Micro cocci) , hammasmätää estävänä aineena suuhygieniatuotteissa (kohdeorganismit Streptococcus mutans) , emättimen hiivain-fektioiden hoidossa käyttökelpoiset aineet (kohdeorganis-mi: Candida albicans) ja antibakterisina aineina deodoran-15 teissä (kohdeorganismit: (1) Micrococci. (2) Diphtheroi- dit). Sekropiinin kaltaisten peptidien suhteellisen tehokkuuden ylläkuvatuissa sovellutuksissa voi alan asiantuntija helposti arvioida määrittämällä minkä tahansa organismin herkkyyden jollekin sekropiinipeptidille. Samaa in 20 vitro käytettyä bakteeriseulontaa voidaan käyttää annosten ja pitoisuuksien määrittämiseen.

Nyt kun tämä keksintö on yleisesti kuvattu, se voidaan ymmärtää paremmin käyttämällä viitteenä seuraavia esimerkkejä, joiden tarkoituksena on valaista keksintöä 25 sitä rajoittamatta, ellei toisin ole määritelty.

Menetelmät

Aminohappokoostumukset

Sekropiinipolypeptidien hydrolyysi suoritettiin käyttämällä 5,5 rool/1 HClta (Pierce) 110°C:ssa 24 tunnin 3 0 ajan vakuumissa. Näytteet kuivattiin vakuumissa 40°C:ssa ja suspendoitiin uudelleen 200 /iltaan Beckman Model 6300 -näytepuskuria (matalan pHtn omaava sitraatti).

Aminohappoanalyysi suoritettiin käyttäen Beckman Model 6300 -analysaattoria. Pylvään jälkeen käytettiin 35 ninhydriiniä aminohappojen toteamiseen. Tiedot talletet- 29 94774 tiin käyttäen Hewlet Packard (HP) -integraattoria Malli 3390. Yksittäiset piikit talletettiin aallonpituuksilla 540 ja 440 nm saatujen signaalien summana. Kaikki aminohapot sisältäviä Beckmanvakioita käytettiin integraattorin 5 kalibroimiseen ja kaskelotin myoglobiinia (Applied Biosys-tems) käytettiin kalibroinnin varmistamiseen.

Proteiinin sekvenssointi

Applied Biosystems Model 470A -proteiinisekvenaat-toria käytettiin kaikissa proteiinisekvenssimäärityksissä.

10 Sekvensointimenetelmien selitykset seuraavat Hunkapiller-Hood -ohjelmaa. Systeemi käyttää ei-vakuumi -ohjelmaa, jossa pilkkominen tapahtuu metanolisen HCl:n avulla.

PTH-määritykset PTH-määritykset suoritettiin käyttäen HP malli 15 1090A -HPLC:tä HP malli 3390A -integraattorin kanssa tie tojen esittämiseksi. IBM-syanopropyyli -pylvästä käytettiin PTHaminohappojen erotukseen. Puskuri oli 30 mmol/1 NaHAc-puskuri, pH 5,1, joka sisälsi 5 % tetrahydrofuraa-nia. Virtausnopeus oli 1 ml/min ja lämpötila 37 °C.

20 Näytteet liuotettiin vakuumissa kuivauksen jälkeen 30 Ml:ssa 33 % asetonitriiliä vedessä 30 min. ajan. Käytetyt PTH-vakiot olivat Pierce Chemical Co. -yhtiöstä.

Esimerkki 1

Synteettisen sekropiini A (CA) -geenin synteesi ja 25 kloonaus A. CA-geenin synteesi CA:ta koodittava geeni suunniteltiin tietokoneella sellaisten kodonien yhdistämiseksi, joita normaalisti esiintyy runsaasti ekspressoiduissa E. colin proteiineis-30 sa. Geenin loppuun yhdistettiin 4 emäsparin ulokkeet Sall-ja EcoRI-kohtien. vastaavasti, liittämisen sallimiseksi. Erikokoisten fuusioproteiinien muodostamisen helpottamiseksi BamHI-kohta otettiin mukaan Sali-kohdan jälkeen. Käyttäen tietokoneohjelmaa otettiin myös aikaisemmin kuva-35 tut optimointitoimenpiteet huomioon. Geeni jaettiin kah- - 94774 30 deksaan oligonukleotidiin, joiden emäspituus vaihteli välillä 23 37 emästä (kuvio 1).

Syntetisoitiin kahdeksan yksisäikeistä DNA-fragmenttia Ito et ai.'n, Nucleic Acids Research 8 (1982) 5 5491, kuvaaman kiinteä faasi -fosfotriesterimenetelmän mukaisesti.

Tehtiin useita modifikaatioita ja parannuksia mukaanlukien seuraavat: (1) Kytkentäreaktio suoritettiin 37 °C:ssa 40 mi- 10 nuutin ajan varovasti ravistellen.

(2) DNA:n suojauksen poistamiseksi viimeisen kyt-kentäreaktion jälkeen DNA-hartsin (10 mg) annettiin reagoida 0,5 mol/1 2-pyridiinialdoksi-imitetrametyyliguani-diiniliuoksen (2 ml) pyridiini-vesiseoksessa (8:2, v/v) 15 kanssa 60 tunnin ajan 37 °C:ssa ravistellen. Yhdistetty liuos haihdutettiin kuiviin ja jäännös käsiteltiin NH40H-:11a (28 %, 3 ml) suljetussa ampullissa 60 °C:ssa 36 tunnin ajan. Ammoniakin haihdutuksen jälkeen liuos uutettiin eetterillä kolmesti, jonka jälkeen se haihdutettiin. DNA:n 20 puhdistamiseksi jäännös liuotettiin 0,1 ml:aan 50 mmol/1 trietyyliammoniumbikarbonaattiin, pH 7,5, (TEAB) ja laitettiin Sephadex G-50 -pylvääseen (1 x 50 cm). Yhden ml:n fraktiot kerättiin. Muutamat ensimmäiset fraktiot tärkeimmän 260 nm:ssä absorboivan piikin etureunassa sisälsivät 25 halutun tuotteen. Nämä fraktiot haihdutettiin, jonka jälkeen ne puhdistettiin edelleen korkeapainenestekromatogra- Φ fisesti (HPLC). HPLC-puhdistus suoritettiin Bondapak C18 -pylväällä (Waters) 55oC:ssa käyttäen lineaarista asetoni-triiligradienttia (10 - 40 %) 10 mmol/1 trietyyliammonium-30 asetaattipuskurissa (pH 7,8). DMT-ryhmä hydrolysoitiin käsittelemällä 80 %:lla etikkahapolla (0,1 ml) 25 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jota seurasi haihdutus ja sitten kuiviinhaihdutus 0,1 ml:n vettä kanssa etikkahapon poistamiseksi täydellisesti. 1 • «

i-il.t iLlli 1,1 t II J

3i 94774 B. CA-geenin kokoaminen yhdistämällä Kemiallisesti syntetisoitujen fragmenttien 1-8 5'0H-päät fosforyloitiin erikseen 10 fil:ssa liuosta, joka sisälsi: 5 70 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,6) 10 mmol/1 MgCl2 5 mmol/1 ditiotreitolia 66 μιηοΐ/ΐ gamma-32P-ATP (1 μΟΐ) 400 ng DNA:ta ja 2 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia 10 Reaktioseosta pidettiin 25 °C:ssa 15 minuutin ajan, jonka jälkeen lisättiin 1 ml 10 mmol/1 leimaamatonta ATP:-tä reaktion jatkamiseksi vielä 15 min. ajan. Puhtauden tarkistamiseksi 10 % fosforyloidusta DNArsta analysoitiin normaalilla menetelmällä käyttäen polyakryyliamidigeeli-15 elektroforeesia (polyakryyliamidipitoisuus 15 %) 7 mol/1 urean läsnäollessa.

400 ng:aa fosforyloituja DNA-fragmentteja 2, 3, 4, 5, 6 ja 7 kuumennettiin 95 °C:ssa viiden minuutin ajan T4-polynukleotidikinaasin inaktivoimiseksi. Sitten 400 ng 20 fosforyloimattomia fragmentteja 1 ja 8 lisättiin ja seosta kuumennettiin 95 °C:ssa vielä viisi minuuttia, jonka jälkeen se jäähdytettiin hitaasti 25 °C:seen (1 °C 10 minuutissa) . Kahdeksan DNA-fragmenttia liitettiin toisiinsa 100 μ1:η kokonaistilavuudessa 66 mmol/1 Tris-HCl:n (pH 7,5), 25 6,6 mmol/1 MgCl2:n, 10 mmol/1 ditiotreitolin, 0,4 mmol/1 ATP:n ja 2 yksikön T4-DNA-ligaasia läsnäollessa kahden tunnin ajan 25 °C:ssa.

C. Plasmidien pING 1, pCAlA, pCAlB ja pCAl' muodostaminen . 30 Muodostamiskaavio on esitetty kuviossa 2.

pMH6 kuvataan artikkelissa Horwitz, A. H. et ai.,

Gene 14 (1981) 309-319, ja M13mp9 on kaupallisesti saatavilla.

1. Kohdasta B, edellä, saadut CA-geenifragmentit 35 liitettiin plasmidiin pING 1, joka oli esikäsitelty rest- 32 94774 riktioendonukleaasi Sali:llä ja EcoRI:llä. jonka jälkeen tuote hajotettiin restriktioendonukleaasi Smal:llä pING l:tä kantavien transformanttien vähentämiseksi.

2. Smal:llä käsitelty plasmidi transformoitiin 5 E. coli MC1061 -bakteeriin.

3. Pesäkkeet, jotka sisälsivät CA-geenifragmenttia kantavia plasmideja, identifioitiin pesäkehybridisaatiolla käyttäen synteettistä DNA-fragmenttia 7 (kuvio 1) koettimena. 1000 pesäkkeestä löytyi kolme itsenäistä kloonia, 10 jotka sisälsivät CA-fragmentin. Jokainen eristetyistä plasmideista hajotettiin Sali:llä ja EcoRI:llä poistetun fragmentin koon tarkistamiseksi. CA-insertin nukleotidi-sekvenssin analyysi suoritettiin Sanger et ai.'n, PNAS 74. (1977) 5463 - 5467, dideoksi-ketjunpäättämismenetelmällä, 15 vähäisin muutoksin [Wallace et ai., Gene 1£ (1981) 21-26]. Määritettiin kaksi sekvenssiä ja ne on esitetty kuviossa 7(2) ja kuviossa 7(3). Plasmidit, jotka sisälsivät nämä sekvenssit, nimettiin pCAlA:ksi ja pCAlB:ksi (kuvio 2) . Kumpikin näistä sekvensseistä erosi villityyppisestä CA-20 sekvenssistä asemissa, jotka on osoitettu nuolilla kuviossa 7(2) ja kuviossa 7(3).

Lukuisia menetelmiä voidaan käyttää villityyppisen sekvenssin muodostamiseksi, esimerkiksi pCAlA:n ja pCAlB:n uudelleenyhdistämistä in vivo tai in vitro tai seulomalla 25 lisää itsenäisiä klooneja. Ehdotetun villityyppisen sekvenssin sisältävä plasmidi nimetään pCAl':ksi (Kuvio 2).

Seuraavassa kuvauksessa heittomerkin (') sisältävät plasmidit tarkoittavat villityyppisiä CA-sekvenssejä, kun taas plasmidit, joissa ei ole heittomerkkiä, ovat peräisin 30 mutanteista pCAlA tai pCAlB.

D. Plasmidien pCA2', pCA2A, pCA3', pCA3A ja pCA3B

muodostaminen Tämä esitetään kuviossa 3. pCAl (tai pCAlA tai pCAlB) hajotetaan BamHI:llä jolloin, polymeraasilla sekä 35 dTNP:llä käsittelyn jälkeen, jota seuraa Sstl-haioitus.

33 94774 saadaan fragmentti (1), jonka toinen pää on tylpistetty ja joka kantaa Sstl-uloketta toisessa päässään. Tämä fragmentti liitetään Narl-hajotuksella, tylpän pään muodostuksella ja SstI-käsittelyllä pMH6:sta saatuun fragmenttiin, 5 jolloin T4-ligaation jälkeen saadaan pCA3' (tai pCA3 tai pCA3B). Fragmentti (1) liitetään myös fragmenttiin, joka on saatu pMH6:sta HgiAI-hajotuksella, tylpän pään muodostamisella ja Sstl-käsittelvllä. jolloin T4-ligaation jälkeen saadaan pCA2' (tai pCA2A).

10 Halutut tuotteet etsitään transformoimalla E. coli MC1061 -bakteeri ligaatiotuotteilla. Plasmidit eristetään edellä mainitulla minilysaattimenetelmällä. Jokainen eristetyistä plasmideista hajotetaan BamHI:llä ja PstI;llä. vastaavasti. Molempien ryhmien plasmidit, jotka ovat oi-15 keankokoisia ja joiden BamHI-fragmentin orientaatio on oikea, nimetään pCA2:ksi (tai pCA2A:ksi) ja pCA3':ksi (tai pCA3A:ksi tai pCA3B:ksi).

E. araB-CA-fuusioproteiinin ekspressio E. coli -soluja, jotka sisälsivät araB-CA -fuusio-20 geenit plasmideissa pCAlA, pCA2A, pCA3A, pCA3B ja pCA3D (huomautus: pCA3D:tä käytetään tämän jälkeen vaihtoehtoisesti nimeämään villityyppistä, CA:n sisältävää plasmidia pCA3'), kasvatettiin 37 °C:ssa väliaineessa, joka sisälsi 1,5 % tryptonia, 1,0 % hiivauutetta ja 0,5 % NaCl:a (TYE) 25 sekä ampisilliinia pitoisuudessa 50 μg/ml. Solutiheydessä OD(joo=0,2 viljelmiä käsiteltiin L-arabinoosilla loppupitoi-suuteen 0,5 % araB-CA -fuusioproteiinin ekspression indu-soimiseksi ja solut kerättiin talteen, kun solutiheydet saavuttivat Οϋ^^Ι,δ -1,7 -lukeman, sentrifugoimalla kier-30 rosnopeudella 4000 RPM 4 °C:ssa 20 minuutin ajan Beckman JS-4,2 -roottorissa. Solut pestiin kerran suspendoimalla ne uudelleen puoleen alkuperäisestä viljelmätilavuudesta 50 mmol/1 fosfaattipuskuria (pH 6,6). Plasmidit pCAlA, pCA2A ja pCA32 sisältävät pestyt solunapit uutettiin kym-35 menesosatilavuuteen fosfaattipuskuria ja 1 % natriumdode- 94774 kyylisulfaattia (SDS) ja analysoitiin 10 % polyakryyliami-di-SDS -denaturoivassa geelissä. Tällä analyysillä osoitettiin, että E. coli -viljelmät, jotka sisälsivät plasmi-din pCA3A, tuottivat enemmän araB-CA-proteiinia kuin joko 5 pCAlA:llä tai pCA2A:lla transformoitu viljelmä.

F. Plasmidit pCA3A, pCA3B ja pCA3D sisältävien indusoitujen E. coli -solujen fraktiointi

Vaiheen E pestyt napit suspendoitiin uudelleen yhteen kymmenesosaan alkuperäisestä tilavuudesta fosfaatti-10 puskuria, jäähdytettiin 0 °C:seen, jonka jälkeen solut rikottiin French-puristuskammiossa. Sitten subsellulaariset komponentit sentrifugoitiin kierrosnopeudella 4000 RPM 4 °C:ssa 20 minuutin ajan roottorissa. Saadun supernatan-tin ja 4000 RPM:n solunapin analysointi 10 % polyakryy-15 liamidi-SDS -denaturoivassa geelissä osoitti, että kaikki pCA3A:n, 3B:n ja 3D:n araB-CA-fuusioproteiini löytyi 4 K -solunapista.

G. Synteettisen CA:n puhdistus (a) Hajotus syanogeenibromidilla 20 1. 4 K -solunappifraktio, joka sisälsi viimeisessä vaiheessa saadun araB-CA-fuusioproteiinin. sekoitettiin 90 % muurahaishappoon, jolloin saatiin 0,7 - 1,1 mg/ml proteiinia 70 % muurahaishapossa. Painon mukaan 10-kertainen ylimäärä syanogeenibromidia (1 g/ml:n kantaliuos asetonit-25 rillissä) lisättiin. Reaktioseos huuhdeltiin typellä ja sitä inkuboitiin huoneenlämpötilassa yli yön.

2. Muurahaishappo ja syanogeenibromidi poistettiin typpivirran alla. Jäännös liuotettiin 70 % muurahaishappoon ja kuivattiin typpivirran alla vielä kahdesti.

30 3. 0,1 % trifluorietikkahappoliuos vedessä lisät tiin; tämä liuotti hajotetun CA:n täysin pitoisuudessa 1 mg proteiinia/ml.

(b) Syanogeenibromidifragmenttien korkeapainenes-tekromatograf ia 35 94774

Syanogeenibromidilla hajotettu fuusioproteiini kro-matografoitiin HPLC:llä molekyylin CA-osasta peräisin olevan fragmentin eristämiseksi. Käytettiin C-18 -käänteis-faasipylvästä (Waters). Gradientti ajettiin 0,1 % trifluo-5 rietikkahapolla (TFA) vedessä (puskuri A) ja 0,1 % TFA:11a asetonitriilissä (puskuri B). Lähtöeluentti sisälsi 2 0 % puskuria B; 2 minuutin kuluttua näytteen ruiskutuksesta aloitettiin gradientin 20 % - 60 % B:tä 60 minuutissa ajo. Virtausnopeus oli 1 ml/minuutti. Eluutioprofiilia monito-10 roitiin aallonpituudella 280 nm. Kerättiin useita piikkejä eluoituneen, syanogeenibromidilla hajotetun fuusioproteii-nin kromatogrammista, jotta bakterisidinen vaikutus voitiin testata, kuten myöhemmin on kuvattu (esimerkki 4).

H. Mutantti-sekropiinipolypeptidin pCA3A-koodit 15 Taulukko 1 E. colissa olevan pCA3A:n avulla tuotetun sekropiini-A:n aminohappokoostumus

Mutantti A

20 Amino- Kokeelliset Teoreettiset happo arvot arvot*

Asp 2,9 3

Thr 0,1 0

Glu 2,7 2 _ Pro 2,4 2 25 Gly 6,3 4

Ala 3,0 3

Vai 3,6 4

Ile 2,9 4

Leu 1,2 1

Phe 1,1 1

Lys 6,2 6 30 Arg 2,1 2

Trp ND 1

Ser 1,3 1

Cys 0 0

Met 0 0

Tyr 0,1 0

His 0,4 o 35 - N.D. - ei määritetty • ·

Teoreettiset arvot: jokaisen mutanttikloonin DNA-sekven-sointianalyysistä saadut arvot 36 94774

Nukleiinihappo- ja aminohapposekvenssit on esitetty kuviossa 7.

Esimerkki 2

Toisen mutantti-sekropiinipolypeptidin osoitus 5 Plasmidi pCA3B:tä sisältävät solut fraktioitiin, CA-sekvenssit todettiin ja synteettinen CA puhdistettiin ja analysoitiin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osat F-G. Taulukossa II esitetyt aminohappokoostumustiedot ja aminohapposekvenssitiedot osoittivat, että myös toinen 10 klooni sisälsi mutantti-sekropiiniä koodittavan CA-gee-nisekvenssin.

Taulukko II

E. colissa olevan pCA3B:n avulla tuotetun sekropiini-A:n aminohappokoostumus 15 _

Mutantti B

Amino- Kokeelliset Teoreettiset happo arvot arvot*

Asp 2,3 2 20 Thr ι,ο l

Glu 4,2 4

Pro 1,0 1

Gly 4,1 3

Ala 5,0 5

Vai 3,6 4

Ile 3,9 5 25 Leu 1,1 1

Phe 0,9 1

Lys 6,6 7

Arg 1,0 1

Trp ND 1

Ser 1,1 1

Cys 0 0

Met 0 0 30 Tyr 0 0 : His 0,1 0 N.D.= ei määritetty ♦Teoreettiset arvot: jokaisen mutanttikloonin DNA-sekven-35 sointianalyysistä saadut arvot.

Il ' ·*:» liiti l lld i 37 9 4 7 7 4

Nukleiinihappo- ja aminohapposekvenssit on esitetty kuviossa 7.

Esimerkki 3

Villityyppistä sekropiini A:ta koodittavan plasmi-5 din pCA3D muodostaminen

Muodostamiskaavio on esitetty kuvioissa 4 ja 5.

A. pl9C:n muodostaminen 1. Plasmidi pING 1 hajotettiin täydellisesti endo-nukleaaseilla Fokl ja sitten BamHI. saatu hajotus pysäy- 10 tettiin fenoli/kloroformi (suhde 1:1) -uutolla ja vesipitoinen jäännös pestiin eetterillä, jonka jälkeen sen annettiin kulkea Bio-GelR P-10 -pylvään läpi fenoli/klorofor-mi-seoksen poistamiseksi.

Fokl-hajotus tuotti "CTACM-5/-ulokkeen. Tämä 76 15 emäsparia sisältävä BamHI-Fokl -fragmentti sisältää araB-promoottorin.

2. Uusi CA-geenifragmentti (katso kuvio 6) muodostettiin käyttämällä esimerkissä 1, vaiheessa B kuvattua menetelmää paitsi, että kaksi DNA-fragmenttia, nrot 1 ja 20 5, korvattiin fragmenteilla nrot nn-1 ja nn-5 (sekvenssi esitetty kuviossa 6) "GATG"-5'-ulokkeen tuottamiseksi sen N-päähän ja EcoRI-kohdan, joka sisältää ATTT-ulokkeen, tuottamiseksi sen C-päähän.

3. pBR322 hajotettiin täydellisesti endonukleaa- 25 seilla BamHI ja EcoRI. Saatu hajotus pysäytettiin kuvatulla tavalla.

4. Vaiheen 1, edellä, BamHI-Fokl -fragmentti ja vaiheen 2, edellä, uusi CA-geeni yhdistettiin suurempaan pBR322:n BamHI-EcoRI -fragmenttiin.

30 5. Yhdistetty tuote hajotettiin endonukleaasi

Hindin:11a pBR322:ta kantavien transformanttien lukumäärän vähentämiseksi.

6. Hindlll:llä käsitelty plasmidi transformoitiin E. coli MC1061 -bakteeriin.

38 94774 7. CA-geenifragmenttia kantavat plasmidit sisältävät pesäkkeet identifioitiin pesäkehybridisaatiolla käyttäen synteettistä DNA-fragmenttia 7 (kuvio 6) koettimena.

1000 pesäkkeestä löytyi kolme itsenäistä kloonia, jotka 5 sisälsivät CA-fragmentin. Jokainen eristetty plasmidi hajotettiin BamHI:llä ja EcoRI:llä; plasmidi, joka pystyi vapauttamaan oikean fragmentin, nimettiin pl9C:ksi. CA-in-serttien nukleotidijärjestyksen analyysi suoritettiin Sanger et ai.'n, PNAS 74 (1977) 5463 - 6467, dideoksi-ket- 10 junlopetusmenetelmällä vähäisin muutoksin (Wallace et ai.,

Gene 16 (1981) 21-26). pl9C sisälsi oikean CA-geenisek- venssin. CA-geeni laitettiin suoraan araB-oromoottorin alapuolelle ilman mitään välissä olevaa araB:tä kooditta-vaa sekvenssiä.

15 B. pCA0:n muodostaminen 1. pl9C:n BamHI-EcoRI -fragmentit poistettiin hajottamalla ylimäärällä restriktioendonukleaaseja EcoRI ja BamHI. Plasmidit hajotettiin myös PvuI:llä sen mahdollisuuden vähentämiseksi, että poistetut fragmentit liitet- 20 täisiin uudelleen plasmidiin seuraavassa liittämisvaihees-sa.

2. Kohdan A. 7 BamHI-EcoRI -fragmentit liitettiin plasmidiin pING 1, jota oli esikäsitelty restriktioendo-nukleaasilla BamHI ja EcoRI. jonka jälkeen tuote hajotet- 25 tiin restriktioendonukleaasilla Smal pING l:tä kantavien transformanttien vähentämiseksi.

3. Smal:llä käsitelty plasmidi transformoitiin JS. coli MC1061 -bakteeriin.

4. Pesäkkeet, jotka sisältävät CA-geenifragmentteja . 30 kantavia plasmideja, identifioitiin plasmidikarakterisoin- ' nilla. Jokainen eristetyistä plasmideista hajotettiin

BamHI:llä ja EcoRI:llä poistetun fragmentin koon tarkistamiseksi. Plasmidi, joka oli oikeankokoinen, nimettiin pCA0:ksi. CA-inserttien nukleotidisekvenssin analyysi suo-

35 ritettiin dideoksi-ketjunlopetusmenetelmällä. Tämä pCAO

lf ali.i *14, I l l st 39 9 4 7 7 4 sisälsi oikean CA-geenisekvenssin. Tämä täydellisen araB-säätelygeenin sisältävä pCAO ja CA-geeni sijoitettiin heti araB-promoottorin jälkeen sekropiini-A:n ekspressoimiseksi suoraan muodostamatta araB-CA -fuusioproteiinia.

5 C. Plasmidi pCA3A- -l:n muodostaminen Tämän muodostelman tarkoituksena oli poistaa Aval-PvuII -alue pCA3A:sta yhden Xmnl-kohdan eliminoimiseksi. Deleetio pystyy myös lisäämään E. colissa olevien plasmi-dikopioiden lukumäärää.

10 1. pCA3A hajotettiin endonukleaasilla Aval ja

PvuII. jonka jälkeen se täytettiin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentin avulla dNTP:n läsnäollessa tylpän pään muodostamiseksi.

2. Vaiheen 1 plasmidi liitettiin uudelleen, jonka 15 jälkeen se hajotettiin Aval:llä ja PvuII:11a alkuperäistä pCA3A:ta sisältävien transformanttien lukumäärän vähentämiseksi.

3. Aval-PvuII -käsitelty plasmidi transformoitiin E. coli MC1061 -bakteeriin.

20 4. Pesäkkeet, jotka sisälsivät Aval-PvuII -alueen sisältämättömät plasmidit, identifioitiin pesäkehybridi-saatiolla käyttäen synteettistä DNA-fragmenttia 5'-TCATCAGCGTGGTCG-3' koettimena. Neljäkymmentäkuusi itsenäistä kloonia, jotka eivät sisältäneet Aval-PvuII -aluet-• 25 ta, löydettiin viidenkymmenen pesäkkeen joukosta. Jokainen eristetyistä plasmideista hajotettiin Xmnl:llä poistettujen fragmenttien koon tarkistamiseksi. Plasmidi, joka oli oikeankokoinen, nimettiin pCA3A- l:ksi.

D. Plasmidi pCA3D:n lopullinen kokoaminen 30 pl9C sisältää villityyppisen sekropiini-A:n sek venssin, mutta siitä puuttuu sopiva restriktiokohta N-päästä proteiinifuusion muodostamiseksi araB:n kanssa.

pCA3A sisältää kahden emäsparin deleetion, joka esiintyy lähellä CA-geenin C-päätä saaden sen tuottamaan 35 mutantti-araB-CA -fuusioproteiinia.

94774 Nämä kaksi plasmidia yhdistettiin muodostamaan plasmidi, jossa oli villityyppinen CA-geeni fuusioituna araBthen ja joka tuotti araB-CA -fuusioproteiinia.

Muodostamiskaavio on esitetty kuviossa 5.

5 1. Plasmidi pl9C (1 /ug) hajotettiin täydellisesti endonukleaasilla Xmnl: saatu hajotus pysäytettiin kuumentamalla seosta 65 °C:ssa 10 minuutin ajan.

2. Plasmidi pCA3A- -1 (0,1 μg) hajotettiin täydellisesti endonukleaasilla Xmnl. saatu hajotus pysäytettiin 10 kuumentamalla seosta 65 °C:ssa 10 minuutin ajan.

3. DNA vaiheista D.l ja D.2 yhdistettiin ja liitettiin toisiinsa.

4. Liitetty tuote hajotettiin PvuII:11a pl9C:tä kantavien transformanttien vähentämiseksi.

15 5. PvuII:11a käsitelty plasmidi transformoitiin E.

coli MC1061 -bakteeriin.

6. Pesäkkeet, jotka sisälsivät villityyppistä araB-CA -geeniä kantavia plasmideja ja jotka pystyivät tuottamaan araB-CA -fuusioproteiinia, identifioitiin DNA-sek- 20 venssianalyysilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Analysoiduista seitsemästä pesäkkeestä saatiin yksi, joka sisälsi villityyppisen sekvenssin ja joka nimettiin pCA3D:ksi.

« i a.in M4«a .

• · 94774

Taulukko III

E. colissa olevan pCA3D:n avulla tuotetun villityyppisen sekropiini-A:n aminohappokoostumus 5 _

Amino- Kokeelliset Odotetut happo arvot arvot

Asp 2,2 2

Thr 1,0 1 10 Glu 4,1 4

Pro 1,1 1

Gly 4,4 4

Ala 5,2 5

Vai 3,4 4

Ile 4,3 5

Leu 0,7 1

Phe 1,1 1 15 Lys 7,3 7

Arg 1,0 1

Trp ND 1

Ser 0,3 0

Cys 0 0

Met 0 0

Tyr 0 0 20 His 0 0 N.D. = ei määritetty

Nukleiinihappo- ja aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 7.

25 Esimerkki 4

Bakteereja tappavan vaikutuksen määritys Valmistettiin agar-levyt (halkaisijaltaan 8 cm) käyttäen 6 ml TYE-väliainetta, joka sisälsi noin 107 koe-organismin elävää solua. Halkaisijaltaan 2 mm:n kaivot 30 revitettiin levyille. Koeaine liuotettiin 50 mrool/1 fos- • faattipuskuriin (pH 6,6) ja jokaiseen kaivoon laitettiin 3 Ml tätä liuosta. Kaivon ympärille muodostuneiden inhibi-tiovyöhykkeiden eli kehien kehänhalkaisijät mitattiin yli yön inkuboinnin 25 °C:ssa jälkeen. Kehänmuodosturoan vakion 35 määrittämisessä käytettiin CA 1-33 -proteiinia. 1 Mg ja 3

Mg CA 1-33:a kaivoon annosteltaessa aiheutti halkaisijal- • « 42 94774 taan 8 mm ja 11 mm, vastaavasti, olevat kehät, E. coli-kantaa JF568 täynnä olevassa väliaineessa. 10 μg ja 30 μg syanogeenibromidilla hajotettua pCA3A-araB-CA -fuusiopro-teiinia aiheutti kehät, joiden halkaisijat olivat 7 mm ja 5 18 mm, vastaavasti.

Myös HPLC:llä fraktioitua syanogeenibromidilla hajotettua fuusioproteiinia käytettiin tässä määrityksessä. Useita piikkejä testattiin ja yksi tietty piikki osoittautui biologisesti aktiiviseksi. Myös muita bakteeri- ja 10 hiivakantoja testattiin tällä määritysmenetelmällä. Syano geenibromidilla hajotettuja ja hajottamattomia fuusiopro-teiininäytteitä laitettiin £. coli kannan JF 568 testauksessa käytettyjä, yllä kuvattuja määriä ja saadut kehien halkaisijat mitattiin.

15 Tulokset kaikille saaduille sekropiineille on esi tetty taulukossa IV.

ii iu i nm 114« 43 94774

Taulukko IV

CNBr-hajotettujen pCA3A-, pCA3B-, pCA3D-fuusioproteiini-isolaattien (5 /*g) ja ampisilliinin (750 ng) biologinen 5 aktiivisuus mitattuna kehänmuodostusaktiivisuuden perus teella

Kehänmuodostusakti ivisuus _millimetreinä_

Bakteerikanta pCA3AY pCA3BY pCA3D* Ampisil- _liini_

Staphylococcus 10 aureus NE NE NE 11,5

Streptococcus f aecalis NE NE NE 7,0

Salmonella derby 5,0 5,0 5,0 6,0

Pseudomonas PS-9 2,0 2,25 2,0 NE

15 Klebsiella

pneumoniae 4,5 4,0 4,5 NE

Erwinia caratovora EC 5,0 4,5 4,75 6,5

Streptococcus 2 0 pyogenes NE NE NE 12,5

Xenohabdus nemat oph i 1 lus 3,5 3,9 2,75 12,5

Serratia

marcesens 1,0 1,0 1,0 NE

25 E. coli 5506 5,0 4,5 5,0 4,5 E. coli 5506 DR 7,0 7,0 6,5 4,5 ‘Villi YMutantit 30 NE - ei kehänmuodostusaktiivisuutta 44 94774

Esimerkki 5

Sekropiinin ja kasvaimen kasvutekijän fermentatii-vinen tuotanto Tämä esimerkki kuvaa alfa-TGF:n (kasvaimen kasvu-5 tekijän) ja sekropiinin fermentaatiotuotantoa araB-pro-moottorin kontrollin alaisena E. colissa.

E. coli kanta MC1061 sisältää plasmidin kantaman araB-promoottorin. joka säätelee araB-alfa-TGF:n (pTGF58), tai araB-sekrooiini:n (pCA3CD) fuusiogeeniä. Viljelmiä 10 kasvatettiin 37 °C:ssa kierrosnopeudella 250 rpm 100 Ullissa TYE-viljelyväliainetta, joka sisälsi ampisilliinia (0,1 g/1). Viljelmiä kasvatettiin myöhäiseen eksponentiaaliseen vaiheeseen asti, noin 200 Klett-yksikköä, punainen suodatin. Sitten viljelmät siirrettiin neljän litran suun-15 taa muuttavaan ravistelupulloon, joka sisälsi 900 ml tuoretta TYE-väliainetta. Inkubointia jatkettiin vielä kolmen tunnin ajan, ennenkuin solut siirrostettiin 9 litraan tuo-tantoväliainetta. Tuotantoväliaine sisälsi taulukossa V luetellut ainekset:

20 Taulukko V

_Perusväliaine_Lisäaineet_

Ainekset Taso Ainekset Taso

_(g/1)_(g/D

kaseiinihydro- 25 lysaatti 30 glyseroli 16 hiivauute 1 CaCl2:2H20 0,022 KH2P04 3 MgS04:7H20 0,2 5

Na2HP04 6 tiamiini-HCl 0,01

NaCl 0,5 ampisilliini 0,1 30 NH4C1 4

Aluksi tuotantofermentaatio-olosuhteet asetettiin 37 °C:ksi, 800 rpmrksi ja 1 vvmiksi (astian tilavuus minuutissa) . Koska liuennutta happea kulutettiin kasvun ai- il aa,t mu i l * ** · · 45 94774 kana, sekä ravistelu- että ilmastusnopeuksia lisättiin sen mukaisesti, jotta liuenneen hapen (D.O.) minimimäärä pysyisi 30 %:ssa. Tämän väliaineen pH säätyi jatkuvasti itsestään pH:hon 6,5 - 6,8, mikä on E. colin kasvulle opti-5 maalinen, niin ettei väliaineen pH:n happo- ja emäskont-rollia tarvittu. Noin neljän tunnin kuluttua siirrostuk-sesta tuotantoväliaineeseen solutiheys saavutti 00^=10-lukeman, jolloin L-arabinoosia (50 g) lisättiin sekropii-nifuusioproteiinin synteesin indusoimiseksi. Ekspressio-10 vektorin stabiilisuuden edelleen varmistamiseksi lisättiin liemeen 1 g ampisilliinia OD^-lukeman ollessa 20.

Sekä alfa-TGF että sekropiini-araB -fuusioproteii-nit sijaitsivat vain E. coli -solujen liukenemattomassa fraktiossa. Mikroskooppinen tutkimus osoitti, että liuke-15 nemattomia jyväsiä muodostui solujen sisään yhden tunnin kuluttua induktiosta ja ne pysyivät koko fermentaation ajan. Enemmän kuin 95 % soluista sisälsi vähintään yhden jyväsen, joka suureni nopeasti, kun solutiheys jatkuvasti lisääntyi. Solumassasaanto oli 13,1 g (kuivapaino) litraa 20 kohti. Solumassasta noin 30 % oli fuusioproteiinia.

Esimerkki 6 E. coli-vektorin muodostaminen, jossa vektorissa araB-hTGF -fuusioproteiinin ekspressio on S. typhimurjumin araB-promoottorin säätelyn alainen 25 AraC-geenin tuote säätelee positiivisesti araB-pro- moottoria. Larabinoosi on vuorovaikutuksessa araC-proteii-nin kanssa araB-promoottorin ekspressioon tarvittavan ak-tivaattorin muodostamiseksi. Plasmidia, joka sisältää S. typhimurjumin araB- ja araC-geenit, käytettiin muodosta-30 maan araB-hTGF (ihmisen kasvaimen kasvutekijä alfa) -eks-pressiovektori. Plasmidin muodostaraisstrategia on esitetty kuviossa 8. Lopullinen plasmidi phTGF5 sisältää araB-hTGF -fuusion, joka koodittaa 548 aminohappoa sisältävää proteiinia. phTGF5:n sisältävää IS. coli -kantaa MC1061 kasva-35 tettiin minimaalisen glyserolimäärän (1 %) sisältävässä t 46 94774 väliaineessa, jota oli täydennetty kaseiinihydrolysaatilla (0,5 %) ja tiamiinilla (1 μς/ιηΐ) . Kun viljelmän tiheys saavutti OD^-lukeman 0,2 L-arabinoosia lisättiin 1 % ja inkubointia jatkettiin viiden tunnin ajan, ennenkuin vil-5 jelmä korjattiin talteen. SDS-PAGE:n avulla todettiin 55 kD:n proteiini, joka edustaa noin 10 % solun kokonaispro-teiinista.

Esimerkki 7 araB-hTGF:n geeniin 3'-päähän lisätty transkriptio-10 terminaattori

Transkriptioterminaattori on DNA-sekvenssi, joka saa RNA-polymeraasin lopettamaan kopioinnin. Transkriptio-terminaattorin sijoittaminen araB-hTGF:n geenin 3'-päähän estää ei-toivotun geenituotteen (ei-toivottujen geenituot-15 teiden) ekspression alaspäin. Plasmidin muodostamisstrate- gia on esitetty kuviossa 9. Lopullinen plasmidi phTGF58 sisältää E. coli rrnB -geenin transkriptioterminaattorin lisättynä araB-hTGF -geenin 3'-päähän. Kun osittain puhdistettuja araB-hTGF5 -proteiineja, jotka oli eristetty 20 joko phTGF58:aa tai phTGF5:tä (lähtöplasmidi) sisältävästä E. coli -kannasta MC1061, verrattiin SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesin jälkeen, tärkeimmän kontaminoivan proteiinin, beetalaktamaasin, määrä oli huomattavasti vähentynyt phTGF58:aa sisältävissä soluissa.

* 25 Esimerkki 8 araB-promoottori ja kalsitoniini A. Ihmisen kalsitoniinigeeni (hCT)

Kalsitoniini tai tyrokalsitoniini (CT) on hyperkal-semiaa aiheuttavalle kilpirauhasesta eritettävälle hormo-30 nille annettu nimi. CT vähentää luun resorptiivista aktii-: visuutta. CT vaikuttaa myös munuaisiin stimuloiden lisään tynyttä virtsan kalsiumin ja fosfaatin poistumista. CT:n nopea vapautuminen vasteena veren kalsiumin nousulle viittaa siihen, että CT:n päätarkoitus on suojella korkeampia 35 eläimiä akuuteilta hyperkalsemioilta. CT:tä koskeva tutki- « · 47 94774 mustyö tutkii sen käyttöä Pagetin taudin, jossa esiintyy kiihtynyttä luun uudelleenmuotoutumista, kontrolloinnissa.

Ihmisen kalsitoniinigeenin sekvenssi on seuraavanlainen (Graig et ai., Nature 295 (1982) 345-347): 5

Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly

TGC GGT AAT CTG AGT ACT TGC ATC CTG GGC

Thr Tyr Thr Gin Asp Phe Asn Lys Phe His

10 ACA TAC ACG CAG GAC TTC AAC AAG TTT CAC

Thr Phe Pro Gin Thr Ala Ile Gly Vai Gly

ACG TTC CCC CAA ACT GCA ATT GGG GTT GGA

15 Ala Pro Gly

GCA CCT GGA

B. Indusoitavaa regulonia, araB-rakennegeeniä ja hCT-geeniä kantavan plasmidin muodostaminen 20 Plasmidi pll5, jonka muodostaminen on esitetty kuviossa 10, sisältää oikean kalsitoniinigeenisekvenssin.

Plasmidi hajotettiin endonukleaaseilla MstI ja PstI kalsitoniinigeenin poistamiseksi, kuten kuviossa 11 on esitetty. Poistettu fragmentti liitettiin plasmidiin, joka 25 kantoi araB-rakennegeeniä (plasmidi pINGl, katso kuvio 12) .

Plasmidia pMH6 [Horwitz et ai., Gene 14 (1981) 309 - 319], joka sisältää intaktin araCrn ja araB:n, käytettiin lähtömateriaalina pINGl:n muodostamiseksi. Muodosta-30 miskaavio on esitetty kuviossa 12. Plasmidi pMH6 hajotettiin restriktioendonukleaasilla EcoRI ja Sali. jotka pilkkovat araB- ja araA-geeniä, vastaavasti, ja 1,9 kiloemäksen Sall-EcoRI- fragmentti korvattiin M13 mp9:stä peräisin olevalla [Vieira ja Messing, Gene 19 (1982) 259-268], 16 35 emäsparia sisältävällä Sall-EcoRI -fragmentilla pINGl:n 94774 48 muodostamiseksi. araB-geenin lukuvaiheistus määritettiin lacZ-aeenin fuusiolla pINGlin EcoRI-kohtaan. Koska sekä restriktioendonukleaasi Smal että MstI muodostavat tylppäpäisiä fragmentteja, pINGl:n 760 emäsparin fragmentti kor-5 vattiin sitten plasmidista #115 saadulla Mstl-PstI -fragmentilla phCTl:n muodostamiseksi. Plasmidi #115 sisältää kemiallisesti syntetisoidun geenin Mstl-PstI -fragmentissa. MstI- ja Smal-pään yhdistäminen fuusioi hCT-geenin araB-aeenin saaden aikaan araB-hCT -proteiinifuusion.

10 C. phCTl:ä sisältävien E. coli -solujen kasvatus phCTl:ä sisältäviä transformoituja E. coli -soluja kasvatettiin 37 °C:ssa ravistellen tiheyteen 10*-109/ml ja araB-kalsitoniini -fuusioproteiinin synteesi indusoitiin lisäämällä L-arabinoosia (1 %, w/v) 1-6 tunnin lisäkasva-15 tuksen aikana. Talteenkorjatut solut sonikoitiin (5 s, 3 kertaa) ja araB-kalsitoniinipitoisuus määritettiin ELISA-menetelmällä käyttäen anti-hCT-vasta-aineita.

Vaikka keksintö onkin kuvattu melko yksityiskohtaisesti esimerkein valaisemalla tarkoituksena selventää sen 20 ymmärtämistä, on selvää, että tiettyjä muutoksia ja modifikaatioita voidaan suorittaa keksinnön piirissä liitteenä olevien patenttivaatimusten piirin rajoittamana.

s· : iu i min n i ti t #:

Claims (28)

49 94774

1. Replikoituva ekspressioväline, tunnettu siitä, että se sisältää polynukleotidisekvenssin, joka 5 voidaan ekspressoida bakteeri-isännässä ja joka sisältää araB-promoottorin sekvenssin, joka on toimivasti kytketty bakteeri-isännälle heterologiseen geeniin, jolloin geeni koodittaa biologisesti aktiivista polypeptidiä, joka ei ole bakteriofaagin geenituote.

2. Expressionsmedel enligt patentkrav 1, k ä n - netecknat därav, att polypeptiden är ett enzym, ett hormon eller ett strukturprotein.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ekspressioväline, tunnettu siitä, että polypeptidi on entsyymi, hormoni tai rakenneproteiini.

3. Expressionsmedel enligt patentkrav 1, k ä n -netecknat därav, att polypeptiden är cekropin, en 15 tillväxtfaktor eller kalcitonin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ekspressioväline, tunnettu siitä, että polypeptidi on sekropiini, 15 kasvaimen kasvutekijä tai kalsitoniini.

4. Expressionsmedel enligt patentkrav 3, k ä n -netecknat därav, att polypeptiden är cekropin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen ekspressioväline, tunnettu siitä, että polypeptidi on sekropiini.

5. Expressionsmedel enligt patentkrav 1, k ä n -netecknat därav, att det är en plasmid.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ekspressioväline, tunnettu siitä, että se on plasmidi.

6. Expressionsmedel enligt patentkrav 5, k ä n - netecknat därav, att det även innehäller en feno-typisk selektionsmarker.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen ekspressioväline, tunnettu siitä, että se sisältää myös fenotyyppi-sen selektiomarkkerin.

7. Expressionsmedel enligt patentkrav 6, k ä n -netecknat därav, att markern är antibiotisk re- 25 sistens.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen ekspressioväline, tunnettu siitä, että markkeri on antibioottinen 25 resistenssi.

8. Bakterie, kännetecknad därav, att den transformerats med expressionsmedlet enligt patentkrav 1.

8. Bakteeri, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 1 mukaisella välineellä.

9. Förfarande för framställning av en biologiskt 30 aktiv, heterolog peptid i en bakterie som transformerats för exprimering av nämnda peptid, kännetecknat därav, att (a) en polynukleotidmolekyl, vilken omfattar en araB-promotor funktionellt kopplad tili en heterolog gen, 54 94774 vilken kodar för nämnda biologiskt aktiva peptid, vilken inte är genprodukten av en bakteriofag, insätts i ett rep-likerbart expressionsmede1, (b) en bakterie, som förmär exprimera peptiden 5 transformeras med expressionsmedeIt som innehäller nämnda polynukleotidmolekyl, (c) den transformerade bakterien odlas under od-lingsförhällanden och (d) nämnda peptid utvinns ur odlingen. 10 10. Förfarande enligt patentkrav 9, kanne- t e c k n a t därav, att (a) den transformerade bakterien inkuberas i ett odlingsmedium under valda tillväxtförhällanden tills sen exponentiell tillväxtfas uppnäs, 15 (b) odlingen frän steg (a) överförs till färskt odlingsmedium och odlingen inkuberas under tillräcklig tid för att tilläta ytterligare tillväxt, (c) odlingen frän steg (b) ympas till ett produk-tionsmedium och odlingen inkuberas under fermentationsför- 20 hällanden för att maximal bakterietillväxt uppnäs och för en tid som är tillräcklig för att en vald celltäthet uppnäs, (d) en mängd av Larabinos tillsätts, vilken är ef-fektiv för produktion av väsentliga mängder av nämnda he- 25 terologa peptid i roediet, och (e) nämnda heterologa peptid utvinns.

9. Menetelmä biologisesti aktiivisen, heterologisen peptidin tuottamiseksi bakteerissa, joka on transformoitu 30 ekspressoimaan mainittu peptidi, tunnettu siitä, että (a) lisätään polynukleotidimolekyyli, joka sisältää araB-promoottorin. joka on toimivasti kytketty mainittua biologisesti aktiivista peptidiä, joka ei ole bakteriofaa- 35 gin geenituote, koodittavaan heterologiseen geeniin, rep- : likoituvaan ekspressiovälineeseen, so 94774 (b) transformoidaan peptidin ekspressointiin kykenevä bakteeri ekspressiovälineellä, joka sisältää mainitun polynukleotidimolekyyIin, (c) viljellään transformoitua bakteeria viljely- 5 olosuhteissa, ja (d) otetaan talteen mainittu peptidi viljelmästä.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (a) inkuboidaan transformoitua bakteeria viljely-10 väliaineessa valituissa kasvuolosuhteissa, kunnes myöhäis- eksponentiaalisen kasvun vaihe saavutetaan, (b) siirretään vaiheen (a) viljelmä tuoreeseen viljelyväliaineeseen ja inkuboidaan viljelmää riittävä aika lisäkasvun sallimiseksi, 15 (c) siirrostetaan vaiheen (b) viljelmä tuotantovä- liaineeseen ja inkuboidaan viljelmää fermentointiolosuh-teissa maksimaalisen kasvun aikaansaamiseksi ja tarpeeksi pitkän aikaa, jotta saavutetaan valittu solutiheys, (d) lisätään L-arabinoosimäärä, joka on tehokas 20 tuottamaan oleellisia määriä mainittua heterologista pep tidiä väliaineeseen, ja (e) otetaan talteen mainittu heterologinen peptidi.

11. Genetisk konstruktion, kännetecknad därav, att den omfattar en genetisk sekvens, vilken kodar för cekropin, funktionellt kopplad tili en araB-promotor.

11. Geneettinen muodostelma, tunnettu siitä, että se sisältää sekropiiniä koodittavan geneettisen 25 sekvenssin, joka on toimivasti kytketty araB-promootto-riin.

12. Genetisk konstruktion enligt patentkrav 11, kännetecknad därav, att den ytterligare omfattar en genetisk sekvens, vilken kodar för en polypeptid som förmär undertrycka den baktericidala effekten hos det resulterande fusionsproteinet gentemot en i övrigt cekro- • 55 94774 pinkänslig bakterie, och som funktionellt kopplats tili den genetiska sekvens, vilken kodar för cekropin.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen geneettinen muodostelma, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää geneettisen sekvenssin, joka koodittaa polypepti- . 30 diä, joka pystyy estämään saadun fuusioproteiinin baktee reja tappavan vaikutuksen muuten sekropiinille herkässä bakteerissa, ja joka sekvenssi on toimivasti kytketty sekropiiniä koodittavaan geneettiseen sekvenssiin.

13. Genetisk konstruktion enligt patentkrav 11 el-ler 12, kännetecknad därav, att den för cek- 5 ropin kodande sekvensen är en syntetisk sekvens.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen geneet-35 tinen muodostelma, tunnettu siitä, että sekropii- :l : »»:f 14»4 | l 4 #» 51 94774 niä koodittava geneettinen sekvenssi on synteettinen sekvenssi.

14. Genetisk konstruktion enligt patentkrav 12, kännetecknad därav, att nämnda polypeptid är en leader-polypeptid.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen geneettinen muodostelma, tunnettu siitä, että mainittu poly- 5 peptidi on leader-polypeptidi.

15. Genetisk konstruktion enligt patentkrav 12, 10 kännetecknad därav, att den genetiska sekvensen, vilken kodar för nämnda polypeptid, omfattar ca 300 -5000 baspar.

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen geneettinen muodostelma, tunnettu siitä, että mainittua poly-peptidiä koodittava geneettinen sekvenssi sisältää noin 300 - 5000 emäsparia.

16. Genetisk konstruktion enligt patentkrav 11 eller 12, kännetecknad därav, att cekropinet 15 är cekropin A, B eller D.

16. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen geneet tinen muodostelma, tunnettu siitä, että sekropii-ni on sekropiini A, B tai D.

17. Genetisk konstruktion enligt patentkrav 12, kännetecknad därav, att den genetiska sekvensen, vilken kodar för nämnda polypeptid, kodar för araB-genen.

17. Patenttivaatimuksen 12 mukainen geneettinen muodostelma, tunnettu siitä, että mainittua poly- 15 peptidiä koodittava geneettinen sekvenssi koodittaa araB— geeniä.

18. Enhet som kan replikeras i en bakterievärd, kännetecknad därav, att den omfattar den genetiska konstruktionen enligt patentkrav 11 eller 12.

18. Väline, joka voi replikoitua bakteeri-isännässä, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukaisen geneettisen muodostelman.

19. Enhet enligt patentkrav 18, kännetecknad därav, att cekropinet är A, B eller D.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen väline, tunnettu siitä, että sekropiini on A, B tai D.

20. Bakterievärd, kännetecknad därav, att den transformerats med den genetiska konstruktionen enligt patentkrav 11 eller 12.

20. Bakteeri-isäntä, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukaisella geneettisellä muodostelmalla.

21. Bakterievärd enligt patentkrav 20, kännetecknad därav, att den är en cekropinkänslig bak- • 30 terie.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen bakteeri-isän tä, tunnettu siitä, että se on sekropiinille herkkä bakteeri.

22. Bakterievärd enligt patentkrav 20, kännetecknad därav, att cekropinet är A, B eller D.

22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen bakteeri-isäntä, tunnettu siitä, että sekropiini on A, B tai

30 D. * 23. Sekropiinille herkkä bakteeri-isäntä, tun nettu siitä, että se on transformoitu siinä ekspres-soituvalla välineellä, joka kantaa sekropiiniä koodittavan geneettisen sekvenssin toimivasti kytkettynä geneettiseen 35 sekvenssiin, joka koodittaa sekropiinin bakteereja tappa- 52 94774 vaa vaikutusta isännässä estämään pystyvää polypeptidiä saadussa ekspressiofuusiotuotteessa, sekä näiden lisäksi tomivasti kytkettynä araB-promoottorin.

23. Cekropinkänslig bakterievärd, kännetecknad därav, att den transformerats med en i den- 56 . 94774 samma exprimerbar enhet, vilken innehäller en genetisk för cekropin kodande sekvens funktionellt kopplad till en genetisk sekvens funktionellt kopplad till en genetisk sekvens soin kodar för en polypeptid, vilken förmär undertryc-5 ka den baktericidala effekten hos cekropin gentemot värden i den resulterande expressionsfusionsprodukten, och ytter-ligare en funktionellt kopplad araB-promotor.

24. Fusionsprotein, kännetecknat där-av, att det omfattar ett första segment, vilket kodar för 10 cekropin, och ett andra segment, vilket kodar för en annan polypeptid sä, att fusionsproteinet väsentligen saknar de baktericidala egenskaperna hos cekropin.

24. Fuusioproteiini, tunnettu siitä, että 5 se sisältää ensimmäisen sekropiiniä koodittavan segmentin ja toisen eri polypeptidiä koodittavan segmentin siten, että fuusioproteiinista oleellisesti puuttuvat sekropiinin bakteereja tappavat ominaisuudet.

25. Fusionsprotein enligt patentkrav 24, kännetecknat därav, att cekropinet är A, B eller D.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen fuusioproteii-10 ni, tunnettu siitä, että sekropiini on A, B tai D.

26. Fusionsprotein enligt patentkrav 24, kän netecknat därav, att det mellan de bägge segmen-ten innehäller ett selektivt spjälkbart ställe.

26. Patenttivaatimuksen 24 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että se sisältää selektiivisesti pilkottavan kohdan molempien segmenttien välissä.

27. Menetelmä sekropiinin tuottamiseksi mikrobio logisia menetelmiä käyttäen, tunnettu siitä, että toimivasti kytketään araB-promoottori, sekropiiniä koodittava ensimmäinen geneettinen sekvenssi ja toinen ge-20 neettinen sekvenssi, joka koodittaa eri polypeptidiä, fuusioidun geenimuodostelman muodostamiseksi, transformoidaan fuusioitu geenimuodostelma sekro-piinille herkkään bakteeri-isäntään, viljellään transformoitua bakteeri-isäntää, jolloin 25 tuotetaan proteiinikonjugaatti, joka ei ole myrkyllinen bakteeri-isännälle, ja tämän jälkeen otetaan talteen sekropiini proteiinikon jugaatista.

28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, . 30 tunnettu siitä, että se edelleen sisältää vaiheen, jossa proteiinikonjugaatti pilkotaan sekropiiniksi ja mainituksi eri polypeptidiksi. tl ' ·«'* tf,|« |.f ♦ 91 i 53 94774 l. Replikerbart expressionsmedel, kanne-t e c k n a t därav, att det omfattar en polynukleotid-5 sekvens vilken kan exprimeras i en bakterievärd och omfat-tande sekvensen för en araB-promotor funktionellt kopplad till en gen som är heterolog med bakterievärden, varvid genen kodar för en biologiskt aktiv polypeptid, som inte är genprodukten av en bakteriofag.

27. Förfarande för framställning av cekropin genom mikrobiologiska metoder, kännetecknat därav, 20 att en araB-promotor, en första genetisk för cekropin kodande sekvens och en andra genetiskt sekvens, vilken kodar för en annan polypeptid, funktionellt kopplas för att bilda en fusionerad genkonstruktion, 25 den fusionerade genkonstruktionen transformeras tili en cekropinkänslig bakterievärd, den transformerade bakterivärden odlas, varvid ett för värden icke-giftigt proteinkonjugat produceras och härefter utvinns cekropin ur proteinkonjugatet. 30

28. Förfarande enligt patentkrav 27, känne tecknat därav, att det ytterligare omfattar ett steg, där proteinkonjugatet spjälks i cekropin och nämnda andra polypeptid. ii ' m I »Ml I i «M