JP2007500852A - 外部勾配クロマトフォーカシング - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれている米国仮出願第60/498287号(2003年8月28日出願)および米国仮出願第60/470889号(2003年5月16日出願)の利益を主張するものである。
本明細書に参照として載せているすべての出版物および特許出願は、それぞれの個別の出版物または特許出願が、あたかも参照により組み込まれて具体的かつ個別に示されたものと同程度に参照により組み込まれる。
本発明は、外部勾配クロマトクロマトグラフィーに関する。より詳しくは、本発明は、タンパク質等の荷電分子をそれらの等電点(pI)によって分離する新規な方法に関するものであり、該荷電分子を分離するために採用されるシステムおよびバッファー組成物を含む。
クロマトフォーカシングは、最初にSluytermanと共同研究者によって発表された陰イオン交換クロマトグラフィーの一形態である(例えば、L. A. AE SluytermanおよびO. Elgersma、Journal of Chromatography A、150(1)、1978、17-30;L. A. AE SluytermanおよびJ. Wijdenes、Journal of Chromatography A、150(1)、1978、31-44;L.A. AE. SluytermanおよびJ. Wijdenes、Journal of Chromatography A、206 (3)、1981、429-440;L. A. AE. SluytermanおよびJ. Wijdenes、Journal of Chromatography A、206 (3)、1981、441-447;L. A. AE. SluytermanおよびC. Kooistra、Journal of Chromatography A、470 (2)、1989、317-326を参照)。クロマトフォーカシングにおいては、保持されたpH勾配が、溶離溶液中のPolybufferの種類またはその他のバッファーの種類が、弱陰イオン交換樹脂の表面の官能基を滴定するときクロマトグラフカラム中に自動的に生じる。
本発明の一態様は、タンパク質等の荷電分子をそれらの等電点によりクロマトグラフ分離する新規な方法を提供することである。本発明の第2の目的は、自動化されたフィードバック制御の外部pH勾配発生システムを備える低圧または高圧液体クロマトグラフィーと共に使用する新規なクロマトグラフィーシステムを提供することである。
陰イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期pHで、少なくとも3種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも3種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される初期pHとは前記少なくとも3種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを形成する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
陽イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期pHで、バッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される初期pHとは異なるpHのバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を維持するために外部で定められた傾きで変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
陰イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ最高の初期pHで、少なくとも3種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される初期pHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも3種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される異なるpHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも3種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を維持するために外部で定められた傾きで変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
陽イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期pHで、バッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される初期pHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される初期pHとは異なるpHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を維持するために外部で定められた傾きで変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
イオン交換吸着剤に、前記荷電分子を温度T0で加えるステップと、
前記イオン交換吸着剤に、初期pHのバッファー成分を含む溶媒を含浸させるステップ(その場合イオン交換吸着剤は、荷電分子と反対の電荷をもつ)と、
イオン交換吸着剤の温度をT1に変化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される初期pHとは異なるpHの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを有する溶離液を、前記イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を維持するために外部で定められた傾きで変動させるステップと、
それぞれがイオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含み、
ここで、T0とT1の間の差が0℃と80℃の間である。
イオン交換吸着剤に、温度T0において、初期pHのバッファー成分を含む溶媒を含浸させるステップ(その場合イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)と、
イオン交換吸着剤の温度をT1に変化させるステップと、
分離すべき荷電分子をイオン交換吸着剤に加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される初期pHとは異なるpHの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを有する溶離液を、前記イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を維持するために外部で定められた傾きで変動させるステップと、
それぞれがイオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含み、
ここで、T0とT1の間の差が0℃と80℃の間である。
陰イオン交換吸着剤が分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ最高の初期pHで、少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、両方の交換体を最高の初期pHで平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離し、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に所定の最小pHに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を所定の最小pHから所定の最大pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
最低の初期pHの少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤(該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、両方の交換体を最低の初期pHで平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導き、かつ
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に所定の最小pHに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を所定の最大pHから所定の最小pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最大pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
分離すべき荷電分子を、後に陽イオン交換吸着剤が直列に接続されている陰イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その2つの吸着剤が、少なくとも1つの初期pHのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこでそれぞれの分離すべき荷電分子が、3つの荷電の種類、すなわち、初期pHより低い見掛けのpIを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期pHで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期pHより高い見掛けのpIを有する荷電分子は正に帯電したものの1つに分類されるステップと、
初期pHで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで陽イオン交換吸着剤または陰イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陰イオン交換吸着剤と陽イオン交換吸着剤との初期pHにおける接続を互いから切り離すステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、初期pHに始まる時間依存的に減少するpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、初期pHに始まる時間依存的に増加するpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
分離すべき荷電分子を、後に陰イオン交換吸着剤が直列に接続されている陽イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その2つの吸着剤が、少なくとも1つの初期pHのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこでそれぞれの分離すべき荷電分子が、3つの荷電の種類、すなわち、初期pHより低い見掛けのpIを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期pHで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期pHより高い見掛けのpIを有する荷電分子は正に帯電したものの1つに分類されるステップと、
初期pHで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで温度T0で陰イオン交換吸着剤または温度T1で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期pHにおける接続を互いから切り離すステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、初期pHに始まる時間依存的に増加するpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、初期pHに始まる時間依存的に減少するpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
最高の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤(該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陽イオン交換吸着剤の温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T0の溶媒中で測定した最高の初期pHで平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度T0で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度T0で所定の最小pHに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最小pHから所定の最大pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
最低の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤(該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陰イオン交換吸着剤の温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T0の溶媒中で測定した最低の初期pHで平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度T0で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度T0で所定の最大pHに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最大pHから所定の最小pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
最高の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤(該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T1で変化させた最高の初期pHにおいて平衡化させるステップと、
温度T1の第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、温度T1の第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度T1で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T1で所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度T1で所定の最小pHに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最小pHから所定の最大pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
最低の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤(該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T1で変化させた最高の初期pHにおいて平衡化させるステップと、
温度T1の第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、温度T1の第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度T1で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T1で所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度T1で所定の最大pHに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最大pHから所定の最小pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最小pHに達するまで陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
最高の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤(該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陽イオン交換体の温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T0で測定した最高の初期pHにおいて平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度T0で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度T0で所定の最小pHに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最小pHから所定の最高の初期pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最高の初期pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
陽イオン交換樹脂の温度をT2に変化させるステップと、
温度T2における所定の最高の初期pHから所定の2番目の最大pHまで時を合わせて増大するpH勾配を有する陽イオン交換吸着剤を含浸させ続けるステップと、
それぞれがその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から、温度T2において前記所定の2番目の最大pHに達するまで別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
増大しつつあるpH勾配を使用する溶離が後に続く段階的な温度の変化を繰り返し、それぞれが最終温度Tfに達するまで陽イオン交換吸着剤から時を合わせて別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
所定の最後から2番目の最大pHから所定の究極の最大pHまで時を合わせて増大するpH勾配を有する陽イオン交換吸着剤の含浸を継続するステップと、
それぞれが別々に最終温度Tfで究極の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
最低の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤(該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陰イオン交換体の温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T0で測定した最高の初期pHにおいて平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度T0で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度T0で所定の最大pHに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最大pHから所定の最低の初期pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最低の初期pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
陰イオン交換樹脂の温度をT2に変化させるステップと、
温度T2における所定の最低の初期pHから所定の2番目の最小pHまで時を合わせて減少するpH勾配を有する陰イオン交換吸着剤を含浸させ続けるステップと、
それぞれがその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から、温度T2において前記所定の2番目の最小pHに達するまで別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
増大しつつあるpH勾配を使用する溶離が後に続く段階的な温度の変化を繰り返し、それぞれが最終温度Tfに達するまで陰イオン交換体から時を合わせて別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
所定の最後から2番目の最小pHから所定の究極の最小pHまで時を合わせて減少するpH勾配を有する陰イオン交換吸着剤の含浸を継続するステップと、
それぞれが別々に最終温度Tfで究極の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
分離すべき荷電分子を、温度T0の陰イオン交換吸着剤に、続いて温度T1で直列に接続されている陽イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その2つの吸着剤が、少なくとも1つの温度T0で測定される初期pHのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、3つの荷電の種類、すなわち、初期pHより低い見掛けのpIを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期pHで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期pHより高い見掛けのpIを有する荷電分子は正に帯電したものの少なくとも1つに分類されるステップと、
初期pHで負に帯電した荷電分子を温度T0で陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで正に帯電した荷電分子を温度T1で陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで温度T0で陰イオン交換吸着剤または温度T1で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期pHにおける接続を互いから切り離すステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、温度T0で測定して初期pHに始まる時間依存的に減少するpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで温度T0で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度T0で最終の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、温度T1で測定して初期pHに始まる時間依存的に増加するpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで温度T1で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度T1で最終の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
分離すべき荷電分子を、温度T0の陽イオン交換吸着剤に、続いて温度T1で直列に接続されている陰イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その2つの吸着剤が、少なくとも1つの温度T0で測定される初期pHのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、3つの荷電の種類、すなわち、初期pHより低い見掛けのpIを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期pHで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期pHより高い見掛けのpIを有する荷電分子は正に帯電したものの1つに分類されるステップと、
初期pHで正に帯電した荷電分子を温度T0で陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで負に帯電した荷電分子を温度T1で陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで温度T0で陰イオン交換吸着剤または温度T1で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期pHにおける接続を互いから切り離すステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、温度T0で測定して初期pHに始まる時間依存的に増加するpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで温度T0で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度T0で最終の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、温度T1で測定して初期pHに始まる時間依存的に減少するpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで温度T1で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度T1で最終の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
温度T0で測定した最高の初期pHにおける少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤(該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるものであって、前記陰イオン交換吸着剤を、温度T1から温度T2までの温度勾配の下(温度T1は、前記溶媒が吸着剤に入るときの温度であり、温度T2は、前記溶媒が吸着剤を出るときの温度である)におくステップと、
陰イオン交換吸着剤の後に温度T3から温度T4までの温度勾配の下(温度T3は、陰イオン交換吸着剤からの溶出液が、陽イオン交換体に入るときの陽イオン交換吸着剤の温度であり、温度T4は、前記溶出液が、陽イオン交換体を出るときの温度である)におく陽イオン交換吸着剤を直列に接続し、温度T0で測定した最高の初期pHにおける両方のイオン交換体を平衡化させるステップと、
温度T0の第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、温度T0の第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、温度T1から温度T2の勾配にかけた前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で測定した所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、さらに分離されるように、温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を、温度T0で測定した所定の最小pHに達するまで温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤を温度T0で測定した所定の最小pHから所定の最大pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に、温度T0で測定して所定の最大pHに達するまで、その実効等電点において温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤から、溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
温度T0で測定した最低の初期pHにおける少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤(該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるものであって、前記陽イオン交換吸着剤を、温度T1から温度T2までの温度勾配の下(温度T1は、前記溶媒が吸着剤に入るときの温度であり、温度T2は、前記溶媒が吸着剤を出るときの温度である)におくステップと、
陽イオン交換吸着剤の後に温度T3から温度T4までの温度勾配の下(温度T3は、陽イオン交換吸着剤からの溶出液が、陰イオン交換体に入るときの陰イオン交換吸着剤の温度であり、温度T4は、前記溶出液が、陰イオン交換体を出るときの温度である)におく陰イオン交換吸着剤を直列に接続し、温度T0で測定した最低の初期pHにおける両方のイオン交換体を平衡化させるステップと、
温度T0の第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、温度T0の第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、温度T1から温度T2の勾配にかけた前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で測定した所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、さらに分離されるように、温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を、温度T0で測定した所定の最大pHに達するまで温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤を温度T0で測定した所定の最大pHから所定の最小pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に、温度T0で測定して所定の最小pHに達するまで、その実効等電点において温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤から、溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
初期pHの少なくとも3種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラム(前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)と、
初期pHの前記少なくとも3種のバッファー成分を含む第1の溶液を含有する第1の貯蔵器と、
初期pHとは異なるpHの前記少なくとも3種のバッファー成分を含む第2の溶液を含有する第2の貯蔵器と、
前記第1および第2の溶液の外部で作製した混合物を送り込んで外部で規定したpH勾配を吸着剤に形成させ、カラム内に保持されていないpH勾配を出現させる手段と
を備えている。
初期pHの少なくとも3種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラム(前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)と、
初期pHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記少なくとも3種のバッファー成分を含む第1の溶液を含有する第1の貯蔵器と、
初期pHとは異なるpHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記少なくとも3種のバッファー成分を含む第2の溶液を含有する第2の貯蔵器と、
前記第1および第2の溶液の外部で作製した混合物を送り込んで外部で規定した初期pHから最終pHまでのpH勾配を形成させ、カラム内に保持されていないpH勾配を出現させる手段とを備えている。
測定pHの既知関数である出力電圧を生ずるpH測定装置と、
フィードバック制御装置であって、
適切に短時間の間隔の入力として、クロマトグラフシステムによって発生する溶離液のpHを監視するpH測定装置から電圧を受け取り、その電圧を、前もってプログラムされた時間依存性pH勾配の予想されるpH値に対応するセットポイント電圧と比較し、
その絶対値が誤差と見なされる入力電圧(すなわち測定pH)とセットポイント電圧(すなわち予想pH)の間の差を計算し、かつ
クロマトグラフシステムの勾配を発生させるポンプのポンピング速度を、誤差の絶対値が最小となるように、適宜電流または電圧いずれかとしての訂正信号を計算するための任意の既知のフィードバックアルゴリズムを使用して調節する
制御装置とを備えている。
初期pHの少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラム(前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)と、
初期pHの前記少なくとも1種のバッファー成分を含む第1の溶液を含有する第1の貯蔵器と、
初期pHとは異なるpHの前記少なくとも1種のバッファー成分を含む第2の溶液を含有する第2の貯蔵器と、
第1および第2の溶液を混合するための第1の貯蔵器ポンプおよび第2の貯蔵器ポンプ(前記第1の貯蔵器ポンプおよび前記第2の貯蔵器ポンプのポンピング速度は、制御された流速で外部で定めた溶離液pH勾配を形成するべく調節される)と、
pH測定装置がpHフローセルである、制御された流速で外部で定めた溶離液pH勾配の形成を監視および補正するための上記のフィードバックコントロールシステムとを備えている。
最高の初期pHで、少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤(該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される初期pHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からミキサー中にポンプで送出される異なるpHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
pHに依存する電圧信号が発生し、第1の貯蔵器および第2の貯蔵器からポンプで送出される溶液の比率が、上述のフィードバックコントロールシステムによって、外部から定めて調節する勾配により保持されていないpH勾配が維持されるように変動することを可能にするpHフローセルを通るミキサーからの溶離液を流すステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
最低の初期pHの少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤(該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される初期pHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からミキサー中にポンプで送出される異なるpHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
pHに依存する電圧信号が発生し、第1の貯蔵器および第2の貯蔵器からポンプで送出される溶液の比率が、上で議論したフィードバックコントロールシステムによって、外部から定めて調節する勾配により保持されていないpH勾配が維持されるように変動することを可能にするpHフローセルを通るミキサーからの溶離液を流すステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
初期pHの少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラム(前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)と、
初期pHの前記少なくとも1種のバッファー成分を含む第1の溶液を含有する第1の貯蔵器と、
初期pHとは異なるpHの前記少なくとも1種のバッファー成分を含む第2の溶液を含有する第2の貯蔵器と、
第1および第2の溶液を前記第1の溶液の所定の容量を含有する混合チャンバー中にポンピングするための第1の貯蔵器ポンプおよび第2の貯蔵器ポンプ(前記第1の貯蔵器ポンプおよび前記第2の貯蔵器ポンプのポンピング速度は、制御された流速で外部で定めた溶離液pH勾配を形成するべく調節される)と、
pH測定装置が混合チャンバー中に浸されたpH電極である制御された流速で外部で定めた溶離液pH勾配の形成を監視および補正する上述のフィードバックコントロールシステムと、
当該混合溶液を混合チャンバーから制御された流速でポンピングするための手段と
を備えている。
最高の初期pHで、少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤(該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器から混合チャンバー中にポンプで送出される異なるpHの前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
pH依存性の電圧信号を発生する混合チャンバー中に浸したpH電極を用いて溶離液のpHを測定するステップと、
第1の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度および第2の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度を、外部から範囲を限定して調節する勾配により保持されていないpH勾配が維持されるように、pH電極からの電圧信号およびうえで議論したフィードバックコントロールシステムを利用することによって補正するステップと、
溶離液を混合チャンバーから陰イオン交換吸着剤を含有するカラムを通して供給するステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
最低の初期pHの少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤(該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器から混合チャンバー中にポンプで送出される異なるpHの前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップと、
pH依存性の電圧信号を発生する混合チャンバー中に浸したpH電極を用いて溶離液のpHを測定するステップと、
第1の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度および第2の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度を、外部から範囲を限定して調節する勾配により保持されていないpH勾配が維持されるように、pH電極からの電圧信号およびフィードバックコントロールシステムを利用することによって補正するステップと、
溶離液を、陽イオン交換吸着剤を含有するカラムを通して供給するステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
他に明示しない限り、本明細書で使用されている技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の熟練者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似したまたは同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載されている。
から直接得られる。解離のエンタルピー(ΔH)対気体定数Rの比は、カルボン酸基に対する約600からアミノ基に対する約5500まで変化する。
Mono S陽イオン交換体による見掛けのpI=1.7019×[(Mono Q陰イオン交換体による見掛けのpI)−1.9034]または、別法では
Mono Q陰イオン交換体による見掛けのpI=0.5506×[(Mono S陽イオン交換体による見掛けのpI)+1.3516]
最高の初期pHで、少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤(該陰イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に所定の最小pHに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を所定の最小pHから所定の最大pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
最低の初期pHの少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤(該陽イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ)に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に所定の最大pHに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を所定の最大pHから所定の最小pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
分離すべき荷電分子を、後に陽イオン交換吸着剤が続く陰イオン交換吸着剤(または、補完の態様においては、後に陰イオン交換吸着剤が続く陽イオン交換吸着剤)に適用し、その結果、その2つの吸着剤が、少なくとも1つの初期pHのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、3つの荷電の種類、すなわち、初期pHより低い見掛けのpIを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期pHで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期pHより高い見掛けのpIを有する荷電分子は正に帯電したものの1つに分類されるステップと、
初期pHで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHでいずれの吸着剤にも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期pHにおける接続を互いから切り離すステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、初期pHに始まる時間依存的に減少するpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、初期pHに始まる時間依存的に増加するpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップとを含む。
実施例で登場するすべてのクロマトグラフ分離は、コンピュータ制御のACTAFPLC高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステム(Amersham Pharmacia Biothech、ウプサラ、スウェーデン)により行い、それは、P−920ポンプ装置、ミキサーM−925、UPC900監視装置、Hg光学素子、5mmフローセル、伝導度セルおよびフラクションコレクターFrac−900を装備している。タンパク質のカラムからの溶離は、280nmまたは254nmにおける溶出液UV吸光度により監視した。各分離の間に1または0.5mlの画分を回収し、それらのpHを、実験の完了直後にPHM82標準pHメーター(Radiometer、コペンハーゲン、デンマーク)により測定した。カラム、Mono Q HR 5/5強陰イオン交換体、Mono S HR 5/5強陽イオン交換体およびMono P HR 5/20弱陰イオン交換体は、Amersham Pharmacia Biotechから購入した。トリエタノールアミンは、Sigma(セントルイス、ミズーリ州、米国)から、イミノ二酢酸、ピペラジン、メチルピペラジンおよびギ酸は、Aldrich(ミルウォーキー、ウィスコンシン州、米国)から、ビス−トリスプロパンは、ICN Biomedicals Inc.(アーヴィン、カリフォルニア州、米国)から、Polybuffer96、Polybuffer74は、Amersham Pharmacia Biotechからである。タンパク質は、Sigma(セントルイス、ミズーリ州、米国)およびCalbiochem(サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)から入手し、さらなる精製はしないで使用した。pH勾配形成溶液は、バッファーの種類を必要な濃度で水に溶解し、それらのそれぞれのpHまで塩酸で滴定し、最終容積まで希釈し、0.45μmのフィルターを通して真空ろ過することにより各実験前に新たに用意した。特に別の指示がない限り、すべて分離は、以下の手順を使用して行った。分離すべきタンパク質の1ないし2mgを、開始時pHのバッファーに溶解し、0.45μmの低タンパク質結合性フィルターを通してろ過した。各分離の前に、カラムを少なくとも10カラム体積分の開始バッファーで平衡化させた(溶出液のpHが開始バッファーのpHと同じになるまで)。タンパク質試料を次にカラムの入口に注入し、結合していない物質を除去するために、カラムを3ないし5カラム体積の開始バッファーにより洗浄した(溶出液中に検出される吸光度の変化がなくなるまで)。その後ポンプを停止することなく、コンピュータ制御の外部勾配クロマトフォーカシング(逆クロマトフォーカシング)分離を、ACTAFPLCシステムのソフトウェア(Unicorn V.3)による前もってプログラムされたクロマトグラフ方法を実行することにより実施した。その方法に包含されていた情報は、溶離液の流速、カラムに適用される前もって形成された外部pH勾配の長さおよび形状、カラムの特性、ならびに前段の溶離および後段の溶離時間に関するものである。
強陰イオン交換体Mono Q HR5/5による室温における複雑なタンパク質の混合物の外部勾配クロマトフォーカシング分離。開始バッファーA−5mMのメチルピペラジン、5mMのピペラジン、5mMのTE pH9.5、最終バッファーB−5mMのメチルピペラジン、5mMのピペラジン、5mMのTE pH3.5。流速1ml/分、0%Bから100%Bまでの直線状勾配形成の長さ40カラム体積。この実施例における外部勾配を形成するために使用された3成分のバッファーシステムは、極端ではない非直線性のpHプロフィールを示している(図1、パネルB,点線)。試料の複雑性、いくつもの種類のpIが接近していることおよびすべての化合物を分離するために必要な広いpH範囲にもかかわらず、すばらしい分離が達成されている(図1、パネルAおよびB)。
本発明の4成分バッファーシステムを用いる強陰イオン交換体Mono Q HR 5/5による室温における外部勾配クロマトフォーカシングにより分離した実施例1におけるのと同じ組成のタンパク質混合物。開始バッファーA−4mMのトリス−ビスプロパン、4mMのメチルピペラジン、4mMのピペラジン、4mMのTE pH9.5、最終バッファーB−4mMのトリス−ビスプロパン、4mMのメチルピペラジン、4mMのピペラジン、4mMのTE pH3.5。流速1ml/分、0%Bから100%Bまでの直線状勾配形成の長さ40カラム体積。分離における改良は顕著ではないが、勾配形成溶液(AおよびB)にビス−トリスプロパンを加えることによりpHプロフィールがより一層直線になっている(図2、パネルB,点線)。図2、パネルAは、分離されたタンパク質種類のUV吸光度対pHを示している。
酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ0.2mgの2つの変異体の弱および強陰イオン交換体による内部保持pH勾配クロマトフォーカシングと外部pH勾配クロマトフォーカシングの分離の比較。パネルA Pharmacia Amersham Biotechにより提供されたPolybuffersおよびMono P HR5/20カラムによるクロマトフォーカシング。平衡化バッファーA−25mMのTE イミノ二酢酸によるpH8.3 溶離バッファーB−6mlのPolybuffer96+14mlのPolybuffer74、イミノ二酢酸によるpH5 200mlに希釈。内部保持pH勾配を発生させ、タンパク質を1ml/分の流速の12カラム体積のPolybufferにより溶離した。図3パネルB。
pH4からpH9.5までの広範な直線状pH勾配(図4B、点線)および本発明の4成分バッファーシステムを用いる強陽イオンカラムMono S HR 5/5によるタンパク質混合物の外部pH勾配逆クロマトフォーカシング。STIおよびβ−ラクトグロブリンが、この実施例では非常に良く分離されるが、実施例2で示したように、同じバッファーシステムを使用する同じpH範囲にわたる陰イオンカラムでは分離が困難であることに注意することが重要である。これは、利用できる2つの機能、クロマトフォーカシングおよび逆クロマトフォーカシング、を有することの1つの重要な理由を明示している。
この実施例は、非常に広いpH範囲にわたって、外部勾配クロマトフォーカシングおよび逆クロマトフォーカシングにより荷電分子を分離するために使用される強力なバッファーシステムを示している。その外部勾配は、溶離液1ミリリットル当たり0.10pH単位の直線状pH勾配を維持するように前もってプログラムされている(パネルB、曲線1、3)。両方の技術において観察される平均のpH変化は、溶離液1ミリリットル当たり0.10pH単位(パネルA、曲線1、3)である。その外部勾配は、次のようにして前もってプログラムして形成した:1.クロマトフォーカシングにおいて−58カラム体積で0%のBから90%のBと、15カラム体積で90から100%までのBと,その後100%のBの7カラム体積が続く(パネルB曲線1);2.逆クロマトフォーカシングにおいて−15カラム体積で100%のBから90%のBと、66カラム体積で90から0%までのBと,その後0%のBの7カラム体積が続く(パネルB曲線3)。溶出液の吸光度は、バッファー種の低い吸収性を示し、したがって、両方の技術によって分離した際のバッファーシステムが荷電分子の分光学的検出に対して有する影響が無視できる254nmで監視した(パネルA曲線2、4)。溶出液伝導度の直線状の変化(パネルB曲線2、4)および直線状pHプロフィール(パネルA曲線1、3)は、両方とも、前もって形成された外部pH勾配の形状に対するMono QおよびMono Sカラム樹脂の妨害が低いことを反映している。流速1ml/分。
この実施例は、外部pH勾配クロマトフォーカシングおよび逆クロマトフォーカシングにより荷電分子を分離するための典型的なクロマトグラフシステムのブロックダイヤグラムを示し、イオン交換カラムに送るpH勾配の形成を監視および調整する自動フィードバックシステムを含む(図6に例示)。このクロマトグラフシステムは、フィードバック源として、pHフローセル(図6、パネルA)またはミキサーチャンバーに組み込まれているpH電極(図6、パネルB)のいずれかを利用することができる。どちらの場合も、そのpH測定装置は、実際のpH勾配の前もってプログラムされたpH勾配からの偏差を補正するために勾配形成溶液のポンピング速度を調節するフィードバックコントローラにpHに依存する電圧信号を送る。これらのシステムの間の違いは、ミキサーチャンバーシステムにおいては、時間依存のpHにより生じた溶離液が、追加のポンプによってミキサーチャンバーからイオン交換カラムに送られることである。そのミキサーチャンバーシステムは、異なる容量のチャンバーを使用することができるために、実際のpH勾配の前もってプログラムされたpH勾配からの大きなpHの偏差を防ぐことができる。ミキサーチャンバー中で滴定される溶液の容積が大きいほどpHを変えるのはより困難である。この技術の実際の応用では、強酸溶液と弱塩基溶液との、または、強塩基溶液と弱酸溶液との任意の組み合わせを使用してpH勾配を形成することが可能である。
この実施例は、複合外部勾配クロマトフォーカシング技術の汎用性を説明する。2つのカラム、Mono Q強陰イオン交換カラムおよびMono S強陽イオン交換カラムを連続して接続し、開始pH7で平衡化させる。最初のステップでヒトトランスフェリンおよびβlgを注入し、陰イオン交換体に結合させる。2番目のEGCFステップで、pH7からpH4までのpH勾配を展開させ、タンパク質を分離して陰イオン交換体から溶離させ、直ちに陽イオン交換体に結合させる。EGCFの完了と同時に、2つのカラムを互いから切り離し、Mono Qカラムを流路から除去する。最終のEGRCFステップにおいて、pH4からpH7.5まで展開されたpH勾配によって、タンパク質を陽イオン交換体から溶離する。パネルAは、後にEGRCFステップ(破線)が続く最初のEGCFステップ(実線)に基づく吸光度およびpHの変化を図示している。パネルBは、後に2番目のEGRCFステップ(破線)が続く最初のEGCFステップ(実線)の間のpHの関数としての吸光度および伝導度の変化を示している。CEGCF法は、EGRCFにより開始し、同様にEGCFにより終了する逆の順序で実施することができる。
Claims (102)
- 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
陰イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ最高の初期pHで、少なくとも3種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも3種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも3種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
陽イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期pHで、バッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される初期pHとは異なるpHの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 荷電分子がタンパク質である請求項1または2に記載の方法。
- 溶媒が水である請求項1または2に記載の方法。
- バッファー成分が、重複するpKaを有しており、各成分のモル比率が初期pHと最終pHの間の変遷を通して一定に維持される請求項1または2に記載の方法。
- 各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも1つの官能基を含有している請求項5に記載の方法。
- バッファー成分が、ピペラジン、1−メチルピペラジン、トリエタノールアミンおよびビス−トリスプロパンを含んでいる請求項5に記載の方法。
- 陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂からなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂である請求項8に記載の方法。
- 陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂および弱陽イオン交換樹脂からなる群から選択される請求項2に記載の方法。
- 陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂である請求項10に記載の方法。
- 初期pHと初期pHとは異なるpHの間の差が、約1単位から約12単位までである請求項1または請求項2に記載の方法。
- 外部で定めた傾きが、ほぼ直線勾配または非直線勾配である請求項1または請求項2に記載の方法。
- 初期pHが、初期pHとは異なるpHより高い請求項1に記載の方法。
- 初期pHが、初期pHとは異なるpHより低い請求項2に記載の方法。
- 荷電分子を加えるところから分離した荷電分子を収集するところまで吸着剤に沿って上昇する温度勾配が存在するように吸着剤を加熱することをさらに含む請求項1または請求項2に記載の方法。
- 温度勾配の範囲が、0℃と80℃の間である請求項16に記載の方法。
- 荷電分子を加えるところから分離した荷電分子を収集するところまで吸着剤に沿って下降する温度勾配が存在するように吸着剤を冷却することをさらに含む請求項1または請求項2に記載の方法。
- 温度勾配の範囲が、0℃と80℃の間である請求項18に記載の方法。
- 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する方法であって、
イオン交換吸着剤に、前記荷電分子を温度T0で加えるステップと、
前記イオン交換吸着剤に、初期pHのバッファー成分を含む溶媒を含浸させるステップであって、ここでイオン交換吸着剤は荷電分子と反対の電荷をもつ、ステップと、
イオン交換吸着剤の温度をT1に変化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される初期pHとは異なるpHの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを有する溶離液を、前記イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれがイオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップであって、T0とT1の間の差が0℃と80℃の間であるステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する方法であって、
イオン交換吸着剤に、温度T0において、初期pHのバッファー成分を含む溶媒を含浸させるステップであって、ここでイオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、ステップと、
イオン交換吸着剤の温度をT1に変化させるステップと、
分離すべき荷電分子をイオン交換吸着剤に加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される初期pHとは異なるpHの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを有する溶離液を、前記イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれがイオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップであって、T0とT1の間の差が0℃と80℃の間であるステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をイオン交換樹脂でクロマトグラフィーにより分離するためのバッファー組成物であって、予め定めたpHの前記組成物が別の予め定めたpHの前記組成物により滴定するとき、その2つの組成物の混合物のpHの変化が、その2つの組成物のそれぞれによって表される混合物の画分に直線的に正比例するような少なくとも3つのバッファー組成物の水溶液を含む組成物。
- 予め定めたpHと別の予め定めたpHの間の差が、1から10のpH単位である請求項22に記載の組成物。
- pHをイオン交換カラムの出口で測定する請求項22に記載の組成物。
- 各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも1つの官能基を含有している請求項22に記載の組成物。
- 各バッファー成分が0.001mMから1000mMの濃度で存在する請求項22に記載の組成物。
- バッファー成分が、ピペラジン、1−メチルピペラジン、トリエタノールアミンおよびビス−トリスプロパンを含んでいる請求項22に記載の組成物。
- 荷電分子を分離するためのクロマトグラフシステムであって、
初期pHの少なくとも3種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期pHの前記少なくとも3種のバッファー成分を含む第1の溶液を含有する第1の貯蔵器と、
初期pHとは異なるpHの前記少なくとも3種のバッファー成分を含む第2の溶液を含有する第2の貯蔵器と、
前記第1および第2の溶液の外部で作製した混合物を送り込んで外部で定めたpH勾配を吸着剤に形成させ、カラム内に保持されていないpH勾配を出現させる手段と
を備えたシステム。 - カラム内の保持されていないpH勾配が、直線状である請求項28に記載のシステム。
- カラム内の保持されていないpH勾配が、非直線状である請求項28に記載のシステム。
- カラム内の非直線状のpH勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項30に記載のシステム。
- 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
陰イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ最高の初期pHで、少なくとも3種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される初期pHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも3種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される異なるpHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも3種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
陽イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期pHで、バッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される初期pHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される初期pHとは異なるpHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - バッファー成分が、重複するpKaを有しており、各成分のモル比率が初期pHと最終pHの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項32または33に記載の方法。
- バッファー成分が、ピペラジン、1−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよびギ酸を含んでいる請求項33に記載の方法。
- 荷電分子を分離するためのクロマトグラフシステムであって、
初期pHの少なくとも3種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期pHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記少なくとも3種のバッファー成分を含む第1の溶液を含有する第1の貯蔵器と、
初期pHとは異なるpHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記少なくとも3種のバッファー成分を含む第2の溶液を含有する第2の貯蔵器と、
前記第1および第2の溶液の外部で作製した混合物を送り込んで外部で定めた初期pHから最終pHまでのpH勾配を形成させ、カラム内に保持されていないpH勾配を出現させる手段と
を備えたシステム。 - クロマトグラフシステムによって発生する前もってプログラムされた時間依存性pH勾配におけるpH偏差を自動的に補正するためのフィードバック制御システムであって、
測定pHの既知関数である出力電圧を生ずるpH測定装置と、
フィードバック制御装置であって、
適切に短時間の間隔の入力として、クロマトグラフシステムによって発生する溶離液のpHを監視するpH測定装置から電圧を受け取り、その電圧を、前もってプログラムされた時間依存性pH勾配の予想されるpH値に対応するセットポイント電圧と比較し、
その絶対値が誤差と見なされる入力電圧(すなわち測定pH)とセットポイント電圧(すなわち予想pH)の間の差を計算し、かつ
クロマトグラフシステムの勾配を発生させるポンプのポンピング速度を、誤差の絶対値が最小となるように、適宜電流または電圧いずれかとしての訂正信号を計算するための任意の既知のフィードバックアルゴリズムを使用して調節する
制御装置と
を備えたシステム。 - 荷電分子を分離するためおよびカラム内に調節された保持されていないpH勾配を出現させるためのクロマトグラフシステムであって、
初期pHの少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期pHの前記少なくとも1種のバッファー成分を含む第1の溶液を含有する第1の貯蔵器と、
初期pHとは異なるpHの前記少なくとも1種のバッファー成分を含む第2の溶液を含有する第2の貯蔵器と、
第1および第2の溶液を混合するための第1の貯蔵器ポンプおよび第2の貯蔵器ポンプであって、前記第1の貯蔵器ポンプおよび前記第2の貯蔵器ポンプのポンピング速度は、制御された流速で外部で定めた溶離液pH勾配を形成するべく調節される、ポンプと、
pH測定装置がpHフローセルである、制御された流速で外部で定めた溶離液pH勾配の形成を監視および補正する請求項37に記載のフィードバックコントロールシステムと
を備えたシステム。 - カラム内の調節された保持されていないpH勾配が、直線状である請求項38に記載のシステム。
- カラム内の調節された保持されていないpH勾配が、非直線状である請求項38に記載のシステム。
- カラム内の調節された非直線状のpH勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項40に記載のシステム。
- pHフローセルが、第1および第2溶液が混合される場所から下流に位置する請求項38に記載のシステム。
- 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期pHで、少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される初期pHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からミキサー中にポンプで送出される異なるpHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
pHに依存する電圧信号が発生し、第1の貯蔵器および第2の貯蔵器からポンプで送出される溶液の比率が、請求項37に記載のフィードバックコントロールシステムによって、外部から定め調節する勾配により保持されていないpH勾配が維持されるように変動することを可能にするpHフローセルを通ってミキサーから溶離液を流すステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期pHで、少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される初期pHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からミキサー中にポンプで送出される異なるpHのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
pHに依存する電圧信号が発生し、第1の貯蔵器および第2の貯蔵器からポンプで送出される溶液の比率が、請求項37に記載のフィードバックコントロールシステムによって、外部から定め調節する勾配により保持されていないpH勾配が維持されるように変動することを可能にするpHフローセルを通ってミキサーから溶離液を流すステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 少なくとも1種のバッファー成分が、少なくとも2つの成分であるとき、該複数成分が、重複するpKaを有しており、各成分のモル比率が初期pHと最終pHの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項43または44に記載の方法。
- 少なくとも1種のバッファー成分が、少なくとも2つの成分であるとき、成分の1つが強酸であるかまたは強塩基であり、各成分のモル比率が初期pHと最終pHの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項43または44に記載の方法。
- 荷電分子を分離するためおよびカラム内に調節された保持されていないpH勾配を生じさせるためのクロマトグラフシステムであって、
初期pHの少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期pHの前記少なくとも1種のバッファー成分を含む第1の溶液を含有する第1の貯蔵器と、
初期pHとは異なるpHの前記少なくとも1種のバッファー成分を含む第2の溶液を含有する第2の貯蔵器と、
第1および第2の溶液を前記第1の溶液の所定の容量を含有する混合チャンバー中にポンピングするための第1の貯蔵器ポンプおよび第2の貯蔵器ポンプであって、前記第1の貯蔵器ポンプおよび前記第2の貯蔵器ポンプのポンピング速度は、制御された流速で外部で定めた溶離液pH勾配を形成するべく調節される、ポンプと、
pH測定装置が混合チャンバー中に浸されたpH電極である、制御された流速で外部で定めた溶離液pH勾配の形成を監視および補正する請求項37に記載のフィードバックコントロールシステムと、
当該混合溶液を混合チャンバーから制御された流速でポンピングするための手段と
を備えたシステム。 - カラム内の調節された保持されていないpH勾配が、直線状である請求項47に記載のシステム。
- カラム内の調節された保持されていないpH勾配が、非直線状である請求項47に記載のシステム。
- カラム内の調節された非直線状のpH勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項49に記載のシステム。
- 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期pHで、少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器から混合チャンバー中にポンプで送出される異なるpHの前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
pH依存性の電圧信号を発生する混合チャンバー中に浸したpH電極を用いて溶離液のpHを測定するステップと、
第1の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度および第2の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度を、外部から定め調節する勾配により保持されていないpH勾配が維持されるように、pH電極からの電圧信号および請求項37に記載のフィードバックコントロールシステムを利用することによって補正するステップと、
溶離液を混合チャンバーから陰イオン交換吸着剤を含有するカラムを通して供給するステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期pHの少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器から混合チャンバー中にポンプで送出される異なるpHの前記の少なくとも1種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップと、
pH依存性の電圧信号を発生する混合チャンバー中に浸したpH電極を用いて溶離液のpHを測定するステップと、
第1の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度および第2の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度を、外部から定め調節する勾配により保持されていないpH勾配が維持されるように、pH電極からの電圧信号および請求項37に記載のフィードバックコントロールシステムを利用することによって補正するステップと、
溶離液を陽イオン交換吸着剤を含有するカラムを通して供給するステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 少なくとも1種のバッファー成分が、少なくとも2つの成分であるとき、該複数成分が、重複するpKaを有しており、各成分のモル比率が初期pHと最終pHの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項43、44、51または52のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種のバッファー成分が、少なくとも2つの成分であるとき、成分の1つが強酸であるかまたは強塩基であり、各成分のモル比率が初期pHと最終pHの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項43、44、51または52のいずれか一項に記載の方法。
- 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期pHで、少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、両方の交換体を最高の初期pHで平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に所定の最小pHに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を所定の最小pHから所定の最大pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期pHの少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、両方の交換体を最低の初期pHで平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導き、かつ
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に所定の最大pHに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を所定の最大pHから所定の最小pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、後に陽イオン交換吸着剤が直列に接続されている陰イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その2つの吸着剤が、少なくとも1つの初期pHのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこでそれぞれの分離すべき荷電分子が、3つの荷電の種類、すなわち、初期pHより低い見掛けのpIを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期pHで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期pHより高い見掛けのpIを有する荷電分子は正に帯電したものの1つに分類されるステップと、
初期pHで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで陽イオン交換吸着剤または陰イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陰イオン交換吸着剤と陽イオン交換吸着剤との初期pHにおける接続を互いから切り離すステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、初期pHに始まる時間依存的に減少するpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、初期pHに始まる時間依存的に増加するpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、後に陰イオン交換吸着剤が直列に接続されている陽イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その2つの吸着剤が、少なくとも1つの初期pHのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこでそれぞれの分離すべき荷電分子が、3つの荷電の種類、すなわち、初期pHより低い見掛けのpIを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期pHで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期pHより高い見掛けのpIを有する荷電分子は正に帯電したものの1つに分類されるステップと、
初期pHで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期pHにおける接続を互いから切り離すステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、初期pHに始まる時間依存的に増加するpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、初期pHに始まる時間依存的に減少するpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - カラム内の保持されていないpH勾配が直線状である請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- カラム内の保持されていないpH勾配が非直線状である請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- カラム内の非直線状のpH勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項60に記載の方法。
- 荷電分子がタンパク質である請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 溶媒が水である請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- バッファー成分が、重複するpKaを有しており、各成分のモル比率が初期pHと最終pHの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも1つの官能基を含有している請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 各バッファー成分が0.001mMから1000mMの濃度で存在する請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- バッファー成分が、ピペラジン、1−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよびギ酸を含んでいる請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 陰イオン交換吸着剤を、強陰イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂である請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 陽イオン交換吸着剤を、強陽イオン交換樹脂および弱陽イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂である請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 初期pHと初期pHとは異なるpHの間の差が、>0単位から約12単位までである請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 分離すべき分子を加えるところから分離した分子を収集するところまで1または複数の吸着剤に沿って上昇する温度勾配が存在するように第1の吸着剤または第2の吸着剤または両方の吸着剤を加熱することをさらに含む請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 温度勾配の範囲が、0℃と80℃の間である請求項73に記載の方法。
- 分離すべき分子を加えるところから分離した分子を収集するところまで1または複数の吸着剤に沿って降下する温度勾配が存在するように第1の吸着剤または第2の吸着剤または両方の吸着剤を冷却するステップをさらに含む請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
- 温度勾配の範囲が、0℃と80℃の間である請求項75に記載の方法。
- 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陽イオン交換吸着剤の温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T0の溶媒中で測定した最高の初期pHで平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度T0で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度T0で所定の最小pHに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最小pHから所定の最大pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陰イオン交換吸着剤の温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T0の溶媒中で測定した最低の初期pHで平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度T0で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度T0で所定の最大pHに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最大pHから所定の最小pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T1で変化させた最高の初期pHにおいて平衡化させるステップと、
温度T1の第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、温度T1の第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度T1で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T1で所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度T1で所定の最小pHに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最小pHから所定の最大pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T1で変化させた最高の初期pHにおいて平衡化させるステップと、
温度T1の第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、温度T1の第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度T1で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T1で所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度T1で所定の最大pHに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最大pHから所定の最小pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最小pHに達するまで陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陽イオン交換体の温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T0で測定した最高の初期pHにおいて平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度T0で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度T0で所定の最小pHに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最小pHから所定の最高の初期pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最高の初期pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
陽イオン交換樹脂の温度をT2に変化させるステップと、
温度T2における所定の最高の初期pHから所定の2番目の最大pHまで時を合わせて増大するpH勾配を有する陽イオン交換吸着剤を含浸させ続けるステップと、
それぞれがその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から、温度T2において前記所定の2番目の最大pHに達するまで別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
増大しつつあるpH勾配を使用する溶離が後に続く段階的な温度の変化を繰り返し、それぞれが最終温度Tfに達するまで陽イオン交換吸着剤から時を合わせて別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
所定の最後から2番目の最大pHから所定の究極の最大pHまで時を合わせて増大するpH勾配を有する陽イオン交換吸着剤の含浸を継続するステップと、
それぞれが別々に最終温度Tfで究極の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期pHおよび温度T0における少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陰イオン交換体の温度をT1に変化させ、両方の交換体を温度T0で測定した最低の初期pHにおいて平衡化させるステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度T0で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度T1でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度T0で所定の最大pHに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度T1における所定の最大pHから所定の最低の初期pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度T1で所定の最低の初期pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
陰イオン交換樹脂の温度をT2に変化させるステップと、
温度T2における所定の最低の初期pHから所定の2番目の最小pHまで時を合わせて減少するpH勾配を有する陰イオン交換吸着剤を含浸させ続けるステップと、
それぞれがその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から、温度T2において前記所定の2番目の最小pHに達するまで別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
増大しつつあるpH勾配を使用する溶離が後に続く段階的な温度の変化を繰り返し、それぞれが最終温度Tfに達するまで陰イオン交換体から時を合わせて別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
所定の最後から2番目の最小pHから所定の究極の最小pHまで時を合わせて減少するpH勾配を有する陰イオン交換吸着剤の含浸を継続するステップと、
それぞれが別々に最終温度Tfで究極の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、温度T0の陰イオン交換吸着剤に、続いて温度T1で直列に接続されている陽イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その2つの吸着剤が、少なくとも1つの温度T0で測定される初期pHのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、3つの荷電の種類、すなわち、初期pHより低い見掛けのpIを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期pHで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期pHより高い見掛けのpIを有する荷電分子は正に帯電したものの少なくとも1つに分類されるステップと、
初期pHで負に帯電した荷電分子を温度T0で陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで正に帯電した荷電分子を温度T1で陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで温度T0で陰イオン交換吸着剤または温度T1で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期pHにおける接続を互いから切り離すステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、温度T0で測定して初期pHに始まる時間依存的に減少するpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで温度T0で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度T0で最終の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、温度T1で測定して初期pHに始まる時間依存的に増加するpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで温度T1で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度T1で最終の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、温度T0の陽イオン交換吸着剤に、続いて温度T1で直列に接続されている陰イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その2つの吸着剤が、少なくとも1つの温度T0で測定される初期pHのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、3つの荷電の種類、すなわち、初期pHより低い見掛けのpIを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期pHで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期pHより高い見掛けのpIを有する荷電分子は正に帯電したものの1つに分類されるステップと、
初期pHで正に帯電した荷電分子を温度T0で陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで負に帯電した荷電分子を温度T1で陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期pHで温度T0で陰イオン交換吸着剤または温度T1で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期pHにおける接続を互いから切り離すステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、温度T0で測定して初期pHに始まる時間依存的に増加するpHを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで温度T0で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度T0で最終の最大pHに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される、温度T1で測定して初期pHに始まる時間依存的に減少するpHを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで温度T1で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度T1で最終の最小pHに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - カラム内の保持されていないpH勾配が直線状である請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- カラム内の保持されていないpH勾配が非直線状である請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- カラム内の非直線状のpH勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項86に記載の方法。
- 荷電分子がタンパク質である請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- 溶媒が水である請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- バッファー成分が、重複するpKaを有しており、各成分のモル比率が初期pHと最終pHの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- 各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも1つの官能基を含有している請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- 各バッファー成分が0.001mMから1000mMの濃度で存在する請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- バッファー成分が、ピペラジン、1−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよびギ酸を含んでいる請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- 陰イオン交換吸着剤を、強陰イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- 陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂である請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- 陽イオン交換吸着剤を、強陽イオン交換樹脂および弱陽イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- 陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂である請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- 初期pHと初期pHとは異なるpHの間の差が、>0単位から約12単位までである請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- 温度勾配の範囲が、0℃と80℃の間である請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
- 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
温度T0で測定した最高の初期pHにおける少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるものであって、前記陰イオン交換吸着剤を、前記溶媒が吸着剤に入るときの温度である温度T1から前記溶媒が吸着剤を出るときの温度である温度T2までの温度勾配の下におくステップと、
陰イオン交換吸着剤の後に、陰イオン交換吸着剤からの溶出液が陽イオン交換体に入るときの陽イオン交換吸着剤の温度である温度T3から前記溶出液が陽イオン交換体を出るときの温度である温度T4までの温度勾配の下におく陽イオン交換吸着剤を直列に接続し、温度T0で測定した最高の初期pHにおける両方のイオン交換体を平衡化させるステップと、
温度T0の第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、温度T0の第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、温度T1から温度T2の勾配にかけた前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で測定した所定の最小pHに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、さらに分離されるように、温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を、温度T0で測定した所定の最小pHに達するまで温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤を温度T0で測定した所定の最小pHから所定の最大pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に、温度T0で測定して所定の最大pHに達するまで、その実効等電点において温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤から、溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - 異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
温度T0で測定した最低の初期pHにおける少なくとも1種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるものであって、前記陽イオン交換吸着剤を、前記溶媒が吸着剤に入るときの温度である温度T1から前記溶媒が吸着剤を出るときの温度である温度T2までの温度勾配の下におくステップと、
陽イオン交換吸着剤の後に、陽イオン交換吸着剤からの溶出液が、陰イオン交換体に入るときの陰イオン交換吸着剤の温度である温度T3から前記溶出液が陰イオン交換体を出るときの温度である温度T4までの温度勾配の下におく陰イオン交換吸着剤を直列に接続し、温度T0で測定した最低の初期pHにおける両方のイオン交換体を平衡化させるステップと、
温度T0の第1の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも1種のバッファー成分を含有する初期pHの溶液を、温度T0の第2の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも1種のバッファー成分を含有するpHの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のpHを有する溶離液を、温度T1から温度T2の勾配にかけた前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないpH勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度T0で測定した所定の最大pHに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、さらに分離されるように、温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を、温度T0で測定した所定の最大pHに達するまで温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤を温度T0で測定した所定の最大pHから所定の最小pHまで展開するように含浸させてpH勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に、温度T0で測定して所定の最小pHに達するまで、その実効等電点において温度T3から温度T4までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤から、溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。 - n∈{0,1,2,3,4}およびm∈{0,1,2,3,4}の場合に、任意の一組の温度についての温度差の絶対値|Tn〜Tm|が0℃から80℃の範囲である、請求項100または請求項101に記載の方法。
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