CN111440234B - 水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水牛乳β‑酪蛋白抗氧化物的制备方法，包括以下步骤：水牛乳脱脂，加热、调节pH值后加入氯化钙溶液，所得沉淀进行清洗；清洗后沉淀加超纯水溶解、冷却、调节pH值、离心，所得的上清液加热、调节pH值、离心，得到β‑CN沉淀；β‑CN沉淀透析脱盐、冻干；得β‑CN蛋白粉。将β‑CN蛋白粉利用碱性蛋白酶进行酶解，得水牛乳β‑酪蛋白抗氧化物。该水牛乳β‑酪蛋白抗氧化物具有较强的抗氧化能力。
Description
技术领域
本发明属于新型抗氧化肽的分离纯化及相关产品开发，具体涉及一种水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法。
背景技术
生物活性肽是对身体功能或状况产生积极影响并最终影响健康的特定蛋白质片段。酶解法是制备生物活性肽的常用方法之一，其原理是通过切割蛋白质特定位点来释放具有活性的多肽片段。机体内小肽比游离氨基酸吸收地更多，代谢速率更快，许多肽甚至还具有蛋白质或其组成氨基酸所没有的新特性。已有大量研究表明乳源性活性肽可以在人体中发挥抗高血压、抗氧化、抗血栓、降低胆固醇、抗菌和免疫调节等作用[1]。其中抗氧化活性肽是被研究的较广泛的一个方向，由于某些化学合成类抗氧化剂(丁基羟基甲苯和丁基羟基茴香醚等)对人体健康有害，因此寻求有效、无毒的天然抗氧化剂(如抗氧化肽)便得到了社会的广泛认可。
水牛是世界上最主要的反刍动物之一，资源丰富。与传统荷斯坦牛乳相比，水牛乳富含蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质和共轭亚油酸，营养价值更高。酪蛋白是牛乳蛋白质的主要成分，占总蛋白的80％左右，在酪蛋白中，β-CN又是最主要蛋白之一，占35％左右[2]。对牛乳源活性肽的制备和结构研究已经比较成熟，但关于水牛乳蛋白源活性肽的研究还较少。水牛乳源生物活性肽的研究可以为功能性乳制品的开发提供理论依据和技术支撑，还可以增加我国水牛资源的开发与利用，促进奶水牛业的发展和水牛乳加工技术的转型升级。
参考文献：
[1]Korhonen H.Milk-derived bioactive peptides:From science toapplications[J].Journal of Functional Foods.2009,1(2):177-187；
[2]王强.水牛CSN1S1多态性对泌乳品质及马苏里拉干酪品质的影响研究[D].东北农业大学,2015。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法，即，提供了一种具有抗氧化活性的水牛乳β-酪蛋白(β-CN)的制备方法，从而实现从水牛乳β-CN中释放出具备抗氧化的活性肽。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法，包括依次进行以下步骤：
S1、水牛乳β-CN的制备：
S1.1、将水牛乳于(4±1)℃离心，从而除去上层的脂肪，得脱脂乳：
S1.2、将脱脂乳加热到(30±2)℃，先调节pH值至(11.0±0.2)，再加入0.5M氯化钙溶液，接着调节pH值至(7.0±0.2)，离心(从而除去上清液)，得沉淀；
每100g的脱脂乳配用(15±2)ml的0.5M氯化钙溶液；
S1.3、溶解--调节pH值--离心：将沉淀用超纯水溶解，调节pH值至(7.0±0.2)后离心；
再重复上述溶解--调节pH值--离心1～3次(即，共2～4次)，得清洗后沉淀；
说明：超纯水的用量只需要使得沉淀能溶解即可；
S1.4、将清洗后沉淀加超纯水溶解，冷却到2～4℃，调节pH值至(4.5±0.2)，离心，得到上清液；
将上清液加热至(35±2)℃，调节pH值至(4.6±0.2)，离心(从而除去上清液)，得到β-CN沉淀；
说明：超纯水的用量只需要使得清洗后沉淀能溶解；
S1.5、将β-CN沉淀溶于超纯水中，装入分子截留量为8000～14000Da的透析袋内，将透析袋放入超纯水中透析48h，每隔8h换一次超纯水；得β-CN溶液(位于透析袋内)；
β-CN沉淀与超纯水的料液比为1g/30～50ml；
S1.6、将β-CN溶液冷冻干燥，得β-CN蛋白粉；
S2、蛋白酶酶解：
S2.1、将β-CN蛋白粉配制成质量浓度2.0％～3.0％的水溶液，先于(80±10)℃加热(10±1)min，再冷却至室温；
接着调节pH值至(8.0±0.2)，(55±2)℃预热8～12分钟后加入碱性蛋白酶于(100±10)r/min保温酶解(即，酶解温度同上述预热温度)，酶解时间为120～210min，得酶解液；整个酶解过程中始终控制pH值为(8.0±0.2)；
碱性蛋白酶的添加量为：6000～10000U/gβ-CN蛋白粉(作为底物)；
说明：酶解时间到后，沸水浴10min灭酶，从而结束酶解；
S2.2、将酶解液离心，取上清液，pH调至中性，得到含有水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的溶液。
作为本发明的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法的改进：S2还包括以下步骤：
S2.3、将S2.2制备所得的含有水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的溶液进行冷冻干燥，得水牛乳β-酪蛋白抗氧化物。
作为本发明的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法的进一步改进：
所述S1.1～S1.4中的离心均为：(4000±500)r/min离心(15±2)min。
步骤S2.2中的离心为：(8000±500)r/min离心(15±2)min。
作为本发明的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法的进一步改进：
所述S1.2，采用5M氢氧化钠溶液/5M盐酸溶液进行pH值的调节；
所述S1.3，采用1M氢氧化钠溶液/1M盐酸溶液进行pH值的调节；
所述S1.4，采用0.1M氢氧化钠溶液/0.1M盐酸溶液进行pH值的调节。
作为本发明的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法的进一步改进：
S1.6和S2.3的冷冻干燥均为真空冷冻干燥；所述真空冷冻干燥为：于-40℃～-80℃冷冻干燥24～48小时，真空度为0.01～0.3mbar。
作为本发明的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法的进一步改进：水牛乳为广西水牛乳。
作为本发明的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法的进一步改进：所述氯化钙为食品级氯化钙。
本发明以酶解液的抗氧化能力作为产物性能的主要评价标准。
在本发明中，碱性蛋白酶可购自上海源叶生物技术科技有限公司，酶活力为200U/mg。
本发明步骤S1的分离提纯的技术路线如下：
水牛乳→离心脱脂→加热到(30±2)℃→调节pH至(11.0±0.2)→加入0.5M氯化钙→调节pH至(7.0±0.2)→离心→沉淀清洗→溶解后冷却→调节pH至(4.5±0.2)→离心→上清液→加热到(35±2)℃→调节pH至(4.6±0.2)→离心→β-CN沉淀→透析脱盐→冻干。
本发明，在发明过程中，考察了碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶酶解水牛乳β-CN的效果，最终发现：碱性蛋白酶酶解水牛乳β-CN，效果最佳。
本发明中，各项性能检测方法具体如下：
实验一、水解度测定：
称取0.2g的β-CN蛋白粉(步骤S1所得)，消煮后，用自动凯氏定氮仪测定其含氮量，然后根据蛋白含量＝含氮量×6.38，计算获得β-CN的总蛋白含量P。
用电子天平准确称取0.0052g D-丝氨酸于50mL容量瓶中定容，使其浓度为1mM，再分别稀释至0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mM，用来配制标准溶液。OPA试剂配制：取160mg邻苯二甲醛(OPA)，用4mL无水乙醇于黑暗处避光溶解，再取7.620g四硼酸钠、0.2g十二烷基硫酸钠(SDS)、176mg二硫代苏糖醇加水溶解，然后全部转移至200mL棕色容量瓶中加水定容至200mL，现用现配。
OPA法测吸光度的具体方法如下，将水牛乳β-酪蛋白抗氧化物(S2所得)稀释80倍后作为待测液，取0.4mL待测液或D-丝氨酸标准溶液与3mL OPA溶液混合均匀，同时用秒表开始计时，在2min时测定波长为340nm的吸光度，并绘制标准曲线。用0.4mL超纯水代替待测液作为空白对照组，以2min时空白对照组的OD340调零，每组做3个平行。根据公式计算DH，公式如下：
式中：
WSerine NH2：每克蛋白质含serine NH2的量，mM/g；
C：样品OD值相对于标曲中D-丝氨酸的浓度，M；
说明：以D-丝氨酸标准溶液的OD值为纵坐标，以D-丝氨酸标准溶液的相应浓度为横坐标，得到D-丝氨酸的标准曲线(如图2所示)；将待测液所得的OD值代入该标准曲线，从而获得C。
V：样品体积，L；
N：样品稀释倍数，80；
X：样品质量，g；
P：样品中蛋白质量分数，％；
h：水解过程中每克蛋白被断裂的肽键数，mM/g；
α：酪蛋白为1.039；
β：酪蛋白为0.383；
htot：酪蛋白为8.2。
经检测，在本发明设定的酶解条件下，所得的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的水解度可高达49.81％。
实验二、FRAP法测定抗氧化能力：
配制一系列浓度为0～500μM的硫酸亚铁溶液(水溶液)、300mM醋酸—醋酸钠缓冲液(pH 3.6)，20mM氯化铁水溶液以及10mM 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ缓冲液，用40mM的盐酸配制)。将不同浓度梯度的硫酸亚铁溶液、10mM TPTZ缓冲液和300mM醋酸-醋酸钠缓冲液按1:1:10体积比混合，吸取170μL混合液加入酶标板中，在酶标仪中升温至37℃，于593nm处读取吸光值。每组做3个平行。
以硫酸亚铁溶液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，如图4所述。
将新鲜配制的20mM氯化铁溶液、10mM TPTZ缓冲液和300mM醋酸-醋酸钠缓冲液按1:1:10体积比混合，作为TPTZ-Fe工作液。吸取150μL TPTZ-Fe工作液加入酶标板中，放入酶标仪中升温至37℃，之后向各孔中加入20μL待测样品(即，步骤S2.2制备所得的含有水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的溶液)，超纯水作为空白对照。10min后分别于593nm处读取吸光值，样品吸光值为At，空白对照吸光值为A0。由At-A0的值在标准曲线(图4)上相对应硫酸亚铁的浓度定义为FRAP值，结果表示为μM FeSO4。用FRAP值的大小来反映抗氧化物质的活性大小。
本发明所提供的含有水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的溶液FRAP值(铁离子还原能力)为大于90μM FeSO4。
实验三、β-CN碱性蛋白酶水解后耐高温和耐消化
将S1所得的β-CN配制成3％(质量％)的水溶液，在pH为8.0、温度为55℃时酶解，总酶剂量为9 000U/g，酶解时间为150min。将酶解液冷冻干燥，得到多肽粉，再将多肽粉配制成浓度为3.0％(质量％)的水溶液，然后进行温度、pH和体外模拟消化测定。
3.1、温度对抗氧化性影响
将3.0％的酶解液分别在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的条件下加热，分别处理1h，采用FRAP法测定其在1h后的抗氧化性，结果表示为1h与0h的FRAP值的差值。
3.2、pH对抗氧化性影响
将3.0％的酶解液用1M HCl和1M NaOH将pH分别调至为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、和12.0，分别处理3h后将pH调至7.0，采用FRAP法测定其抗氧化性，测定过程中始终保持室温。结果表示为3h与0h的FRAP值的差值。
3.3、体外模拟消化对抗氧化性影响
配制模拟胃液(SGF)，即2g/L NaCl，并将pH调整为1.2，配制模拟肠液(SIF)，即0.68％K2HPO4，并用2M NaOH调整至pH 6.8。先将样品与模拟胃液按2:1体积比混合，用6MHCl酸化至pH 1.5，先在37℃恒温水浴振荡器中预热10min，然后加入胃蛋白酶(3.2mg/mL的SGF)，分别在0min(G0)、15min(G15)、30min(G30)、45min(G45)和60min(G60)取样并通过FRAP法测定抗氧化性。60min胃消化完后将剩余样品与提前37℃预热好的模拟肠液按照体积比1:1混合，用2M NaOH将pH调节至7.0，加入胆汁提取物(5mg/mL的SIF)和胰蛋白酶(1.6mg/mL的SIF)，在37℃恒温水浴振荡器进行，分别在0min(I0)、30min(I30)、60min(I60)、90min(I90)和120min(I120)采用FRAP法测定抗氧化性。
结果数据如表1～表3所示。
表1、温度对β-CN酶解产物抗氧化性的影响
| 处理温度(℃) | FRAP(μM FeSO<sub>4</sub>) |
| 20 | 245 |
| 40 | 219 |
| 60 | 219 |
| 80 | 141 |
| 100 | 65 |
表2、pH对β-CN酶解产物抗氧化性的影响
| 处理pH | FRAP(μM FeSO<sub>4</sub>) |
| 2 | 102 |
| 4 | 193 |
| 6 | 226 |
| 8 | 279 |
| 10 | 206 |
表3、胃肠消化对β-CN酶解产物抗氧化性的影响
上述结果表明本发明的酶解产物对温度、pH值和消化有一定的耐受能力。
综上所述，本发明通过对酶解条件进行优化，提供了一套从水牛乳β-CN中高效制备抗氧化活性肽的方法。本发明首先从脱脂水牛乳中制备水牛乳β-CN，即，将新鲜水牛乳脱脂后利用选择性沉淀法分离β-CN，经透析和冷冻干燥后制得水牛乳β-CN；再将β-CN进行酶解及相应的后处理，得水牛乳β-酪蛋白抗氧化物。
本发明具有如下技术优势：
(1)工艺操作简单、快速、条件温和、易于工业化规模生产；
(2)原料制备工艺成熟方便，β-CN得率高，能达到14％；所述得率为β-CN与作为原料的水牛乳的重量比。
(3)抗氧化肽数量多、抗氧化能力强；
(4)抗氧化物感官良好、品质稳定、可直接作为多肽添加剂应用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为水牛乳β-CN的分离效果图；
泳道从左到右分别是α--CN标准品、β-CN标准品、marker、水牛乳β-CN。
图2为D-丝氨酸标准曲线。
图3为CaCl2添加量对水牛乳β-CN分离效果的影响。
图4为FeSO4标准曲线。
图5为不同酶的酶解时间对酶解产物水解度的影响。
图6为不同酶解时间对酶解产物抗氧化性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下案例中，水牛乳选用广西水牛乳，氯化钙选用食品级氯化钙。
实施例1、水牛乳β-CN的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、将水牛乳用离心机4℃、4000r/min、离心15min后，从而除去上层脂肪，得脱脂乳；
2)、先将100g脱脂乳加热到30℃，然后用5M氢氧化钠溶液调节pH值至11.0，再加入15ml的0.5M氯化钙溶液，接着用5M氢氧化钠溶液/5M盐酸溶液调节pH值至7.0，4000r/min离心15min后除去上清液，得沉淀；
3)、溶解--调节pH值--离心：将沉淀用超纯水溶解后，调节pH值至7.0后离心(4000r/min、离心15min)；
再重复上述溶解--调节pH值--离心2次(即，共3次)，得清洗后沉淀；
说明：此步骤中，超纯水的用量只需要使得沉淀能溶解；采用1M氢氧化钠/1M盐酸进行pH值调节。
4)、将清洗后沉淀加超纯水溶解(超纯水的用量只需要使得清洗后沉淀能溶解即可)，冷却到2℃，调节pH值至4.5，4 000r/min离心15min，得到上清液；
将上清液加热至35℃，调节pH值至4.6，4000r/min离心15min，从而除去上清液，得到β-CN沉淀；
说明：此步骤中，用0.1M氢氧化钠溶液/0.1M盐酸溶液进行pH值调节；
5)、按照β-CN沉淀：超纯水＝1g/30ml的料液比，将β-CN沉淀溶于超纯水中，装入分子截留量为8000～14000Da的透析袋内，将透析袋放入300mL的超纯水中透析48h，每隔8h换一次超纯水，得β-CN溶液(于透析袋内)；
6)、将β-CN溶液冷冻干燥(于-40℃～-80℃冷冻干燥24～48小时，真空度为0.01～0.3mbar)，得β-CN蛋白粉约14g。
因此，β-CN得率约为14％。
将β-CN蛋白粉、α-CN标准品、β-CN标准品按照SDS-PAGE法进行检测；所得结果如图1所述。根据图1，可得知：本发明分离出的β-CN纯度最高。
对比例1、将实施例1“水牛乳β-CN的制备方法”的步骤2)中0.5M氯化钙溶液的用量由15ml分别改成5ml、10ml、20ml、25ml、30ml；其余等同于实施例1。β-CN得率如下表4所述。
表4
将上述对比例1、实施例1所得的β-CN、α-CN标准品、β-CN标准品按照SDS-PAGE法进行检测；所得结果如图3所述。根据图3，可得知：0.5M氯化钙溶液的用量为15％时，分离出的β-CN效果最好。
实施例2-1、蛋白酶酶解：
1)、将β-CN蛋白粉(实施例1制备而得)配制成浓度为2.0％(质量％)的水溶液，80℃加热10min，冷却至室温，得蛋白溶液。
先将蛋白溶液调至最适pH 8.0，55℃预热10min，然后按照6 000U/g底物的酶添加量加入碱性蛋白酶，保温(55℃)条件下于100r/min恒温振荡水浴锅中进行酶解，酶解时间150min。酶解过程中始终控制pH 8.0。
说明：此步骤中可采用0.1M氢氧化钠进行pH值调节。6 000U/g底物代表：每1g作为底物的β-CN蛋白粉配用6 000U碱性蛋白酶。
反应时间到达后，将其沸水浴10min灭酶，以终止反应，冷却到室温，得酶解液。
2)、将酶解液8000r/min离心15min，取上清液，pH调至中性，得到含有水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的溶液。
说明：此步骤中采用0.1M氢氧化钠/0.1M盐酸进行pH值调节。
水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的水解度为44.86％；FRAP值为125±1.18μM FeSO4。
实施例2-2、
改变实施例2-1步骤1)中的酶解时间，其余等同于实施例2-1；不同酶解时间下，水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的水解度的对比如图5所述，FRAP值的对比如图6所述。
实施例2-3、
将实施例2-1中的酶添加量由“6000U/g底物”改成“10000U/g底物”，且将酶解时间由150min改成120min(10000U/g底物浓度下的优选时间)，其余等同于实施例2-1。
最终制得的酶解液水解度为42.67％，FRAP值为119±1.72μM FeSO4。
实施例2-4、
将实施例2-1中的酶添加量由“6000U/g底物”改成“8000U/g底物”，且将酶解时间由150min改成120min(8000U/g底物浓度下的优选时间)，其余等同于实施例2-1。
最终制得的酶解液水解度为42.13％，FRAP值为119±0.60μM FeSO4。
实施例2-5、
将β-CN蛋白粉配制成浓度为3.0％(质量％)的水溶液，且将酶解时间由150min改成120min(3％浓度下的优选时间)。其余等同于实施例2-1。
最终制得的酶解液水解度为27.90％，FRAP值为102±2.07μM FeSO4。
对比例2、将实施例2-1中的碱性蛋白酶分别改成木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；设定不同的酶解时间；预热/酶解温度、酶添加量均设定为其对应的优选值；其余参照实施例2-1。所得结果如图5～图6所述。
碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶在各自优选酶解条件下进行酶解的工艺参数及酶解液的FRAP值的对比如下表5所述。
表5
对比例3
将β-CN蛋白粉配制成浓度为3.0％(质量％)的水溶液，80℃加热10min，冷却至室温，得蛋白溶液。
先将蛋白溶液调至最适pH 8.0，55℃预热10min，然后按照9000U/g底物的酶用量加入碱性蛋白酶后，立即将其沸水浴10min灭酶，以终止反应，冷却到室温，8000r/min离心15min，取上清液，pH调至中性，得到水牛乳酪蛋白酶解液。FRAP值约为0μM FeSO4。
根据此对比例，可得知：未酶解的β-CN基本没有抗氧化性，酶解之后才具有较高的抗氧化性。
对比例4、将实施例1制备而得的β-CN蛋白粉在步骤1)中的水解温度(包括预热温度)由“55℃”改成“37℃”，酶解时间改为210min，其余等同于实施例2-1。
所得结果为：酶解液水解度为33％，FRAP值为67.73μM FeSO4。明显低于本发明。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法，其特征在于包括依次进行以下步骤：
S1、水牛乳β-CN的制备：
S1.1、将水牛乳于(4±1)℃离心，从而除去上层的脂肪，得脱脂乳；
水牛乳为广西水牛乳；
S1.2、将脱脂乳加热到(30±2)℃，先调节pH值至(11.0±0.2)，再加入0.5M氯化钙溶液，接着调节pH值至(7.0±0.2)，离心，得沉淀；
每100g的脱脂乳配用(15±2)ml的0.5M氯化钙溶液；
S1.3、溶解--调节pH值--离心：将沉淀用超纯水溶解，调节pH值至(7.0±0.2)后离心；
再重复上述溶解--调节pH值--离心1～3次，得清洗后沉淀；
所述S1.2，采用5M氢氧化钠溶液/5M盐酸溶液进行pH值的调节；
所述S1.3，采用1M氢氧化钠溶液/1M盐酸溶液进行pH值的调节；
所述S1.4，采用0.1M氢氧化钠溶液/0.1M盐酸溶液进行pH值的调节；
S1.4、将清洗后沉淀加超纯水溶解，冷却到2～4℃，调节pH值至(4.5±0.2)，离心，得到上清液；
将上清液加热至(35±2)℃，调节pH值至(4.6±0.2)，离心，得到β-CN沉淀；
S1.5、将β-CN沉淀溶于超纯水中，装入分子截留量为8000～14000Da的透析袋内，将透析袋放入超纯水中透析48h，每隔8h换一次超纯水；得β-CN溶液；
β-CN沉淀与超纯水的料液比为1g/30～50ml；
S1.6、将β-CN溶液冷冻干燥，得β-CN蛋白粉；
S2、蛋白酶酶解：
S2.1、将β-CN蛋白粉配制成质量浓度2.0％的水溶液，先于80℃加热10±min，再冷却至室温；
接着调节pH值至8.0，55℃预热10分钟后加入碱性蛋白酶于100r/min保温酶解，酶解时间为150min，得酶解液；整个酶解过程中始终控制pH值为8.0；
碱性蛋白酶的添加量为：6000U/gβ-CN蛋白粉；
S2.2、将酶解液离心，取上清液，pH调至中性，得到含有水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的溶液；其具有铁离子还原能力。
2.根据权利要求1所述的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法，其特征在于：S2还包括以下步骤：
S2.3、将S2.2制备所得的含有水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的溶液进行冷冻干燥，得水牛乳β-酪蛋白抗氧化物。
3.根据权利要求1或2所述的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法，其特征在于：
所述S1.1～S1.4中的离心均为：(4000±500)r/min离心(15±2)min；
步骤S2.2中的离心为：(8000±500)r/min离心(15±2)min。
4.根据权利要求1或2所述的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法，其特征在于：
S1.6和S2.3的冷冻干燥均为真空冷冻干燥；所述真空冷冻干燥为：于-40℃～-80℃冷冻干燥24～48小时，真空度为0.01～0.3mbar。
5.根据权利要求4所述的水牛乳β-酪蛋白抗氧化物的制备方法，其特征在于：所述氯化钙为食品级氯化钙。
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