CN112210579B - 一种罗非鱼钙离子结合肽及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法与应用。所述制备方法包括以下步骤：对罗非鱼加工废弃物进行预处理；然后使用罗非鱼内源酶与商业蛋白酶复配酶解；超滤分离；固定化金属亲和层析；活性肽与钙离子结合物的制备，得到所述罗非鱼钙离子结合肽。采用本发明方法制备的罗非鱼钙离子结合肽具有促进钙离子转运吸收的生物活性，此外，本发明中公开的上述罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，工艺较为简单，产品安全，可应用于实际生产中。

Description

一种罗非鱼钙离子结合肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于矿物离子结合肽技术领域，具体涉及一种罗非鱼钙离子结合肽及其制备方法与应用。
背景技术
肽-矿物离子结合物是一种含有矿物离子的有机化合物，它是由矿物离子与肽通过螯合反应制备而得的，其能够借助肽类在机体内的吸收机制提高矿物离子的生物利用率，具备无机态矿物离子所没有的生理生化特性。目前，以人体必需的微量元素与肽螯合后制得的螯合物已成为一种新型矿物离子补充剂，越来越受到人们的重视。
我国是罗非鱼生产大国，其产量位居世界首位。目前，罗非鱼的加工主要以加工成鱼片产品为主，在此过程中会产生大量的加工废弃物，如零碎肉、鱼皮、鱼肠等，大多被当成饲料、肥料甚至被丢弃，亟待高值化利用。目前利用罗非鱼加工废弃物制备高附加值的钙离子结合肽的方法尚未见报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种罗非鱼钙离子结合肽及其制备方法与应用。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将罗非鱼加工后产生的零碎肉浸泡在NaOH溶液中，洗涤，沥干后绞成罗非鱼零碎肉肉糜；
(2)原料预处理：将罗非鱼加工后产生的鱼皮浸泡在NaOH溶液中，洗涤，沥干后绞成罗非鱼鱼皮肉糜；
(3)将步骤(1)所述罗非鱼零碎肉肉糜与步骤(2)所述罗非鱼鱼皮肉糜混合，得到混合肉糜，将所述混合肉糜加入去离子水中，混合均匀，得到混合液；将混合液的pH值调节为7.0-9.0，然后加入复配蛋白酶，进行酶解反应，然后灭酶处理，离心取上清液，得到酶解液；
(4)将步骤(3)所述酶解液通过超滤膜，取滤过液；将滤过液通过固定化钙离子亲和层析柱，然后用pH值为7.0-7.5的流动相冲洗2-3个柱体积，再用pH值为4.0-6.0的流动相进行洗脱，收集洗脱液，然后进行透析处理，浓缩，得到罗非鱼活性肽溶液；
(5)将钙盐加入步骤(4)所述罗非鱼活性肽溶液中，混合均匀，得到混合物，调节所述混合物的pH值为6.0-10.0，在超声波的作用下进行螯合反应，透析，浓缩，干燥，得到所述罗非鱼钙离子结合肽。
进一步地，步骤(1)所述NaOH溶液的质量百分比浓度为0.1-0.5wt％；所述浸泡的温度为30-60摄氏度，浸泡的时间为0.5-2.0h。
优选地，步骤(1)所述洗涤为用水洗涤至滤液呈中性。
进一步地，步骤(2)所述NaOH溶液的质量百分比浓度为0.5-2.0wt％；所述浸泡的温度为25-40摄氏度，浸泡的时间为1.0-3.0h。
优选地，步骤(2)所述洗涤为用水洗涤至滤液呈中性。
进一步地，步骤(3)所述罗非鱼零碎肉肉糜与罗非鱼鱼皮肉糜的质量比为1:0.5-3；所述混合肉糜与水的质量比为1:1-3；所述复配蛋白酶为罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶中的一种以上，所述复配蛋白酶的质量为混合肉糜质量的0.2-1wt％；所述酶解反应的温度为50-60摄氏度，酶解反应的时间为4-8小时；所述灭酶处理的温度为85-95摄氏度，灭酶处理的时间为15-40min；所述离心的速率为4000-10000rpm，离心的时间为15-40min，离心的温度为4摄氏度。
优选地，步骤(3)所述复配蛋白酶为罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶三种酶联合使用。
进一步优选地，步骤(3)所述复配蛋白酶为罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶三种酶联合使用；所述罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶的质量比(w/w/w)为1：1：1。
进一步优选地，步骤(3)所述复配蛋白酶为罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶三种酶联合使用；所述罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶的质量比(w/w/w)为1：1：2。
进一步优选地，步骤(3)所述复配蛋白酶为罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶三种酶联合使用；所述罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶的质量比(w/w/w)为2:1:1。
进一步优选地，步骤(3)所述复配蛋白酶为罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶三种酶联合使用；所述罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶的质量比(w/w/w)为1:2:1。
进一步地，步骤(3)所述罗非鱼内源酶的制备，包括如下步骤：
取罗非鱼鱼肠，用去离子水洗涤，然后加入磷酸缓冲液中进行匀浆破碎，超声提取处理，得到匀浆液，将所述匀浆液进行离心处理，取上清液，冷冻干燥得到所述罗非鱼内源酶。
优选地，所述洗涤为用水洗涤至滤液呈中性。
进一步地，所述磷酸缓冲液的pH值为7.5-8.5，所述磷酸缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/L；所述罗非鱼鱼肠与磷酸缓冲液的质量体积比(w/v)为1:4-1:6g/mL；所述超声提取处理的频率为20Khz，超声提取处理的温度为30-45摄氏度，超声提取处理的时间为30-90min；所述离心处理的速率为8000-10000rpm，离心处理的时间为20-40min，离心处理的温度为4-25摄氏度。
优选地，所述超声提取处理的功率为100-500W，超声提取处理的温度为35摄氏度。
优选地，离心处理的温度为4摄氏度。
进一步地，步骤(4)所述超滤膜的截留分子量为1-10kDa；所述pH值为7.0-7.5的流动相为氢氧化钠溶液；所述pH值为4.0-6.0的流动相为盐酸溶液；所述透析处理为采用截留分子量为100Da的透析袋进行；所述透析处理的时间为24小时，透析处理的温度为4-20摄氏度；所述罗非鱼活性肽溶液的质量百分比浓度为2wt％-15wt％。
优选地，步骤(4)所述透析处理的时间为24小时，透析处理的温度为4摄氏度。
进一步地，步骤(5)所述钙盐为氯化钙及硫酸钙中的一种以上，所述钙盐与罗非鱼活性肽溶液的蛋白质量比为1:1-30；所述在超声波的作用下的超声频率为20KHz，；所述螯合反应的温度为30-80摄氏度，所述螯合反应的时间为10-120min；所述透析采用截留分子量为100-200Da的透析袋进行；所述透析的时间为12-48h，透析的温度为4-20摄氏度。
优选地，步骤(5)所述超声波的功率为200W-1200W。
优选地，步骤(4)、(5)所述的浓缩为真空浓缩，所述的干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的罗非鱼钙离子结合肽。
本发明提供的罗非鱼钙离子结合肽能够应用在制备矿物离子补充剂中。
本发明公开了一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法与应用。所述制备方法包括以下步骤：原料预处理；(2)罗非鱼内源酶与商业蛋白酶复配酶解；(3)超滤分离；(4)固定化金属亲和层析；(5)活性肽与钙离子结合物的制备；采用本发明方法制备的罗非鱼钙离子结合肽具有促进钙离子转运吸收的生物活性，此外，本发明中公开的上述罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，工艺较为简单，产品安全，可应用于实际生产中。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的制备方法，所用的原料为罗非鱼加工过程中产生的废弃物(零碎肉、鱼皮、鱼肠)来制备具有高附加值的钙离子结合肽。
(2)本发明提供的罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，使用罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶对罗非鱼组织进行处理，得到的多肽具有良好的钙螯合能力(钙离子结合率达85-95％)，制得的罗非鱼钙离子结合肽的钙含量为60-70mg/g。
(3)本发明提供的罗非鱼钙离子结合肽，其制备工艺较为简便，产品安全，可应用于实际生产。
(4)本发明提供的制备方法中，酶解反应后得到的罗非鱼活性肽分子量为850-600Da，容易被人体吸收。
附图说明
图1是肽-钙结合物在Caco2细胞上的吸收图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗非鱼加工后产生的零碎肉浸泡在质量百分比浓度为0.2wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为40℃，浸泡的时间为1h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼零碎肉肉糜；
(2)将罗非鱼加工后产生的鱼皮浸泡在质量百分比浓度为1.5wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为35℃，浸泡的时间为3h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼鱼皮肉糜；
(3)取罗非鱼鱼肠，用去离子水洗涤，然后加入浓度为0.04mol/L磷酸缓冲液(pH值为8.0)中进行匀浆破碎，所述罗非鱼鱼肠与磷酸缓冲液的质量体积比为1:5g/mL，超声提取处理(超声频率为20kHz，温度为35℃，时间为40min)，得到匀浆液，将所述匀浆液进行离心处理，离心处理的温度为4℃，离心处理的时间为30min，离心处理的转速为8000rpm，取上清液，冷冻干燥得到罗非鱼内源酶；
(4)将步骤(1)所述罗非鱼零碎肉肉糜与步骤(2)所述罗非鱼鱼皮肉糜混合，所述罗非鱼零碎肉肉糜与罗非鱼鱼皮肉糜的质量比为1:2，得到混合肉糜，将所述混合肉糜加入去离子水中，所述混合肉糜与水的质量比为0.5：1，混合均匀，得到混合液；将所述混合液的pH值调节为8.0，然后加入复配蛋白酶(由罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶组成，质量比为1:1:1)，所述复配蛋白酶的质量为混合肉糜质量的0.5wt％，进行酶解反应，酶解反应的温度为55℃，酶解反应的时间为6h，然后灭酶处理(95℃水浴条件下加热20min)，离心取上清液(转速为8000rpm，温度为4摄氏度，时间为20min)，得到酶解液；
(5)将步骤(4)所述酶解液通过截留分子量为1kDa的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过固定化钙离子亲和层析柱，然后用pH值为7.5的流动相(氢氧化钠溶液)冲洗3个柱体积，再用pH值为6.0的流动相(盐酸溶液)进行洗脱，收集洗脱液，然后进行透析处理，透析处理使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析处理的时间为24小时，透析处理的温度为4℃，浓缩，得到罗非鱼活性肽溶液，所述罗非鱼活性肽溶液的浓度为2wt；
(6)将钙盐(选用氯化钙)加入步骤(5)所述罗非鱼活性肽溶液中，所述钙盐与罗非鱼活性肽溶液的蛋白质量比为1:5，混合均匀，得到混合物，调节所述混合物的pH值为8.0，在超声波的作用下(超声频率为20kHz)进行螯合反应，螯合反应的温度为60℃，螯合反应的时间为30min，透析至透析液中检测不出盐离子，透析使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析的时间为24小时，透析的温度为4℃，真空浓缩，冷冻干燥，得到所述罗非鱼钙离子结合肽。
钙离子结合率的测定
取一定体积的透析后的未透过液于消化管(经硝酸浸泡过夜)，加入10ml浓硝酸进行微波消解，用超纯水将消解液定容到50ml，将上述溶液稀释到适当倍数，用电感耦合等离子体质谱测定溶液中的钙离子含量，结合率按式(1)进行计算。
钙离子结合率(％)＝(C×V×n)/m×100％(1)
式中：C：为透析后钙离子的浓度(ug/L)；V：为总膨胀体积(ml)；m：为加入钙总质量(mg)；n：为稀释倍数
钙螯合活性按以下公式(2)进行计算,表示为每克蛋白螯合钙的毫克数(mg/g)。
钙螯合活性(mg/g)＝C/P
式中:CC:钙螯合活性(mg/g)；C:溶液中钙含量(mg)；P:溶液中蛋白含量(g)。
实施例1制得的罗非鱼钙离子结合肽，其钙结合率为93.12％，所述罗非鱼钙离子结合肽的钙螯合能力为67.11mg/g。
实施例2
一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗非鱼加工后产生的零碎肉浸泡在质量百分比浓度为0.3wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为35℃，浸泡的时间为1.5h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼零碎肉肉糜；
(2)将罗非鱼加工后产生的鱼皮浸泡在质量百分比浓度为1.0wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为30℃，浸泡的时间为2.5h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼鱼皮肉糜；
(3)取罗非鱼鱼肠，用去离子水洗涤，然后加入浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液(pH值为8.5)中进行匀浆破碎，所述罗非鱼鱼肠与磷酸缓冲液的质量体积比为1:4g/mL，超声提取处理(超声频率为20kHz，温度为35℃，时间为90min)，得到匀浆液，将所述匀浆液进行离心处理，离心处理的温度为4℃，离心处理的时间为30min，离心处理的转速为10000rpm，取上清液，冷冻干燥得到罗非鱼内源酶；
(4)将步骤(1)所述罗非鱼零碎肉肉糜与步骤(2)所述罗非鱼鱼皮肉糜混合，所述罗非鱼零碎肉肉糜与罗非鱼鱼皮肉糜的质量比为1:1，得到混合肉糜，将所述混合肉糜加入去离子水中，所述混合肉糜与水的质量比为1；1，混合均匀，得到混合液；将所述混合液的pH值调节为7.5，然后加入复配蛋白酶(由罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶组成，质量比为1:2:1)，所述复配蛋白酶的质量为混合肉糜质量的0.5wt％，进行酶解反应，酶解反应的温度为50℃，酶解反应的时间为8h，然后灭酶处理(90℃水浴条件下加热30min)，离心取上清液(转速为7000rpm，温度为4摄氏度，时间为30min)，得到酶解液；
(5)将步骤(4)所述酶解液通过截留分子量为3kDa的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过固定化钙离子亲和层析柱，然后用pH值为7.5的流动相(氢氧化钠溶液)冲洗3个柱体积，再用pH值为6.0的流动相(盐酸溶液)进行洗脱，收集洗脱液，然后进行透析处理，透析处理使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析处理的时间为24小时，透析处理的温度为4℃，浓缩，得到罗非鱼活性肽溶液，所述罗非鱼活性肽溶液的浓度为5wt；
(6)将钙盐(选用氯化钙)加入步骤(5)所述罗非鱼活性肽溶液中，所述钙盐与罗非鱼活性肽溶液的质量比为1:1，混合均匀，得到混合物，调节所述混合物的pH值为7.0，在超声波的作用下(超声频率为20kHz)进行螯合反应，螯合反应的温度为70℃，螯合反应的时间为60min，透析至透析液中检测不出盐离子，透析使用的透析袋的截留分子量为150Da，透析的时间为29小时，透析的温度为8℃，真空浓缩，冷冻干燥，得到所述罗非鱼钙离子结合肽。
实施例2制得的罗非鱼钙离子结合肽，其钙结合率为92.12％，所述罗非鱼钙离子结合肽的钙螯合能力为65.11mg/g，测试方法同实施例1。
实施例3
一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗非鱼加工后产生的零碎肉浸泡在质量百分比浓度为0.5wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为50℃，浸泡的时间为2h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼零碎肉肉糜；
(2)将罗非鱼加工后产生的鱼皮浸泡在质量百分比浓度为0.5wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为35℃，浸泡的时间为2.5h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼鱼皮肉糜；
(3)取罗非鱼鱼肠，用去离子水洗涤，然后加入浓度为0.03mol/L磷酸缓冲液(pH值为8.5)中进行匀浆破碎，所述罗非鱼鱼肠与磷酸缓冲液的质量体积比为1:4g/mL，超声提取处理(超声频率为20kHz，温度为35℃，时间为90min)，得到匀浆液，将所述匀浆液进行离心处理，离心处理的温度为4℃，离心处理的时间为25min，离心处理的转速为8000rpm，取上清液，冷冻干燥得到罗非鱼内源酶；
(4)将步骤(1)所述罗非鱼零碎肉肉糜与步骤(2)所述罗非鱼鱼皮肉糜混合，所述罗非鱼零碎肉肉糜与罗非鱼鱼皮肉糜的质量比为1:0.5，得到混合肉糜，将所述混合肉糜加入去离子水中，所述混合肉糜与水的质量比为1:3，混合均匀，得到混合液；将所述混合液的pH值调节为8.0，然后加入复配蛋白酶(由罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶组成，质量比为2:1:1)，所述复配蛋白酶的质量为混合肉糜质量的0.8wt％，进行酶解反应，酶解反应的温度为60℃，酶解反应的时间为7h，然后灭酶处理(90℃水浴条件下加热25min)，离心取上清液(转速为8000rpm，温度为4摄氏度，时间为20min)，得到酶解液；
(5)将步骤(4)所述酶解液通过截留分子量为1kDa的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过固定化钙离子亲和层析柱，然后用pH值为7.5的流动相(氢氧化钠溶液)冲洗2个柱体积，再用pH值为5.5的流动相(盐酸溶液)进行洗脱，收集洗脱液，然后进行透析处理，透析处理使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析处理的时间为24小时，透析处理的温度为4℃，浓缩，得到罗非鱼活性肽溶液，所述罗非鱼活性肽溶液的浓度为8wt；
(6)将钙盐(选用硫酸钙)加入步骤(5)所述罗非鱼活性肽溶液中，所述钙盐与罗非鱼活性肽溶液的质量比为1:3，混合均匀，得到混合物，调节所述混合物的pH值为7.5，在超声波的作用下(超声频率为20kHz)进行螯合反应，螯合反应的温度为55℃，螯合反应的时间为90min，透析至透析液中检测不出盐离子，透析使用的透析袋的截留分子量为200Da，透析的时间为48小时，透析的温度为20℃，真空浓缩，冷冻干燥，得到所述罗非鱼钙离子结合肽。
实施例3制得的罗非鱼钙离子结合肽，其钙结合率为94.12％，所述罗非鱼钙离子结合肽的钙螯合能力为68.11mg/g，测试方法同实施例1。
实施例4
一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗非鱼加工后产生的零碎肉浸泡在质量百分比浓度为0.2wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为30℃，浸泡的时间为2h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼零碎肉肉糜；
(2)将罗非鱼加工后产生的鱼皮浸泡在质量百分比浓度为1wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为30℃，浸泡的时间为2.0h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼鱼皮肉糜；
(3)取罗非鱼鱼肠，用去离子水洗涤，然后加入浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液(pH值为7.5)中进行匀浆破碎，所述罗非鱼鱼肠与磷酸缓冲液的质量体积比为1:4g/mL，超声提取处理(超声频率为20kHz，温度为35℃，时间为80min)，得到匀浆液，将所述匀浆液进行离心处理，离心处理的温度为4℃，离心处理的时间为25min，离心处理的转速为9000rpm，取上清液，冷冻干燥得到罗非鱼内源酶；
(4)将步骤(1)所述罗非鱼零碎肉肉糜与步骤(2)所述罗非鱼鱼皮肉糜混合，所述罗非鱼零碎肉肉糜与罗非鱼鱼皮肉糜的质量比为1:3，得到混合肉糜，将所述混合肉糜加入去离子水中，所述混合肉糜与水的质量比为1:1，混合均匀，得到混合液；将所述混合液的pH值调节为8.0，然后加入复配蛋白酶(由罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶组成，质量比为1:1:2)，所述复配蛋白酶的质量为混合肉糜质量的1wt％，进行酶解反应，酶解反应的温度为55℃，酶解反应的时间为8h，然后灭酶处理(85℃水浴条件下加热35min)，离心取上清液(转速为8000rpm，温度为4摄氏度，时间为20min)，得到酶解液；
(5)将步骤(4)所述酶解液通过截留分子量为1kDa的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过固定化钙离子亲和层析柱，然后用pH值为7.5的流动相(氢氧化钠溶液)冲洗2个柱体积，再用pH值为4.0的流动相(盐酸溶液)进行洗脱，收集洗脱液，然后进行透析处理，透析处理使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析处理的时间为24小时，透析处理的温度为4℃，浓缩，得到罗非鱼活性肽溶液，所述罗非鱼活性肽溶液的浓度为8wt；
(6)将钙盐(选用氯化钙)加入步骤(5)所述罗非鱼活性肽溶液中，所述钙盐与罗非鱼活性肽溶液的质量比为1:4，混合均匀，得到混合物，调节所述混合物的pH值为8.0，在超声波的作用下(超声频率为20kHz)进行螯合反应，螯合反应的温度为60℃，螯合反应的时间为90min，透析至透析液中检测不出盐离子，透析使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析的时间为24小时，透析的温度为4℃，真空浓缩，冷冻干燥，得到所述罗非鱼钙离子结合肽。
实施例4制得的罗非鱼钙离子结合肽，其钙结合率为93.87％，所述罗非鱼钙离子结合肽的钙螯合能力为67.63mg/g，测试方法同实施例1。
对比例1
一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗非鱼加工后产生的零碎肉浸泡在质量百分比浓度为0.2wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为40℃，浸泡的时间为1h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼零碎肉肉糜；
(2)将罗非鱼加工后产生的鱼皮浸泡在质量百分比浓度为1.5wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为35℃，浸泡的时间为3h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼鱼皮肉糜；
(3)取罗非鱼鱼肠，用去离子水洗涤，然后加入浓度为0.04mol/L磷酸缓冲液(pH值为8.0)中进行匀浆破碎，所述罗非鱼鱼肠与磷酸缓冲液的质量体积比为1:5g/mL，超声提取处理(超声频率为20kHz，温度为35℃，时间为40min)，得到匀浆液，将所述匀浆液进行离心处理，离心处理的温度为4℃，离心处理的时间为30min，离心处理的转速为8000rpm，取上清液，冷冻干燥得到罗非鱼内源酶；
(4)将步骤(1)所述罗非鱼零碎肉肉糜与步骤(2)所述罗非鱼鱼皮肉糜混合，所述罗非鱼零碎肉肉糜与罗非鱼鱼皮肉糜的质量比为1:2，得到混合肉糜，将所述混合肉糜加入去离子水中，所述混合肉糜与水的质量比为1:1，混合均匀，得到混合液；将所述混合液的pH值调节为8.0，然后加入罗非鱼内源酶，所述罗非鱼内源酶的质量为混合肉糜质量的0.5wt％，进行酶解反应，酶解反应的温度为55℃，酶解反应的时间为6h，然后灭酶处理(95℃水浴条件下加热20min)，离心取上清液(转速为8000rpm，温度为4摄氏度，时间为20min)，得到酶解液；
(5)将步骤(4)所述酶解液通过截留分子量为1kDa的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过固定化钙离子亲和层析柱，然后用pH值为7.5的流动相(氢氧化钠溶液)冲洗3个柱体积，再用pH值为6.0的流动相(盐酸溶液)进行洗脱，收集洗脱液，然后进行透析处理，透析处理使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析处理的时间为24小时，透析处理的温度为4℃，浓缩，得到罗非鱼活性肽溶液，所述罗非鱼活性肽溶液的浓度为2wt；
(6)将钙盐(选用氯化钙)加入步骤(5)所述罗非鱼活性肽溶液中，所述钙盐与罗非鱼活性肽溶液的质量比为1:2，混合均匀，得到混合物，调节所述混合物的pH值为8.0，在超声波的作用下(超声频率为20kHz)进行螯合反应，螯合反应的温度为60℃，螯合反应的时间为30min，透析至透析液中检测不出盐离子，透析使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析的时间为24小时，透析的温度为4℃，真空浓缩，冷冻干燥，得到所述罗非鱼钙离子结合肽。
对比例1制得的罗非鱼钙离子结合肽，其钙结合率为93.12％，所述罗非鱼钙离子结合肽的钙螯合能力为67.11mg/g。
对比例1制得的罗非鱼钙离子结合肽，其钙含量为85.42％，所述罗非鱼钙离子结合肽的钙螯合能力为61.27mg/g，测试方法同实施例1。
对比例2
一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗非鱼加工后产生的零碎肉浸泡在质量百分比浓度为0.2wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为40℃，浸泡的时间为1h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼零碎肉肉糜；
(2)将罗非鱼加工后产生的鱼皮浸泡在质量百分比浓度为1.5wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为35℃，浸泡的时间为3h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼鱼皮肉糜；
(3)将步骤(1)所述罗非鱼零碎肉肉糜与步骤(2)所述罗非鱼鱼皮肉糜混合，所述罗非鱼零碎肉肉糜与罗非鱼鱼皮肉糜的质量比为1:2，得到混合肉糜，将所述混合肉糜加入去离子水中，所述混合肉糜与水的质量比为1:1，混合均匀，得到混合液；将所述混合液的pH值调节为8.0，然后加入碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶的质量为混合肉糜质量的0.5wt％，进行酶解反应，酶解反应的温度为55℃，酶解反应的时间为6h，然后灭酶处理(95℃水浴条件下加热20min)，离心取上清液(转速为8000rpm，温度为4摄氏度，时间为20min)，得到酶解液；
(4)将步骤(3)所述酶解液通过截留分子量为1kDa的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过固定化钙离子亲和层析柱，然后用pH值为7.5的流动相(氢氧化钠溶液)冲洗3个柱体积，再用pH值为6.0的流动相(盐酸溶液)进行洗脱，收集洗脱液，然后进行透析处理，透析处理使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析处理的时间为24小时，透析处理的温度为4℃，浓缩，得到罗非鱼活性肽溶液，所述罗非鱼活性肽溶液的浓度为2wt；
(5)将钙盐(选用氯化钙)加入步骤(4)所述罗非鱼活性肽溶液中，所述钙盐与罗非鱼活性肽溶液的质量比为1:2，混合均匀，得到混合物，调节所述混合物的pH值为8.0，在超声波的作用下(超声频率为20kHz)进行螯合反应，螯合反应的温度为60℃，螯合反应的时间为30min，透析至透析液中检测不出盐离子，透析使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析的时间为24小时，透析的温度为4℃，真空浓缩，冷冻干燥，得到所述罗非鱼钙离子结合肽。
对比例2制得的罗非鱼钙离子结合肽，其钙含量为86.42％，所述罗非鱼钙离子结合肽的钙螯合能力为62.29mg/g，测试方法同实施例1。
对比例3
一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗非鱼加工后产生的零碎肉浸泡在质量百分比浓度为0.2wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为40℃，浸泡的时间为1h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼零碎肉肉糜；
(2)将罗非鱼加工后产生的鱼皮浸泡在质量百分比浓度为1.5wt％的NaOH溶液中，浸泡的温度为35℃，浸泡的时间为3h，用水洗涤至中性，沥干后绞成罗非鱼鱼皮肉糜；
(3)将步骤(1)所述罗非鱼零碎肉肉糜与步骤(2)所述罗非鱼鱼皮肉糜混合，所述罗非鱼零碎肉肉糜与罗非鱼鱼皮肉糜的质量比为1:2，得到混合肉糜，将所述混合肉糜加入去离子水中，所述混合肉糜与水的质量比为1:1，混合均匀，得到混合液；将所述混合液的pH值调节为8.0，然后加入菠萝蛋白酶，所述菠萝蛋白酶的质量为混合肉糜质量的0.5wt％，进行酶解反应，酶解反应的温度为55℃，酶解反应的时间为6h，然后灭酶处理(95℃水浴条件下加热20min)，离心取上清液(转速为8000rpm，温度为4摄氏度，时间为20min)，得到酶解液；
(4)将步骤(3)所述酶解液通过截留分子量为1kDa的超滤膜，取滤过液；将滤过液通过固定化钙离子亲和层析柱，然后用pH值为7.5的流动相(氢氧化钠溶液)冲洗3个柱体积，再用pH值为6.0的流动相(盐酸溶液)进行洗脱，收集洗脱液，然后进行透析处理，透析处理使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析处理的时间为24小时，透析处理的温度为4℃，浓缩，得到罗非鱼活性肽溶液，所述罗非鱼活性肽溶液的浓度为2wt；
(5)将钙盐(选用氯化钙)加入步骤(4)所述罗非鱼活性肽溶液中，所述钙盐与罗非鱼活性肽溶液的质量比为1:2，混合均匀，得到混合物，调节所述混合物的pH值为8.0，在超声波的作用下(超声频率为20kHz)进行螯合反应，螯合反应的温度为60℃，螯合反应的时间为30min，透析至透析液中检测不出盐离子，透析使用的透析袋的截留分子量为100Da，透析的时间为24小时，透析的温度为4℃，真空浓缩，冷冻干燥，得到所述罗非鱼钙离子结合肽。
对比例3制得的罗非鱼钙离子结合肽，其钙含量为83.42％，所述罗非鱼钙离子结合肽的钙螯合能力为60.17mg/g，测试方法同实施例1。
结果分析
通过上述的测试结果可发现，本发明提供的制备方法中，同时联用罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶对罗非鱼肉糜进行酶解反应，使得酶解更加充分，所需的时间更少，得到的多肽能够更好地与钙离子螯合，其中，实施例3制得的罗非鱼钙离子结合肽的钙含量达94.12％，超过市面常规的含钙产品；而通过实施例与对比例相比较，可发现，将罗非鱼的内源性酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶三种酶联合使用，实施例制得的多肽比对比例制得的罗非鱼钙离子结合肽效果要好，与钙离子螯合的能力更强。
Caco-2细胞单层模型评价促钙吸收效果
本实验Caco2细胞单层模型建立时细胞代数为30-55代。取Caco2细胞在最低必需培养基(1％v/v非必需氨基酸，1％v/v L-谷氨酰胺和1％抗生素溶液)中，37℃培养箱中5％的二氧化碳，95％的空气湿度和95％的相对湿度条件下培养到对数期(约4-6d)后进行细胞传代，用含0.05％胰蛋白酶和0.005％EDTA的消化液消化3-5min，取Transwell插入式培养皿，细胞浓度约为8×104个/cm2，Transwell上室腔侧(AP侧)每空加入400μL细胞悬液，下室基底侧(BL侧)加入600μL新鲜培养基培养。培养基前一周每天更换一次，接下来为2天更换一次，培养21天后，用含有荧光素钠的溶液验证Caco2细胞单层模型的完整性。
待Caco2细胞在Transwell板上培养到21d，荧光素钠溶液检验其透过率，确定其可以作为模拟小肠吸收的模型后，吸弃培养基，上室和下室分别用预热好的磷酸盐缓冲溶液洗两遍，然后在上室依次加入0.2mL的A液，下室加入0.6mL B液。37℃，5％CO2和95％相对湿度条件下培养2h后，磷酸盐缓冲液清洗细胞表面以除去样品溶液中未被细胞吸收转运的游离钙。用含2％SDS的溶液收割细胞，采用ICP-MS测定细胞破碎液中的钙离子含量，即钙的保留量；相同方法测定下室中钙离子的含量，即钙的转运量；此外，相同方法测定钙的加入量。钙的吸收率按以下计算。
钙的吸收率/％＝(钙保留量+钙转运量)/钙加入量×100％
动物实验
参照AIN-76饲料配制低钙饲料、普通饲料。大鼠适应性饲喂1周后，将70只SD大鼠称重、随机分成2组，正常对照组20只，饲喂普通饲料，缺钙组50只，饲喂低钙饲料。4周后两组各取10只大鼠进行血钙、骨钙及骨密度检测，确定是否造模成功。正常对照组剩余的10只大鼠继续饲喂普通饲料4周，缺钙组剩余的40只大鼠再随机分成4组，每组10只。一组称为缺钙模型组，继续饲喂低钙饲料4周，另外三组分别称为CaCO3组、TPH-Ca组和CPP-Ca组，分别饲喂普通饲料、实施例1制得的罗非鱼钙离子结合肽(TPH-Ca)饲料和酪蛋白磷酸肽-钙(CPP-Ca)饲料4周。大鼠用不锈钢鼠笼喂养，鼠笼每周清洗、消毒，实验期间大鼠自由进食和饮用去离子水。饲养房环境参数：温度20±2℃，湿度为60±5％。
实验结束后，所有大鼠禁食过夜。向大鼠腹腔注射水合氯醛(0.3g/kg)使其麻醉，从其腹主动脉取血4ml，低温静置20min后，离心(4500rpm，10min，4℃)取血清，置全自动生化分析仪中检测血清中钙含量。
取大鼠右侧股骨，将肌肉和结缔组织去除干净，用电子天平称量纪录湿重，然后在580℃下干法灰化8h，灰分溶解于10ml的6M盐酸中，稀释后用原子吸收光谱法测定钙含量。另取大鼠左侧股骨，置于骨密度仪扫描台上，测定股骨中点密度。结果如表1和图1所示。
表1活性肽对大鼠骨骼生长的影响
Figure BDA0002181563370000201
实验结果如图1所示，CPP-Ca组与罗非鱼活性肽-Ca组没有显著性差异(p>0.05)，CaCl2组钙吸收率最低，与其他两组具有显著性差异(p<0.05)。此结果表明，罗非鱼活性肽-Ca结合物能够促进Caco2细胞对钙离子的吸收，且与CPP-Ca结合物效果相当。
由表1可知，缺钙模型组的血清钙是各组之间最低的，罗非鱼肽-Ca组(实施例1制得的罗非鱼钙离子结合肽)与CPP-Ca组最高且两者不存在显著差异。当机体内钙充足时，钙被肠道吸收后通过血液沉积在骨骼中，促进骨骼生长，增强骨密度和骨强度，血钙维持在正常水平。而当机体缺钙时，会导致血钙降低。本研究中，缺钙模型组的血清钙含量仅为1.89mmol/L，显著低于其余4组，表明机体长期处于低钙摄入状态时，大鼠机体钙代谢出现了异常。三种补钙物质均可显著改善低血钙的症状，但罗非鱼肽-Ca组(实施例1制得的罗非鱼钙离子结合肽)与CPP-Ca组的血清钙含量均显著高于CaCO3组，从而表明肽钙复合物比无机态钙更能促进大鼠体内钙的吸收。其他实施例制得的罗非鱼钙离子结合肽与实施例1相似，同样具有促进体内钙吸收的效果，可参照表1。
本实验中缺钙模型组的骨密度显著低于其余各组，表明机体长时间钙摄入不足已经严重影响骨骼矿化，导致骨密度低下。罗非鱼肽-Ca能显著增强大鼠骨密度，使其迅速恢复到正常对照组的水平，效果显著优于CaCO3而与CPP-Ca效果相当。骨钙表示骨骼中的钙含量，是反映补钙效果更直观的指标。由表可知，三种补钙方式均能起到增加大鼠骨钙含量的效果。通过三种补钙方式效果比较可知，罗非鱼肽-Ca(实施例1制得的罗非鱼钙离子结合肽)和CPP-Ca能使缺钙大鼠的骨钙含量迅速增加到正常对照组的水平，效果显著优于CaCO3，且二者的效果无显著差异。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种罗非鱼钙离子结合肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将罗非鱼加工后产生的零碎肉浸泡在NaOH溶液中，洗涤，沥干后绞成罗非鱼零碎肉肉糜；所述NaOH溶液的质量百分比浓度为0.1-0.5wt％；所述浸泡的温度为30-60摄氏度，浸泡的时间为0.5-2.0h；
(2)将罗非鱼加工后产生的鱼皮浸泡在NaOH溶液中，洗涤，沥干后绞成罗非鱼鱼皮肉糜；所述NaOH溶液的质量百分比浓度为0.5-2.0wt％；所述浸泡的温度为25-40摄氏度，浸泡的时间为1.0-3.0h；
(3)将步骤(1)所述罗非鱼零碎肉肉糜与步骤(2)所述罗非鱼鱼皮肉糜混合，得到混合肉糜，将所述混合肉糜加入水中，混合均匀，得到混合液；将混合液的pH值调节为7.0-9.0，然后加入复配蛋白酶，进行酶解反应，然后灭酶处理，离心取上清液，得到酶解液；所述罗非鱼零碎肉肉糜与罗非鱼鱼皮肉糜的质量比为1:0.5-3；所述混合肉糜与水的质量比为1:1-3；所述复配蛋白酶为罗非鱼内源酶、碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述复配蛋白酶的质量为混合肉糜质量的0.2-1wt％；所述酶解反应的温度为50-60摄氏度，酶解反应的时间为4-8小时；所述灭酶处理的温度为85-95摄氏度，灭酶处理的时间为15-40min；所述离心的速率为4000-10000rpm，离心的时间为15-40min，离心的温度为4摄氏度；所述罗非鱼内源酶的制备，包括如下步骤：
取罗非鱼鱼肠，用水洗涤，然后加入磷酸缓冲液中进行匀浆破碎，超声提取处理，得到匀浆液，将所述匀浆液进行离心处理，取上清液，冷冻干燥得到所述罗非鱼内源酶；所述磷酸缓冲液的pH值为7.5-8.5，所述磷酸缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/L；所述罗非鱼鱼肠与磷酸缓冲液的质量体积比为1:4-1:6g/mL；所述超声提取处理的频率为20Khz，超声提取处理的温度为30-45摄氏度，超声提取处理的时间为30-90min；所述离心处理的速率为8000-10000rpm，离心处理的时间为20-40min，离心处理的温度为4-25摄氏度；
(4)将步骤(3)所述酶解液通过超滤膜，取滤过液；将滤过液通过固定化钙离子亲和层析柱，然后用pH值为7.0-7.5的流动相冲洗2-3个柱体积，再用pH值为4.0-6.0的流动相进行洗脱，收集洗脱液，然后进行透析处理，浓缩，得到罗非鱼活性肽溶液；所述超滤膜的截留分子量为1-10kDa；所述pH值为7.0-7.5的流动相为氢氧化钠溶液；所述pH值为4.0-6.0的流动相为盐酸溶液；所述透析处理为采用截留分子量为100Da的透析袋进行；所述透析处理的时间为24小时，透析处理的温度为4-20摄氏度，所述罗非鱼活性肽溶液的质量百分比浓度为2wt％-15wt％；
(5)将钙盐加入步骤(4)所述罗非鱼活性肽溶液中，混合均匀，得到混合物，调节所述混合物的pH值为6.0-10.0，在超声波的作用下进行螯合反应，透析，浓缩，干燥，得到所述罗非鱼钙离子结合肽；所述钙盐为氯化钙及硫酸钙中的一种以上，所述钙盐与罗非鱼活性肽溶液的质量比为1:1-30；所述在超声波的作用下的超声频率为20KHz；所述螯合反应的温度为30-80摄氏度，所述螯合反应的时间为10-120min；所述透析采用截留分子量为100-200Da的透析袋进行；所述透析的时间为12-48h，透析的温度为4-20摄氏度。
2.一种由权利要求1所述的制备方法制得的罗非鱼钙离子结合肽。
3.权利要求2所述的罗非鱼钙离子结合肽在制备矿物离子补充剂中的应用。
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