CN112062834A - 一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽及其提取制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，涉及生物技术领域，包括：S1、将深海鱼鱼皮进行脱腥预处理；S2、将步骤S1处理后的鱼皮进行打浆处理，得到深海鱼鱼皮匀浆；S3、在深海鱼鱼皮匀浆中加入胃蛋白酶进行酶解，酶解pH为1.5‑3；加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解pH为5.5‑7；加入胰蛋白酶进行酶解，酶解pH为7.5‑8.5，得到酶解混合液；S4、对酶解混合液进行灭活、纯化和干燥，得到深海鱼鱼皮胶原蛋白肽。本发明的有益效果是将鱼皮依次置于酸性的胃蛋白酶、中性的木瓜蛋白酶以及碱性胰蛋白酶中，通过三种酶对鱼皮进行充分酶解，可以最大程度地将鱼皮中的蛋白质酶解得到多肽，提高了最终蛋白肽的提取率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽及其提取制备方法。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25-30%，某些生物体甚至高达80%以上。胶原蛋白是皮肤的重要组成物质，一般人皮肤干重的76%左右都是胶原蛋白。胶原蛋白在皮肤中起到支撑作用，可以将水分锁在内部，避免水分流失，可见胶原蛋白对皮肤的重要性，故补充胶原蛋白可以避免很多皮肤问题。
现代生物代谢研究表明，蛋白质消化后主要是以多肽的形式直接吸收，如鱼皮胶原多肽不仅具有鱼皮蛋白质相同的氨基酸组成，而且其消化吸收比蛋白质态更佳。某些低肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，同时还具有防病治病、调节人体生理机能的功效。有些水解多肽具有原食品蛋白或其组成氨基酸所没有的独特生理机能。
深海鱼是所有天然胶原蛋白原料中受环境污染最小的，从深海鱼中直接提取的胶原蛋白肽不含防腐剂和色素等添加剂，安全性有所保证，有利于身体健康吸收，因此是最安全的。并且与动物性胶原蛋白相比，鱼类的胶原蛋白分子量是最小的，最有利于人体的吸收，同时深海鱼具有腥味较少特点。此外，深海鱼的蛋白质含量以其鱼皮中的胶原蛋白含量最高，可超过其蛋白质总量的80%，较鱼体的其它部位要高许多，所以由鱼皮提取胶原蛋白提取率是最高的，综上，从深海鱼鱼皮中提取的鱼胶原蛋白具有很多优势，因此，如何从鱼皮提取到胶原蛋白肽是本领域亟需解决的问题。
现有技术中胶原多肽的制备方法主要包括化学方法和酶法等。化学方法是利用酸或碱水解胶原蛋白，虽然方法简单、成本低廉，但水解过程中会破坏L- 型氨基酸而形成D-型氨基酸，产物复杂，蛋白质的营养损失大，并且生产过程产生的废水多，生产周期长，不利于工业化生产。与酸法和碱法相比，酶法具有水解效率高、条件温和、易于控制水解进程等优点，尤其最重要的一点是能对蛋白质进行定向水解而产生具有特定生物活性的肽类。另外，酶法被广泛用来改善蛋白质的功能性质，如溶解性、乳化性、胶凝性能、起泡性、持水性和包油性等。
目前，国内关于从深海鱼鱼皮中提取低分子蛋白肽的方法很少，主要困难有提取效率偏低，蛋白肽的纯度偏低，提取方法不够环保以及不适合工业规模化等。
发明内容
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽及其提取制备方法。
本发明的技术解决方案如下：
一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，包括以下步骤：
S1、将新鲜深海鱼去头取其鱼皮清洗干净后，置于浓度为4-5mol/L的小苏打中浸泡20-40min进行脱腥预处理，然后置于浓度为0.3-0.7mol/L的NaOH溶液中浸泡30-40min后，用水冲洗干净；
S2、将步骤S1处理后的鱼皮进行打浆处理，得到深海鱼鱼皮匀浆；
S3、在深海鱼鱼皮匀浆中先加入胃蛋白酶进行酶解，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100-200，酶解pH为1.5-3，酶解温度为35-40℃，酶解时间为5-7h；再加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100-200，酶解pH为5.5-7，酶解温度为50-60℃，酶解时间为4-6h；最后加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100-200，酶解pH为7.5-8.5，酶解温度为35-40℃，酶解时间为5-7h，得到酶解混合液；
S4、对酶解混合液进行灭活，调节灭活后的酶解混合液的pH值至10-12，然后往酶解混合液中加入活性炭，再加入氯化钾，最后将酶解混合液静置分层、纯化和干燥，得到深海鱼鱼皮胶原蛋白肽。
优选地，所述步骤S2中，将脱腥处理后的深海鱼鱼皮置入打浆机中，加入纯水打浆5-10min，纯水与深海鱼鱼皮的体积比为3-5:1，得到深海鱼鱼皮匀浆。
优选地，所述步骤S3具体包括，在深海鱼鱼皮匀浆中先加入胃蛋白酶进行酶解，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:120-180，酶解pH为2-2.5，酶解温度为36-38℃，酶解时间为5.5-6.5h；再加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:120-180，酶解pH为6-6.5，酶解温度为52-58℃，酶解时间为4.5-5.5h；最后加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:120-180，酶解pH为7.8-8.2，酶解温度为36-39℃，酶解时间为5.5-6.5h，得到酶解混合液。
优选地，所述步骤S3具体包括：在深海鱼鱼皮匀浆中先加入胃蛋白酶进行酶解，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，酶解pH为2，酶解温度为38℃，酶解时间为6h；再加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，酶解pH为6，酶解温度为55℃，酶解时间为5h；最后加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:200，酶解pH为8，酶解温度为38℃，酶解时间为6h，得到酶解混合液。
优选地，所述步骤S4中，将酶解混合液放在95-100℃温度的水浴条件下加热10-15min灭活后，向酶解混合液中加入碱性溶液调节其pH值为10-12。
优选地，所述步骤S4中，每毫升酶解混合液中加入2-2.5mg活性炭。
优选地，所述步骤S4中，每毫升酶解混合液中加入1-2mg的氯化钾。
优选地，所述步骤S4中，待酶解混合液完全分层后在4-6℃下进行过滤、超滤和钠滤，重复2-3次后收集滤液，将滤液浓缩，灭菌，喷雾干燥，得到深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉。
一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽，采上述的方法提取得到。
本发明至少具有以下有益效果之一：
本发明选用深海鱼鱼皮部位作为鱼胶原蛋白肽的提取部位，纯净无污染，胶原蛋白肽含量高，先采用采用小苏打对鱼皮进行脱腥预处理，然后再将鱼皮依次置于酸性的胃蛋白酶、中性的木瓜蛋白酶以及碱性胰蛋白酶中，通过三种酶分别在酸性、中性和碱性条件下对鱼皮进行了充分酶解，可以最大程度地将鱼皮中的蛋白质酶解得到多肽，提高制备效率和质量；同时本发明还加入添加剂氯化钾以增加多肽的溶解度，提高了最终蛋白肽的提取率；经最后过滤、超滤纳米可以除去蛋白肽中的杂质，提取出纯净高质量的胶原蛋白，采用本发明方法提取得到的胶原蛋白肽纯度高，能够方便进行后续加工，在食品、护肤品或药品中具有良好的商业应用价值。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
实施例1
本实施例提出了一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，包括如下步骤：
S1、首先将新鲜深海鳕鱼去头取其鱼皮清洗干净，称取鳕鱼鱼皮2.0kg，置于浓度为4mol/L小苏打中浸泡40min进行脱腥预处理；然后将其放入浓度为0.3mol/L的NaOH溶液中浸泡30min后，用水冲洗干净。
S2、将所述步骤S1处理过的深海鱼鱼皮置入打浆机中，加入纯水打浆5min，纯水与深海鱼鱼皮的体积比为3:1，得到深海鱼鱼皮匀浆。
S3、在深海鱼鱼皮匀浆中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，反应条件为：pH为1.5，温度为35℃，酶解时间为5h；再加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，反应条件为：pH为5.5，温度为50℃，酶解时间为4 h；最后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，反应条件为：pH为7.5，温度为35℃，酶解时间为5 h，得到酶解混合液。
S4、在酶解结束后将酶解混合液放在95℃温度的水浴条件下加热10min灭活，向酶解混合液中加入碱性溶液调节其pH值为10，每毫升的酶解混合液中加入2mg的活性炭进行吸附，再每毫升的酶解混合液中加入1mg氯化钾以增加多肽的溶解度，重复3次后置于分液漏斗中静置分层30min。酶解混合液待完全分层后在4℃温度下进行过滤，超滤，钠滤，重复3次后收集滤液，将滤液浓缩，灭菌，最后喷雾干燥得到深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉，称重约为1.05kg。
实施例2
本实施例提出了一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，包括如下步骤：
S1、首先将新鲜深海鳕鱼去头取其鱼皮清洗干净，称取鳕鱼鱼皮2.0kg，置于浓度为4.2mol/L小苏打中浸泡35min进行脱腥预处理；然后将其放入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液中浸泡32min后，用水冲洗干净。
S2、将所述步骤S1处理过的深海鱼鱼皮置入打浆机中，加入纯水打浆5min，纯水与深海鱼鱼皮的体积比为3.5:1，得到深海鱼鱼皮匀浆。
S3、在深海鱼鱼皮匀浆中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:150,反应条件为：pH为2，温度为36℃，酶解时间为6 h；再加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:150，反应条件为：pH为6.5，温度为55℃，酶解时间为5 h；最后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:150，反应条件为：pH为 8，温度为36℃，酶解时间为6 h，得到酶解混合液。
S4、在酶解结束后，将酶解混合液放在96℃温度的水浴条件下加热12min灭活，向酶解混合液中加入碱性溶液调节其pH值为10.5，每毫升的酶解混合液中加入2.2mg的活性炭进行吸附，再每毫升的酶解混合液中加入1.5mg氯化钾以增加多肽的溶解度，重复3次后置于分液漏斗中静置分层30min；待酶解混合液完全分层后在4℃温度下进行过滤，超滤，钠滤，重复3次后收集滤液，将滤液浓缩，灭菌，最后喷雾干燥得到深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉，称重约为1.13kg。
实施例3
本实施例提出了一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，包括如下步骤：
S1、首先将新鲜深海鳕鱼去头取其鱼皮清洗干净，称取鳕鱼鱼皮2.0kg，置于浓度为4.5mol/L小苏打中浸泡30min进行脱腥预处理；然后将其放入浓度为0.5mol/L的NaOH溶液中 浸泡35min后，用水冲洗干净。
S2、将所述步骤S1处理过的深海鱼鱼皮置入打浆机中，加入纯水打浆5min，纯水与深海鱼鱼皮的体积比为4:1，得到深海鱼鱼皮匀浆。
S3、在深海鱼鱼皮匀浆中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:200。反应条件为：pH为2.5，温度为38℃，酶解时间为7 h；再加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:200，反应条件为：pH为6，温度为55℃，酶解时间为5h；最后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:200，反应条件为：pH为 8，温度为38℃，酶解时间为6 h，得到酶解混合液。
S4、在酶解结束后将酶解混合液放在95℃～100℃温度的水浴条件下加热10min灭活，向酶解混合液中加入碱性溶液调节其pH值为11，每毫升的酶解混合液中加入2.4mg的活性炭进行吸附，再每毫升的酶解混合液中加入1.8mg氯化钾以增加多肽的溶解度，重复3次后置于分液漏斗中静置分层30min；待酶解混合液完全分层后在4℃温度下进行过滤，超滤，钠滤，重复3次后收集滤液，将滤液浓缩，灭菌，最后喷雾干燥得到深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉，称重约为1.01kg。
实施例4
本实施例提出了一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，包括如下步骤：
S1、首先将新鲜深海鳕鱼去头取其鱼皮清洗干净，称取鳕鱼鱼皮2.0kg，置于浓度为5mol/L小苏打中浸泡20min进行脱腥预处理；然后将其放入浓度为0.7mol/L的NaOH溶液中浸泡40min后，用水冲洗干净。
S2、将所述步骤S1处理过的深海鱼鱼皮置入打浆机中，加入纯水打浆10min，纯水与深海鱼鱼皮的体积比为5:1，得到深海鱼鱼皮匀浆。
S3、在深海鱼鱼皮匀浆中依次加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:150。反应条件为：pH为3，温度为40℃，酶解时间为7h；再加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:150，反应条件为：pH为6.5，温度为55℃，酶解时间为7h；最后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:150，反应条件为：pH为8，温度为40℃，酶解时间为6h，得到酶解混合液。
S4、在酶解结束后将酶解混合液放在100℃温度的水浴条件下加热10min灭活，向酶解混合液中加入碱性溶液调节其pH值为12。每毫升的酶解混合液中加入2.5mg的活性炭进行吸附，再每毫升的酶解混合液中加入2g氯化钾以增加多肽的溶解度，重复3次后置于分液漏斗中静置分层30min；待酶解混合液完全分层后在4℃温度下进行过滤，超滤，钠滤，重复3次后收集滤液，将滤液浓缩，灭菌，最后喷雾干燥得到深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉，称重约1.21kg。
对比例1
与实施例1的区别在于：
S3、在深海鳕鱼鱼皮匀浆中依次加入复合蛋白酶中，复合蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，复合蛋白酶由质量为1:1:1的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶组成，反应条件为：pH为5，温度为40℃，酶解时间为10h，得到酶解混合液。
其他步骤同实施例1。
对比例1得到的深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉称重约0.49kg。
对比例2
与实施例1的区别在于：
S3、在深海鳕鱼鱼皮匀浆中依次先加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，反应条件为：pH为5.5，温度为50℃，酶解时间为4 h；再加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，反应条件为：pH为1.5，温度为35℃，酶解时间为5h；再最后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，反应条件为：pH为7.5，温度为35℃，酶解时间为5 h，得到酶解混合液。
其他步骤同实施例1。
对比例2得到的深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉称重约0.85kg。
对比例3
与实施例1的区别在于：
S3、在深海鳕鱼鱼皮匀浆中依次先加入胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，反应条件为：pH为7.5，温度为35℃，酶解时间为5 h，再加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，反应条件为：pH为5.5，温度为50℃，酶解时间为4 h；最后加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，反应条件为：pH为1.5，温度为35℃，酶解时间为5h；再最后加入胰蛋白酶，得到酶解混合液。
其他步骤同实施例1。
对比例3得到的深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉称重约0.79kg。
对比例4
与实施例1的区别在于：步骤S4中不加入氯化钾，其他同实施例1。
对比例4得到的深海鳕鱼鱼皮胶原蛋白肽粉称重约0.71kg。
将实施例1-4与对比例1-4得到的深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉重量进行比较，可以看出，实施例1-4制得的深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉的重量明显要大于对比例1（步骤S3中采用混合蛋白酶）、对比例2（步骤S3中依次加入木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶）、对比例3（步骤S3中依次加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶）以及对比例4（步骤S4中不加入氯化钾），由此可以得出，本发明中的蛋白酶是否分步加入、蛋白酶加入的顺序以及是否添加氯化钾均会影响胶原蛋白肽粉的提取率。
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (9)
1.一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将新鲜深海鱼去头取其鱼皮清洗干净后，置于浓度为4-5mol/L的小苏打中浸泡20-40min进行脱腥预处理，然后置于浓度为0.3-0.7mol/L的NaOH溶液中浸泡30-40min后，用水冲洗干净；
S2、将步骤S1处理后的鱼皮进行打浆处理，得到深海鱼鱼皮匀浆；
S3、在深海鱼鱼皮匀浆中先加入胃蛋白酶进行酶解，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100-200，酶解pH为1.5-3，酶解温度为35-40℃，酶解时间为5-7h；再加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100-200，酶解pH为5.5-7，酶解温度为50-60℃，酶解时间为4-6h；最后加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100-200，酶解pH为7.5-8.5，酶解温度为35-40℃，酶解时间为5-7h，得到酶解混合液；
S4、对酶解混合液进行灭活，调节灭活后的酶解混合液的pH值至10-12，然后往酶解混合液中加入活性炭，再加入氯化钾，最后将酶解混合液静置分层、纯化和干燥，得到深海鱼鱼皮胶原蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，将脱腥处理后的深海鱼鱼皮置入打浆机中，加入纯水打浆5-10min，纯水与深海鱼鱼皮的体积比为3-5:1，得到深海鱼鱼皮匀浆。
3.根据权利要求1所述的一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：在深海鱼鱼皮匀浆中先加入胃蛋白酶进行酶解，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:120-180，酶解pH为2-2.5，酶解温度为36-38℃，酶解时间为5.5-6.5h；再加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:120-180，酶解pH为6-6.5，酶解温度为52-58℃，酶解时间为4.5-5.5h；最后加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:120-180，酶解pH为7.8-8.2，酶解温度为36-39℃，酶解时间为5.5-6.5h，得到酶解混合液。
4.根据权利要求1所述的一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：在深海鱼鱼皮匀浆中先加入胃蛋白酶进行酶解，胃蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，酶解pH为2，酶解温度为38℃，酶解时间为6h；再加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:100，酶解pH为6，酶解温度为55℃，酶解时间为5h；最后加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶与深海鱼鱼皮匀浆的质量比为1:200，酶解pH为8，酶解温度为38℃，酶解时间为6h，得到酶解混合液。
5.根据权利要求1所述的一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，将酶解混合液放在95-100℃温度的水浴条件下加热10-15min灭活后，向酶解混合液中加入碱性溶液调节其pH值为10-12。
6.根据权利要求1所述的一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，每毫升酶解混合液中加入2-2.5mg活性炭。
7.根据权利要求1所述的一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，每毫升酶解混合液中加入1-2mg的氯化钾。
8.根据权利要求1所述的一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，待酶解混合液完全分层后在4-6℃下进行过滤、超滤和钠滤，重复2-3次后收集滤液，将滤液浓缩，灭菌，喷雾干燥，得到深海鱼鱼皮胶原蛋白肽粉。
9.一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽，其特征在于，采用权利要求1-8中任意一种方法提取得到。
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