KR20060005770A

KR20060005770A - 동물의 전혈 또는 응고혈로부터 수용성 헴철-폴리펩타이드복합체의 제조방법

Info

Publication number: KR20060005770A
Application number: KR1020040054723A
Authority: KR
Inventors: 김우현; 임미재; 심지연; 김상진; 한명관
Original assignee: 주식회사 에이.비.아이
Priority date: 2004-07-14
Filing date: 2004-07-14
Publication date: 2006-01-18

Abstract

본 발명은 흡수율이 높은 철공급원 중의 하나인 헴철-폴리펩타이드 복합체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 동물의 전혈 또는 응고혈로부터 직접 용해도가 높은 고순도의 헴철-폴리펩타이드 복합체를 제조할 수 있는 경제적이며 효율적인 헴철-폴리펩타이드 복합체의 제조방법에 관한 것이다.

동물 전혈, 동물 응고혈, 돼지 혈액, 헴철, 헴철-폴리펩타이드 복합체, 용해도, 단백질 분해 효소

Description

동물의 전혈 또는 응고혈로부터 수용성 헴철-폴리펩타이드 복합체의 제조방법 {Preparation of water soluble heme-iron polypeptide complex from animal whole blood or clotted blood}

도 1은 시판 헴철 (일본 이또 케미칼 제품)과 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 헴철-폴리펩타이드 복합체의 용해도를 비교한 그림이다.

도 2는 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 헴철-폴리펩타이드 복합체의 각 pH 용액에서의 용해도를 보여주는 그림이다.

철분은 생체 내에서 중요한 무기질로 산소운반에 필수적인 역할을 한다. 우리나라에서 철분의 1일 권장량은 소아가 10-12 mg, 성인남자 12 mg, 성인 여자 18 mg, 임산부 26-30 mg, 수유부는 20 mg이다. 철분은 헴철(heme iron)과 비헴철 (non-heme iron)의 2가지 형태로 존재하며 동물성 식품의 전체 철 함량 중 평균 40%가 헴철형이고 나머지 60%가 비헴철형으로 존재하고 식물성 식품 중의 철은 모두 비헴철형으로 존재한다.

헴철은 대부분 헤모글로빈과 미오글로빈의 형태로 섭취되며 흡수율이 매우 높고 다른 식사요인에 의하여 영향을 받지 않으나 비헴철의 흡수는 여러가지 요인에 의하여 영향을 받으며 식품의 종류에 따라 큰 차이가 있다. 육류식품에서의 철의 흡수율은 10% 가량이며 곡류의 경우 5% 이하여서 일일 필요량을 충족시키기 위하여는 다량을 섭취하여야 한다. 또한 개인의 철 영양상태에 따라서도 흡수율은 영향을 받는다. 여성과 어린이들과 같이 체내 보유량이 적으면 흡수율은 높아지고 남성처럼 철 저장량이 높으면 흡수율은 낮아진다. 이와 같이 철분의 흡수율은 섭취한 철분의 형태 및 다른 식이인자의 존재, 체내 철분 저장상태에 영향을 받으며 통상 건강인은 섭취한 철분의 5-10% 정도만을 흡수하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 철의 결핍은 전 세계적으로 가장 흔한 영양문제로 그 원인은 부적절한 섭취, 철 흡수의 불량, 빠른 성장과 혈액손실, 반복되는 임신에 의한 저장 철의 고갈 등이다. 철 결핍의 위험이 높은 시기는 급격한 신체성장이 이루어지는 6개월-4세의 영유아기, 사춘기, 월경혈의 손실이 있는 가임기여성, 철의 요구가 증가하는 임신기이며 특히 영 유아와 임산부는 철 결핍이 되기 쉬운 것으로 알려져 있다. 철 결핍을 예방, 치료하기 위하여 염화 제2철 (ferric chloride), 구연산 철 (ferric citrate), 구연산 철 암모늄 (ferric ammonium citrate), 호박산 구연산 철 나트륨 (iron and sodium succinate citrate), 젖산 철 (ferrous lactate), 피로인산 제2철 (ferric pyrophosphate), 헴철 (heme iron) 등의 철 화합물이 식품의 철 강화제 및 제약 원료로 사용되고 있다.

철 화합물 중 헴철을 제외한 나머지는 무기철 성분으로 철 함량이 높고 경제적으로 저렴한 장점이 있으나 생체에서 흡수율이 낮고 과잉 섭취 시 철 중독을 유발할 수 있는 단점이 있어 점차 흡수율이 높고 부작용이 없는 유기철 성분인 헴철의 사용량이 증가하고 있다.

헴철은 헤모글로빈, 미오글로빈 등에 함유되어 있는 성분으로 동물의 전혈로부터 분리, 정제하여 제조한다. 헤모글로빈 (분자량 65,000달톤)은 헴기를 포함하고 있는 4개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 단백질로 1몰의 헤모글로빈에는 4몰의 철이 함유되어 있다. 헤모글로빈 중 철의 함량을 분자량에 따라 계산하면 0.34 %, 헴철의 함량은 3.8 %이다. 따라서, 고농도 헴철을 얻기 위하여는 단백질 함량을 낮추는 것이 필요하다.

헴철을 얻기 위한 화학적 방법으로는 먼저 혈액 중 적혈구에서 헤모글로빈을 분리하고, 카르복시메틸 셀룰로스 (carboxylmethyl cellulose;CMC)를 첨가하여 CMC 복합체로 헴을 침전시키는 방법 (Autio, et al., US Patent 4,518,525), 저급 알코올과 같은 탈수제를 사용하거나 이미다졸 (imidazol) 유도체를 사용하는 방법 (Lindroos, US Patent 4,431,581), 라이신, 아르기닌의 아미노산 등을 이용한 헴 분리 방법 (Ingberg, et al., US Patent 5,008,388) 등이 알려져 있다. 그러나 이상의 방법들은 헤모글로빈으로부터 글로빈 단백질을 분리하기 위하여 고안된 것으로 적혈구 용액 혹은 헤모글로빈 용액에 별도의 화합물을 첨가하여 글로빈 단백질 을 분리하고 부산물로 헴철을 얻을 수 있도록 구성되어 있으나 첨가물을 회수하거나 제거하는 별도의 공정이 필요하여 대량제조가 곤란한 단점이 있다. 또 다른 제법으로는 고농도의 유기산을 이용하여 고온에서 분해하는 방법 (Liu et al., J, Agric. Food Chem., 44, 2957, 1996)이 있으나, 유기산을 사용하는 방법은 다량의 유기산이 최종 제품에 함유되어 품질에 좋지 않은 영향을 줄 수 있다는 단점이 있다.

헤모글로빈으로부터 유래한 헴철은 체내 소화과정 중에 일부 글로빈 단백이 제거되고 난 후 헴주위의 폴리펩타이드가 붙어있어 용해도를 유지하며 체내로 흡수된다. 따라서 최근에는 헴주위의 일부 폴리펩타이드가 함유되도록 단백분해효소를 이용하여 헴철-폴리펩타이드 복합체를 제조하여 철공급원으로 이용하고 있다.

이와 관련된 선행기술로는 단백질 분해효소를 처리하여 헤모글로빈 중 글로빈을 분해하여 펩타이드를 함유하는 헴철을 제조하는 방법 (Eriksson, US Patent 4,411,915, Piot et al., J. Chem. Technol. Biotechnol., 42, 147, 1988) 이 있으나 이 방법에 따르면 실제로 제조된 헴철의 용해도가 불충분하여 체내에서 잘 흡수되지 않는다는 단점이 있고, 시판되고 있는 헤모글로빈을 이용하여 헴철을 생산하는 방법 (오남순 외, 대한민국 등록특허 제0434842호, 오남순 외, 대한민국 등록특허 제0382293호) 이 있으나 이 방법은 여러 종류의 효소를 복잡한 단계로 처리해야 하고 원료가 되는 헤모글로빈을 정제하는 별도의 공정이 필요하거나 또는 고가의 시판되고 있는 헤모글로빈을 이용해야 하므로 상업적 이용이 곤란하다는 단점이 있다.

한편, 소나 돼지의 도축시 방류되는 혈액이 헴-폴리펩타이드 복합체의 중요한 자원이 되고 있으나 아직까지 혈액으로부터 직접 헴-폴리펩타이드 복합체를 제조할 수 있는 상업적으로 이용가능한 방법이 개발되어 있지 않다. 현재 한국의 실정상 헴-폴리펩타이드 복합체 제조에 필요한 원료인 동물혈액은 도축장에서 주로 응고혈 형태로 얻을 수 있다. 이에 본 발명에서는 상기와 같은 종래기술의 제반 문제점을 인식하고, 동물의 혈액 즉 전혈 또는 응고혈로부터 신속 간편하고 경제적이며 효율적인 방법에 의하여 용해도가 높고 고순도의 헴-폴리펩타이드 복합체를 대량 생산할 수 있는 방법을 개발하였다.

본 발명은 동물의 전혈 또는 응고혈로부터 간편한 공정에 의하여 용해도가 높은 고순도의 헴-폴리펩타이드 복합체를 제조하는 것을 목적으로 한다.

이러한 본 발명의 기술적 과제는, 동물의 전혈 또는 응고혈에 물을 첨가하고 분쇄하여 지방층을 제거하고 열처리하는 단계를 거친 다음 단백질 가수분해 효소를 처리하여 단백질을 분해하고 여과·농축 및 건조하는 단계를 거쳐, 넓은 범위의 pH에서 용해도가 높고 철함량이 높은 헴철-폴리펩타이드 복합체를 제조함으로써 달성하게 되었다.

본 발명은 흡수율이 높은 철공급원 중의 하나인 헴철-폴리펩타이드 복합체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 동물의 전혈 또는 응고혈로부터 직접 용해도가 높은 고순도의 헴철-폴리펩타이드 복합체를 제조할 수 있는 경제적이 며 효율적인 헴철-폴리펩타이드 복합체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 (A) 동물의 전혈 또는 응고혈에 1-5배 중량의 물을 첨가하고 분쇄조를 이용하여 1,000-10,000 rpm으로 5-15분간 분쇄하는 단계; (B) 상기 단계에서 얻어진 혈액 분쇄액에서 분리조 플라스크를 이용하여 상층의 지방층 및 불용성 물질을 분리하는 단계; (C) 상기 단계에서 지방층이 제거된 혈액 분쇄액을 pH 8-11, 50-90℃에서 열처리하는 단계; (D) 상기 단계에서 열처리된 혈액 분쇄액을 단백질 가수분해 효소로 처리하는 단계; 및 (E) 상기 단계에서 얻어진 가수분해물을 여과, 농축 및 건조하여 헴-폴리펩타이드 복합체를 얻는 단계로 이루어진다.

상기 (D) 단계의 단백질 가수분해효소 처리 공정은, 상기 종래 기술에 설명한 바와 같이 헴철-폴리펩타이드 복합체 제조시 이용되는 공지의 방법이나, 본 발명은 단백질 가수분해효소 처리 전 동물의 전혈 또는 응고혈에 1-5배 중량의 물을 첨가하고 분쇄조를 이용하여 1,000-10,000 rpm으로 5-15분간 분쇄시킴으로써 균질화를 유도하고 지방층을 제거하였으며, 또한 지방층이 제거된 혈액 분쇄액을 pH 8-11, 50-90℃에서 열처리함으로써 단백질을 변성시키고 효율적으로 가수분해를 수행하였으므로, 상기와 같은 본 발명의 공정에 의하여 제조된 헴철-폴리펩타이드 복합체는 다양한 pH에서 용해도가 높고 철의 함량도 높다. 즉, 본 발명의 방법에 의하면 매우 간편하고 효과적으로 동물의 전혈 또는 응고혈로부터 직접 헴철-폴리펩타이드 복합체를 분리해낼 수 있다.

본 발명에서 상기 (D) 단계의 단백질 가수분해효소는 기존의 알려진 단백질 가수분해 효소로서 어떤 것이든 선택하여 사용 가능하며, 선택된 효소의 최적 온 도, 최적 pH에서 반응시킨다.

본 발명에서 상기와 같이 (A) 내지 (E) 단계를 거쳐 정제된 분획은 열풍건조, 분무건조, 진공동결건조, 진공건조 등의 방법으로 건조할 수 있다. 최종 건조물은 암갈색의 분말로 철의 함량은 1 ~ 1.6%(w/w), 헴철의 함량으로는 10.0 ~ 28.0%(w/w)이며, 수율은 헤모글로빈 대비 20 ~ 10%(w/w)이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하나 본 발명의 권리범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 돼지 응고혈로부터 헴-폴리펩타이드 복합체의 제조방법 1

1.2 kg의 응고된 돼지 혈액에서 200g 정도의 혈청을 제거하였다. 혈청을 제거하고 남은 응고혈에 1 kg(1배량)의 물을 첨가하고 분쇄조에 넣어 1,000 rpm으로 실온에서 15분간 분쇄하였다. 마쇄액을 분리 플라스크로 옮겨 하층액을 수거하였다. 이 액을 항온 수조로 옮기고 pH를 8 로 맞추고 온도를 50 ℃까지 올려 한 시간 동안 단백질을 변성시켰다. 이를 1 kg 씩 이등분한 다음, 각각 다음과 같이 처리하였다.

(A) 하나는 2 ml/kg의 알칼라아제(Alkalase)를 첨가하였다. 이때 4-6 N의 NaOH를 이용하여 pH를 9-10가 되도록 유지하고 반응 온도는 50-60 ℃가 되도록 하면서 2-15시간 동안 반응시켰다. 10 kDa 이하의 물질은 여과하여 버리고 남은 물질은 물을 이용하여 씻은 후 196-202 ℃에서 분사 건조 또는 냉동건조 시켰다.

(B) 다른 하나는 3 N HCl로 pH를 6-8로 맞추고 플라보자임(flavourzyme)을 넣고 37 ℃에서 2-10시간 반응시켰다. 그런 다음 5 N의 HCl을 이용하여 pH를 4-5로 맞추고 헴철-폴리펩타이드 복합체를 침전시키고 원심분리하여 침전물을 얻었다. 침전물을 1 N NaOH를 사용하여 중성이 되게 하여 용해시킨 후 이 용액을 10 kDa 이하의 물질은 여과하여 버리고 남은 물질은 물을 이용하여 씻은 후 196-202 ℃에서 분사 건조 또는 냉동건조 시켰다.

(A)와 (B)의 방법으로 각각 분리한 헴-폴리펩타이드 복합체의 철 함량은 하기 표 1과 같다.

방법	pH	온도 (℃)	철 (mg/g)	프로토헴 (mg/g)
A	9-10	50-60	12-15	110-185
B	6.5-8	37	11-14	110-185

실시예 2 : 소의 전혈로부터 헴-폴리펩타이드 복합체의 제조방법

1.0 kg의 소 혈액 (전혈)에 1.0 kg (1배량)의 물을 첨가하고 분쇄조에 넣어 1,000 rpm으로 실온에서 15분간 분쇄하였다. 마쇄액을 분리조로 옮긴후 상층액을 제거하고 남은 용액을 항온 수조로 옮기고 pH를 10 - 11 로 맞추고 온도를 50 ℃까지 올려 한 시간 동안 단백질을 변성시켰다. 이 용액에 2 ml/kg의 알칼라아제를 첨가하였다. 이때 4-6 N의 NaOH를 이용하여 pH를 9-10가 되도록 유지하고 반응 온도는 50-60 ℃가 되도록 하면서 3-10시간 동안 반응시켰다. 이 반응액을 10 - 30 kDa 이하의 물질은 여과하여 버리고 남은 물질은 물을 이용하여 씻은 후 196-202 ℃에서 분사 건조 또는 냉동건조 시켰다. 이와 같은 방법으로 각각 분리한 헴-폴리펩타 이드 복합체의 철 함량은 12-18 mg/g이었고 프로토헴 함량은 140-250 mg/g이었다.

실시예 3 : 헴철의 용해도 검사

상기 실시예 1에서 분리한 헴철-폴리펩타이드 복합체와 다른 방법으로 분리하여 시판되고 있는 헴철 (이또 케미칼, 일본)을 물에 녹여 시간 경과에 따라 비교한 결과, 도 1과 같이 높은 용해도를 나타내었다. 또한 헴철-폴리펩타이드 복합체의 각각의 다른 pH의 용액에서의 용해도를 확인한 결과, 도 2과 같이 넓은 범위의 pH에서 높은 용해도를 나타내었다.

본 발명은 헴철의 제조방법에 관한 것으로 기존의 헤모글로빈으로부터 제조하는 방법이 고가의 헤모글로빈을 이용하거나 또는 헤모글로빈을 분리하는 데 고비용이 들어 실용화되기 곤란했던 것에 비해, 본 발명은 동물의 전혈 또는 응고혈로부터 직접 용해도가 보존되는 방식으로 헴철을 분리해 내는 방법으로서 기존의 제조법에 비해 공정이 간편할 뿐더러 경제적이고 수율이 높은 효과가 있다. 헴철-폴리펩타이드 복합체의 높은 용해도는 철분의 흡수효율을 높여주므로 좋은 빈혈치료제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 식품 첨가물로서도 높은 효용성을 가지므로, 이는 약품 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

채취된 혈액에 단백질 분해효소를 처리하여 가수분해시키고 여과, 농축 및 건조시킴으로써 헴철-폴리펩타이드 복합체를 제조하는 방법에 있어서,

단백질 분해효소 처리 전에, 동물의 전혈 또는 응고혈에 1-5배 중량의 물을 첨가하고 분쇄조를 이용하여 1,000-10,000 rpm으로 5-15분간 분쇄하는 단계; 및

상기 단계에서 얻어진 혈액 분쇄액에서 분리조 플라스크를 이용하여 상층의 지방층 및 불용성 물질을 분리하는 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 헴철-폴리펩타이드 복합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 단백질 분해효소 처리 전에 지방층이 제거된 혈액 분쇄액을 pH 8-11, 50-90℃에서 열처리하는 단계를 더욱 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 헴철-폴리펩타이드 복합체의 제조방법.