KR100925352B1 - 용해도와 체내 흡수율이 높은 헴철-폴리펩타이드 중합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 헴철-폴리펩타이드 중합체 - Google Patents

용해도와 체내 흡수율이 높은 헴철-폴리펩타이드 중합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 헴철-폴리펩타이드 중합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 용해도와 체내 흡수율이 높은 헴철-폴리펩타이드 중합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 헴철-폴리펩타이드 중합체를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 헴철-폴리펩타이드 중합체의 분자적인 특성을 기초로 한 제조 방법으로, 기존의 헴철보다 철 함량, 용해도와 체내 흡수율등에서 현저한 효과를 보이는 헴철-폴리펩타이드 중합체를 제조하는 방법 및 헴철 폴리펩타이드 중합체에 관한 것이다.
헴철-폴리펩타이드 중합체, 용해도, 철 함량, Sephacryl 크로마토그래피 (Sephacryl chromatography), 전기영동

Description

용해도와 체내 흡수율이 높은 헴철-폴리펩타이드 중합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 헴철-폴리펩타이드 중합체{A method for preparing heme-iron polypeptide polymer having high solubility and absorption rate and heme-iron polypeptide polymer prepared from this method}
본 발명은 헴철 폴리펩타이드 중합체의 분자적 특성을 기초로, 기존의 헴철 중합체보다 높은 용해도와 체내 흡수율을 가지는 헴철 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
철은 산소운반에 필수적인 역할을 하는 생체 내에서 반드시 필요한 무기물중의 하나이다. 철의 1일 권장량은 어린이의 경우 10-12 mg, 성인 남성 12 mg, 성인 여성 18 mg, 임산부 26-30 mg, 수유기의 여성은 20 mg이다. 식품 중, 철은 헴철 (heme iron)과 비-헴철 (non-heme iron)의 2가지 형태로 존재하며 육류등 동물성 식품 중의 철 함량의 평균 40 %가 헴철형이고 나머지 60% 가 비-헴철형이다. 또한 식물성 식품 중의 철은 모두 비-헴철형으로 존재한다.
헴철의 섭취 형태는 헤모글로빈과 미오글로빈이 대부분이고, 흡수율이 매우 높고 다른 식사요인에 의하여 영향을 받지 않는다. 그러나 비-헴철의 흡수는 여러가지 요인과 식품의 종류에 따라 큰 영향을 받는다. 육류에서의 철의 흡수율은 대략 10 % 가량이며 곡류의 경우 5 % 이하여서 철분 필요량을 충족하기 위해서는 많은 섭취량이 요구되며, 개인의 철 영양상태에 따라서도 흡수율은 영향을 받는다. 여성과 어린이들과 같이 체내 보유량이 적으면 흡수율은 높아지고 남성처럼 철 저장량이 높으면 낮아진다. 철의 흡수율은 통상 건강의 경우 섭취한 철분의 5% 정도만을 흡수돠는 것으로 알려져 있다. 그러므로 철의 결핍은 전 세계적으로 가장 중요한 영양문제로서 그 원인은 낮은 섭취량, 흡수 문제, 성장, 실혈, 임신 등에 의한 저장 철의 고갈 등이다. 철 결핍의 위험이 높은 시기는 급격한 신체성장이 이루어지는 6개월-4세의 영유아기, 사춘기, 월경 혈의 손실이 있는 가임기 여성, 철의 요구가 증가하는 임신기이며 특히 영 유아와 임산부는 철 결핍이 되기 쉬운 것으로 알려져 있다. 철 결핍을 예방, 치료하기 위하여 염화 제2철 (ferric chloride), 구연산 철 (ferric citrate), 구연산 철 암모늄 (ferric ammonium citrate), 호박산 구연산 철 나트륨 (iron and sodium succinate citrate), 젖산 철 (ferrous lactate), 피로인산 제2철 (ferric pyrophosphate), 헴철 (heme iron) 등의 철 화합물이 식품의 철 강화제 및 제약 원료로 사용되고 있다.
헴철은 헤모글로빈, 미오글로빈 등에 함유되어 있는 성분으로 동물의 전혈로부터 분리, 정제하여 제조한다. 헤모글로빈 (분자량 65,000 달톤)은 헴기를 포함하고 있는 4개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 단백질로 1몰의 헤모글로빈에는 4몰의 철이 함유되어 있다. 헤모글로빈 중 철의 함량을 분자량에 따라 계산하면 0.34 %, 헴철의 함량은 3.8%이다. 따라서, 고농도 헴철을 얻기 위하여는 단백질 함량을 낮추는 것이 필요하다.
헴철을 얻기 위한 방법으로는 먼저 혈액 중 적혈구에서 헤모글로빈을 분리하고, 카르복시메틸 셀룰로스 (carboxymethyl cellulose; CMC)를 첨가하여 CMC 복합 체로 헴을 침전시키는 방법 (Autio, et al., US Patent 4,518,525), 저급 알코올과 같은 탈수제를 사용하거나 이미다졸 (imidazol) 유도체를 사용하는 방법 (Lindroos, US Patent 4,431,581), 라이신, 아르기닌의 아미노산을 헤민의 3배 이상을 첨가하는 방법 (Ingberg, et al., US Patent 5,008,388) 등이 알려져 있다. 그러나 이상의 방법들은 헤모글로빈으로부터 글로빈 단백질을 분리하기 위하여 고안된 것으로 적혈구 용액 혹은 헤모글로빈 용액에 별도의 화합물을 첨가하여 글로빈 단백질을 분리하고 부산물로 헴철을 얻을 수 있도록 구성되어 있으나 회수된 헴철의 성상에 따른 기능성 및 특성은 알려진 바 없다.
또 다른 제법으로는 고농도의 유기산을 이용하여 고온에서 분해하는 방법 (Liu et al., J, Agric. Food Chem., 44, 2957, 1996)과 단백질 분해효소를 처리하여 헤모글로빈 중 글로빈을 분해하여 펩타이드를 함유하는 헴철을 제조하는 방법 (Eriksson, US Patent 4,411,915, Piot et al., J. Chem. Technol. Biotechnol., 42, 147, 1988) 이 있다. 유기산을 사용하는 방법은 다량의 유기산이 최종 제품에 함유되어 인체에 좋지 않은 영향을 줄 수 있다는 단점이 있다.
기존에 정제된 헤모글로빈을 이용하여 헴철을 생산하는 방법 (오남순 외, 대한민국 특허 특2001-0007785)와 단백질 분해효소를 사용하여 헴철을 생산하는 방법 중 효소 분해물의 pH를 조절하여 헴철을 선택적으로 침전시킨 후 분리 건조하는 방법 (오남순 외, 대한민국 특허 특2002-9985167) 이 있다. 상기 기술들에서는 헴철의 분자량이 매우 작기 때문에 헴철의 효율적인 회수를 위해 1~10 kDa 의 포어 사이즈 한외 여과막을 사용해야 한다고 규정하고 있다. 그러나 이러한 방법에 의해 생산된 헴철의 구체적인 성상에 대해서는 기술한 바 없다.
중성의 pH를 가지는 십이지장과 같은 조건에서의 헴철의 용해도는 흡수율에 중요한 요소로 작용한다는 보고가 있다(Kim SY 외. JOURNAL OF MEDICINAL FOOD. 9 (2) 2006, 231-236). 기존에 공개된 기술 (대한민국 공개특허 2006-0005770)에서는 Ito(이토)산 헴철과 헴철-폴리펩타이드 중합체의 용해도의 중요성을 서술하고 있다. 국내 헴철 시장의 대부분을 차지하는 Ito(이토)산 헴철 (일본, 이토케미칼 사)은 중성 수용액에서 매우 낮은 용해성을 보였는데, 이는 Ito(이토)산 헴철의 낮은 체내 흡수율의 요인이 될 수 있을 것으로 판단된다.
이에 본 발명에서는 철 함량이 높은 헴철-폴리펩타이드 중합체의 단백질 특성을 규정하고, Ito (이토)산 헴철과 인체 흡수율의 비교 시험을 통해 본 기술의 우수성을 증명하였다. 또한 헴철-폴리펩타이드 중합체를 효율적으로 회수할 수 있는 방법을 개발하였다.
삭제
본 발명은 용해도와 체내 흡수율이 높은 철 함량이 높은 함량 헴철-폴리펩타이드 중합체의 규정과 생산에 그 목적이 있다.
이러한 본 발명의 기술적 과제는 동물의 전혈 또는 응고혈을 이용하여 생산한 철 함량이 높은 헴철-폴리펩타이드 중합체의 분자적 특성을 규정하고 용해도와 체내 흡수율과의 상관관계의 규명 및 효율적인 제조방법을 제공함으로서 달성하였다.
삭제
본 발명은 용해도와 흡수율이 높은 철 공급원인 철 함량이 높은 함량 헴철-폴리펩타이드 중합체의 특성을 규정하고 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 철 함량이 높은 함량 헴철-폴리펩타이드 중합체의 특성 및 효능을 검증하였으며, 전혈 또는 응고혈로부터 혈청제거 효율을 높이는 방법과 단백 분해 효소반응 후 철 함량이 높은 함량 헴철-폴리펩타이드 중합체를 효율적으로 회수하기 위한 방법을 개발하였다.
구체적으로, 본 발명의 제1 견지에 따르면,
동물의 전혈 또는 응고혈을 최소 12시간동안 냉암소에서 응고시킨 다음, 응고혈을 12-15cm 간격으로 정방형 타입으로 수직 절단하고 최소 1시간 경과후 혈청을 제거하여 총 중량 대비 20-25 %의 혈청이 제거되고 남은 응고혈을 사용하는 혈청 제거 단계;
혈청이 제거된 응고혈에 1-5배 중량의 물을 첨가하고 분쇄조를 이용하여 1,000-10,000 rpm으로 5-15분간 분쇄하는 단계; 상기 분쇄액에서 분리조를 이용하여 상층의 지방층 및 불용성 물질을 분리하는 단계; 상기 지방층이 제거된 혈액 분쇄액을 pH 8-11, 50-90℃에서 교반하며 열처리하는 단계; 상기 열처리후 단백질 분해효소를 처리하여 가수분해시키는 단계; 및 상기 가수분해물을 한외여과으로 여과, 농축 및 건조시키는 단계; 로 이루어지는 용해도와 체내 흡수율이 높은 헴철-폴리펩타이드 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 한외 여과막으로의 여과단계는 100~250kDa 포어사이즈를 갖는 한외 여과막을 사용하는 것을 특징으로 하는, 용해도와 체내 흡수율이 높은 헴철-폴리펩타이드 중합체의 제조 방법.
본 발명의 제2 견지에 따르면,
상기 제1 견지의 방법에 의해 제조되며, pH 6.5~7.6의 수용액하에 비환원 상태에서 100~250 kDa, 환원상태에서 9~11kDa의 분자량이 95%(w/w) 이상을 차지하는 헴철-폴리펩타이드 중합체를 제공한다. 또한 pH 6.5-7.5 사이의 중성 완충액으로 용해시킨 0.0001-10 %(w/v) 헴철 폴리펩타이드 중합체 용해액에서 첨가한 철 분량 대비 97.0±2.0 % (w/w)이상의 철분이 상청액에서 검출이 가능한 것을 특징으로 하는 용해도가 높은 헴철-폴리펩타이드 중합체를 제공한다.
삭제
본 발명은 십이지장과 소장과 같은 조건인 중성 수용액에서 뛰어난 용해성을 유지함으로 인해 체내 흡수율이 높은 고순도의 헴철-폴리펩타이드 중합체의 분자적 특성을 규정하였고 생산 효율을 높일 수 있어 관련 시장의 창출을 확대시키는 효과를 얻을 수 있게 될 것이다.
실시예 1: 돈혈의 전혈로부터 효율적인 혈청 제거 기술
전혈 (돈혈) 20 kg을 분리 가능한 내부 거름 용기가 포함된 배수 밸브가 장치된 용기에 담고 혈액을 12시간 이상 냉암소에서 응고 시킨 뒤, 응고혈을 12~15cm 간격으로 정방형 모양으로 수직 절단하여 4℃에 보관하며 시간별로 혈청을 수거하여 정량하여 혈청제거율을 측정한 결과, 절단 후 1시간 이상 경과하였을 때 혈청을 제거하면 총중량 대비 약 20~25% 의 혈청이 제거되며 남은 응고혈만을 이용하여 헴철-폴리펩타이드 중합체의 제조 공정을 시작하였다. 이는 자연 침강법을 이용한 상청액으로부터 혈청을 제거하는 방법에 비해 15~20%의 제거 효율을 높였다.
실시예 2: 돈혈의 응고혈로부터 헴철-폴리펩타이드 중합체의 제조
120 kg의 응고된 혈액에서 혈청을 제거한 후 100 kg의 물과 함께 분쇄조에 넣고 1분당 1,000에서 10,000회의 회전수를 갖는 분쇄 날을 이용하여 실온에서 15분간 마쇄한다. 마쇄 액을 2시간 이상 정치하고 부유층을 제외한 하층 액을 항온 조건의 반응조로 이송한다. 반응조의 pH를 9-11 로 맞추고 온도를 50-90 ℃까지 올려 한 시간 동안 교반하며 단백질을 변성시킨다. 이때 2 ml/kg의 Alkalase (노보자임사, 미국)를 첨가하고 4~6 N의 NaOH를 이용하여 pH를 9-10, 반응 온도는 50-60 ℃가 되도록 유지 하면서 2~15시간동안 반응시킨다. 반응을 마친 원료는 실온과 동일하게 될 때까지 냉각시키고, 다량의 물과 함께 한외여과막을 이용하여 순환 농축하여 고온 분사건조를 실시한다.
실시예 3: 헴철-폴리펩타이드 중합체의 분자량 측정
헴철-폴리펩타이드 중합체를 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 100 mg/ml 농도로 완전 용해시키고 15,000xg, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 상청액을 취하여, 동일 용액으로 동질화되어 있는 Sephacryl S-200HR (1.5 x 110 cm) (시그마알드리치사, 미국)을 이용하여 0.24 ml/min의 속도로 용출시켰다. 용출된 단백질은 10분 간격으로 분획을 얻었으며 각 분획은 Bradford 법 (Bio-Rad, 미국)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였고, QuantiChrom(TM) 철 정량 키트 (Bio assay system, 미국)을 이용하여 철 함량을 측정하여 그 결과는 도 1에 표시하였다.
분자량별로 용출된 단백질 분자량의 분포 특성을 비교하였을 때 동일한 용출 조건에서 실시한 표지 단백질의 Sephacryl 크로마토그래피에서 250 kDa에 해당하는 분자의 용출지점에 해당하는 지점에서 최고 농도의 단백질의 용출을 확인하였으며 철분의 농도의 패턴도 역시 정확히 일치하였다. 또한 70 kDa에 해당하는 표지 단백질의 용출지점에서도 고농도의 단백질의 용출을 확인할 수 있었고 철분의 농도 곡선과 정확히 일치하였다. 그러나 단백질 대비 철의 함량은 250 kDa 중합체에 비교 할 때 70 kDa 중합체가 낮았다 (도 1, inset). 이는 앞서 기술한 실시 예에 의해 획득된 철 함량이 높은 헴철-폴리펩타이드 중합체는 250 kDa 전후의 분자량을 가지는 단백질임을 증명하고 있다.
도 1의 그래프상 제 1 정점에 있는 분획을 이용하여 다양한 폴리아크릴아마이드 농도와, 환원 및 비환원등의 조건으로 전기영동을 시행한 결과는 도 2와 같다. 도 1의 그래프에서 철 함량 및 단백질이 모두 정점에서 일치하는 분획을 이용하여 환원제로서 β-메르캅토에탄올을 포함한 Laemmli buffer와 함께 100℃에서 5분간 가열한 시료를 이용하여 20 % SDS-PAGE를 실시한 결과를 (도2A)에 표현하였고 헴철-폴리펩타이드 중합체 용액을 이용하여 비환원상태에서 10 % SDS-PAGE를 실시한 결과를 (도2B)에 표현하였다.
Sephacryl 크로마토그래피와 전기영동을 실시하여 얻은 결과를 통해 고순도의 고분자량 헴철-폴리펩타이드 복합체는 10 kDa 미만인 동종 또는 이종 단량체의 복합체로 판단되었지만, 상호간의 다양한 결합을 통해 거대분자를 형성하고 있어, 실제로는 250 kDa 이상의 중합체를 형성하고 있음을 확인하였다.
실시예 4: 헴철-폴리펩타이드 중합체의 대량생산을 위한 한외여과 방법
돈혈 300 kg을 혈청제거, 분쇄, 지질층분리, 효소반응을 거쳐 얻어진 산물을 각각 1/3로 나누고, 포어 사이즈가 30, 100, 300 kDa인 한외여과 모듈 (100 x 1,500 mm)(케미코아사, 한국)을 이용하여 순환 농축을 실시하였다. 각 공정은 제조사가 제시한 포어 사이즈 기준별 유속과 압력이 유지되는 상태에서 세척 및 농축 공정을 실시하였다. 한외여과 공정을 마친 시료는 분무 건조 (input temp. 150~300℃, output temp. 70~200℃; 0.2~1 Liter/min)(삼연엔지니어링, 한국)를 실시하여 분말상의 헴철-폴리펩타이드 중합체를 회수하였다.
각 공정에서 회수된 분말상의 헴철-폴리펩타이드 중합체는 중량과 철 함량은 킬달 분해방법을 통해 측정하였으며, 각 공정에 사용된 한외여과막의 포어 사이즈에 따른 철분 회수량의 비교표는 하기표 1과 같다.
헴철-폴리펩타이드 중합체의 제조 공정에서 사용된 한외여과막의 포어 사이즈에 따른 분말상의 헴철-폴리펩타이드 중합체의 회수량 (100 kg 전혈 이용시 회수된 분말의 kg수), 철 함량 (1 g의 분말상의 헴철-폴리펩타이드 중합체에 포함된 철의 mg수), 100 kg 전혈을 이용하여 실시한 공정에서 회수된 헴철-폴리펩타이드 중합체에 함유된 총 철분 량 (g)을 확인한 것으로, 모든 시험은 최소 5회 이상 반복하였으며 평균과 표준편차 값을 구하여 유의성을 검증하였다 (300 kDa 포어 사이즈 한외 여과막 대비 *P<0.01; ** P<0.05).
한외여과막의 포어사이즈에 따른 헴철 폴리펩타이드 중합체 회수율 비교
Production of heme-iron polypeptide polymer complex (kg) Content of Iron (mg/g) Total Iron (g)
30 kDa 한외여과막 2.725±0.892 9.105±2.156* 23.407±2.765*
100 kDa 한외여과막 1.565±0.453 13.048±1.333** 21.023±4.492**
300 kDa 한외여과막 1.027±0.326 12.690±2.179 12.595±1.895

상기표 1에서 보듯이, 30, 100, 300 kDa 한외여과막을 사용하였을 때 헴철-폴리펩타이드 중합체 회수량은 30 kDa 막의 경우가 가장 높았고 100, 300 kDa 순이었다. 그러나 30 kDa 막의 경우, 헴철-폴리펩타이드 중합체 무게 당 철 함량은 9.1 mg/g로서 헴철 원료 기준치(1.0% 식품의약품안전청 식품첨가물공전)에 못 미쳤다. 100, 300 kDa 막의 경우, 각각 13.0, 12.7 mg/g로서 기준치 이상의 높은 철함량을 갖는 헴철-폴리펩타이드 중합체를 보였다. 총 철 회수율은 30 kDa 막에 비하여 300 kDa 막의 사용을 통한 회수율은 50%의 감소를 보였다. 이는 헴철-폴리펩타이드 중합체의 분자량은 실시예를 통한 제조방법을 통해 생산한 상태에서 거대 분자를 형성하고 있지만, 50% 이상은 300 kDa 이하의 분자량을 가지고 있으므로 대량생산에서 300 kDa의 포어 사이즈 막의 사용은 주의가 필요함을 나타내고 있다.
삭제
실시예 5: 헴철-폴리펩타이드 중합체의 용해도 시험
상기의 실시예에 의해 제조된 헴철-폴리펩타이드 중합체 (철분함량 1.5%, w/w)를 기존 시중에 판매되고 있는 Ito(이토)산 헴철 (철분함량 1.0%, w/w) (이또사, 일본)의 용해도를 비교하고 표 2에 정리하였다.
구체적으로는, 15 ml falcon tube에 100 mg의 헴철-폴리펩타이드 중합체와 Ito(이토)산 헴철을 정량하여 넣고 십이지장의 pH 조건과 유사한 20 mM 인산 완충 용액 (pH 7.4)로 정확히 10 ml까지 채운 다음 vortex로 1분간 강하게 혼합한 후 20℃에서 5분간 1,500×g로 원심분리를 실시하였다. 상청액은 분리하여 다른 청정 용기에 옮기고 침전된 잔류물은 건조한 다음 칭량하여 분말 용해성을 측정하였다. 또한 분리된 상청액은 킬달 분해 방법을 통해 철분 함량을 측정하여 철분 용해성을 측정하였다. 본 시험은 최소 3회 이상 반복하였으며, 평균과 표준편차 값을 구하여 유의성을 검증하였다 (Ito(이토)산 헴철 대비 * P<0.005; **P<0.001).
헴철 폴리펩타이드 중합체와 수입산 헴철의 분말 용해성 및 철분 용해성 평가
헴철-폴리펩타이드 중합체 (철로서 15 mg) Ito(이토)산 헴철 (철로서 10 mg)
잔류물 건조 중량 (mg) 5 ± 1.3* 97.3 ± 2.5
분말 용해도 (%, w/w) ≥ 95.0 ≤ 3
상청액 내 총철분 (mg) 14.2 ± 1.1** 0.2 ± 0.07
철분 용해도 (%, w/w) ≥ 94.7 ≤ 2
실시예 6: 헴철-폴리펩타이드 중합체의 흡수율 시험
피험자 (남성 24명, 여성 32명)을 대상으로 공복시에 철분 측정 키트 (시그마알드리치사, 미국)를 이용하여 혈청 내 철분농도를 측정하였다. 이중 철 결핍 증상을 나타내는 피험자를 선별하여 헴철-폴리펩타이드 중합체와 Ito(이토)산 헴철의 흡수도를 위약을 대조군으로 하여 시험하였다. 철로서 12 mg에 해당하는 헴철-폴리펩타이드 중합체와 Ito(이토)산 헴철, 그리고 위약을 정량의 식단에 맞춘 식사를 실시한 직후 동시에 물과 함께 섭취하고 3시간, 5시간 경과 후 각각 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 동일한 방법에 의해 혈청을 분리하고 철분 농도를 측정하였다. 하기표 3은 헴철-폴리펩타이드 중합체와 Ito(이토)산 헴철의 체내 흡수율을 비교한 결과를 정리한 것으로, 철분 결핍 증상이 있는 12시간 공복간의 피험자 (n=10)를 대상으로 헴철-폴리펩타이드 중합체와 Ito(이토)산 헴철을 철분량 기준으로 12 mg을 간단한 식사 직후 동시에 섭취하게 한 후 공복시에 대한 3시간과 5시간 후의 혈청내 철분 농도의 값을 나타낸 것이다. 각 군별로 평균과 표준편차를 구하여 유의성을 검증하였다(Ito(이토)산 헴철 섭취군 대비 *P<0.05; **P<0.03).
헴철 폴리펩타이드 중합체와 수입산 헴철의 체내흡수도 비교
헴철-폴리펩타이드 중합체 (철로서 12mg) Ito(이토)산 헴철 (철로서 12mg)
공복시 혈청 내 철분농도 (㎍/dl) 65±6 67±7
섭취후 3시간 경과후 98±8* 75±6
섭취후 5시간 경과후 110±9** 68±7

상기 표 3의 결과를 통해 헴철-폴리펩타이드 중합체 섭취군은 3시간과 5시간후 혈청 내 철분 농도가 유의하게 증가하는 것을 확인하였으나 Ito(이토)산 헴철과 위약은 각각 변화가 없거나 오히려 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과들은 실시예에 의해 제조된 헴철-폴리펩타이드 중합체는 헴수송체에 의해 선택적으로 흡수되므로 다른 음식물의 섭취등에 영향을 받지 않으며 철분 이용도가 높다는것을 확인시켜 주고 있다.
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본 발명은 기존에 알려지지 않았던 헴철-폴리펩타이드 중합체의 분자적 특성을 규정하였고 그 특성에 맞는 효율적 생산 기술을 제공하였으므로 국민 보건을 위해 제약 및 관련 산업에 이용할 수 있는 기술이다.
도 1. 철 함량이 높은 함량 헴철-폴리펩타이드 중합체의 분자량을 측정하기 위해 Sephacryl S-200HR을 이용하여 용출 시간대 분획별로 철 함량 및 단백질 함량을 측정한 결과.
삼각형 표지 (-▲-) 의 곡선은 철 함량을, 원형 표지 (-●-)의 곡선은 단백질 함량을 나타내는 수치들이다. 화살표 (↓)와 표기된 것은 분자량을 알고 있는 단백질 혼합액을 동일조건에서 시험하였을 때 용출되는 분획 위치와 분자량을 표기한 것이다.
Inset: 250 kDa (달톤), 70 kDa 헴철-폴리펩타이드 중합체의 단백질 함량 당 철 함유량의 비율.
도 2. 환원제의 첨가 유무에 따른 헴철-폴리펩타이드 중합체의 분자량의 변화를 나타내는 전기영동 결과.
(A) 환원조건 전기영동. lane 1: 분자량 표지자; lane 2: 헴철-폴리펩타이드 중합체.
(B) 비환원조건 전기영동. lane 1: 분자량 표지자; lane 2: 헴철-폴리펩타이드 중합체

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  11. 동물의 전혈을 냉암소에서 응고시킨 후 응고혈의 혈청제거 단계, 혈청이 제거된 혈에 분쇄조를 이용하여 분쇄하는 단계, 분쇄액에서 상층의 지방층 및 불용성 물질을 분리하는 단계, 지방층이 제거된 혈액 분쇄액을 열처리하는 단계, 단백질 분해효소로 가수 분해시키는 단계, 가수 분해물을 한외 여과막으로 여과, 농축 및 건조시키는 단계로 이루어지는 헴철-폴리펩타이드 중합체 제조 방법에 있어서,
    상기 혈청제거 단계는 응고혈을 12-15㎝ 간격의 정방형 타입으로 절단하고, 최소 1시간 경과 후 총 중량대비 20-25%의 혈청을 제거하고, 상기 한외 여과막으로의 여과단계는 100~250kDa의 포어사이즈를 갖는 한외 여과막을 사용하는 것을 특징으로 하는, 용해도와 체내 흡수율이 높은 헴철-폴리펩타이드 중합체의 제조 방법.
  12. 제11항에 따라 제조되고, pH 6.5~7.6의 수용액하에 분자량이 비환원 상태에서는 100~250 kDa, 환원상태에서는 9~11kDa가 95%(w/w) 이상을 차지하는 헴철-폴리펩타이드 중합체.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 헴철-폴리펩타이드 중합체는 pH 6.5-7.5 사이의 중성 완충액으로 용해시킨 0.0001-10 %(w/v) 헴철 폴리펩타이드 중합체 용해액에서 첨가한 철 분량 대비 97.0±2.0 % (w/w)이상의 철분이 상청액에서 검출이 가능한 것을 특징으로 하는 헴철-폴리펩타이드 중합체.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112999897A (zh) * 2021-03-22 2021-06-22 湖南益旺生物科技有限公司 一种利用反渗透膜提取血粉中血红素的方法与工艺

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KR20060005770A (ko) * 2004-07-14 2006-01-18 주식회사 에이.비.아이 동물의 전혈 또는 응고혈로부터 수용성 헴철-폴리펩타이드복합체의 제조방법

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