CN101124988B - 从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法，属于医药保健、化工领域。将蛹虫草粉末以冷渗法提取过滤，滤渣与乙醇混合，超声波辅助提取、离心，上清液浓缩、醇析。醇析上清液减压浓缩、洗脱，洗脱液浓缩结晶，用正丁醇重结晶，得到精制虫草素；醇析沉淀进行酶解脱蛋白处理、离心，上清液浓缩、洗脱，流出液浓缩、醇析，冷冻干燥后得到精制多糖。本发明的制备过程中只以水和乙醇为溶剂，减少污染，所用树脂可数次重复使用，成本低。本发明方法充分开发利用蛹虫草生物活性成分，实现虫草素和虫草多糖的共同提取，保证了虫草素和虫草多糖的生物活性。最大限度地增加了原料的利用率，降低了生产成本，适合大规模工业化生产。
Description
一、技术领域：
本发明涉及一种从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法，属于医药保健、化工领域。总体上涉及物质的提取、分离，更具体地讲，本发明涉及一种从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法。
二、背景技术：
蛹虫草是一种名贵的中药材，性平味甘，具有滋肺补肾、止血化痰的功效。近年来的研究结果表明，蛹虫草是冬虫夏草的重要人工替代品之一，其在降血脂，防治动脉硬化，保护心、脑组织，镇静催眠，增强巨噬细胞活性，抗癌、抗炎、抗菌、抗缺氧等方面具有良好功效。蛹虫草的功能性成分、药理药效作用与天然冬虫夏草基本一致，其子实体富含虫草素和虫草多糖等重要的生理活性成分。据现代科学论证：虫草素是一种具有抗菌活性的核苷类物质，对多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用，能抑制癌细胞的生长，并有降血糖的作用；虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖，它能促进淋巴细胞转化，提高血清IgG的抗体含量和机体的免疫功能，增强机体自身抗癌抑癌的能力。
目前，根据国内外公开专利报道，提取精制虫草素和虫草多糖的方法主要有水煮法、醇提法、超临界CO2萃取法等。中国专利CN1339440报道了以食用真菌虫草或北虫草人工培养后的发酵物为原料，采用超临界技术萃取有效成分，同时结合常规方法除去杂质、浓缩、结晶获得虫草素。较之于传统的浸提法，超临界CO2萃取克服了前者提取时间长、温度高、系统开放的缺点，可萃取出较多的极性组分，可以更加真实、全面的反映药材的化学组份，但由于超临界CO2萃取技术用于虫草素提取阶段成本过高，难以进行大规模实践。中国专利CN1560085A公开了一种利用虫草人工培养中产生的培养基下脚料提取虫草多糖的工艺，该法可变废为宝，减少资源的浪费，提高经济效益，但是在多糖制备过程中使用了氯仿等有机溶剂，不利于食品安全。目前有关蛹虫草活性成分综合提取精制方面的专利还未见报道，现有提取技术多是单一的或间歇的，往往通过一套系统单纯提取虫草素或虫草多糖，这样非连续性的提取技术不便于工业化生产；另外，由于提取分离步骤太多，使得现有技术提取的有效成分总含量不高，造成资源极大的浪费。
三、发明内容：
技术问题本发明主要克服现有技术的不足，提供一种低成本，并且对环境污染小的虫草素和虫草多糖的精制方法，目的是使虫草素和虫草多糖能同时被提取、避免单一提取给蛹虫草活性成分带来的损失，以提高蛹虫草综合利用度，降低投资和运行成本，最大价值的发挥蛹虫草的综合经济效益。
技术方案
一种从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法，包括如下步骤：
(1)将蛹虫草子实体粉碎过40～60目筛；
(2)向粉碎的原料中加入95％乙醇或无水乙醇以冷渗法进行提取，蛹虫草粉和95％乙醇或无水乙醇的混合比例按重量计为1∶5-20，将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来；
(3)弃滤液，将滤渣回收于55℃真空烘干；
(4)将烘干后的滤渣与乙醇混合，蛹虫草粉和10-30％乙醇的混合比例按重量计为1∶15-40，进行超声波辅助提取，超声波频率为20-40KHz，超声处理时间为30-90分钟，重复处理1-3次，其中乙醇浓度为10-30％；提取结束后，过滤，合并多次滤液，在35-45℃，300-700mmHg下减压浓缩，添加95％乙醇或无水乙醇，使溶液中乙醇重量含量为55-90％，静置8-24小时，使水溶性蛹虫草粗多糖析出；
(5)取醇析后的上清液，在35-45℃，300-700mmHg下减压浓缩至干，向其中加蒸馏水溶解，调pH值至3.0-4.0，上离子交换柱用0.1-0.3mol/L氨水洗脱除掉杂质，收集洗脱液进行再浓缩，冷藏析出晶体，用正丁醇重结晶，得到精制虫草素；
(6)收集第(4)步沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖，在50-60℃下将之烘干；
(7)向烘干的蛹虫草粗多糖中加入20-25倍体积蒸馏水溶解，加入木瓜蛋白酶进行脱蛋白处理，木瓜蛋白酶在提取溶液中重量含量为1.5-3.0‰，在50-60℃，pH5.5-6.5条件下水解4-6小时，离心去除沉淀得二次上清液，将二次上清液浓缩，上大孔树脂柱床，用蒸馏水洗脱至流出液呈无色透明，合并流出液，浓缩，加入95％乙醇或无水乙醇，使得溶液中乙醇重量含量达到55-90％，沉淀出多糖，经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖。
上述从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法中，所述的冷渗法是在0-8℃环境中，进行静态提取1-3次，每次2-4小时。离子交换树脂为732、724型阳离子交换树脂或D113型大孔阳离子交换树脂。大孔树脂为普通大孔树脂，其型号为AB-8型或D101型。
有益效果
本发明克服了现有技术的不足，提供了一种低成本，并且对环境污染小的虫草素和虫草多糖的精制方法，制备过程中只以水和乙醇为溶剂，减少污染，所用的树脂再生后可数次重复使用，成本低，制得的虫草素纯度在90％以上，多糖纯度在85％以上。
本发明方法以综合利用蛹虫草资源为前提，充分挖掘蛹虫草功能性成分，实现虫草素和虫草多糖的共同提取，保证了虫草素和虫草多糖的生物活性。最大限度地增加了原料的利用率，降低了生产成本。本发明方法适合大规模工业化生产。
四、具体实施方式：
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述，但并不意味着对本发明的任何限制。
实施例1
将1kg蛹虫草子实体粉碎过60目筛，向粉碎的原料中加入5000毫升95％乙醇以冷渗法提取3次，每次3小时，将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来，弃滤液，滤液可留作其他用途。将滤渣回收于55℃真空烘干，将烘干后的滤渣与20％的乙醇按重量比1∶10混合，进行超声波辅助提取3次，每次提取40分钟。提取结束后，过滤，合并多次滤液，减压浓缩，添加95％乙醇，使溶液中乙醇含量为80％(重量)，静置8小时。
取上清液，减压浓缩至干，向其中加水溶解，调pH值至3.5，上732型阳离子交换柱用0.15mol/L的氨水进行洗脱除掉杂质，收集洗脱液进行再浓缩，冷藏析出晶体，用8毫升正丁醇重结晶，得到精制虫草素0.489g，含量为97.1％。
收集沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖，在55℃下将之烘干，收取蛹虫草粗多糖，向烘干的蛹虫草粗多糖中加入15倍体积蒸馏水溶解，加入木瓜蛋白酶在55℃，pH6.0条件下水解5小时，木瓜蛋白酶的加入量为加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的2‰，离心去除沉淀得二次上清液，将二次上清液浓缩，上D101型大孔树脂柱床，用蒸馏水洗脱至流出液呈无色透明，合并流出液，浓缩，加入95％乙醇，使得溶液中乙醇含量达到80％(重量比)，沉淀出多糖，经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖33.21g，含量为92.8％。
实施例2
将0.5kg蛹虫草子实体粉碎过40目筛，向粉碎的原料中加入3000毫升无水乙醇以冷渗法提取2次，每次4小时，将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来，弃滤液，滤液可留作其他用途。将滤渣回收于55℃真空烘干，将烘干后的滤渣与30％的乙醇按重量比1∶20混合，进行超声波辅助提取2次，每次提取60分钟。提取结束后，进行过滤，合并多次滤液，减压浓缩，添加无水乙醇，使溶液中乙醇含量为80％(重量)，静置12小时。
取上清液，减压浓缩至干，向其中加水溶解，调pH值至3.0，上724型阳离子交换柱用0.2mol/L氨水进行洗脱除掉杂质，收集洗脱液进行再浓缩，冷藏析出晶体，用4毫升正丁醇重结晶，得到精制虫草素0.185g，含量为94.8％。
收集沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖，在55℃下将之烘干，收取蛹虫草粗多糖，向烘干的蛹虫草粗多糖中加入20倍体积蒸馏水溶解，加入木瓜蛋白酶在55℃，pH6.0条件下水解4小时，木瓜蛋白酶的加入量为加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的1.5‰，离心去除沉淀得二次上清液，将二次上清液浓缩，上D101型大孔树脂柱床，用蒸馏水洗脱至流出液呈无色透明，合并流出液，浓缩，加入无水乙醇，使得溶液中乙醇含量达到80％(重量)，沉淀出多糖，经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖15.52g，含量为93.1％。
实施例3
将0.8kg蛹虫草子实体粉碎过40目筛，向粉碎的原料中加入4500毫升无水乙醇以冷渗法提取2次，每次5小时，将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来，弃滤液，滤液可留作其他用途。将滤渣回收于55℃真空烘干，将烘干后的滤渣与20％的乙醇按重量比1∶25混合，进行超声波辅助提取2次，每次提取90分钟。提取结束后，进行过滤，合并多次滤液，减压浓缩，添加无水乙醇，使溶液中乙醇含量为70％(重量)，静置16小时。
取上清液，减压浓缩至干，向其中加水溶解，调pH值至3.0，上D113型大孔阳离子交换柱用0.15mol/L氨水∶乙醇(80∶20，体积比)的碱性洗脱液除掉杂质，收集洗脱液进行再浓缩，冷藏析出晶体，用7毫升正丁醇重结晶，得到精制虫草素0.336g，含量为94.8％。
收集沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖，在55℃下将之烘干，向烘干的蛹虫草粗多糖中加入20倍体积蒸馏水溶解，加入木瓜蛋白酶在55℃，pH6.5条件下水解6小时，木瓜蛋白酶的加入量为加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的2‰，离心去除沉淀得二次上清液，将二次上清液浓缩，上AB-8型大孔树脂柱床，用蒸馏水洗脱至流出液呈无色透明，合并流出液，浓缩，加入无水乙醇，使得溶液中乙醇含量达到70％(重量)，沉淀出多糖，经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖26.63g，含量为90.8％。
实施例4
将0.75kg蛹虫草子实体粉碎过60目筛，向粉碎的原料中加入4800毫升95％乙醇以冷渗法提取3次，每次4小时，将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来，弃滤液，滤液可留作其他用途。将滤渣回收于55℃真空烘干，将烘干后的滤渣与10％的乙醇按重量比1∶25混合，进行超声波辅助提取2次，每次60分钟。提取结束后，过滤，合并多次滤液，减压浓缩，添加无水乙醇，使溶液中乙醇含量为90％(重量比)，静置24小时。
取上清液，减压浓缩至干，向其中加水溶解，调pH值至3.0，上732型阳离子交换柱用0.2mol/L氨水进行洗脱除掉杂质，收集洗脱液进行再浓缩，冷藏析出晶体，用6毫升正丁醇重结晶，得到精制虫草素0.321g，含量为96.8％。
收集沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖，在55℃下将之烘干，收取蛹虫草粗多糖，向烘干的蛹虫草粗多糖中加入25倍体积蒸馏水溶解，加入木瓜蛋白酶在50℃，pH5.5条件下水解6小时，木瓜蛋白酶的加入量为加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的3.0‰，离心去除沉淀得二次上清液，将二次上清液浓缩，上AB-8型大孔树脂柱床，用蒸馏水洗脱至流出液呈无色透明，合并流出液，浓缩，加入无水乙醇，使得溶液中乙醇含量达到90％(重量)，沉淀出多糖，经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖22.17g，含量为89.7％。
实施例5
(一)虫草素含量测定(高效液相色谱法)
标准曲线的绘制 分别准确称取虫草素标准品(购于Sigma公司，纯度≥98％)10.0mg，用甲醇定容至50ml，摇匀。分别准确吸取标准品母液1ml、2ml、4ml、8ml和10ml，用甲醇稀释至10ml，摇匀，得系列标准溶液。色谱条件：色谱柱为Eclipse XDB C18色谱柱(150mm×4.6mm i.d.，5μm)；流动相为水∶甲醇∶甲酸＝95∶4∶1(v/v/v)；流速0.8ml/min；柱温25℃；检测波长：260nm。分别取上述制备的系列标准溶液20μl，按色谱条件分别进样，测定峰面积，以峰面积Y为横坐标，对照品浓度X为纵坐标，绘制标准曲线。
样品含量测定 取精制的虫草素0.0050g，加入甲醇稀释至100ml，过0.22μm微孔滤膜，20μl进样，通过标准回归方程计算虫草素含量。
(二)虫草多糖含量的测定(蒽酮-硫酸法)
葡萄糖标准曲线的绘制 精密称取105℃下干燥至恒重的无水葡萄糖约10.0mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。准确称取0.2g蒽酮和1g硫脲置于烧杯中，缓慢加入100ml浓硫酸，边加边搅拌，直至溶解后呈黄色透明溶液，将其置于棕色瓶中于冷暗处保存。从葡萄糖对照品溶液中分别精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，置于25ml干燥洁净的具塞试管中，补水至2.0ml，混匀。在冰浴中沿管壁缓慢加入蒽酮试剂4.0ml，混匀，将反应液一并在沸水浴中加热8min，取出在流水中冷却至室温，同时以2.0ml蒸馏水加蒽酮试剂4.0ml作空白，在624nm波长处测定吸光值。以吸光值A为纵坐标，以标准品浓度C为横坐标绘制标准曲线。
样品含量测定 准确称取0.0010g待测样品，加蒸馏水溶解稀释至10μg/ml，取0.5ml置于25ml干燥洁净的具塞试管中，补水至2.0ml，混匀。在冰浴中沿管壁缓慢加入蒽酮试剂4.0ml，混匀，将反应液一并在沸水浴中加热8min，取出在流水中冷却至室温，同时以2.0ml蒸馏水加蒽酮试剂4.0ml作空白，在624nm波长处测定吸光值。根据标准回归方程计算蛹虫草多糖含量。
Claims (5)
1.一种从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法，包括如下步骤：
(1)将蛹虫草子实体粉碎过40～60目筛；
(2)向粉碎的原料中加入95％乙醇或无水乙醇以冷渗法进行提取，蛹虫草粉和95％乙醇或无水乙醇的混合比例按重量计为1∶5-20，将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来；
(3)弃滤液，将滤渣回收于55℃真空烘干；
(4)将烘干后的滤渣与乙醇混合，蛹虫草粉和10-30％乙醇的混合比例按重量计为1∶15-40，进行超声波辅助提取，超声波频率为20-40KHz，超声处理时间为30-90分钟，重复处理1-3次，其中乙醇浓度为10-30％；提取结束后，过滤，合并多次滤液，在35-45℃，300-700mmHg下减压浓缩，添加95％乙醇或无水乙醇，使溶液中乙醇重量含量为55-90％，静置8-24小时，使水溶性蛹虫草粗多糖析出；
(5)取醇析后的上清液，在35-45℃，300-700mmHg下减压浓缩至干，向其中加蒸馏水溶解，调pH值至3.0-4.0，上离子交换柱用0.1-0.3mol/L氨水洗脱除掉杂质，收集洗脱液进行再浓缩，冷藏析出晶体，用正丁醇重结晶，得到精制虫草素；
(6)收集第(4)步沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖，在50-60℃下将之烘干；
(7)向烘干的蛹虫草粗多糖中加入20-25倍体积蒸馏水溶解，加入木瓜蛋白酶进行脱蛋白处理，木瓜蛋白酶在提取溶液中重量含量为1.5-3.0‰，在50-60℃，pH5.5-6.5条件下水解4-6小时，离心去除沉淀得二次上清液，将二次上清液浓缩，上大孔树脂柱床，用蒸馏水洗脱至流出液呈无色透明，合并流出液，浓缩，加入95％乙醇或无水乙醇，使得溶液中乙醇重量含量达到55-90％，沉淀出多糖，经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖。
2.根据权利要求1所述从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法，其特征在于，所述的冷渗法是在0-8℃环境中，进行静态提取1-3次，每次2-4小时。
3.根据权利要求1或2所述从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法，其特征在于，所述的离子交换树脂为732、724型阳离子交换树脂或D113型大孔阳离子交换树脂。
4.根据权利要求1或2所述从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法，其特征在于，所述大孔树脂为普通大孔树脂，其型号为AB-8型或D101型。
5.根据权利要求3所述从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法，其特征在于，所述大孔树脂为普通大孔树脂，其型号为AB-8型或D101型。
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