CN103755825B - 一种从废弃蛹虫草培养基质中提取虫草基质多糖的方法及其提取物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从废弃蛹虫草培养基质中提取草基质多糖的方法以及提取物的应用。本发明通过酶解、微波、离心分离后加乙醇沉淀，然后再经过除淀粉、除蛋白、凝胶柱纯化等实验步骤实现从废弃蛹虫草培养基质中提取虫草基质多糖。该多糖提取物成分单一、多糖含量在90%以上，同目前已有的护肝解酒类药物及保健食品相比，具有活性更确切，化学组成更纯等特色。

Description

一种从废弃蛹虫草培养基质中提取虫草基质多糖的方法及其 提取物的应用

技术领域

本发明涉及生物制品领域，更具体地说，涉及一种从废弃蛹虫草培养基质中提取虫草基质多糖的方法及其提取物的应用。

背景技术

酒精性肝损伤是由于过度饮酒导致的肝脏损伤疾病。随着现在社会的发展，人们的饮酒量开始急剧上涨，酒精滥用和酒精依赖所造成的肝损伤已经是病毒性肝炎之后导致肝损伤的第二大病因。酒精性肝损伤可以分为急性酒精性肝损伤以及慢性酒精性肝损伤。急性酒精性肝损伤是一次摄入过多的酒精而造成肝功能损害，表现为食欲下降，恶心呕吐，肝部不适等类急性肝炎症状。

目前，针对酒精性肝损伤的治疗方法主要有戒酒，营养治疗、药物治疗。基因治疗等方法，而其中最常用的的是药物治疗，有一定的疗效但也存在很多不足。由于药物可能会驱使血脂集中于肝脏代谢，容易促进脂质蓄积，此外，药物通常是在肝脏中代谢，容易进一步加重已经受损的肝脏的负担，反而损害肝功能。而且通常药物只对酒精性肝损伤的初期具有一定疗效，当到达酒精性肝损伤的后期，人体免疫功能严重下降，肝功能受损严重，此时，只有进行肝移植才能显著改善症状和增加患者生存率。因此，研究人员正在积极探索酒精性肝损伤的新型治疗与干预方案。

蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草、蛹草、北虫草，蛹草菌等与冬虫夏草(Chinese Caterpillar Fungus) 归为同一个属。是著名的食药用菌。其菌体内含有多种生物活性成分, 可与冬虫夏草相媲美。而且，蛹虫草可以人工通过发酵法栽培，是虫草菌中唯一能够替代天然生长的药食用菌。人工栽培的蛹虫草在营养生长阶段在培养基内长着大量的菌丝体，据研究菌丝体含量最多的药理活性成分就是虫草基质多糖。

多糖是由糖苷键连接起来或酮糖组成的一类天然大分子化合物，近二十年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，糖类化合物特别是糖缀合物上的糖链参与了多种生命现象的调解，如细胞识别、粘连与融合；信号转导；免疫与应答；细胞转化、分化与反分化、细胞的生长与衰老都离不开糖链的参与，有时糖链的作用更为直接和重要，在糖蛋白新生肽链折叠、聚合时，糖链往往是不可缺少的。大量研究表明，虫草基质多糖有着多种生物活性功能，如具有抗氧化活性、抗肿瘤活性、降血糖、抗肝纤维化、抗菌活性等作用，并可增强单核巨嗜细胞系统的功能，提高免疫力，治疗肝病毒性感染。虫草基质多糖的这些功能昭示人们，其对于缓解酒精性肝损伤能够发挥一定作用，而目前已公开的专利申请中，针对酒精性肝损伤的预防和治疗主要集中于中药组合物，如专利CN101897746A中提到利用三七和刺梨仙人掌的提取物组成一种解酒保肝的中药组合物，能有效地消除过量饮酒产生的自由基对生物大分子的攻击，实现解酒保肝的功效。又如CN101961367A公开了一种预防酒精性肝损伤的中药组合物，由虫草多糖、灵芝多糖与水飞蓟水提物等组分组成，其溶解性好，在胃肠道中崩解快，吸收好，可增强免疫力并对酒精性肝损伤起辅助保护作用。但是现有技术中保留的多糖等生物提取物多为粗多糖，粗多糖中的成分未进行细分，有的具有生物活性，有的则不具备相关活性。有效成分为粗多糖中具体何种组分不明确。

此外，目前虫草多糖通常以虫草的子实体为直接原料，水提醇沉，因受到子实体产量限制，原料成本较高，本发明是利用人工种植蛹虫草的废弃培养基为主要原料，其间夹杂大量蛹虫草菌丝体，富含大量的多糖成分，因而可利用该部分资源进一步提纯并对提取的粗多糖进行细分，以开发具有预防酒精性肝损伤的单一组分的虫草基质多糖为目标，效果更加显著，具有重要的意义。

基于上述原因，我们通过科学实验，确定虫草粗多糖中的去除蛋白之后的水溶性多糖是其药效活性较好的部分，将水不溶性的多糖以及糖蛋白去除掉，在尽量保留有效活性成分的基础上去除无效的成分，从而得到单一组分的虫草基质多糖有效提取物，同目前已有的护肝解酒类药物及保健食品相比，具有活性更确切，化学组成更纯等特色，这是本发明的突出贡献。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种以蛹虫草培养基废弃物作为原料（主要培养基原料为大米或者小麦）提取出组分单一、化学纯度高的虫草多糖的方法。

本发明的第二个目的是提供所述的蛹虫草基质多糖提取物在制备治疗和预防酒精性肝损伤食品或药品的应用。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

1） 原料预处理

取蛹虫草废基质，烘干，粉碎，得到废基质粉末；

2） 酶解提取废基质粉末

向步骤1）所得的废基质粉末中加入一定量的蒸馏水，调节pH为4.5~6，温度50℃，加入一定量的单酶或复合酶进行酶解1~2h；

3)酶法除淀粉和蛋白

将步骤2）所得的酶解液90~95℃灭酶，pH值调到5.0~7.0区间，加入一定量的中温淀粉酶于70℃~80℃下水解60min清除淀粉，85~95℃灭酶5min，淀粉酶用量为每g虫草干粉1500~8000U，随即加入一定量的蛋白酶，调节到适宜的pH值后，40~60℃继续酶解1~3h；

4)醇沉

将步骤3）中所得的酶解液加热到90~98℃灭酶，后取上清液加入95%的乙醇，在低温下醇沉，4500r/min离心并冷冻干燥，得到沉淀的虫草粗多糖粉末；

5）进一步纯化

将步骤4）所得多糖提取物粗品适量用色谱柱纯化，用苯酚硫酸法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入乙醇，冰浴放置，过滤，将沉淀物进行冷冻干燥或者在常温下进行真空干燥，得到白色的虫草单一组分多糖提取物。

所述步骤2）中单酶为纤维素酶，复合酶由纤维素酶与果胶酶组成，纤维素酶用量为每克虫草干粉250U~1000U，果胶酶用量为每克虫草干粉500U~2500U。

所述步骤3）中的蛋白酶为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中任一种；优选的，胃蛋白酶用量用量为每克虫草干粉4000~200000U、木瓜蛋白酶的用量为每克虫草干粉10000~300000U，胰蛋白酶用量为每g虫草干粉20000~100000U。

所述步骤5）中所用的色谱柱是Cellufine A-200离子交换层析柱、琼脂糖凝胶柱色谱Sephadex G50、琼脂糖凝胶柱色谱Sephadex G100、琼脂糖凝胶柱色谱Sephacryl S300中的一种或者两种，优选为Cellufine A-200离子交换层析柱，洗脱相为0.1~15mol/L的氯化钠溶液。

优选的，所述步骤1）还包括后粉碎，过60或100目筛。

优选的，所述步骤3）之前还包括微波提取：将步骤2）所得的酶解液置于微波场中处理1~6min，微波场功率为400~600W。

优选的，所述步骤4）还包括离心后将沉淀物8000Da透析48h。

优选的，所述步骤5）之前还包括脱蛋白：将步骤4）所得粉末配制成2%-5%溶液，加入Sevage试剂，在0~4℃条件下振摇之后离心分离除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤1-5次至多糖溶液中福临酚法检测蛋白含量低于0.3%为止，合并上清液，加入3~5倍体积的乙醇沉淀后离心分离，取沉淀，冷冻干燥得到多糖提取物粗品。

本发明的有益效果

本发明通过酶解、微波、离心分离后加乙醇沉淀，然后再经过除淀粉、除蛋白、凝胶柱纯化等实验步骤实现从废弃蛹虫草培养基质中提取虫草基质多糖。该多糖提取物成分单一、多糖含量在90%以上，同目前已有的护肝解酒类药物及保健食品相比，具有活性更确切，化学组成更纯等特色。

具体实施方式

下面结合具体实施实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法，浓缩除醇方法为减压旋蒸法，所用的酶与试剂均为市售商业产品。下面对发明做进一步详细说明：

实施例1 本发明提供的蛹虫草基质多糖的提取方法

1）原料处理

取蛹虫草培养基的废基质（培养基原料为大米），烘干之后粉碎，过60目筛，备用；

2）酶提取

向步骤1）所得的基质粉末中按基质粉末：蒸馏水=1:20比例加入水，调节pH值为4.5，加入每克虫草干粉500U的纤维素酶于50℃搅拌酶解2小时；

3）微波提取

将步骤2）所得酶解液置于微波场中处理5min，微波场功率为480W；

4）除淀粉及蛋白

对骤3）微波处理所得提取液，90℃加热10min灭酶，然后添加中温淀粉酶于PH5.5，70℃下水解60min清除淀粉，淀粉酶用量为每g虫草干粉5000U，85℃灭酶5min，随即调节pH为9.5，添加每g虫草干粉2000U的胰蛋白酶在60℃下搅拌酶解1h；

5）醇沉

将步骤4）所得提取液95℃下灭活10min。冷却之后离心分离，得到上清液和沉淀。将上清液初步浓缩之后，加入3倍浓缩液体系95%的乙醇，4℃下沉淀10小时后4500rmin离心10min得到沉淀，将此沉淀溶于水后，8000Da透析48h后冷冻干燥，得到虫草粗多糖，苯酚硫酸法测定其糖含量为49.3%；

6）脱蛋白

将步骤5）所得虫草基质多糖粗品用水稀释到50ml加入Sevage试剂（V氯仿：V正丁醇=4：1）中，震荡20min后离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤1次，此时多糖中蛋白含量为0.25%,向溶液中加入4倍体积的95%乙醇，4℃下醇沉12h后冻干；

7）进一步纯化

取步骤6）所得多糖提取物粗品适量加入蒸馏水中完全溶解之后，加入SephadexG100葡聚糖凝胶柱中，用0.15mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为1ml/min.采用苯酚硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，于50℃下0.09MPa的真空度条件下进行减压浓缩至原流出液体积的1/5后，加入三倍体积的95%乙醇水溶液收，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得到白色的单一组分多糖提取物。经测定，该组分多糖的纯度在90%以上。

实施例2 本发明提供的蛹虫草基质多糖的提取方法（复合酶提取法）

1）原料处理

取蛹虫草培养基的废基质（培养基原料为大米），烘干之后粉碎，过100目筛，备用；

2）酶提取

取100g基质粉末加入250ml水，按每克虫草干粉500U加入纤维素酶，同时按每克虫草干粉2500U加入果胶酶，调节pH值为6.0，于50℃搅拌酶解1小时；

3)酶法除淀粉和蛋白

将步骤2）所得的酶解液pH值调到7.0，加入一定量的中温淀粉酶于80℃下水解60min清除淀粉，90℃灭酶5min，淀粉酶用量为每g虫草干粉2500U，随即以6mol/L的盐酸调节pH为2.0，加入每克虫草干粉10000U的胃蛋白酶，于40℃下搅拌酶解3h；

4）醇沉

将步骤3）中所得的酶解液加热到98℃灭酶，后取上清液加入3倍浓缩液体系95%的乙醇，在4℃下沉淀10小时后，4500r/min离心10min，冷冻干燥后得到干燥的虫草基质多糖，苯酚硫酸法测定其糖含量为46.5%，蛋白含量为0.29%；

5）进一步纯化

将步骤4）得到的粗多糖加入蒸馏水完全溶解后，加入Cellufine A-200离子交换层析柱中，用0.10mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min.采用蒽酮-硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，于50℃下0.09MPa的真空度条件下进行减压浓缩至原流出液体积的1/5后，加入三倍体积的95%乙醇水溶液收，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得到白色的单一组分多糖提取物。经测定，该组分多糖的纯度在93%以上。

实施例3 本发明提供的蛹虫草基质多糖的提取方法（微波结合酶法提取）

1）原料处理

取蛹虫草小麦培养基的废基质，烘干之后粉碎，过100目筛，备用；

2） 复合酶提取

按每克虫草干粉1000U加入纤维素酶，同时按每克虫草干粉1500U加入果胶酶，调节pH值为5.0，于55℃搅拌酶解1小时后加热灭酶；

3） 微波提取

将步骤2）所得提取液置于微波场中处理4min，微波场功率为600W；

4） 除淀粉和蛋白

将步骤3）所得提取液在95℃加热10min灭酶。冷却之后离心分离，得到上清液和沉淀。在上清液中加入中温淀粉酶，PH调到6.0，于75℃水解60min后90℃灭酶5min，淀粉酶用量为每g虫草干粉2500U，随后在冷却后的上清液中加入每克虫草干粉200000U的木瓜蛋白酶，在PH6.5下，于55℃搅拌酶解2小时；

5）醇沉

将步骤4）所得上清液加热95℃灭酶10min，初步浓缩之后，加入4倍浓缩液体系95%的乙醇，4℃下沉淀12小时后4500rmin离心10min得到沉淀，将此沉淀溶于水后，8000Da透析48h后冷冻干燥，得到虫草粗多糖，苯酚硫酸法测定其糖含量为59.7%；

6）脱蛋白

将步骤5）所得虫草基质多糖粗品用水稀释到50ml加入Sevage试剂（V氯仿：V正丁醇=4：1）中，震荡20min后离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤1次，向溶液中加入4倍体积的95%乙醇，4℃下醇沉12h后冻干；

7）进一步纯化

将步骤6）得到的粗多糖加入蒸馏水中完全溶解之后，加入Cellufine A-200离子交换层析柱中，用0.10mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min.采用蒽酮-硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，然后通入Sephadex G100葡聚糖凝胶柱中，用0.15mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为1ml/min.采用苯酚硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，于50℃下0.09MPa的真空度条件下进行减压浓缩至原流出液体积的1/5后，加入三倍体积的95%乙醇水溶液收，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得到白色的单一组分多糖提取物。经测定，该组分多糖的纯度在98%以上。

实施例4本发明提供的蛹虫草基质多糖的提取方法

1）原料处理

取蛹虫草小麦培养基的废基质，烘干之后粉碎，过100目筛，备用；

2） 复合酶提取

按每克虫草干粉1000U加入纤维素酶，同时按每克虫草干粉500U加入果胶酶，调节pH值为5.0，于55℃搅拌酶解1小时后加热灭酶；

3） 微波提取

将步骤2）所得提取液置于微波场中处理4min，微波场功率为600W；

4） 除淀粉和蛋白

将步骤3）所得提取液在95℃加热10min灭酶。冷却之后离心分离，得到上清液和沉淀。在上清液中加入中温淀粉酶，PH调到6.0，于75℃水解60min后95℃灭酶5min，淀粉酶用量为每g虫草干粉1500U，随后在冷却后的上清液中加入每克虫草干粉100000U的胰蛋白酶（ph8.0 ），于55℃搅拌酶解2小时，加热95℃灭酶10min；

5）醇沉

将步骤4）所得上清液初步浓缩之后，加入4倍浓缩液体系95%的乙醇，4℃下沉淀12小时后4500rmin离心10min得到沉淀，将此沉淀溶于水后，8000Da透析48h后冷冻干燥，得到虫草粗多糖，苯酚硫酸法测定其糖含量为63.5%；

6）脱蛋白

将步骤5）所得虫草基质多糖粗品用水稀释到50ml加入Sevage试剂（V氯仿：V正丁醇=4：1）中，震荡20min后离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤1次，向溶液中加入4倍体积的95%乙醇，4℃下醇沉12h后冻干；

7）进一步纯化

将步骤6）得到的粗多糖加入蒸馏水中完全溶解之后，加入琼脂糖凝胶柱色谱Sephadex G50纤维素柱中，用0.10mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min.采用蒽酮-硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，然后通入琼脂糖凝胶柱色谱Sephacryl S300中，用0.15mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为1ml/min.采用苯酚硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，于50℃下0.09MPa的真空度条件下进行减压浓缩至原流出液体积的1/5后，加入三倍体积的95%乙醇水溶液收，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得到白色的单一组分多糖提取物。经测定，该组分多糖的纯度在95%以上。

实施例5本发明提供的蛹虫草基质多糖的提取方法

1）原料处理

取蛹虫草小麦培养基的废基质，烘干之后粉碎，过100目筛，备用；

2） 复合酶提取

按每克虫草干粉1000U加入纤维素酶，同时按每克虫草干粉1000U加入果胶酶，调节pH值为5.0，于55℃搅拌酶解1小时后加热灭酶；

3） 微波提取

将步骤2）所得提取液置于微波场中处理4min，微波场功率为600W；

4） 除淀粉和蛋白

将步骤3）所得提取液在95℃加热10min灭酶。冷却之后离心分离，得到上清液和沉淀。在上清液中加入中温淀粉酶，PH调到6.0，于75℃水解60min后95℃灭酶5min，淀粉酶用量为每g虫草干粉8000U，随后在冷却后的上清液中加入每克虫草干粉300000U的木瓜蛋白酶在pH6.5下，于55℃搅拌酶解2小时，加热95℃灭酶10min；

5）醇沉

将步骤4）所得上清液初步浓缩之后，加入4倍浓缩液体系95%的乙醇，4℃下沉淀12小时后4500rmin离心10min得到沉淀，将此沉淀溶于水后，8000Da透析48h后冷冻干燥，得到虫草粗多糖，苯酚硫酸法测定其糖含量为50.8%；

6）脱蛋白

将步骤5）所得虫草基质多糖粗品用水稀释到50ml加入Sevage试剂（V氯仿：V正丁醇=4：1）中，震荡20min后离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤1次，向溶液中加入4倍体积的95%乙醇，4℃下醇沉12h后冻干；

7）进一步纯化

将步骤6）得到的粗多糖加入蒸馏水中完全溶解之后，加入Cellufine A-200离子交换层析柱中，用0.10mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min.采用蒽酮-硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，然后通入琼脂糖凝胶柱色谱SephacrylS300中，用0.15mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为1ml/min.采用苯酚硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，于50℃下0.09MPa的真空度条件下进行减压浓缩至原流出液体积的1/5后，加入三倍体积的95%乙醇水溶液收，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得到白色的单一组分多糖提取物。经测定，该组分多糖的纯度在91.6% 以上。

实施例6本发明提供的蛹虫草基质多糖的提取方法

1）原料处理

取蛹虫草培养基的废基质（培养基原料为大米），烘干之后粉碎，过100目筛，备用；

2）酶提取

取100g基质粉末加入250ml水，按每克虫草干粉1000U加入纤维素酶，同时按每克虫草干粉2500U加入果胶酶，调节pH值为6.0，于50℃搅拌酶解1小时；

3)酶法除淀粉和蛋白

将步骤2）所得的酶解液pH值调到7.0，加入一定量的中温淀粉酶于80℃下水解60min清除淀粉，90℃灭酶5min，淀粉酶用量为每g虫草干粉2500U，随即以6mol/L的盐酸调节pH为2.0，加入每克虫草干粉200000U的胃蛋白酶，于40℃下搅拌酶解3h；

4）醇沉

将步骤3）中所得的酶解液加热到98℃灭酶，后取上清液加入3倍浓缩液体系95%的乙醇，在4℃下沉淀10小时后，4500r/min离心150min，冷冻干燥后得到干燥的虫草基质多糖，苯酚硫酸法测定其糖含量为51.5% ，蛋白含量为（0.19%）；

5）进一步纯化

将步骤4）得到的粗多糖加入蒸馏水中完全溶解之后，加入Cellufine A-200离子交换层析柱中，用0.10mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min.采用蒽酮-硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，然后通入琼脂糖凝胶柱色谱SephadexG50纤维素柱中，用0.15mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为1ml/min.采用苯酚硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，于50℃下0.09MPa的真空度条件下进行减压浓缩至原流出液体积的1/5后，加入三倍体积的95%乙醇水溶液收，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得到白色的单一组分多糖提取物。经测定，该组分多糖的纯度在90.6% 以上。

实施例7 本发明提供的蛹虫草基质多糖的提取方法

1）原料处理

取蛹虫草培养基的废基质（培养基原料为大米），烘干之后粉碎，过100目筛，备用；

2）酶提取

取100g基质粉末加入250ml水，按每克虫草干粉700U加入纤维素酶，同时按每克虫草干粉2000U加入果胶酶，调节pH值为6.0，于50℃搅拌酶解1小时；

3)酶法除淀粉和蛋白

将步骤2）所得的酶解液pH值调到7.0，加入一定量的中温淀粉酶于80℃下水解60min清除淀粉，90℃灭酶5min，淀粉酶用量为每g虫草干粉6000U，随即以6mol/L的盐酸调节pH为2.0，加入每克虫草干粉4000U的胃蛋白酶，于40℃下搅拌酶解3h；

4）醇沉

将步骤3）中所得的酶解液加热到98℃灭酶，后取上清液加入3倍浓缩液体系95%的乙醇，在4℃下沉淀10小时后，4500r/min离心10min，冷冻干燥后得到干燥的虫草基质多糖，苯酚硫酸法测定其糖含量为53.2%，蛋白含量为0.49%；

5）进一步纯化

将步骤3）得到的粗多糖加入蒸馏水完全溶解后，加入Cellufine A-200离子交换层析柱中，用0.10mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min.采用蒽酮-硫酸法跟踪流出液，收集多糖含量大于30%的流出液，于50℃下0.09MPa的真空度条件下进行减压浓缩至原流出液体积的1/5后，加入三倍体积的95%乙醇水溶液收，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得到白色的单一组分多糖提取物。经测定，该组分多糖的纯度在90%以上。

实施例8本发明提供的蛹虫草基质多糖抗酒精性肝损伤的动物实验

药理实验

1.酒精诱导肝损伤动物模型的建立

小鼠适应性喂养3d，随机分为空白对照组、酒精模型组、阳性对照组(联苯双酯(150mg/(kg·d))、多糖各剂量组(100、200、400mg/(kg·d))，每组12只。受试样品用蒸馏水配制，每天灌胃受试样品1次，连续灌胃30d，实验期间供给全价颗粒饲料，不限制饮食饮水。末次给药后，各组小鼠禁食12h，除空白对照组灌予等体积的蒸馏水之外，阳性对照组、实验组及酒精模型组以12mL/kg的量，用50%体积分数的乙醇溶液灌胃，建立小鼠急性肝损伤模型。去除死亡小鼠，各组取10只小鼠均在灌胃12h后摘眼球采血，分离血清，测定血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST），并取肝脏称重，计算肝脏指数。剪碎肝脏并加入预冷的50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8)，于冰水浴中进行超声破碎(400W，20s×3)制成10%肝匀浆。肝匀浆于4℃、10000r/min离心10min，一部分上清液用于测定丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量，另一部分上清液加饱和硫酸铵溶液至25%饱和度，同样条件下离心，上清液即为粗酶液，用于测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。

肝指数是肝重与体重的比值，它在一定程度上反映了肝脏的健康水平，发生病变时往往会引起器官萎缩或肿胀，从而导致肝指数也随之发生变化。从表1可知，灌胃酒精使小鼠的肝指数显著增加，灌胃多糖可使酒精损失小鼠肝脏指数显著降低，灌胃酒精使小鼠的ALT AST显著增加，灌胃多糖提取物可使小鼠血清ALT，AST显著降低，也可显著降低小鼠肝脏指数。尤其是高、中剂量组显著性更加明显，阳性对照药可使小鼠血清ALT，AST显著降低，也可显著降低小鼠肝脏指数。

表1 本发明组合物对酒精损伤小鼠血清ALT、AST及肝脏、脾脏系数的影响

注： 与空白对照组比较：^aP＜0.05，与模型对照组比：^bP＜0.05

本发明组合物可降低模型动物血清MDA含量，提高GSH-PX酶、SOD活性，从而发挥保护肝细胞免受损伤的作用。从表2结果表明，酒精能引起小鼠MDA含量等指标显著升高，引起GSH-PX酶、SOD活性显著降低，而虫草基质多糖可以显著降低MDA含量，能显著升高GSH-PXSOD活性，阳性对照药也能显著降低MDA活性，显著升高GSH-PX酶，SOD活性，活性与本发明组合物中剂量相当。

表2 本发明组合物对酒精损伤小鼠肝脏MDA、GSH-PX、SOD的影响

注： 与空白对照组比较：^aP＜0.05，与模型对照组比较：^bP＜0.05

综上所述，本发明得到的蛹虫草基质多糖在急性酒精性肝损伤的小鼠模型中，能够降低血清转氨酶的活性，提高抗氧化能力，抑制自由基的生成。从血清和肝脏各项指标可以看出，本发明的蛹虫草基质多糖具有良好的治疗急性酒精性肝损伤的生理功效，可以进一步用于功能性食品或者相关药物的开发。

Claims (8)

1.一种从蛹虫草废基质中提取多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1） 原料预处理

取蛹虫草废基质，烘干，粉碎，得到废基质粉末；

2） 酶解提取废基质粉末

向步骤1）所得的废基质粉末中加入一定量的蒸馏水，调节pH为4.5~6，温度50℃，加入一定量的单酶或复合酶进行酶解1~2h；

3)酶法除淀粉和蛋白

将步骤2）所得的酶解液90~95℃灭酶，pH值调到5.5~7.0区间，加入一定量的中温淀粉酶于70~80℃下水解60min清除淀粉，85~95℃灭酶5min，淀粉酶用量为每克虫草干粉1500~8000U，随即加入一定量的蛋白酶，调节到适宜的pH值后，40~60℃继续酶解1~3h；

4)醇沉

将步骤3）中所得的酶解液加热到90~98℃灭酶，后取上清液加入95%的乙醇，在低温下醇沉，4500r/min离心并冷冻干燥，得到沉淀的虫草粗多糖粉末；

5）进一步纯化

将步骤4）所得多糖提取物粗品适量用色谱柱纯化，用苯酚硫酸法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入95%乙醇，冰浴放置，过滤，将沉淀物进行冷冻干燥或者在常温下进行真空干燥，得到白色的虫草单一组分多糖提取物；

所述步骤2）中单酶为纤维素酶，复合酶由纤维素酶与果胶酶组成；

所述复合酶用量为：纤维素酶用量为每克虫草干粉250U~1000U，果胶酶用量为每克虫草干粉500U~2500U。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中的蛋白酶为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的任一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中所用的色谱柱是CellufineA-200离子交换层析柱、琼脂糖凝胶柱色谱Sephadex G50、琼脂糖凝胶柱色谱SephadexG100、琼脂糖凝胶柱色谱Sephacryl S300中的一种或者两种的组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）之前还包括微波提取：将步骤2）所得的酶解液置于微波场中处理1~6min，微波场功率为400~600W。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤5）之前还包括脱蛋白：将步骤4）所得粉末配制成2%-5%溶液，加入Sevage试剂，在0~4℃条件下振摇之后离心分离除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤1-5次至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量低于0.3%为止，合并上清液，加入3~5倍体积的乙醇沉淀后离心分离，取沉淀，冷冻干燥得到多糖提取物粗品。

6.根据权利要求1-5的任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中的淀粉酶用量为每克虫草干粉2500U。

7.根据权利要求1-6，任一权利要求所述方法制成的虫草单一组分多糖提取物。

8.根据权利要求1-6，任一权利要求所述的方法制备成的虫草单一组分多糖提取物在制备预防或治疗酒精性肝损伤的食品或药品中的应用。