CN101275149A - 一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，属于真菌发酵生物活性产品技术领域。本发明涉及采用云芝发酵，将云芝接入以马铃薯为主要成分的培养基中，用HCl调节pH，发酵培养，收集菌体，反复冻融与超声波相结合将菌体细胞破碎，高速离心，离心上清液经过大孔树脂脱色得到粗抑制剂，再通过DEAE52离子交换层析得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉。本发明所制备的抑制剂专一性抑制天冬氨酸蛋白酶的活性，粗抑制剂中含有的各种云芝发酵产物具有很高的医药保健价值，而且经过脱色处理，应用中不会产生色素方面的影响，保证安全性，在医药、食品添加剂及病虫害防治等领域有很好的应用前景。

Description

一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法

技术领域

一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，具体地说是利用云芝发酵，反复冻融结合超声波进行细胞破碎，通过大孔树脂脱色，DEAE离子交换层析，获得较纯的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，属于真菌发酵生物活性产品技术领域。

背景技术

在中国，随着“纯生热”的不断升温，纯生啤酒的泡沫稳定性问题越来越受到生产厂家和研究者的关注。现有的研究证明，有活性的蛋白酶A及非活性的蛋白酶A前驱物的存在会直接或间接地破坏纯生啤酒的泡沫蛋白，从而使纯生啤酒的泡沫稳定性降低，蛋白酶A及其前驱物的总量决定着降解成品啤酒中泡沫蛋白的综合能力。

蛋白酶A的释放途径：PrA和其他蛋白酶在发酵和成熟阶段从酵母细胞中释放出来，酵母中蛋白酶A的释放主要是破坏泡持性蛋白质Z，而对纯生啤酒的泡持性产生不良的影响。降低啤酒中蛋白酶A的途径：第一种途径是限制酶的产生和分泌。第二种途径是控制或降低已经从酵母分泌的蛋白酶活性，这可以添加蛋白酶A抑制剂或使蛋白酶A失活来实现。第三种途径是通过基因工程技术构建蛋白酶A缺失的啤酒酵母菌株。国外国内对前期菌种和工艺方面都有一定的研究，但尚不能完全解决此问题，尤其是菌株方面，由于存在安全性问题以及公众对基因技术的态度问题，尚需细致而深入的研究。而寻找特异的PrA抑制剂，作为一种后修饰的思路，正在引起人们的关注。但是直到目前为止，还没有商业化的既安全又有效的蛋白酶A抑制剂可以在啤酒行业中使用。

蛋白酶A是一种天冬氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白水解酶，参与机体的新陈代谢及生物调控作用。它的活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成。天冬氨酸蛋白酶包括：胃蛋白酶、HIV蛋白酶抑制剂、蛋白酶A、组织蛋白酶D、逆转录蛋白酶、血管紧张素转化酶、天冬氨酸膜内裂解蛋白酶等。深入了解天冬氨酸蛋白酶及其特异的抑制剂，对治疗一些疾病如艾滋病、恶性肿瘤等世界上几种难治的疾病都有一定的帮助，天冬氨酸蛋白酶在这些疾病的发病机制中都发挥了一定的作用，积极了解天冬氨酸蛋白酶的活化机制、作用位点特别是其抑制特性，将会有助于治疗这些顽固性疾病。

蛋白酶抑制剂泛指对蛋白酶有抑制作用的一类物质，参与生物体内蛋白酶解活动的控制，对维持正常的生命活动具有重要意义。它的来源十分广泛，在各种动植物的组织器官中都有存在。按其所抑制的目标蛋白酶活性中心的不同，可分为以下几种：丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)：如胰蛋白酶抑制剂；半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cys-C)：如木瓜蛋白酶抑制剂；天冬氨酸蛋白酶抑制剂：如HIV蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、蛋白酶A抑制剂和血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；及金属蛋白酶抑制剂等。目前国内外报道的蛋白酶A抑制剂大多数都是通过化学法合成的，这些抑制剂在应用中受到相当大的限制；国外曾有人从马铃薯、番茄及豆科植物中提取出天冬氨酸族蛋白酶抑制剂；本实验室曾从灵芝发酵全粉中提到GLPIA1和GLPIA2两种蛋白酶A抑制剂，并从马铃薯块茎中提取一种蛋白酶A抑制剂。这些蛋白酶抑制剂在医药及食品添加剂等方面都有很好的应用前景。

云芝是我国传统的名贵药材，富含丰富的营养及多种生物活性成分，具有药用保健作用，是一种具有广泛药理活性的药用真菌。云芝液体深层发酵的发酵产物复杂，主要为云芝多糖和云芝糖肽。

云芝多糖是良好的生物效应调节剂，具有抑制肿瘤、调节免疫、降低放射、化疗毒副反应等多种药理作用，并有抗艾滋病毒活性，能调节人体的免疫功能，增强巨噬细胞的吞噬作用；因射线等引起免疫功能低下者，云芝多糖能显著提高其溶菌力；云芝多糖最重要的作用是它对肝脏的保护；云芝多糖对冠心病具有一定的治疗作用、抗动脉粥样硬化、提高鼠大脑皮层、肝组织的抗氧化作用，对顿抑心肌的功能和超微结构有显著保护作用，对慢性应激引起的学习和记忆障碍有明显的改善作用。

云芝糖肽是一种有效的免疫增强剂，抗肿瘤、镇痛、免疫调节、抗缺氧、促进多种细胞因子、抗乙肝病毒的产生；云芝或云芝糖肽与螺旋霉素合用，具有潜在的抗弓形虫感染的效果。

利用云芝发酵制备天冬氨酸蛋白酶抑制剂，除了对天冬氨酸蛋白酶具有抑制作用外，还有云芝多糖和云芝糖肽等的活性功能，保证了其应用的安全性，在医药保健及食品饮料等方面将有很好的应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，采用云芝发酵、细胞破碎、高速离心、大孔树脂脱色得到粗抑制剂，蛋白质与糖的浓度比约为0.73～0.93，对胃蛋白酶的IC₅₀值约为1.99～2.16mg/mL，收率约为83.4～88.6％；再经离子交换层析得较纯的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，蛋白质与糖的浓度比约为2.18～2.50，对胃蛋白酶的IC₅₀值约为0.018～0.021mg/mL，收率约为73.2～81.5％；最适作用pH 5.0左右，pH稳定范围3.5～7.5，温度稳定范围0～100℃。对其底物特异性进行分析，知该抑制剂对胃蛋白酶和蛋白酶A有较强的抑制活性，对木瓜蛋白酶抑制活性较小，而对胰蛋白酶、中性蛋白酶等几乎没有抑制活性。

本发明的技术方案：一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征为：采用云芝发酵，将云芝接入以马铃薯为主要成分的培养基中，用HCl调节pH，发酵培养，收集菌体，反复冻融与超声波相结合将菌体细胞破碎，高速离心，离心上清液经过大孔树脂脱色得到粗抑制剂，再通过DEAE52离子交换层析得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉；其工艺为：

A云芝发酵：

(1)出发菌株：采用云芝(copious versicolor)作为出发菌株，该菌株购自华中农业大学菌种实验中心；

(2)种子培养基(W/V)：切丝加热煮沸30min的新鲜马铃薯20％，葡萄糖2％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，麸皮1％，pH自然，121℃灭菌30min；培养条件：接入2～3粒黄豆粒大小的斜面菌块，26℃，150r/min培养4～6天；

(3)发酵培养基组成(W/V)：糖2％，NH₄)₂SO₄ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，Na₂SO₃ 0.05％，KH₂PO₄ 0.3％，马铃薯汁40％，121℃灭菌20min；

发酵条件：发酵温度为24～28℃，发酵时间为5天，搅拌频率为150-170r/min，起始pH为5.8～6.5，装液量为75mL/250mL三角瓶，接种量为10％；

B提取并分离纯化天冬氨酸蛋白酶抑制剂：

(1)反复冻融：将发酵液放入-20℃冰箱冷冻，取出后30℃水浴解冻，如此反复进行3次；

(2)超声波破壁：超声波功率280W、温度20℃、处理量40mL进行细胞破碎10min，12000r/mim离心15min，收集上清细胞破碎液；

(3)大孔树脂脱色：利用大孔树脂D101对上清细胞破碎液进行脱色；

(4)DEAE离子交换层析：DEAE52离子交换纤维素色谱柱规格为15cm×2.2cm，平衡缓冲液为20mmol/L、pH7.0的磷酸钠缓冲液，洗脱模式：以平衡缓冲液洗脱2倍柱体积后，再以平衡缓冲液依次加0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mol/L不同浓度的NaCl的磷酸钠缓冲液进行阶段洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，280nm波长紫外检测，结果显示：0.1mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液梯度下收集的峰液对天冬氨酸蛋白酶具有较强的抑制活性，其它梯度下收集的峰液则无抑制活性；

(5)干燥成粉：采用真空冷冻干燥机将DEAE52离子交换层析0.1mol/LNaCl的磷酸钠缓冲液梯度下收集的峰液脱盐后干燥成粉，即为纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂冻干粉。

C抑制剂底物特异性分析：用上述(5)中得到的抑制剂冻干粉配成0.9mg/mL的溶液，测其对不同蛋白酶的抑制活性，结果如图1。

所述的方法，述及的糖为葡萄糖。

由图1知，云芝发酵所产抑制剂对两种天冬氨酸族蛋白酶胃蛋白酶和蛋白酶A均有较强的抑制活性，抑制单位分别为8.96IU/mL和9.16IU/mL，对木瓜蛋白酶抑制活性很小，而对胰蛋白酶、中性蛋白酶等几乎没有抑制活性。

酶活测定方法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶活力测定采用常规蛋白酶活力测定法；蛋白酶A活力测定采用添加DFP的常规蛋白酶A专一测定法。

酶活定义：40℃时，每分钟分解血红蛋白产lμmol酪氨酸所需酶量即为一个酶活单位，单位用U表示。

抑制单位定义：依上述方法测定酶活，按抑制率＝[(抑制前酶活-抑制后酶活)/抑制前酶活]×100％计算抑制率，规定对蛋白酶A抑制率达10％的抑制剂活性为一个抑制单位，单位用IU表示。

IC₅₀值定义：抑制率达50％时的抑制剂添加量。

本发明的有益效果：本发明原料马铃薯汁可考虑用土豆加工废液代替，这样可以消除马铃薯加工厂对周边环境的污染，防止资源浪费，变废为宝。本发明所制备的抑制剂专一性抑制天冬氨酸蛋白酶的活性，粗抑制剂中含有的各种云芝发酵产物具有很高的医药保健价值，而且经过脱色处理，应用中不会产生色素方面的影响，保证安全性，在医药、食品添加剂及病虫害防治等领域有很好的应用前景。

附图说明

图1天冬氨酸族蛋白酶抑制剂对不同蛋白酶抑制效果的比较。

图2一种用云芝发酵产天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备流程。

具体实施方式

实施例1

将云芝斜面接入种子培养基，培养后，装液量为75mL/250mL三角瓶，再按接种量10％接入发酵培养基中，种子及发酵培养基组成如说明书所述。起始pH6.0，26℃，170r/min培养5天。将发酵液置于-20℃冰箱冷冻，取出后30℃水浴解冻，如此反复进行3次；按超声时间10min、功率280W、温度20℃、处理量40mL进行超声波破碎细胞，12000r/min离心15mim，弃去沉淀，将多批细胞破碎、离心后收集到的65mL上清液用大孔树脂D101脱色，即得粗抑制剂60mL，蛋白质与糖的浓度比约为0.77，对胃蛋白酶的IC₅₀值约为2.02mg/mL，收率约为86.9％；取15mL粗抑制剂进行DEAE52离子交换层析，柱规格为15cm×2.2cm，平衡缓冲液为20mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，洗脱模式：以平衡缓冲液洗脱2Vt后，再以平衡缓冲液加不同浓度的NaCl(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5)mol/L溶液进行阶段洗脱，流速为1.0mL/min，280nm波长紫外检测。收集NaCl浓度为0.1mol/L梯度下的峰液10mL，蛋白质与糖的浓度比约为2.18，对胃蛋白酶的IC₅₀值约为0.021mg/mL，收率约为76.0％；大孔树脂D101用乙醇再生，并将乙醇回收利用。

实施例2

将云芝平板接入种子培养基，培养后，装液量为75mL/250mL三角瓶，再按接种量10％接入发酵培养基中，种子及发酵培养基组成如说明书所述。起始pH 6.0，26℃，170r/min培养5天。将发酵液置于-20℃冰箱冷冻，取出后30℃水浴解冻，如此反复进行3次；按超声时间10min、超声功率280W、超声温度20℃、处理量40mL进行超声波破碎细胞，12000r/min离心15mim，弃去沉淀，将多批细胞破碎、离心后收集到的65mL上清液用大孔树脂D101脱色，即得粗抑制剂，蛋白质与糖的浓度比约为0.93，对胃蛋白酶的IC₅₀值约为2.16mg/mL，收率约为88.6％；取15mL粗抑制剂进行DEAE52离子交换层析，柱规格为15cm×2.2cm，平衡缓冲液为20mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，洗脱模式：以平衡缓冲液洗脱2Vt后，再以平衡缓冲液加不同浓度的NaCl(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5)mol/L溶液进行阶段洗脱，流速为1.0mL/min，280nm波长紫外检测。收集NaCl浓度为0.1mol/L梯度下的峰液10mL，蛋白质与糖的浓度比约为2.27，对胃蛋白酶的IC₅₀值约为0.018mg/mL，收率约为81.5％；测其对胃蛋白酶的抑制单位为9.8IU/mL。大孔树脂D101用乙醇再生，并将乙醇回收利用。

实施例3

将云芝平板直接接入发酵培养基，发酵培养基组成如说明书所述。起始pH6.0，26℃，170r/min培养5天。将发酵液置于-20℃冰箱冷冻，取出后30℃水浴解冻，如此反复进行3次；按超声时间10min、超声功率280W、超声温度20℃、处理量40mL进行超声波破碎细胞，12000r/min离心15mim，弃去沉淀，将多批细胞破碎、离心后收集到的65mL上清液用大孔树脂D101脱色，即得粗抑制剂，蛋白质与糖的浓度比约为0.73，对胃蛋白酶的IC₅₀值约为1.99mg/mL，收率约为83.4％；取15mL粗抑制剂进行DEAE52离子交换层析，柱规格为15cm×2.2cm，平衡缓冲液为20mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，洗脱模式：以平衡缓冲液洗脱2Vt后，再以平衡缓冲液加不同浓度的NaCl(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5)进行阶段洗脱，流速为1.0mL/min，280nm波长紫外检测。收集NaCl浓度为0.1mol/mL梯度下的峰液10mL，蛋白质与糖的浓度比约为2.50，对胃蛋白酶的IC₅₀值约为0.019mg/mL，收率约为73.2％；大孔树脂D101用乙醇再生，并将乙醇回收利用。

Claims (2)

1、一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征为：采用云芝发酵，将云芝接入以马铃薯为主要成分的培养基中，用HCl调节pH，发酵培养，收集菌体，反复冻融与超声波相结合将菌体细胞破碎，高速离心，离心上清液经过大孔树脂脱色得到粗抑制剂，再通过DEAE52离子交换层析得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉；其工艺为：

A云芝发酵：

(1)出发菌株：采用云芝(copious versicolor)作为出发菌株，该菌株购自华中农业大学菌种实验中心；

(2)种子培养基(W/V)：切丝加热煮沸30min的新鲜马铃薯20％，葡萄糖2％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，麸皮1％，pH自然，121℃灭菌30min；

培养条件：接入2～3粒黄豆粒大小的斜面菌块，26℃、150r/min培养4～6天；

(3)发酵培养基组成(W/V)：糖2％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.15％，Na₂SO₃ 0.05％，KH₂PO₄ 0.3％，马铃薯汁40％，121℃灭菌20min；

发酵条件：发酵温度为24～28℃，发酵时间5天，搅拌频率为150～170r/min，起始pH为5.8～6.5，装液量为75mL/250mL三角瓶，接种量为10％；

B提取并分离纯化天冬氨酸蛋白酶抑制剂：

(1)反复冻融：将发酵液放入-20℃冰箱冷冻，取出后30℃水浴解冻，如此反复进行3次；

(2)超声波破壁：超声波功率280W、温度20℃、处理量40mL进行细胞破碎10min，12000r/mim离心15min，收集上清细胞破碎液；

(3)大孔树脂脱色：利用大孔树脂D101对上清细胞破碎液进行脱色；

(4)离子交换层析：DEAE52离子交换纤维素色谱柱规格为15cm×2.2cm，平衡缓冲液为20mmol/L、pH7.0的磷酸钠缓冲液，洗脱模式：以平衡缓冲液洗脱2倍柱体积后，再以添加0.1mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液进行洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，280nm波长紫外检测；

(5)干燥成粉：采用真空冷冻干燥机将DEAE52离子交换层析0.1mol/LNaCl的磷酸钠缓冲液梯度下收集的峰液脱盐后干燥成粉，即为纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂冻干粉。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述及的糖为葡萄糖。

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