CN104195202A

CN104195202A - 一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法

Info

Publication number: CN104195202A
Application number: CN201410473759.1A
Authority: CN
Inventors: 刘巴宁; 郑安乔
Original assignee: ZHONGSHAN ANQIAO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHONGSHAN ANQIAO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-09-17
Filing date: 2014-09-17
Publication date: 2014-12-10

Abstract

本发明涉及一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法。所述的方法包括以下步骤：取云芝适量冷冻干燥至恒重，粉碎过筛；取过筛后的样品粉末置入斜面培养基中进行培养；将活化后的菌株置入发酵瓶中进行摇瓶发酵培养，得菌株发酵液；最后将菌株发酵液进行超声波细胞破碎，离心，经大孔树脂脱色，取上清液透析后进行胃蛋白酶抑制剂的纯化，制得胃蛋白酶抑制剂。本发明中，将超声波提取的条件严格限制，保证了胃蛋白酶抑制剂的最大释放，也避免了过高温度及过长时间的超声波提取对胃蛋白酶抑制剂的损坏，提取的胃蛋白酶抑制剂的抑制效果好。

Description

一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法。

背景技术

天冬氨酸蛋白酶的活性中心一般由两个天冬氨酸残基组成，目前主要包括胃蛋白酶、凝乳酶、溶酶体酶等。天冬氨酸蛋白酶抑制剂可增强免疫力、抗癌及降压，对老年痴呆及胃溃疡等患者也具有显著的疗效，目前在食品保健及医药行业中应用十分广泛。但目前化学合成天冬氨酸蛋白酶抑制剂安全性得不到保证，如沙奎那韦可引起脂质代谢紊乱，因此，其实际应用受到明显限制。

云芝(Coriolusversicolor)又称为采绒革盖菌、千层蘑、彩云革盖菌等, 隶属真菌门、担子菌亚门、多孔菌科、革盖菌属,是我国传统的名贵药材。云芝味甘、淡, 性微寒, 有健脾利湿, 止咳平喘, 清热解毒,抗肿瘤的功效。云芝多糖是云芝的主要有效成分，能激活免设细胞、提高机体免疫功能，抗肿瘤、降血脂及抗菌，此外，云芝多糖对慢性应激引起的学习和记忆障碍等均有显著的改善效果，因此，云芝多糖可作为一种安全有效的活性物质，应用于保健食品中。云芝深层发酵可制得其中一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂-胃蛋白酶抑制剂，其不仅具有胃蛋白酶抑制剂的作用，还具有云芝多糖等云芝其他生理活性物质等的活性功能。目前，已有学者报道将云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂及其纯化，但存在操作繁琐或胃蛋白酶抑制剂产是不高等缺点。为此，本发明提供能一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，该方法可对胃蛋白酶抑制剂进行充分提取，且操作简单。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中存在的缺陷提供一种云芝发酵胃蛋白酶抑制剂的提取方法。

本发明的技术方案如下：

一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，包括以下步骤：

（1）样品预处理：取云芝3-5g冷冻干燥至恒重，粉碎过筛，取筛下样品粉末备用；

（2）菌种培养活化：取步骤（1）中制得的样品粉末置入斜面培养基中进行培养，得到活化的菌株；

（3）摇瓶发酵培养：取步骤（2）中活化的菌株置入发酵瓶中进行摇瓶发酵培养，得菌株发酵液；

（4）胃蛋白酶抑制剂的提取：将步骤（3）中制得的菌株发酵液进行超声波细胞破碎，离心，经大孔树脂脱色，取上清液透析后进行胃蛋白酶抑制剂的纯化,制得胃蛋白酶抑制剂。

优选的，其特征于，步骤（1）中所述的粉碎过筛为过40-80目筛。

优选的，步骤（2）中所述的斜面培养基的组分为：马铃薯15-25%，葡萄糖1-3%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，硫酸镁水合物0.1-0.3%，琼脂1-3%。

优选的，步骤（3）中所述的摇瓶发酵培养基的组分为：马铃薯汁30-50%，葡萄糖1-3%,硫酸镁水合物0.1-0.3%，硫酸钠0.03-0.08%，磷酸二氢钾0.1-0.5%。

优选的，步骤（2）中所述的斜面培养基及步骤（3）中所述的摇瓶种子培养基均为在121℃条件下湿热灭菌30-40min的培养基。

优选的，步骤（2）中所述的培养条件为：培养温度25-28℃，培养时间3-5d。

优选的，步骤（3）中所述的培养条件为：摇床速度200-220r/min，培养温度25-28℃，培养时间3-5d；步骤（4）中所述的超声波细胞破碎时的操作条件为：功率为250-300W，温度为20-25℃，时间为5-8min。

优选的，步骤（4）中所述的离心的速度为13000-150000r/min,离心时间为5-10min。

步骤（4）中所述的胃蛋白酶抑制剂的纯化的具体方法为：采用DEAE-52离子交换层析，以流动相A液洗脱2倍柱床体积后，以20%B液梯度洗脱，取透析后的上清液上样。

优选的，所述的流动相A液为0.02-0.05mol/L ,PH为6.5-7.0的磷酸盐缓冲液，B液为0.5-0.8mol/L,PH为6.5-7.0的磷酸盐缓冲液，所述的洗脱速度为0.8-1.0ml/min,上样量为3ml。

对步骤（4）中制得的胃蛋白酶抑制剂采用Lowry法测定浓度，采用常规蛋白酶测定法测定其活力。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

1.超声提取技术是通过超声波瞬间产生强烈的振动、强烈的空化效应及很快的加速度，使细胞破裂从而将细胞内的有效成分充分有效的释放出来，因此，超声提取条件对云芝中胃蛋白酶抑制剂的提取及产量均有较大的影响，本发明中，将超声波提取的条件设定为：功率250-300W，温度为20-25℃，时间为5-8min，可保证胃蛋白酶抑制剂的最大释放，也避免了过高温度及过长时间的超声波提取对胃蛋白酶抑制剂的损坏。

2.本发明提取的胃蛋白酶抑制剂具有良好的热稳定性，研究显示，从灵芝发酵粉中提取的胃蛋白酶抑制剂对对胃蛋白酶的半抑制浓度为180ug/ml，而本发明中提取的胃蛋白酶抑制剂对胃蛋白酶的半抑制浓度为29.26ug/ml，这一结果提示，从云芝发酵液中提取的胃蛋白酶抑制剂对胃蛋白酶的抑制效果较好。

3.本发明对样品先后进行预处理、斜面培养基培养及摇瓶发酵培养，最后进行超声波细胞破碎、透析及纯化等一系列步骤，可对样品中胃蛋白酶抑制剂进行充分提取。

具体实施方式

本发明通过以下具体实施例更详细的说明本发明，可以使本专业技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

（1）样品预处理：取云芝3g冷冻干燥至恒重，粉碎过40目筛，取筛下样品粉末备用；

（2）菌种培养活化：取步骤（1）中制得的样品粉末置入斜面培养基中进行培养，培养温度25℃，培养时间3d，得到活化的菌株；

（3）摇瓶发酵培养：取步骤（2）中活化的菌株置入发酵瓶中进行摇瓶发酵培养，摇床速度200r/min，培养温度25℃，培养时间3d，得菌株发酵液；

（4）胃蛋白酶抑制剂的提取：将步骤（3）中制得的菌株发酵液进行超声波细胞破碎，操作功率为250W，温度为20℃，时间为5min，离心，离心速度为13000r/min,离心时间为5min，经大孔树脂脱色，取上清液透析后进行胃蛋白酶抑制剂的纯化,制得胃蛋白酶抑制剂。

步骤（2）中所述的斜面培养基的组分为：马铃薯15%，葡萄糖1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁水合物0.1%，琼脂1%。

步骤（3）中所述的摇瓶发酵培养基的组分为：马铃薯汁30-50%，葡萄糖1%,硫酸镁水合物0.1%，硫酸钠0.03%，磷酸二氢钾0.1%。

步骤（2）中所述的斜面培养基及步骤（3）中所述的摇瓶种子培养基均为在121℃条件下湿热灭菌30min的培养基。

所述的流动相A液为0.02mol/L ,PH为6.5的磷酸盐缓冲液，B液为0.5mol/L,PH为6.5的磷酸盐缓冲液，所述的洗脱速度为0.8ml/min,上样量为3ml。

实施例1

（1）样品预处理：取云芝5g冷冻干燥至恒重，粉碎过80目筛，取筛下样品粉末备用；

（2）菌种培养活化：取步骤（1）中制得的样品粉末置入斜面培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间5d，得到活化的菌株；

（3）摇瓶发酵培养：取步骤（2）中活化的菌株置入发酵瓶中进行摇瓶发酵培养，摇床速度220r/min，培养温度28℃，培养时间5d，得菌株发酵液；

（4）胃蛋白酶抑制剂的提取：将步骤（3）中制得的菌株发酵液进行超声波细胞破碎，操作功率为300W，温度为25℃，时间为8min，离心，离心速度为150000r/min,离心时间为10min，经大孔树脂脱色，取上清液透析后进行胃蛋白酶抑制剂的纯化,制得胃蛋白酶抑制剂。

步骤（2）中所述的斜面培养基的组分为：马铃薯25%，葡萄糖3%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁水合物0.3%，琼脂3%。

步骤（3）中所述的摇瓶发酵培养基的组分为：马铃薯汁30-50%，葡萄糖3%,硫酸镁水合物0.3%，硫酸钠0.08%，磷酸二氢钾0.5%。

步骤（2）中所述的斜面培养基及步骤（3）中所述的摇瓶种子培养基均为在121℃条件下湿热灭菌40min的培养基。

所述的流动相A液为0.05mol/L ,PH为7.0的磷酸盐缓冲液，B液为0.8mol/L,PH为7.0的磷酸盐缓冲液，所述的洗脱速度为1.0ml/min,上样量为3ml。

实施例1

（1）样品预处理：取云芝4g冷冻干燥至恒重，粉碎过40-80目筛，取筛下样品粉末备用；

（2）菌种培养活化：取步骤（1）中制得的样品粉末置入斜面培养基中进行培养，培养温度26℃，培养时间4d，得到活化的菌株；

（3）摇瓶发酵培养：取步骤（2）中活化的菌株置入发酵瓶中进行摇瓶发酵培养，摇床速度210r/min，培养温度26℃，培养时间4d，得菌株发酵液；

（4）胃蛋白酶抑制剂的提取：将步骤（3）中制得的菌株发酵液进行超声波细胞破碎，操作功率为280W，温度为23℃，时间为6min，离心，离心速度为140000r/min,离心时间为8min，经大孔树脂脱色，取上清液透析后进行胃蛋白酶抑制剂的纯化,制得胃蛋白酶抑制剂。

步骤（2）中所述的斜面培养基的组分为：马铃薯20%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁水合物0.2%，琼脂2%。

步骤（3）中所述的摇瓶发酵培养基的组分为：马铃薯汁40%，葡萄糖2%,硫酸镁水合物0.2%，硫酸钠0.06%，磷酸二氢钾0.3%。

步骤（2）中所述的斜面培养基及步骤（3）中所述的摇瓶种子培养基均为在121℃条件下湿热灭菌35min的培养基。

所述的流动相A液为0.03mol/L ,PH为6.8的磷酸盐缓冲液，B液为0.6mol/L,PH为6.8的磷酸盐缓冲液，所述的洗脱速度为0.9ml/min,上样量为3ml。

以上所述实施例只是本发明的较佳实例，并非来限制本发明实施范围，故凡依本发明申请专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括本发明专利申请范围内。

Claims

1. 一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，步骤（1）中所述的粉碎过筛为过40-80目筛。

3.根据权利要求1所述的一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，步骤（2）中所述的斜面培养基的组分为：马铃薯15-25%，葡萄糖1-3%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，硫酸镁水合物0.1-0.3%，琼脂1-3%。

4.根据权利要求1所述的一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，步骤（3）中所述的摇瓶发酵培养基的组分为：马铃薯汁30-50%，葡萄糖1-3%,硫酸镁水合物0.1-0.3%，硫酸钠0.03-0.08%，磷酸二氢钾0.1-0.5%。

5.根据权利要求1所述的一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，步骤（2）中所述的斜面培养基及步骤（3）中所述的摇瓶种子培养基均为在121℃条件下湿热灭菌30-40min的培养基。

6.根据权利要求1所述的一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，步骤（2）中所述的培养条件为：培养温度25-28℃，培养时间3-5d。

7.根据权利要求1所述的一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，步骤（3）中所述的培养条件为：摇床速度200-220r/min，培养温度25-28℃，培养时间3-5d；步骤（4）中所述的超声波细胞破碎时的操作条件为：功率为250-300W，温度为20-25℃，时间为5-8min。

8.根据权利要求1所述的一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，步骤（4）中所述的离心的速度为13000-150000r/min,离心时间为5-10min。

9.根据权利要求1所述的一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，步骤（4）中所述的胃蛋白酶抑制剂的纯化的具体方法为：采用DEAE-52离子交换层析，以流动相A液洗脱2倍柱床体积后，以20%B液梯度洗脱，取透析后的上清液上样。

10.根据权利要求9所述的一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，所述的流动相A液为0.02-0.05mol/L ,PH为6.5-7.0的磷酸盐缓冲液，B液为0.5-0.8mol/L,PH为6.5-7.0的磷酸盐缓冲液，所述的洗脱速度为0.8-1.0ml/min,上样量为3ml。