CN101597332A - 一种马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，属于植物提取生物活性产品技术领域。本发明涉及采用直接将马铃薯去皮、切块、匀浆，高速离心，上清液高压灭菌，再高速离心，超滤浓缩，乙醇分级沉淀，沉淀复溶后离心去不溶物，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉。本发明所制备的天冬氨酸蛋白酶抑制剂对胃蛋白酶有较高抑制活性，直接从马铃薯中提取不仅成本低、应用安全且不会产生色素方面的影响，在食品、医药和农业等领域有非常广泛的应用前景。

Description

一种马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法
技术领域
一种马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，具体的说是利用马铃薯匀浆得马铃薯汁，经高压灭菌，高速离心，超滤浓缩，乙醇分级沉淀，获得天冬氨酸蛋白酶抑制剂制品，属于植物提取生物活性产品技术领域。
背景技术
蛋白酶抑制剂泛指对蛋白酶有抑制作用的一类物质，参与生物体内蛋白酶解活动的控制，对维持正常的生命活动具有重要意义。它的来源十分广泛，在各种动植物的组织器官中都有存在。按其所抑制的目标蛋白酶活性中心的不同，可分为以下几种：丝氨酸蛋白酶抑制剂；半胱氨酸蛋白酶抑制剂；天冬氨酸蛋白酶抑制剂；金属蛋白酶抑制剂等。目前国内外报道的蛋白酶抑制剂大多数都是通过化学法合成的，这些蛋白酶抑制剂在应用中受到相当大的限制，因此从天然产物中开发此类蛋白酶抑制剂日益受到人们的关注。
蛋白酶抑制剂在食品、医药和农业等领域也有非常广泛的应用前景。例如，增强小麦面筋性，提高啤酒泡沫稳定性，治疗胰腺炎和多功能衰竭、休克、心脏外科手术中失血、中风、老年痴呆症等。其中，最令人瞩目的是在HIV和肿瘤治疗中的应用，蛋白酶抑制剂还可抑制昆虫肠道内蛋白水解酶的活性，在植物防御昆虫和病原体侵染时起着重要作用。
天冬氨酸蛋白酶的活性中心一般是由两个天冬氨酸残基所组成，目前主要包括胃蛋白酶、血管紧张肽原酶、蛋白酶A、组织蛋白酶D、天冬氨酸膜内裂解蛋白酶等。天冬氨酸蛋白酶是导致艾滋病、恶性肿瘤、高血压等世界上几种难治疾病的发病因素之一，深入了解天冬氨酸蛋白酶抑制剂，对治疗这些顽固性疾病将有一定的帮助。
天冬氨酸蛋白酶抑制剂在食品保健及医药行业中应用非常广泛，如抑制肿瘤细胞增殖、增强免疫力和抗癌等，对胃溃疡、降血压、艾滋病、中风、老年痴呆症等的治疗具有明显的疗效。而化学法合成天冬氨酸蛋白酶抑制剂往往因其药理毒性和安全性得不到保证(如HIVPI沙奎那韦可导致脂代谢紊乱综合症)，所以在食品及医药行业中的应用受到很大的限制。
将从马铃薯中提取的天冬氨酸蛋白酶抑制剂加入到小麦面粉中，对小麦蛋白酶活性有抑制作用，这样既可满足小麦蛋白质含量保持较高的水平，又可保证小麦有较好的面团流变性和良好的发酵耐力；蛋白酶A是一种天冬氨酸蛋白酶，可导致啤酒泡沫稳定性降低，加入天冬氨酸蛋白酶抑制剂，可抑制蛋白酶A活性提高啤酒泡沫稳定性；胃溃疡发病由多因素所致，目前认为，胃溃疡的发生机制多与攻击因子和防御因子的失衡有关，或“攻击因子”[胃酸、胃蛋白酶、幽门螺杆菌等]过强，或“防御因子”(胃黏膜、胃黏液、碳酸氢盐等)减弱而形成，有报道认为马铃薯中优质纤维素对胃黏膜具有一定的保护作用，本课题组研究发现其中天冬氨酸蛋白酶抑制剂对胃蛋白酶具较强抑制作用，从而可减弱“攻击因子”的作用，揭示从马铃薯中提取的天冬氨酸蛋白酶抑制剂有治疗胃溃疡的药理活性。课题组进一步的特性研究发现该马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂温度和pH稳定性较好，直接从天然产物中提取使安全性有极大保证，可加工成药剂服用，在医药行业的应用潜力较大。
马铃薯是仅次于小麦、玉米、水稻而居第四位的粮食作物，营养丰富，含大量的蛋白质、糖类、维生素、优质纤维素等，素有“地下苹果”和“第二面包”之称，祖国医学认为，土豆性平，有和胃、调中、健脾、益气之功效。马铃薯块茎中含有多种蛋白类蛋白酶抑制剂，含量占所含可溶性蛋白的50％以上。因此，从马铃薯中提取天冬氨酸蛋白酶抑制剂具有取材易，成本低，杂质相对较少，应用广泛，不影响食品的安全性、感官及口味等众多优点。目前，马铃薯除食用外多用于淀粉生产，其生产中产生的蛋白液一般当作废水排放，污染性很大。因此，原料可选择采用马铃薯淀粉加工废水，对增加蛋白质资源、避免环境污染等具有潜在的经济和社会效益。
发明内容
本发明目的是提供一种马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，采用马铃薯匀浆得马铃薯汁，高压灭菌，高速离心，超滤浓缩得粗抑制剂，对胃蛋白酶比抑制活性约为3.98～5.19U/mg，蛋白质与糖的浓度比约为1.23～1.47，收率约为81.9％～86.1％；再经乙醇分级沉淀，得天冬氨酸蛋白酶抑制剂制品，对胃蛋白酶比抑制活性为7.69～10.9U/mg，蛋白质与糖的浓度比约为2.12～2.41，整个工艺流程收率约为52.2％～58.3％，最适温度40℃左右，温度稳定范围0～100℃，pH稳定范围3.0～7.5。
本发明的技术方案：一种马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，采用马铃薯去皮、切块、匀浆，高速离心，上清液高压灭菌，再高速离心，超滤浓缩，乙醇分级沉淀，沉淀复溶后离心去不溶物，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉。工艺为：
A马铃薯汁制备：
(1)马铃薯：市售；
(2)匀浆：马铃薯洗净去皮切块后，按0.5g Na2SO3/kg马铃薯加入Na2SO3以阻止多酚氧化，匀浆，匀浆后以8000r/mim离心30min，取上清；
(3)高压灭菌：将上清液于121℃灭菌20min，冷却，4℃、14000r/mim离心20min，收集上清液，为处理后的马铃薯汁；
B马铃薯汁超滤浓缩：
(1)超滤膜处理：截留分子量为10KDa的卷式超滤膜组件先用蒸馏水洗涤30min，循环阀打开，再用pH 11左右的NaOH溶液循环清洗30min，蒸馏水洗至中性；
(2)超滤条件：处理后的马铃薯汁用所述处理后的截留分子量为10KDa的超滤膜组件进行浓缩，浓缩倍数3～5，压力0.075MPa、室温超滤10min，收集截留液；
C乙醇分级沉淀：
(1)将步骤B所收集截留液，加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为20％进行醇沉，4℃、以10000r/min离心10min后，弃沉淀，取上清液；
(2)取上清液加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为60％进行醇沉，4℃、以10000r/min离心10min后，取沉淀，弃上清；
(3)沉淀加少量pH 6.8的磷酸缓冲液溶解，4℃、以10000r/min离心10min后，弃沉淀，取上清，即为天冬氨酸蛋白酶抑制剂液。
(4)干燥成粉：采用真空冷冻干燥或喷雾干燥的方法将天冬氨酸蛋白酶抑制剂液干燥成粉，即为天冬氨酸蛋白酶抑制剂粉体。
天冬氨酸蛋白酶抑制剂对胃蛋白酶抑制作用分析：用上述(4)中得到的抑制剂冻干粉配成1mg/mL的溶液，测其对胃蛋白酶有较强的抑制活性，比抑制活性约为9.61U/mg。
酶活测定方法：采用常规蛋白酶活力测定法。
酶活定义：40℃时，每分钟分解血红蛋白产1μmol酪氨酸所需酶量即为一个酶活单位，单位用U表示。
抑制单位定义：依上述方法测定酶活，按：抑制率＝[(抑制前酶活-抑制后酶活)/抑制前酶活]×100％计算抑制率，规定对蛋白酶A抑制率达10％的抑制剂活性为一个抑制单位，单位用IU表示。
本发明的有益效果：本发明原料马铃薯汁可考虑用马铃薯加工废液代替，这样既可消除马铃薯加工厂对周边环境的污染，又可防止资源浪费，变废为宝。本发明所制备的抑制剂对天冬氨酸蛋白酶有很高的抑制活性，直接从马铃薯中提取具有取材易，成本低，杂质相对较少，应用广泛，不影响食品的安全性、感官及口味等众多优点，采用超滤与乙醇分级沉淀组合提取天冬氨酸蛋白酶抑制剂不仅简便、易操作、成本低、而且易于规模化放大和工业化生产，在医药、食品添加剂及病虫害防治等领域有很好的应用前景。
附图说明
图1一种马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备工艺示意图。
具体实施方式
实施例1：将682.7g马铃薯洗净、去皮、切块后，按0.5g Na2SO3/kg马铃薯加入0.341g Na2SO3以阻止多酚氧化，匀浆后以8000r/min、4℃离心30min，得上清510mL，将上清液于121℃高压灭菌20min，冷却至室温后，14000r/min、4℃离心20mim，弃去沉淀，将收集到的432mL上清液用10KDa超滤膜浓缩，在压力0.075MPa、室温下超滤10min，得浓缩液112mL，对胃蛋白酶抑制率约为5.19U/mg，蛋白质与糖的浓度比约为1.47，收率约为86.1％；浓缩液中加入28mL-20℃乙醇，10000r/min、4℃离心10min后，取上清液再加入160.5mL-20℃乙醇，10000r/min、4℃离心10min后，取沉淀；沉淀加40mL pH6.8的磷酸缓冲液溶解，以10000r/min、4℃离心10min后，得到上清约39mL，即为天冬氨酸蛋白酶抑制剂液，冷冻干燥后得0.102g抑制剂干粉，对胃蛋白酶比抑制活性为10.9IU/mg，蛋白质与糖的浓度比约为2.12，收率约为58.3％。
实施例2：将887.6g马铃薯洗净、去皮、切块后，按0.5g Na2SO3/kg马铃薯加入0.443g Na2SO3以阻止多酚氧化，匀浆后以8000r/min、4℃离心30min，得上清562mL，将上清液于121℃高压灭菌20min，冷却至室温后，14000r/min、4℃离心20mim，弃去沉淀，将收集到的480mL上清液用10KDa超滤膜浓缩，在压力0.075MPa、室温下超滤10min，得浓缩液95mL，对胃蛋白酶抑制率约为4.65U/mg，蛋白质与糖的浓度比约为1.23，收率约为84.6％；浓缩液中加入23.75mL-20℃乙醇，10000r/min、4℃离心10min后，取上清液再加入142.5mL-20℃乙醇，10000r/min、4℃离心10min后，取沉淀；沉淀加40mL pH 6.8的磷酸缓冲液溶解，以10000r/min、4℃离心10min后，得到上清约40mL，即为天冬氨酸蛋白酶抑制剂液，冷冻干燥后得0.11g抑制剂干粉，对胃蛋白酶比抑制活性约为9.61U/mg，蛋白质与糖的浓度比约为2.41，收率约为56.7％。
实施例3：将507.3g马铃薯洗净、去皮、切块后，按0.5g Na2SO3/kg马铃薯加入0.254g Na2SO3以阻止多酚氧化，匀浆后以8000r/min、4℃离心30min，得上清321mL，将上清液于121℃高压灭菌20min，冷却至室温后，14000r/min、4℃离心20mim，弃去沉淀，将收集到的250mL上清液用10KDa超滤膜浓缩，在压力0.075MPa、室温下超滤10min，得浓缩液87mL，对胃蛋白酶比抑制活性约为3.98U/mg，蛋白质与糖的浓度比约为1.36，收率约为81.9％；浓缩液中加入21.75mL-20℃乙醇，10000r/min、4℃离心10min后，取上清液再加入130.5mL-20℃乙醇，10000r/min、4℃离心10min后，取沉淀；沉淀加40mL pH 6.8的磷酸缓冲液溶解，以10000r/min、4℃离心10min后，得到上清约40mL，即为天冬氨酸蛋白酶抑制剂液，冷冻干燥后得0.09g抑制剂干粉，对胃蛋白酶比抑制活性为7.69U/mg，蛋白质与糖的浓度比约为2.24，收率约为52.2％。

Claims (1)

1、一种马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征为：采用马铃薯去皮、切块、匀浆，高速离心，上清液高压灭菌，再高速离心，超滤浓缩，乙醇分级沉淀，沉淀复溶后离心去不溶物，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉；工艺为：
A马铃薯汁制备：
(1)马铃薯：市售；
(2)匀浆：马铃薯洗净去皮切块后，按0.5g Na2SO3/kg马铃薯加入Na2SO3以阻止多酚氧化，匀浆，匀浆后以8000r/mim离心30min，取上清；
(3)高压灭菌：将上清液于121℃灭菌20min，冷却，4℃、14000r/mim离心20min，收集上清液，为处理后的马铃薯汁；
B马铃薯汁超滤浓缩：
(1)超滤膜处理：截留分子量为10KDa的卷式超滤膜组件先用蒸馏水洗涤30min，循环阀打开，再用pH 11的NaOH溶液循环清洗30min，蒸馏水洗至中性；
(2)超滤条件：处理后的马铃薯汁用所述处理后的截留分子量为10KDa的超滤膜组件进行浓缩，浓缩倍数3～5，压力0.075MPa、室温超滤10min，收集截留液；
C乙醇分级沉淀：
(1)将步骤B所收集截留液，加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为20％进行醇沉，4℃、以10000r/min离心10min后，弃沉淀，取上清液；
(2)取上清液加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为60％进行醇沉，4℃、以10000r/min离心10min后，取沉淀，弃上清；
(3)沉淀加少量pH 6.8的磷酸缓冲液溶解，4℃、以10000r/min离心10min后，弃沉淀，取上清，即为天冬氨酸蛋白酶抑制剂液；
(4)干燥成粉：采用真空冷冻干燥或喷雾干燥的方法将天冬氨酸蛋白酶抑制剂液干燥成粉，即为天冬氨酸蛋白酶抑制剂粉体。
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