CN104643031B - 一种发酵虫草源性β‑葡聚糖提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵虫草源性β‑葡聚糖提取物及其制备方法，该提取物含有总多糖50％以上，1,3‑1,6β葡聚糖40％以上，α葡聚糖含量在10％以下。本发明方法高效提取有效成分，得到的产品浓缩了发酵虫草的有益成分，作为保健产品或药品使用可显著降低服用量。

Description

一种发酵虫草源性β-葡聚糖提取物及其制备方法

技术领域

本发明属于真菌资源应用领域，涉及发酵虫草源性β-葡聚糖提取物的制备方法。

背景技术

β-葡聚糖是一种具有多种功能活性的多糖，主要化学结构β-1，3葡聚糖和β-1，6葡聚糖，其中前者具有抗肿瘤性质，而且能够极大地提高人体自然免疫力。

日本科学家研究成果表明，β-葡聚糖具有调节血糖水平，激活胰岛素活性的作用，为高血糖患者带来了福音。由于国内对虫草多糖的研究还处于比较低的水平，甚至一些生产商片面追求总多糖含量，添加麦芽糖糊精，β-环糊精和黄糊精，导致国外内外对真菌多糖的兴趣丧失。

为了进一步开发利用发酵虫草资源，充分促进真菌多糖在食品中的应用，发明人提供一种发酵虫草源性β-葡聚糖提取物，推动了发酵虫草的广泛应用。

发明内容

本发明为了克服上述不足之处，一种发酵虫草源性β-葡聚糖提取物及其提取方法，该提取物具有高含量的总多糖和1,3-1,6β葡聚糖，以及低含量的α葡聚糖，为生产高档次的保健产品和化妆品提供了原料，推动发酵虫草的广泛应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种发酵虫草源性β-葡聚糖提取物，该提取物含有总多糖50％以上，1,3-1,6β葡聚糖40％以上，α葡聚糖含量在10％以下。

上述发酵虫草源性β-葡聚糖提取物，该发酵虫草源性β-葡聚糖提取物是通过以下方法制备得到的：

a)向发酵的湿虫草菌丝体中，加入质量浓度为70-95％的乙醇，加热至20-50℃，保持2h-5h后，离心，弃去滤液，得到湿菌丝体；

b)向a)中湿菌丝体加入纯化水进行洗涤，得到洗涤后的菌丝体；

c)将b)中洗涤后的菌丝体，加入纯化水，菌丝体与纯化水重量比例为1:2-5，煮沸后，保温3h-10h，每隔1-1.5h，在10-20r/min转速条件下搅拌5min-20min，离心，弃去菌丝体，保留滤液；

d)将c)中所得滤液，浓缩至比重为0.8-1.3，加入乙醇进行醇沉，离心，得到湿β-葡聚糖提取物，回收乙醇；

e)将d)中得到的湿β-葡聚糖提取物在真空度0.02MPa-0.10MPa条件下真空干燥，湿料厚度不高于5cm，干燥温度60-90℃，干燥40h-80h。

步骤a)中该浓度范围的乙醇的使用，除去了低分子多糖及醇溶性多糖，提高产品中有效成分β葡聚糖含量，优选采用的乙醇浓度为80％。

步骤b)中具体的洗涤步骤为：湿菌丝体加入纯化水，湿菌丝体与纯化水的重量比例为1:2-5，转速为10r/min-100r/min条件下搅拌5-30min，然后离心，弃滤液，得到洗涤后的菌丝体。

步骤d)中具体的醇沉步骤为：向浓缩后的滤液中边搅拌边加入浓缩液体积1-5倍量乙醇使乙醇浓度为50-80％，静置8h以上，进行醇沉。

上述发酵虫草源性β-葡聚糖提取物中，还可以将步骤e)中得到的干燥品用纯化水溶解，干燥品与纯化水的重量比例为1:2-5；然后在真空度0.02MPa-0.10MPa，干燥温度60-90℃条件下减压真空干燥40h-80h，粉碎，过80目筛，总混60-90min，得到成品。该过程使得提取的β葡聚糖粗品再次溶解，干燥，进一步有效除去产品中乙醇的残留。

步骤a)中离心可采用卧螺离心机，离心条件为转速1000r/min-5000r/min。步骤b)中提到的离心可采用卧螺离心机，离心条件为转速1000r/min-3000r/min，离心时间为0.5-1.5h。

本发明所述的虫草为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces Hepiali Chen et Dai，sp.Nov)。

发酵的湿虫草菌丝体可按照如下工艺进行：

将蝙蝠蛾拟青霉菌种接于新鲜斜面培养基上，培养基配方为：土豆8-9％，葡萄糖2-4.0％，磷酸二氢钾0.2-0.3％，硫酸镁0.15-0.17％，琼脂1.3-1.5％，26-28℃培养4天；在斜面培养好的菌种转接到摇瓶中，摇瓶培养基为：葡萄糖2.0-4.0％，蛋白胨1.0-2.0％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，硫酸镁0.05-0.07％，26-28℃培养2天；摇瓶培养结束后，将菌种转接到种子罐中，种子罐培养基为：葡萄糖2.0-3.0％，蛋白胨1-2％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，硫酸镁0.05-0.07％，消泡剂0.1-0.2％，发酵工艺条件为：接种量10％，温度26℃±1℃，通气量1∶0.5vvm，罐压0.03MPa；种子罐发酵3天后转接到发酵罐发酵，发酵罐培养基为：蛋白胨2-4％、葡萄糖1.5-1.7％、磷酸二氢钾0.05-0.07％、硫酸镁0.07-0.08％、消泡剂0.1-0.3％。发酵工艺为：接种量10％，发酵温度26℃±1℃，通气量1∶0.5vvm，罐压0.03MPa。发酵罐体积为种子罐的10倍。发酵结束后，发酵液经卧式螺旋卸料沉降离心机分离，得到菌丝体。

步骤c)所述的保温优选在80-100℃条件下保温。

步骤d)所述的离心分离条件为采用卧螺离心机在500-2500r/min转速条件下，分离10-30min；所述的干燥条件是将离心分离得到的虫草多糖在60-90℃下干燥40h-80h。

上述发酵虫草源性β-葡聚糖提取物的制备方法具体包括以下步骤：

a)向发酵的湿虫草菌丝体中，加入质量浓度为70-95％的乙醇，加热至20-50℃，保持2h-5h后，离心，弃去滤液，得到湿菌丝体；

b)向a)中湿菌丝体加入纯化水进行洗涤，得到洗涤后的菌丝体；

c)将b)中洗涤后的菌丝体，加入纯化水，菌丝体与纯化水比例为1:2-5，煮沸后，保温3h-10h，每隔1-1.5h，在10-20r/min转速条件下搅拌5min-20min，离心，弃去菌丝体，保留滤液；

d)将c)中所得滤液，浓缩至比重为0.8-1.3，加入乙醇进行醇沉，离心，得到湿β-葡聚糖提取物，回收乙醇；

e)将d)中得到的湿β-葡聚糖提取物在真空度0.02MPa-0.10MPa条件下真空干燥，湿料厚度不高于5cm，干燥温度60-90℃，干燥40h-80h。

该β-葡聚糖提取物可制备具有保健效果的食品或药品，如咖啡。

一种发酵虫草源性β-葡聚糖咖啡，包括β-葡聚糖提取物，氯化钠与咖啡粉，β葡聚糖，氯化钠与咖啡粉的比例为1：1：(0.05-0.30)：(10-30)。在总混中加入氯化钠可以使咖啡中的焦糖化的味道更为突出，咖啡味道柔和浓郁。

上述β-葡聚糖咖啡的制备方法包括以下步骤：

a)向发酵的湿虫草菌丝体中，加入质量浓度为70-95％的乙醇，加热至20-50℃，保持2h-5h后，离心，弃去滤液，得到湿菌丝体；

b)向a)中湿菌丝体加入纯化水进行洗涤，得到洗涤后的菌丝体；

c)将b)中洗涤后的菌丝体，加入纯化水，菌丝体与纯化水比例为1:2-5，煮沸后，保温3h-10h，每隔1-1.5h，在10-20r/min转速条件下搅拌5min-20min，离心，弃去菌丝体，保留滤液；

d)将c)中所得滤液，浓缩至比重为0.8-1.3，加入乙醇进行醇沉，离心，得到湿β-葡聚糖提取物，回收乙醇；

e)将d)中得到的湿β-葡聚糖提取物在真空度0.02MPa-0.10MPa条件下真空干燥，湿料厚度不高于5cm，干燥温度60-90℃，干燥40h-80h。

f)将e)中干燥品用纯化水溶解，干燥品与纯化水重量比例为1:2-5；然后在真空度0.02MPa-0.10MPa，干燥温度60-90℃条件下减压真空干燥40h-80h，粉碎，过80目筛，总混60-90min，得到成品；

g)β-葡聚糖，氯化钠与咖啡粉的比例为1：0.05-0.30：10-30，用三维运动混合机混匀60-90min。即β-葡聚糖咖啡。

本发明加入氯化钠可中和丹宁酸的苦味，使咖啡中的焦糖化的味道更为突出。

所使用的氯化钠为食品级氯化钠，市售可得。

与现有技术比较本发明的有益效果：

1、市售的真菌多糖提取物中，具有活性的β葡聚糖含量较低，β葡聚糖的含量仅在1-5％。而本发明显著提高了真菌多糖提取物中β葡聚糖的含量，总多糖含量高达56％的同时，1,3-1,6β葡聚糖含量高达43.5％，腺苷含量高达0.33％，甘露醇含量高达12.0％，而α葡聚糖含量可在10％以下。

2、多糖提取物粘度较大，传统上会加入糊精等方式降低黏度，但是这种方法降低了产品中β葡聚糖含量，在本发明中采用特定的减压真空的干燥方式，在无淀粉，麦芽糊精，β环糊精和黄糊精等添加剂的加入的情况下，而且依然能干燥充分，为生产高档次的保健产品和化妆品提供了原料。

3、β葡聚糖是具有抗肿瘤活性的物质，虫草中腺苷和甘露醇有养肾益肺的作用，本发明方法高效提取有效成分，得到的产品浓缩了发酵虫草的有益成分，作为保健产品或药品使用可显著降低服用量。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明，该说明并不对本发明进行限制：

发酵的湿虫草菌丝体按照如下工艺进行制备：

蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali chen)CS-4，购买于中国科学院微生物菌种保藏中心。

从冰箱中取出保藏菌种接于新鲜斜面培养基上，培养基配方为：土豆8％，葡萄糖3.0％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，琼脂1.3％，26℃培养4天。

在斜面培养好的菌种转接到摇瓶中，摇瓶培养基为：葡萄糖2.0％，蛋白胨1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，26℃培养2天。

摇瓶培养结束后，将菌种转接到种子罐中，种子罐培养基为：葡萄糖2.0％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，消泡剂0.1％，发酵工艺条件为：接种量10％，温度26℃±1℃，通气量1∶0.5vvm，罐压0.03MPa。

种子罐发酵3天后转接到大罐发酵，大罐培养基为：蛋白胨2％、葡萄糖1.5％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.07％、消泡剂0.1％。发酵工艺为：接种量10％，发酵温度26℃±1℃，通气量1∶0.5vvm，罐压0.03MPa。

发酵结束后，发酵液经卧式螺旋卸料沉降离心机分离，即得发酵的湿虫草菌丝体。

实施例1

a)发酵的湿虫草菌丝体中，加入质量浓度为80％的乙醇，加热至30℃，保持4h，卧螺离心机在3000r/min条件下分离，弃去滤液，湿菌丝体备用。

b)将a)中湿菌丝体加入，加入纯化水，菌体与纯化水的比例为1:3，搅拌5-30min，转速为10r/min-100r/min，然后卧螺离心机在3000r/min条件下离心1h，弃滤液，得到洗涤后的菌丝体。

c)将b)中洗涤后的菌丝体，加入纯化水，菌丝体与纯化水重量比例为1:3，煮沸，保温6h，每隔1h，在10r/min下搅拌10min，卧螺离心机分离，弃去菌丝体，保留滤液。

d)将c)中所得滤液，真空度0.02MPa-0.10MPa，60℃条件下，双效浓缩至比重为0,8-1.3，打入醇沉锅，边搅拌边加入浓缩液体积3倍量酒精，搅拌均匀后用酒精比重计测定酒精度约50-60％，静置8h以上，三足离心机2000r/min条件下分离10min，得到湿β-葡聚糖，废酒精回收。

e)将d)中β-葡聚糖于至于减压真空干燥箱中干燥，真空度0.02MPa-0.10MPa，湿料厚度不高于5cm，干燥温度60-90℃，干燥40h，得一次干燥品。

f)将e)中一次干燥品用纯化水溶解，干燥品与纯化水比例为1:3。然后置于料盘中减压真空干燥，真空度0.02MPa-0.10MPa，干燥温度60℃，干燥40h。粉碎，过80目筛，总混60min。得到β葡聚糖成品。

实施例1 方法制备得到的β葡聚糖的质量检测结果如下表所示：

项目	检测方法	检测结果
			外观	目测	棕色粉末
气味	嗅觉	特有气味
			水分	GB5009.3	2.91％
总多糖	Megazyme试剂盒	56％

1,3-1,6β葡聚糖	Megazyme试剂盒	43.5％
			α葡聚糖	Megazyme试剂盒	2.9％
腺苷	Q/JSFF0001S-2011	0.31％
			甘露醇	Q/JSFF0001S-2011	12.0％
菌落总数	GB4789.2	<10cfu/g
			霉菌和酵母菌	GB4789.15	<10cfu/g
大肠菌群	GB4789.3	未检出
			大肠埃希菌	CP2010	未检出
沙门氏菌	CP2010	未检出
			Pb	GB5009.12	未检出
Hg	GB/T5009.17	未检出
			Cd	CP2010	未检出
As	GB/T5009.11	0.12ppm

实施例2

a)发酵的湿虫草菌丝体，加入质量浓度为70％的乙醇，加热至40℃，保持2h，1000r/min条件下卧螺离心机分离，弃去滤液，湿菌丝体备用。

b)将a)中湿菌丝体加入，加入纯化水，菌体与纯化水的比例为1:5，搅拌30min，转速为30r/min，然后1000r/min条件下卧螺离心机离心1.5h，弃滤液，得到洗涤后的菌丝体。

c)将b)中洗涤后的菌丝体，加入纯化水，菌丝体与纯化水重量比例为1:5，煮沸，保温3h，每隔1h，在10r/min下搅拌5min，卧螺离心机分离，弃去菌丝体，保留滤液。

d)将c)中所得滤液，真空度0.02MPa-0.10MPa，40-50℃条件下双效浓缩至比重为0,8-1.3，打入醇沉锅，边搅拌边加入浓缩液体积约5倍量酒精，搅拌均匀后用酒精比重计测定酒精度约70-80％，静置8h以上，三足离心机1000r/min条件下分离20min，得到湿β-葡聚糖，废酒精回收。

e)将d)中β-葡聚糖于至于减压真空干燥箱中干燥，真空度0.02MPa-0.10MPa，湿料厚度不高于5cm，干燥温度60-90℃，干燥50h，得一次干燥品。

f)将e)中一次干燥品用纯化水溶解，干燥品与纯化水比例为1:5。然后置于料盘中减压真空干燥，真空度0.02MPa-0.10MPa：干燥温度60℃，干燥40h，粉碎，过80目筛，总混70min。得到β葡聚糖成品。

实施例2方法制备得到的β葡聚糖的质量检测结果如下表所示：

项目	检测方法	检测结果
			外观	目测	棕色粉末
气味	嗅觉	特有气味
			水分	GB5009.3	2.93％
总多糖	Megazyme试剂盒	55.8％
			1,3-1,6β葡聚糖	Megazyme试剂盒	43.2％
α葡聚糖	Megazyme试剂盒	3.0％
			腺苷	Q/JSFF0001S-2011	0.33％
甘露醇	Q/JSFF0001S-2011	12.3％
			菌落总数	GB4789.2	<10cfu/g
霉菌和酵母菌	GB4789.15	<10cfu/g
			大肠菌群	GB4789.3	未检出
大肠埃希菌	CP2010	未检出
			沙门氏菌	CP2010	未检出
Pb	GB5009.12	未检出
			Hg	GB/T5009.17	未检出
Cd	CP2010	未检出
			As	GB/T5009.11	0.12ppm

实施例3

将实施例1方法制备得到的β-葡聚糖提取物，氯化钠与咖啡粉按照1：0.05-0.30：10-30的重量比例用三维运动混合机混合60-90min，即β-葡聚糖咖啡。

Claims (4)

1.一种发酵虫草源性β-葡聚糖提取物，其特征在于该提取物含有总多糖50%以上，1,3-1,6β葡聚糖40%以上，α葡聚糖含量在10%以下；

所述的发酵虫草源性β-葡聚糖提取物是通过以下方法制备得到的：

a)向发酵的湿虫草菌丝体中，加入质量浓度为70%-95%的乙醇，加热至20℃-50℃，保持2h-5h后，离心，弃去滤液，得到湿菌丝体；

b)向a)中湿菌丝体加入纯化水进行洗涤，得到洗涤后的菌丝体；

c)将b）中洗涤后的菌丝体，加入纯化水，菌丝体与纯化水比例为1:2-5，煮沸后，保温3h-10h，每隔1-1.5h，在10-20r/min转速条件下搅拌5min-20min，离心，弃去菌丝体，保留滤液；

d)将c）中所得滤液，浓缩至比重为0.8-1.3，加入乙醇进行醇沉，离心，得到湿β-葡聚糖提取物，回收乙醇；具体的醇沉步骤为：向浓缩后的滤液中边搅拌边加入浓缩液体积1-5倍量乙醇使乙醇浓度为50-80%，静置8h以上，进行醇沉；

e）将d）中得到的湿β-葡聚糖提取物在真空度0.02MPa-0.10MPa条件下真空干燥，湿料厚度不高于5cm，干燥温度60-90℃，干燥40h-80h；

所述的虫草为蝙蝠蛾拟青霉。

2.根据权利要求1所述的发酵虫草源性β-葡聚糖提取物，其特征在于步骤b)中具体的洗涤步骤为：湿菌丝体加入纯化水，湿菌丝体与纯化水的重量比例为1:2-5，转速为10r/min-100r/min条件下搅拌5-30min，然后离心，弃滤液，得到洗涤后的菌丝体。

3.根据权利要求1所述的发酵虫草源性β-葡聚糖提取物，其特征在于步骤d)所述的离心分离条件为采用卧螺离心机在500-2500r/min转速条件下，分离10-30min。

4.一种发酵虫草源性β-葡聚糖提取物的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)向发酵的湿虫草菌丝体中，加入质量浓度为70-95%的乙醇，加热至20-50℃，保持2h-5h后，离心，弃去滤液，得到湿菌丝体；

b)向a)中湿菌丝体加入纯化水进行洗涤，得到洗涤后的菌丝体；

c)将b）中洗涤后的菌丝体，加入纯化水，菌丝体与纯化水比例为1:2-5，煮沸后，保温3h-10h，每隔1-1.5h，在10-20r/min转速条件下搅拌5min-20min，离心，弃去菌丝体，保留滤液；

d)将c）中所得滤液，浓缩至比重为0.8-1.3，加入乙醇进行醇沉，离心，得到湿β-葡聚糖提取物，回收乙醇；具体的醇沉步骤为：向浓缩后的滤液中边搅拌边加入浓缩液体积1-5倍量乙醇使乙醇浓度为50-80%，静置8h以上，进行醇沉；

e）将d）中得到的湿β-葡聚糖提取物在真空度0.02MPa-0.10MPa条件下真空干燥，湿料厚度不高于5cm，干燥温度60-90℃，干燥40h-80h；

所述的虫草为蝙蝠蛾拟青霉。