CN113201522B - 一种蛋白酶的精制和干燥方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白酶的精制和干燥方法，该方法是先用钠盐溶液对粗制蛋白酶原料进行提取，提高蛋白酶的溶解度，再加入絮凝剂对蛋白酶溶液中的杂质进行絮凝沉淀后去除，得到较为纯净的蛋白酶提取液，随后依次采用袋式过滤法和微滤过滤法进一步对蛋白酶提取液进行过滤净化，然后利用超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的蛋白酶浓缩液，最后采用真空冷冻干燥机对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥。本发明中的蛋白酶精制方法简单、效率高，得到的蛋白酶纯度高、活性高且稳定，易于工业化生产。采用本发明的真空冷冻干燥方法及真空冷冻干燥机对蛋白酶浓缩液进行干燥，干燥速度快、能耗低、干燥率高，得到的蛋白酶产品酶活性高、酶活稳定性好、卫生质量好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是一种蛋白酶的精制和干燥方法。
背景技术
蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，能够有效将大分子的蛋白质分解为多肽及游离氨基酸。蛋白酶催化肽键水解的特性，使其成为了常用的工业用酶之一，主要应用在食品、制革、日化、饲料及医药等行业，在肉类加工、洗涤、皮革制造、提高动物营养、制药等领域中都发挥着重要的作用。目前蛋白酶的生产大多是粗提取，酶活低、酶活稳定性不好、卫生质量较差，得到的蛋白酶产品级别低，因此，需要一种能得到酶活高、稳定性好、卫生质量好的蛋白酶的精制方法，同时该方法又适合大规模工业化生产。
现有技术中常使用饱和硫酸铵溶液对蛋白酶进行盐析，将蛋白酶沉淀下来后经固液分离回收沉淀物得到蛋白酶。如专利申请CN103333873A中公开了②硫酸铵盐析：各取发酵液的离心上清液10L，边搅拌边缓慢添加经研磨过的硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度分别为30％～80％，缓慢搅拌20min后，4℃静置数小时。倾去上清液，5000r/min离心20min，取上清液测残余酶活，沉淀添加10～25mmol/L Tris-HCl-CaCl2，pH8.0缓冲液溶解。专利CN200810231714.8中公开了(6)盐析：将硫酸铵晶体磨成粉末，在冰浴条件下边搅拌边加入pH为7.8的粗蛋白酶溶液中，然后继续搅拌1h放置于4℃条件下4000r/min离心30min，收集沉淀，溶于定量缓冲液中。专利CN91103165.0公开了取成熟健康的丝兰麻叶片3.2千克，刮取绿色栅状组织0.97千克，榨取汁410毫升。汁水离心（2000转/分），取上清水加一倍无离子水后，称取汁水量8%的硫酸铵，慢慢加入汁水中搅拌至溶，并继续搅拌10分钟，室温静置4小时后离心（2000转/分），取上清水再加到50%饱和度的硫酸铵盐析，静置12小时离心（2000转/分），收集沉淀物得酶液0.082千克。酶液经真空冷冻干燥得精酶0.043千克，用DHT-酪蛋白法测活性为51300μ/克。专利CN108949617B8公开了于0℃下向粗酶液中加入硫酸铵至浓度达到其饱和溶液摩尔浓度的60％，4℃静置12h后，在4℃、10000r/min离心15min取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液(pH6.0) 溶解沉淀，在4℃、10000r/min离心15min，回收上清液。上述步骤盐析后所得上清液经透析除盐，上样至预先用pH 6.0、20mM磷酸盐缓冲液平衡好的阳离子交换层析柱Mono5/50GL，用含1mol/L NaCl磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集并合并具有蛋白酶活性的组分。硫酸铵具有溶解度大、温度系数小、不易使蛋白质变性等特性，使得硫酸铵沉淀法是蛋白质粗分离时很重要的一种技术，但是硫酸铵也存在一定的缺陷。首先硫酸铵容易吸潮、使用量大，在使用前一般要先磨碎等，使得工业化生产时不好操作。其次使用硫酸铵进行盐析是利用盐析沉淀现象，使蛋白质溶解度降低后沉淀析出，在进行盐析之前还需要先对蛋白质进行净化，否则得到的蛋白质沉淀物中杂质多，而且很难使蛋白质的溶解度降至零，蛋白质的收率难以提高。再者作为食品添加剂的蛋白酶，如枯草芽孢杆菌蛋白、地衣芽孢杆菌蛋白酶等，提纯的产品中如含有硫酸铵，会影响后续的使用。
生物酶通常有固体酶制剂及液体酶制剂两种。液体酶制剂因为酶在液体状态下容易失活保质期短，运输也不方便，所以一般对生物酶干燥后保存来延长其保质期。而且酶在高温条件下容易失活，因此在干燥时要注意温度，尽量让酶保持其活性不失活。现有技术通常采用喷雾干燥法、热风干燥法、真空冷冻干燥法、真空带式干燥法对液体酶制剂进行干燥。因真空冷冻干燥法能够很好地保护酶的活性，且干燥方法简单，真空冷冻干燥法又是液体酶制剂最常用的干燥方法，但现有的真空冷冻干燥机因存在进出料工作繁琐、隔层板温度不均匀、托盘导热不良好、冻干物料易受微生物污染等问题，容易影响物质真空冷冻干燥的效率、成本及产品质量。因此，如何对真空冷冻干燥机进行改进以提高其设备利用率也是生物酶加工工艺过程一个急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白酶的精制和干燥方法，本发明的精制方法简单、高效且易于工业化生产，得到的蛋白酶纯度高、活性高且稳定。采用本发明的真空冷冻干燥方法及真空冷冻干燥机对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，干燥速度快、能耗低、干燥率高，得到的蛋白酶酶活性高、酶活稳定性好、卫生质量好。
本发明的技术方案如下：
一种蛋白酶的精制和干燥方法，包括以下步骤：
（1）在常温下，将粗制蛋白酶原料和水加入到提取罐中，再将钠盐完全溶于水制成溶液后加入到提取罐中，搅拌80～100min，结束后静置35～45min。其中，加料完毕后，混合液中粗制蛋白酶原料和水的重量比为1:15～20，钠盐的质量百分比为1～1.5%。
（2）往步骤（1）得到的提取液中加入絮凝剂Ⅰ，静置絮凝8～12h；将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入离心机进行分离，回收分离液A。所述离心机优选卧式螺旋沉降离心机。
（3）往分离液A中加入适量水进行稀释，再加入絮凝剂Ⅱ静置絮凝1～3h，将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入离心机进行离心分离，回收分离液B。所述离心机优选卧式螺旋沉降离心机。
（4）再将分离液B用离心机进行分离，回收分离液C，对得到的分离液C和步骤（2）、（3）得到的上清液用袋式过滤器进行过滤，滤液再经过两级微滤过滤，回收微滤滤液经超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的蛋白酶浓缩液。所述离心机优选管式离心机。超滤过程除去的盐可以回收处理并作为工业原料使用。
（5）对真空冷冻干燥机的物料干燥舱及物料托盘进行消毒灭菌，将得到的蛋白酶浓缩液泵送至真空冷冻干燥机并均匀地分装在物料干燥舱内的物料托盘上，然后关闭并密封物料干燥舱，对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，得到水分含量为1～5%的冻干蛋白酶。
所述絮凝剂Ⅰ包括钠盐、钙盐；用量（质量百分比）为0.5～2%。所述絮凝剂Ⅱ包括钠盐、钙盐、聚丙烯酰胺；用量（质量百分比）为1～3%。
絮凝剂的添加方法是：先将絮凝剂各成分分别溶于水中制成溶液，溶液的浓度为饱和浓度或者比饱和浓度稍低以确保使其完全溶解，溶液温度控制在30℃以下，再将钠盐溶液、钙盐溶液、聚丙烯酰胺溶液依次在缓慢搅拌下添加。絮凝过程温度控制在23℃以内。
以上步骤（1）及絮凝剂中的钠盐是氯化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫代硫酸钠中一种以上。絮凝剂中的钙盐是氯化钙、硫酸钙中一种或者两种。
所述真空冷冻干燥机包括物料干燥舱、捕水器、制冷装置、抽真空装置和加热装置，制冷装置、抽真空装置和加热装置均设在物料干燥舱和捕水器的外部；物料干燥舱和捕水器之间通过管道连接，并与制冷装置相互连接；加热装置与物料干燥舱连接，抽真空装置与捕水器连接。
所述真空冷冻干燥机具体包括：包括进料泵、臭氧发生器、物料干燥舱、微波发生器、不冻液高位槽、冷热交换器、捕水器、放空阀、真空压力表、观察窗、真空调节装置、排水阀、罗茨真空泵、水环式真空泵、冷凝盘管、膨胀阀、电磁阀、循环泵、不冻液储罐、隔层板、冷凝器、油分离器、制冷压缩机、物料托盘。
物料干燥舱内部由隔层板将其分隔成若干层，上下层间距约8cm。每一层隔层板上均可放置物料托盘；所述物料托盘是在无底矩形框架里面铺上食品级塑料薄膜制成的软托盘。
所述物料托盘还包括食品级塑料薄膜的固定件；将食品级塑料薄膜铺在无底矩形框架里面形成物料托盘的底，并使食品级塑料薄膜高于无底矩形框架侧壁上边框，再通过固定件将在无底矩形框架内形成托盘状的食品级塑料薄膜固定住，从而得到更加稳固的物料托盘。该物料托盘利用无底矩形框架使食品级塑料薄膜形成托盘状，用于盛装物料并将物料与无底矩形框架完全隔开，并利用固定件使食品级塑料薄膜可以长时间保持托盘状。使用该物料托盘盛装物料进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥结束后，出料时取出整个托盘撤下固定件，因塑料薄膜质量轻，冻干完成后的产品与塑料薄膜易分离，用塑料薄膜包裹着物料拿出，出料便捷、效率高；且物料托盘底部为塑料薄膜能完全与隔层板接触，提高了冷、热量的传递效率。
所述无底矩形框架高15～20mm；无底矩形框架和固定件均由耐冷热的材料制成，例如无底矩形框架和固定件的材质可以是金属铝、不锈钢、纤维、塑料或复合材料等，优选不锈钢或铝合金。
所述食品级塑料薄膜为食品级一次性塑料薄膜，厚度为0.04～0.08mm，塑料薄膜的材质可以是聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺或聚酯等。
物料干燥舱前端设置有进料泵，能将物料送入物料干燥舱并均匀分装到物料托盘中，提高了进料速率，且自动化定量进料，物料分布更加均匀，真空冷冻干燥后得到的产品水分也更加稳定均衡，干燥率更高。
所述物料干燥舱内部周边还可以安装臭氧发生器和微波发生器，能对物料干燥舱的内舱体或物料进行消毒或干燥。利用微波对蛋白酶浓缩液杀菌，将冻干与微波、真空干燥三者联合，可以提高干燥速率且产品品质好。同时利用微波、臭氧对物料干燥舱和物料托盘进行消毒，消毒效果好，结合用食品级塑料薄膜将蛋白酶与无底矩形框架隔开，保证冻干品卫生指标合格。臭氧发生器和微波发生器可以单独使用或联合使用，臭氧发生器是用于制取臭氧气体（O3）的装置，可用于杀灭细菌、病毒等有害物质；微波发生器可以消灭细菌、病毒，也可以对设备内部和物料进行快速干燥。
所述抽真空装置包括罗茨真空泵、水环式真空泵，罗茨真空泵与捕水器通过管道连接，在罗茨真空泵与捕水器之间的管道上安装有真空压力表，水环式真空泵连接在罗茨真空泵的末端。所述罗茨真空泵是三级罗茨真空泵，用水环式真空泵给罗茨真空泵提供预备真空，再通过三台罗茨真空泵联用，可以大大提高机组的极限压力。
所述冷热交换器内有不冻液管道和制冷剂管道，不冻液走不冻液管道，制冷剂走制冷剂管道。所述隔层板内部设置有不冻液通道，冻干阶段物料制冷时，按不冻液的流向依次与外部的不冻液储罐、循环泵、冷热交换器内的不冻液管道循环连接；循环泵能够将不冻液储罐中的不冻液泵送至冷热交换器经过冷热交换制冷后送至隔层板内，不冻液在隔层板内经过与物料冷热交换后回到不冻液储罐。循环泵出口处还设有与隔层板内部不冻液通道直接连通的管道，不冻液储罐上安装有电加热器，干燥阶段加热时，隔层板内部不冻液通道与不冻液储罐、循环泵循环连接；不冻液经电加热器加热后经由循环泵直接送到隔层板内部不冻液通道，在隔层板内部不冻液通道经与物料进行冷热交换后回到不冻液储罐。不冻液储罐前端设置了不冻液高位槽，通过不冻液高位槽给不冻液储罐补充不冻液。
所述冷热交换器内的制冷剂管道按制冷剂的走向依次与制冷压缩机、油分离器、冷凝器循环连接，并通过膨胀阀和电磁阀控制，在物料冷冻阶段，制冷剂在冷热交换器、制冷压缩机、油分离器、冷凝器之间循环流动给不冻液制冷。
所述捕水器内设置有冷凝盘管，冷凝盘管按制冷剂的走向依次与制冷压缩机、油分离器、冷凝器循环连接，并通过膨胀阀和电磁阀控制，在物料干燥阶段，制冷剂在冷凝盘管、制冷压缩机、油分离器、冷凝器之间循环流动使得捕水器内的冷凝盘管降温。
在物料托盘和冷凝盘管上均安装有温度检测探头，通过温度检测探头检测到的温度反应物料干燥过程的温度变化和冷凝盘管的温度变化情况。
在物料干燥舱内安装有真空检测探头，在捕水器上设置有真空调节装置；可以根据真空检测探头检测到的真空度，利用真空调节装置调节物料干燥舱和捕水器内的真空度。
物料干燥舱和捕水器上均设置有观察窗；在捕水器外层顶部设置有放空阀，底部设置有排水阀。
所述对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥分2个阶段进行：
第一阶段：进料完毕密封好物料干燥舱后开始制冷；先对蛋白酶浓缩液进行预冻2h以上，使物料干燥舱内的温度降至-30～-40℃；
第二阶段：待物料内水分完全结冰冻透后，对物料干燥舱进行抽真空，当物料干燥舱真空度达40～100Pa后，开始对物料进行加热，使物料中的水分在真空条件下升华除去；当物料温度与物料干燥舱内的真空度达到工艺要求时，真空冷冻干燥结束。所述工艺要求是能使冻干品水分含量降至1～5%时所对应的物料温度与物料干燥舱内的真空度，物料温度与物料干燥舱内的真空度根据前期试验设定。
所述蛋白酶包括枯草芽杆菌蛋白酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶。
本发明的有益效果是：
1.在本发明的精制方法中，先用钠盐溶液对粗制蛋白酶原料进行提取，提高蛋白酶的溶解度，再加入絮凝剂对蛋白酶溶液中的杂质进行絮凝沉淀后去除，得到较为纯净的蛋白酶提取液，随后依次采用袋式过滤法和微滤过滤法进一步对蛋白酶提取液进行过滤净化，最后运用超滤方法进行浓缩、除盐，得到纯净的蛋白酶浓缩液。可见，本发明的精制方法是利用盐溶现象提取蛋白酶并除去溶液中的杂质，方法简单、收率高，得到纯度高、酶活性以及酶活稳定性也高的蛋白酶。
2.本发明对于蛋白酶提取液的絮凝净化分两步进行，先加入絮凝剂Ⅰ静置絮凝8～12h，将上清液分离出来后，下浊液采用卧式螺旋沉降离心机进行固液分离，卧式螺旋沉降离心机进料的固液浓度可高达40～60%，出渣顺利，不会堵，分离液较清，整个过程无需洗机，减少了停机操作，可以连续进行固液分离，下浊液在进入卧式螺旋沉降离心机之前先储存在下浊液储槽中以均衡浓度，避免因进料浓度不均影响卧式螺旋沉降离心机的分离效果，同时可调控进料流量，提高分离效率。二次絮凝时还加入了聚丙烯酰胺，加快了沉淀的速度。二次絮凝后再次分离出上清液，下浊液也采用卧式螺旋沉降离心机进行分离，分离得到的分离液通过管式离心机再进行分离回收分离液，多次对蛋白酶提取液进行分离并回收分离液，提高了提取液的纯净度，同时满足后工序微滤、超滤的工艺要求，避免微滤膜、超滤膜堵塞。回收的上清液和分离液再经过袋式过滤器过滤，既可以得到纯净的提取液，也避免了提取液大颗粒物质对微滤膜的损害，提高了微滤膜的使用寿命，然后再经过两级微滤过滤法进行过滤，分级分步进行过滤，这样得到更为纯净的提取液，最后再利用超滤膜进行浓缩、除盐，得到的蛋白酶浓缩液中蛋白酶纯度高、粒度均一、活性损伤率低。
3.本发明所使用的真空冷冻干燥机进料方式采用泵送进料，减少人工，缩短进料时间，每托物料重量准确、分布均匀、干燥率高。物料托盘采用在无底矩形框架里面铺上食品级一次性塑料薄膜制成的软托盘，蛋白酶浓缩液与无底矩形框架完全不接触，出料时取出整个托盘撤下固定件，因塑料薄膜质量轻，冻干完成后的产品与塑料薄膜易分离，用塑料薄膜包裹着物料拿出即可，出料便捷、效率高。用食品级塑料薄膜代替不锈钢托盘底板，食品级塑料薄膜的厚度薄、耐高/低温性能好，直接与隔层板接触，冷/热量的传导效率高，能有效解决因不锈钢底板太厚或变形造成导热不良或不均的问题；且食品级塑料薄膜几乎不粘蛋白酶，可降低因蛋白酶粘托盘造成的损失以及因借助机械作用使蛋白酶与托盘分离对蛋白酶形成的损伤，能有效提高蛋白酶冷冻干燥的收率。
4.在物料干燥舱内安装微波发生器和臭氧发生器，在投入物料前，可以利用微波、臭氧消毒物料干燥舱内舱体，进行灭菌，使物料干燥设备及干燥得到的物料达到食品级卫生指标要求，解决了冻干品易污染的问题，在干燥阶段，也可以采用适当的微波功率、温度对物料进行快速干燥。利用微波加热，解决了热传导速度缓慢、能耗大、效率低及温度不均匀等问题；将冻干和真空微波干燥联合起来，取长补短，提高了产品品质，缩短了干燥时间，降低了能耗。微波、臭氧单独或者共同消毒，使物料干燥设备及干燥得到的蛋白酶能达到食品级卫生指标要求，解决了冻干品易受污染而卫生不合格的问题。可见，采用本发明的真空冷冻干燥方法及真空冷冻干燥机对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，干燥速度快、效果好、能耗低，得到的蛋白酶符合卫生指标要求且活性高、稳定性好，物料的干燥率能达到95～100%。
附图说明
图1是真空冷冻干燥机的结构示意图；
图2是图1中Ⅰ处的局部放大图；
图3是无底矩形框架的一种结构示意图；
图4是无底矩形框架的一种结构示意图；
图5是固定件的一种结构示意图；下端框架部分可套在无底矩形框架侧壁上端里面，上端薄板压在无底矩形框架的侧壁顶端，以压实食品级塑料薄膜；
图6是固定件的一种结构示意图，使用时将其卡槽倒扣在无底矩形框架侧壁顶端压实食品级塑料薄膜即可；
图7是图6的固定件的仰视图；
图8是在图3的无底矩形框架里面铺上食品级塑料薄膜，再用图5的固定件对食品级塑料薄膜固定后形成的稳固的物料托盘的结构示意图；
图9是图8中A-A处的断面图。
图中标识：1-进料泵、2-臭氧发生器、3-物料干燥舱、4-微波发生器、5-不冻液高位槽、6-冷热交换器、7-捕水器、8-放空阀、9-真空压力表、10-观察窗、11-真空调节装置、12-排水阀、13-罗茨真空泵、14-水环式真空泵、15-冷凝盘管、16A和16B-膨胀阀、17A和17B -电磁阀、18-循环泵、19-不冻液储罐、20-隔层板、21-冷凝器、22-油分离器、23-制冷压缩机、24-物料托盘、241-不锈钢框架、242-食品级塑料薄膜、243-固定件。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1
一种枯草芽孢杆菌蛋白酶的精制和干燥方法，包括以下步骤：
（1）在常温下，将外购回来的粗制枯草芽孢杆菌蛋白酶原料和水加入到提取罐中，再将氯化钠完全溶于水制成溶液后加入到提取罐中，搅拌提取95min，提取温度控制在19.5～22.5℃之间，结束后静置40min；其中，加料完毕后，混合液中蛋白酶原料和水的重量比1:17，氯化钠的质量百分比为1%。
（2）往步骤（1）得到的提取静置液中加入絮凝剂Ⅰ，絮凝剂Ⅰ包括氯化钠、氯化钙，其中氯化钠、氯化钙的添加量（质量百分比）分别为1.0%、0.8%。先将氯化钠、氯化钙分别溶于水中制成溶液，溶液温度控制在30℃以下。在缓慢搅拌（频率为8 Hz）下添加絮凝剂Ⅰ，加料顺序为：加入氯化钠溶液，搅拌5min后，加入氯化钙溶液，继续搅拌5min后，静置絮凝8～12h；絮凝过程温度控制在23℃以内。将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入卧式螺旋沉降离心机进行离心分离，回收分离液A。
（3）往分离液A中加入15～20%水进行稀释，去除液面泡沫，再加入絮凝剂Ⅱ，絮凝剂Ⅱ包括氯化钠、氯化钙、聚丙烯酰胺，其中氯化钠、氯化钙、聚丙烯酰胺的添加量（质量百分比）分别为0.6%、0.6%、0.5～0.6%。先将氯化钠、氯化钙、聚丙烯酰胺分别溶于水中制成溶液，溶液温度控制在30℃以下。在缓慢搅拌（频率为8 Hz）下添加絮凝剂Ⅱ，加料顺序为：加入氯化钠溶液，搅拌5min后，加入氯化钙溶液，继续搅拌5min后静置5min，再继续搅拌并加入聚丙烯酰胺溶液，待出现大块豆腐花状絮凝物时停止搅拌，静置絮凝1～3h，絮凝过程温度控制在23℃以内。将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入卧式螺旋沉降离心机进行分离，回收分离液B。
（4）再将分离液B用管式离心机进行分离，回收分离液C，对得到的分离液C和步骤（2）、（3）得到的上清液用袋式过滤器进行过滤，滤液再经过两级微滤过滤，回收微滤滤液经超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液。
（5）对真空冷冻干燥机的物料干燥舱进行消毒灭菌，将得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液泵送至真空冷冻干燥机并均匀地分装在物料干燥舱内的物料托盘上，然后关闭并密封物料干燥舱，对枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，得到水分含量为1～5%的冻干枯草芽孢杆菌蛋白酶。
所述对枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行真空微波冷冻干燥分2个阶段进行：
第一阶段：进料完毕密封好物料干燥舱后开始制冷；先对枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行预冻2h以上，使物料干燥舱内的温度降至-30～-40℃；
第二阶段：待物料内水分完全结冰冻透后，对物料干燥舱进行抽真空，当物料干燥舱真空度达40～100Pa后，开始对物料进行加热，使物料中的水分在真空条件下升华除去；当物料温度与物料干燥舱内的真空度达到工艺要求时，真空冷冻干燥结束。
外购粗制枯草芽孢杆菌蛋白酶原料的酶活：7.0万u/g，第一次静置絮凝后分离得到的上清液酶活：3900～4100u/mL，第二次静置絮凝后分离得到的上清液酶活：3300～3600u/mL，超滤透过水酶活：＜100u/mL，经真空冷冻干燥后得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶酶活：85～90万u/g。
实施例2
一种枯草芽孢杆菌蛋白酶的精制和干燥方法，包括以下步骤：
（1）在常温下，将外购回来的粗制枯草芽孢杆菌蛋白酶原料和水加入到提取罐中，再将硫酸钠完全溶于水制成溶液后加入到提取罐中，搅拌提取95min，提取温度控制在19.5～22℃之间，提取结束后静置40min；其中，加料完毕后，混合液中蛋白酶原料和水的重量比1:17，硫酸钠的质量百分比为1%。
（2）往步骤（1）得到的提取静置液中加入絮凝剂Ⅰ，絮凝剂Ⅰ包括硫酸钠、硫酸钙，其中硫酸钠、硫酸钙的添加量分别为1.0%、0.8%。先将硫酸钠、硫酸钙分别溶于水中制成溶液，溶液温度控制在30℃以下。在缓慢搅拌（频率为8 Hz）下添加絮凝剂Ⅰ，加料顺序为：加入硫酸钠溶液，搅拌5min后，加入硫酸钙溶液，继续搅拌5min后，静置絮凝8～12h；絮凝过程温度控制在23℃以内。将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入卧式螺旋沉降离心机进行分离，回收分离液A。
（3）往分离液A中加入15～20%水进行稀释，去除液面泡沫，再加入絮凝剂Ⅱ，絮凝剂Ⅱ包括硫酸钠、硫酸钙、聚丙烯酰胺，其中硫酸钠、硫酸钙、聚丙烯酰胺的添加量（质量百分比）分别为0.6～0.8%、0.6%、0.25～0.5%。先将硫酸钠、硫酸钙、聚丙烯酰胺分别溶于水中制成溶液，溶液温度控制在30℃以下。在缓慢搅拌（频率为8 Hz）下添加絮凝剂Ⅱ，加料顺序为：加入硫酸钠溶液，搅拌5min后，加入硫酸钙溶液，继续搅拌5min后静置5min，再继续搅拌并加入聚丙烯酰胺溶液，待出现大块豆腐花状絮凝物时停止搅拌，静置絮凝1～3h，絮凝过程温度控制在23℃以内。将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入卧式螺旋沉降离心机进行分离，回收分离液B。
（4）再将分离液B用管式离心机进行分离，回收分离液C，对得到的分离液C和步骤（2）、（3）得到的上清液用袋式过滤器进行过滤，滤液再经过两级微滤过滤，回收微滤滤液经超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液。
（5）对真空冷冻干燥机的物料干燥舱进行消毒灭菌，将得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液泵送至真空冷冻干燥机并均匀地分装在物料干燥舱内的物料托盘上，然后关闭并密封物料干燥舱，对枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，得到水分含量为1～5%的冻干枯草芽孢杆菌蛋白酶。
所述对枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行真空微波冷冻干燥分2个阶段进行：
第一阶段：进料完毕密封好物料干燥舱后开始制冷；先对枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行预冻2h以上，使物料干燥舱内的温度降至-30～-40℃；
第二阶段：待物料内水分完全结冰冻透后，对物料干燥舱进行抽真空，当物料干燥舱真空达40～100Pa后，对物料进行加热，使物料中的水分在真空条件下升华除去；当物料温度与物料干燥舱内的真空度达到工艺要求时，真空冷冻干燥结束。
外购粗制枯草芽孢杆菌蛋白酶原料的酶活：7.6万u/g，第一次静置絮凝后分离得到的上清液酶活：4000～4200u/mL，第二次静置絮凝后分离得到的上清液酶活：3400～3700u/mL，超滤透过水酶活：＜100u/mL，经冷冻干燥后得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶酶活：88～92万u/g。
实施例3
一种地衣芽孢杆菌蛋白酶的精制和干燥方法，包括以下步骤：
（1）在常温下，将外购回来的粗制地衣芽孢杆菌蛋白酶原料和水加入到提取罐中，再将硫酸钠完全溶于水制成溶液后加入到提取罐中，搅拌提取80min，提取温度控制在21～22℃之间，提取结束后静置40min；其中，加料完毕后，混合液中蛋白酶原料和水的重量比1:20，硫酸钠的质量百分比为1.1%。
（2）往步骤（1）得到的提取静置液中加入絮凝剂Ⅰ，絮凝剂Ⅰ包括硫酸钠、硫酸钙，其中硫酸钠、硫酸钙的添加量（质量百分比）分别为1.1%、0.9%。先将硫酸钠、硫酸钙分别溶于水中制成溶液，溶液温度控制在30℃以下。在缓慢搅拌（频率为8 Hz）下添加絮凝剂Ⅰ，加料顺序为：加入硫酸钠溶液，搅拌5min后，加入硫酸钙溶液，继续搅拌5min后，静置絮凝8～12h；絮凝过程温度控制在23℃以内。将上清液分离到储罐中，下浊液经搅拌均匀后送入卧式螺旋沉降离心机进行分离，回收分离液A。
（3）往分离液A中加入15～20%水进行稀释，去除液面泡沫，再加入絮凝剂Ⅱ，絮凝剂Ⅱ包括硫酸钠、硫酸钙、聚丙烯酰胺，其中硫酸钠、硫酸钙、聚丙烯酰胺的添加量（质量百分比）分别为0.6%、0.6%、0.33%。先将硫酸钠、硫酸钙、聚丙烯酰胺分别溶于水中制成溶液，溶液温度控制在30℃以下。在缓慢搅拌（频率为8 Hz）下添加絮凝剂Ⅱ，加料顺序为：加入硫酸钠溶液，搅拌5min后，加入硫酸钙溶液，继续搅拌5min后静置5min，再继续搅拌并加入聚丙烯酰胺溶液，待出现大块豆腐花状絮凝物时停止搅拌，加入少量水，静置絮凝1～3h，絮凝过程温度控制在23℃以内。将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入卧式螺旋沉降离心机进行分离，回收分离液B。
（4）再将分离液B用管式离心机进行分离，回收分离液C，对得到的分离液C和步骤（2）、（3）得到的上清液用袋式过滤器进行过滤，滤液再经过两级微滤过滤，回收微滤滤液经超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的地衣芽孢杆菌蛋白酶浓缩液。
（5）对真空冷冻干燥机的物料干燥舱进行消毒灭菌，将得到的地衣芽孢杆菌蛋白酶浓缩液泵送至真空冷冻干燥机并均匀地分装在物料干燥舱内的的物料托盘上，然后关闭并密封物料干燥舱，对地衣芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，得到水分含量为1～5%的冻干地衣芽孢杆菌蛋白酶。
所述对地衣芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行真空微波冷冻干燥分2个阶段进行：
第一阶段：进料完毕密封好物料干燥舱后开始制冷；先对地衣芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行预冻2h以上，使物料干燥舱内的温度降至-30～-40℃；
第二阶段：待物料内水分完全结冰冻透后，对物料干燥舱进行抽真空，当物料干燥舱真空度达40～100Pa后，对物料进行加热，使物料中的水分在真空条件下升华除去；当物料温度与物料干燥舱内的真空度达到工艺要求时，真空冷冻干燥结束。
外购粗制地衣芽孢杆菌蛋白酶原料的酶活：20～21万u/g，第一次静置絮凝后分离得到的上清液酶活：11000～12000u/mL，第二次静置絮凝后分离得到的上清液酶活：8000～9000u/mL，超滤透过水酶活：＜100u/mL，经冷冻干燥后得到的地衣芽孢杆菌蛋白酶酶活：170～190万u/g。
为了验证本发明的蛋白酶的精制和干燥方法的效果，本申请人进行了以下对比试验：
实施例4
一种枯草芽孢杆菌蛋白酶的精制方法，包括以下步骤：
（1）在常温下，将外购回来的粗制枯草芽孢杆菌蛋白酶原料（100kg）和水加入到提取罐中，再将氯化钠完全溶于水制成溶液后加入到提取罐中，搅拌提取95min，提取温度控制在19.5～22.5℃之间，提取结束后静置40min；其中，加料完毕后，混合液中蛋白酶原料和水的重量比1:17，氯化钠的质量百分比为1%。
（2）往步骤（1）得到的提取液中加入絮凝剂Ⅰ，絮凝剂Ⅰ包括氯化钠、氯化钙，其中氯化钠、氯化钙的添加量（质量百分比）分别为1.0%、0.8%。先将氯化钠、氯化钙分别溶于水中制成饱和溶液，溶液温度控制在30℃以下。在缓慢搅拌（频率为8 Hz）下添加絮凝剂Ⅰ，加料顺序为：加入氯化钠溶液，搅拌5min后，加入氯化钙溶液，继续搅拌5min后，静置絮凝10h；絮凝过程温度控制在20～23℃。将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入卧式螺旋沉降离心机进行离心分离，回收分离液A。
（3）往分离液A中加入18%水进行稀释，去除液面泡沫，再加入絮凝剂Ⅱ，絮凝剂Ⅱ包括氯化钠、氯化钙、聚丙烯酰胺，其中氯化钠、氯化钙、聚丙烯酰胺的添加量（质量百分比）分别为0.6%、0.6%、0.6%。先将氯化钠、氯化钙、聚丙烯酰胺分别溶于水中制成溶液，溶液温度控制在30℃以下。在缓慢搅拌（频率为8 Hz）下添加絮凝剂Ⅱ，加料顺序为：加入氯化钠溶液，搅拌5min后，加入氯化钙溶液，继续搅拌5min后静置5min，再继续搅拌并加入聚丙烯酰胺溶液，待出现大块豆腐花状絮凝物时停止搅拌，静置絮凝2h，絮凝过程温度控制在23℃以内。将上清液分离出来，储存在上清液储罐中；下浊液先移至下浊液储槽中，经搅拌均匀后送入卧式螺旋沉降离心机进行分离，回收分离液B。
（4）再将分离液B用管式离心机进行分离，回收分离液C，对得到的分离液C和步骤（2）、（3）得到的上清液用袋式过滤器进行过滤，滤液再经过两级微滤过滤，回收微滤滤液经超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液。
实施例5
一种枯草芽孢杆菌蛋白酶的精制方法，包括以下步骤：
（1）在常温下，将外购回来的粗制枯草芽孢杆菌蛋白酶原料（100kg）和水加入到提取罐中，再将氯化钠完全溶于水制成溶液后加入到提取罐中，搅拌提取95min，提取温度控制在19.5～22.5℃之间，提取结束后静置40min；其中，加料完毕后，混合液中蛋白酶原料和水的重量比1:17，氯化钠的质量百分比为1%。
（2）将硫酸铵研磨成细粉末，在缓慢搅拌（搅拌频率为8 Hz）下，往步骤（1）得到的提取液中加入硫酸铵混合均匀（使得混合液中硫酸铵的重量浓度为45%），在4℃下沉淀8h，然后在4℃下10000r/min离心20min，弃去上清液并收集沉淀。
（3)将以上得到的沉淀加入到质量浓度为1%的氯化钠溶液中重新进行溶解，在缓慢搅拌（频率为8 Hz）下，往溶解液中加入硫酸铵混合均匀（使得混合液中硫酸铵的重量浓度为60%），在4℃下沉淀8h，然后在4℃下10000r/min离心20min，弃去上清液并收集沉淀。
（4）将步骤（3）得到的沉淀溶于蒸馏水中，先采用袋式过滤器进行过滤，滤液再经两级微滤过滤，回收微滤滤液经超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液。
将实施例4和实施例5制备得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液（收率、纯度、酶活损失）进行对比，结果如下表1所示：
实施例6
一种枯草芽孢杆菌蛋白酶的干燥方法，包括以下步骤：
对真空冷冻干燥机的物料干燥舱进行消毒，将实施例4得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液泵送至真空冷冻干燥机，并均匀地分装在物料干燥舱内的物料托盘上，然后关闭并密封物料干燥舱，对枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥。以上干燥方法使用本发明介绍的真空冷冻干燥机，但使用两种类型的物料托盘装物料，一种为本发明介绍的物料托盘（结构示意图如图7所示，无底矩形框架和固定件的材质均为不锈钢），另一种为市售真空冷冻干燥机专用不锈钢托盘（有底的矩形不锈钢托盘）。每种类型的物料托盘盛装的枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液总量几乎相同。
所述对枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥分2个阶段进行：
第一阶段：进料完毕密封好物料干燥舱后开始制冷；先对蛋白酶浓缩液进行预冻2h以上，使物料干燥舱内的温度降至-30℃；
第二阶段：待物料内水分完全结冰冻透后，对物料干燥舱进行抽真空，当物料干燥舱真空度达60Pa后，对物料进行加热，使物料中的水分在真空条件下升华除去；当物料干燥舱内真空度到达124～126Pa，且所有的物料托盘中有2/3的物料托盘内物料温度达到44.5℃以上时，关闭不冻液循环泵、罗茨真空泵、水环式真空泵，最后关闭制冷压缩机，待物料干燥舱内的真空度降至真空35Pa时，在洁净条件下出料。
对经真空冷冻干燥后得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶干粉分别进行称重，检测真空冷冻干燥后枯草芽孢杆菌蛋白酶干粉的干燥率，并检测所得枯草芽孢杆菌蛋白酶的酶活，结果如下表2所示：
实施例7
本申请人还同时采用本发明介绍的真空冷冻干燥机（25m2）与杭州创意真空冷冻干燥设备厂销售的真空冷冻干燥机（25m2）对实施例4得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶浓缩液进行了真空冷冻干燥。对经冷冻干燥后得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶干粉分别进行称重，检测真空冷冻干燥后枯草芽孢杆菌蛋白酶干粉的干燥率，并检测所得枯草芽孢杆菌蛋白酶的酶活，结果如下表3所示：
以上实施例1～3、6～7所述本发明介绍的真空冷冻干燥机包括进料泵1，臭氧发生器2，物料干燥舱3，微波发生器4，不冻液高位槽5，冷热交换器6，捕水器7，放空阀8，真空压力表9，观察窗10，真空调节装置11，排水阀12，罗茨真空泵13，水环式真空泵14，冷凝盘管15，膨胀阀16A和16B，电磁阀17A和17B，循环泵18，不冻液储罐19，隔层板20，冷凝器21，油分离器22，制冷压缩机23，物料托盘24。真空冷冻干燥机的结构示意图（见图1）。
所述物料干燥舱3内部由隔层板20将其分隔成若干层，上下层间距为8cm。每一层隔层板上均可放置物料托盘24；所述物料托盘24是在无底矩形框架241里面铺上食品级塑料薄膜242制成的软托盘。所述物料托盘24还包括食品级塑料薄膜242的固定件243；将食品级塑料薄膜242铺在无底矩形框架241里面形成物料托盘24的底，并使食品级塑料薄膜242高于无底矩形框架241侧壁上边框，再通过固定件243将在无底矩形框架241内形成托盘状的食品级塑料薄膜242固定住，从而得到更加稳固的物料托盘24。物料托盘的一种结构示意图如图8所示。
所述无底矩形框架高15～20mm；无底矩形框架和固定件均由不锈钢材料制成，无底矩形框架其中两个样式的结构示意图如图3、4所示，固定件其中两个样式的结构示意图如图5、6所示。
所述食品级塑料薄膜为食品级一次性塑料薄膜，厚度为0.04～0.08mm，塑料薄膜的材质可以是聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺或聚酯等。以上实施例6、7优选聚乙烯。
物料干燥舱3前端设置有进料泵1，能将蛋白酶泵入物料干燥舱并均匀分装到物料托盘中，提高了进料速率，且自动化定量进料，蛋白酶分布更加均匀，冷冻干燥后得到的蛋白酶水分也更加均衡，干燥率更高。
所述冷热交换器6内有不冻液管道和制冷剂管道。所述隔层板20内部设置有不冻液通道，按不冻液的流向依次与外部的不冻液储罐19、循环泵18、冷热交换器6内的不冻液管道循环连接；循环泵18能够将不冻液储罐19中的不冻液泵送至冷热交换器6内的不冻液管道经过冷热交换制冷后送至隔层板20内，不冻液在隔层板20内经过冷冻物料后回到不冻液储罐19；循环泵18出口处还设有与隔层板20内部不冻液通道直接连通的管道。不冻液储罐19前端还设置了不冻液高位槽5，通过不冻液高位槽给不冻液储罐补充不冻液。不冻液储罐19上安装有电加热器，用于对不冻液加热。加热阶段，隔层板20内部不冻液通道与不冻液储罐19、循环泵18循环连接；不冻液经电加热器加热后经由循环泵直接送到隔层板内部不冻液通道，在隔层板内部不冻液通道经与物料进行冷热交换后回到不冻液储罐。
所述冷热交换器6内制冷剂管道按制冷剂的走向依次与制冷压缩机23、油分离器22、冷凝器21循环连接，并通过膨胀阀16B和电磁阀17B控制。
所述捕水器7内设置有冷凝盘管15，冷凝盘管15按制冷剂的走向依次与制冷压缩机23、油分离器22、冷凝器21循环连接，并通过膨胀阀16A和电磁阀17A控制。
所述物料干燥舱3内顶部中间安装有微波发生器4，微波发生器4的两侧安装有臭氧发生器2，可利用微波对蛋白酶加热、杀菌，将冻干与微波、真空干燥三者联合，可以提高干燥速率且产品品质好。利用微波、臭氧对物料干燥舱3和物料托盘24进行消毒灭菌，消毒灭菌效果好，结合用食品级塑料薄膜242将蛋白酶与无底矩形框架241隔开，解决了冻干物料容易被污染而导致冻干品卫生指标不合格问题。
所述罗茨真空泵13与捕水器7通过管道连接，真空压力表9安装在罗茨真空泵13与捕水器7之间的管道上，水环式真空泵14连接在罗茨真空泵13的末端。所述罗茨真空泵是三级罗茨真空泵。
在物料托盘24和冷凝盘管15上均安装有温度检测探头，通过温度检测探头检测到的温度反映蛋白酶干燥过程的温度变化和冷凝管冷凝情况。
在物料干燥舱3内安装有真空检测探头，在捕水器7上设置有真空调节装置11；可以根据真空检测探头检测到的真空度，利用真空调节装置11调节物料干燥舱3和捕水器7内的真空度。
物料干燥舱3和捕水器7上均设置有观察窗10；在捕水器7外层顶部设置有放空阀8，底部设置有排水阀12。
Claims (5)
1.一种蛋白酶的精制和干燥方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）在常温下，将粗制蛋白酶原料和水加入到提取罐中，再将钠盐完全溶于水制成溶液
后加入到提取罐中，搅拌80～100min，结束后静置35～45min；其中，加料完毕后，混合液中粗制蛋白酶原料和水的重量比为1:15～20，钠盐的质量百分比为1～1 .5%；
（2）往步骤（1）得到的提取液中加入絮凝剂Ⅰ，静置絮凝8～12h；将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入离心机进行分离，回收分离液A；
（3）往分离液A中加入适量水进行稀释，再加入絮凝剂Ⅱ静置絮凝1～3h，将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入离心机进行分离，回收分离液B；
（4）再将分离液B用离心机进行分离，回收分离液C，对得到的分离液C和步骤（2）、（3）得到的上清液用袋式过滤器进行过滤，滤液再经过两级微滤过滤，回收微滤滤液经超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的蛋白酶浓缩液；
（5）对真空冷冻干燥机的物料干燥舱及物料托盘进行消毒灭菌，将得到的蛋白酶浓缩液用泵送至真空冷冻干燥机并均匀地分装在物料干燥舱内的物料托盘上，然后关闭并密封物料干燥舱，对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，得到水分含量为1～5%的冻干蛋白酶；
所述絮凝剂Ⅰ包括钠盐、钙盐；所述絮凝剂Ⅱ包括钠盐、钙盐、聚丙烯酰胺；
所述蛋白酶的精制和干燥方法，絮凝剂的添加方法是：先将絮凝剂各成分分别溶于水中制成溶液，溶液温度控制在30℃以下，再将钠盐溶液、钙盐溶液、聚丙烯酰胺溶液依次在缓慢搅拌下添加；絮凝过程温度控制在23℃以内；
所述真空冷冻干燥机包括物料干燥舱、捕水器、制冷装置、抽真空装置和加热装置，制冷装置、抽真空装置和加热装置均设在物料干燥舱和捕水器的外部；物料干燥舱和捕水器之间通过管道连接，并与制冷装置相互连接；加热装置与物料干燥舱连接，抽真空装置与捕水器连接；
所述物料干燥舱内部由隔层板将其分隔成若干层，每一层隔层板上均可放置物料托盘；所述物料托盘是在无底矩形框架里面铺上食品级塑料薄膜制成的软托盘；所述物料托盘还包括食品级塑料薄膜的固定件；将食品级塑料薄膜铺在无底矩形框架里面形成物料托盘的底，并使食品级塑料薄膜高于无底矩形框架侧壁上边框，再通过固定件将在无底矩形框架内形成托盘状的食品级塑料薄膜固定住，从而得到更加稳固的物料托盘；
所述物料干燥舱内部周边安装有能对物料干燥舱的内舱体或物料进行消毒或干燥的臭氧发生器和微波发生器。
2.根据权利要求1所述蛋白酶的精制和干燥方法，其特征在于，所述物料干燥舱前端设置有进料泵，能将蛋白酶浓缩液送入物料干燥舱并均匀分装到物料托盘中。
3.根据权利要求1所述蛋白酶的精制和干燥方法，其特征在于，所述抽真空装置包括罗茨真空泵、水环式真空泵，罗茨真空泵与捕水器通过管道连接，在罗茨真空泵与捕水器之间的管道上安装有真空压力表，水环式真空泵连接在罗茨真空泵的末端。
4.根据权利要求1所述蛋白酶的精制和干燥方法，其特征在于，所述对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥分2个阶段进行：
第一阶段：进料完毕密封好物料干燥舱后开始制冷；先对蛋白酶浓缩液进行预冻，使物料干燥舱内的物料温度降至-30～-40℃；
第二阶段：待物料内水分完全结冰冻透后，对物料干燥舱进行抽真空，当物料干燥舱真空度达40～100Pa后，对物料进行加热，使物料中的水分在真空条件下升华除去；当物料温度与物料干燥舱内的真空度达到工艺要求时，真空冷冻干燥结束。
5.根据权利要求1～4任意一项所述蛋白酶的精制和干燥方法，其特征在于，所述蛋白酶包括枯草芽孢杆菌蛋白酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶。
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