CN114277019B - 一种重组蛋白酶k的冻干工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组蛋白酶K的冻干工艺，包括以下步骤：S1、对蛋白酶k溶液进行纯化，并对蛋白酶k溶液进行浓缩；S2、加入等比例的蛋白酶冻干保存液；S3、进行冻干程序：首先加入蛋白酶溶液进行预冻，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在‑25～‑15℃保持0.5‑1.5h，在‑15～‑5℃保持5‑7h，在‑5～5℃保持3‑5h，在0‑10℃保持1～3h，在5～15℃保持1‑3h，在10‑20℃保持7～9h；结束后冻干完成。本发明提供的重组蛋白酶K的冻干工艺操作简单、成本低廉、冻干时间短，产品易溶解且保质期长。
Description
技术领域
本发明涉及酶的冻干技术领域，具体涉及一种重组蛋白酶K的冻干工艺。
背景技术
蛋白酶K最早于1974年在林伯式白色念球菌(tritirachiumalbumlimber)的提取物中发现，由于该酶能够消化富含二硫键的天然角蛋白(Keratin)，能够以角蛋白作为唯一的碳源和氮源生长，蛋白酶K也由此得名。
蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，其具有蛋白水解酶活性，对天然蛋白质有广谱的切割能力，偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸，特别是丙氨酸的羧基端肽键。
蛋白酶K在一系列广泛的环境中均能保持活性，在pH4-12.5、高盐缓冲液及70℃的环境下也有活性，且能与变性剂和去污剂(如尿素、SDS、盐酸胍、异硫氰酸胍、Triton和Tween)等兼容，且在一定浓度内，这些变性剂和去污剂能使蛋白酶K的活性得以提升。在医疗(病毒与微生物消杀)、食品(肉类嫩化)、皮革(毛发软化)、酿酒(酒类澄清)、氨基酸制备(降解羽毛)、核酸提取、原位杂交等方面，蛋白酶K均有应用。
随着蛋白酶K需求量的日益增大，其大规模生产显得尤为重要。具体地，蛋白酶K的大规模生产包括发酵、菌液分离、过滤、纯化、冻干和分装等过程。冻干工艺的成熟与否，直接影响到蛋白酶k制剂的使用性能和保存时间。对于蛋白酶k的保存，运输有着极其重要的意义。
蛋白酶K冻干工艺的报道不多，早期冻干工艺中的复刻发现，冻干时间长，复溶溶解性差，冻干粉易吸潮，不利于长期保存；综上所述，研究开发一种操作简单、成本低廉、冻干时间短，产品易溶解且保质期长的冻干工艺，并将其应用到重组蛋白酶K的工业化冻干中，显得尤为重要，是本领域技术人员亟需解决的关键技术问题。针对上述情况，本申请提出了一种重组蛋白酶K的冻干工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组蛋白酶K的冻干工艺，操作简单、成本低廉、冻干时间短。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题的：
一种重组蛋白酶K的冻干工艺，包括以下步骤：
S1、对蛋白酶k溶液进行纯化，并对蛋白酶k溶液进行浓缩；
S2、加入等比例的蛋白酶冻干保存液；
S3、进行冻干程序：首先加入蛋白酶溶液进行预冻，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在-25～-15℃保持0.5-1.5h，在-15～-5℃保持5-7h，在-5～5℃保持3-5h，在0-10℃保持1～3h，在5～15℃保持1-3h，在10～20℃保持7～9h；结束后冻干完成。
进一步地，所述步骤S1具体包括：使用亲和层析的方法进行纯化，将溶液装入透析袋中，透析袋外加peg20000，进行浓缩，并检测，控制溶液活性为3500～4500u/ml。
进一步地，所述冻干保存液包括糖类、醇类、表面活性剂和缓冲液。
进一步地，所述糖类包括蔗糖和/或海藻糖。
进一步地，所述醇类包括甘露醇、山梨醇和叔丁醇中的一种或几种。
进一步地，所述预冻的步骤包括在温度为-35～-25℃的条件下冷冻1.5～2.5h。
进一步地，所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油、司盘80、Tween80中的至少一种。
进一步地，所述缓冲液为PVP缓冲液。
本发明的优点在于：本发明一种重组蛋白酶K的冻干工艺，操作简单、成本低廉、冻干时间短，产品易溶解且保质期长。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
本实施例提供一种重组蛋白酶K的冻干工艺，包括以下步骤：
S1、使用亲和层析的方法进行纯化，将溶液装入透析袋中，透析袋外加peg20000，进行浓缩，并检测，控制溶液活性为4000u/ml。；
S2、加入等比例的蛋白酶冻干保存液；所述蛋白酶冻干保存液包括：蔗糖3w/v％、海藻糖2.5w/v％、甘露醇0.3w/v％、山梨醇0.1w/v％、叔丁醇0.7v/v％、Tween-80 0.05v/v％和PVP 0.1w/v％；
S3、进行冻干程序：首先向300mm*400mm的托盘中加入300mm*400mm*10mm的蛋白酶溶液在-30℃条件下进行速冻，并保持2小时进行预冻，预冻后开启抽真空，并打开升温程序，所述冻干的升温曲线为：在-20℃保持1h，在-10℃保持6h，在0℃保持4h，在5℃保持2h，在10℃保持2h，在15℃保持8h；结束后冻干完成，冻干时液体分布状态为300*400*10mm3状。
实施例2
本实施例提供一种重组蛋白酶K的冻干工艺，包括以下步骤：
S1、使用亲和层析的方法进行纯化，将溶液装入透析袋中，透析袋外加peg20000，进行浓缩，并检测，控制溶液活性为4000u/ml。；
S2、加入等比例的蛋白酶冻干保存液；所述蛋白酶冻干保存液包括：蔗糖1w/v％、海藻糖1w/v％、甘露醇0.1w/v％、山梨醇0.04w/v％、叔丁醇0.5v/v％、Tween-80 0.01v/v％和PVP 0.05w/v％；
S3、进行冻干程序：首先向300mm*400mm的托盘中加入300mm*400mm*10mm的蛋白酶溶液在-35℃条件下进行速冻，并保持1.5小时进行预冻，预冻后开启抽真空，并打开升温程序，所述冻干的升温曲线为：在-25℃保持0.5h，在-15℃保持5h，在-5℃保持3h，在0℃保持1h，在5℃保持1h，在10℃保持7h；结束后冻干完成，冻干时液体分布状态为300*400*10mm3状。
实施例3
本实施例提供一种重组蛋白酶K的冻干工艺，包括以下步骤：
S1、使用亲和层析的方法进行纯化，将溶液装入透析袋中，透析袋外加peg20000，进行浓缩，并检测，控制溶液活性为4000u/ml。；
S2、加入等比例的蛋白酶冻干保存液；所述蛋白酶冻干保存液包括：蔗糖5w/v％、海藻糖4w/v％、甘露醇0.5w/v％、山梨醇0.2w/v％、叔丁醇1v/v％、Tween-80 0.1v/v％和PVP 0.2w/v％；
S3、进行冻干程序：首先向300mm*400mm的托盘中加入300mm*400mm*10mm的蛋白酶溶液在-25℃条件下进行速冻，并保持2.5小时进行预冻，预冻后开启抽真空，并打开升温程序，所述冻干的升温曲线为：在-15℃保持1.5h，在-5℃保持7h，在5℃保持5h，在10℃保持3h，在15℃保持3h，在20℃保持9h；结束后冻干完成，冻干时液体分布状态为300*400*10mm3状。
对比例1
S1、使用亲和层析的方法进行纯化，将溶液装入透析袋中，透析袋外加peg20000，进行浓缩，并检测，控制溶液活性为4000u/ml。；
S2、加入等比例的蛋白酶冻干保存液；所述蛋白酶冻干保存液包括：蔗糖3w/v％、甘露醇0.3w/v％、山梨醇0.1w/v％、Tween-80 0.05v/v％和PVP 0.1w/v％；
S3、进行冻干程序：首先向300mm*400mm的托盘中加入300mm*400mm*10mm的蛋白酶溶液在-30℃条件下进行速冻，并保持2小时进行预冻，预冻后开启抽真空，并打开升温程序，所述冻干的升温曲线为：在-20℃保持1h，在-10℃保持6h，在0℃保持4h，在5℃保持2h，在10℃保持2h，在15℃保持8h；结束后冻干完成，冻干时液体分布状态为300*400*10mm3状。
对比例1与实施例1的区别是蛋白酶冻干保存液的配比不同。
对比例2
本实施例提供一种重组蛋白酶K的冻干工艺，包括以下步骤：
S1、使用亲和层析的方法进行纯化，将溶液装入透析袋中，透析袋外加peg20000，进行浓缩，并检测，控制溶液活性为4000u/ml。；
S2、加入等比例的蛋白酶冻干保存液；所述蛋白酶冻干保存液包括：蔗糖3w/v％、海藻糖2.5w/v％、甘露醇0.3w/v％、山梨醇0.1w/v％、叔丁醇0.7v/v％、Tween-80 0.05v/v％和PVP 0.1w/v％；
S3、进行冻干程序：首先向300mm*400mm的托盘中加入300mm*400mm*10mm的蛋白酶溶液降低至温度为-30℃条件下，随后开启抽真空条件，并打开升温程序，所述冻干的升温曲线为：在-20℃保持1h，在-10℃保持6h，在0℃保持4h，在5℃保持2h，在10℃保持2h，在15℃保持8h；结束后冻干完成，冻干时液体分布状态为300*400*10mm3状。
对比例2与实施例1的区别是未进行预冻温度的保持即开始升温。
将上述实施例1-3和对比例1-2中得到的冻干粉进行测试，得到的比活性(U/mg)结果如下表所示：
将实施例1-3中制备得到蛋白酶K冻干粉放置于4℃条件下，放置2年，不定期取样测量其比活性，结果如下表所示：
| 冻干粉的比活性(U/mg) | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 1天 | 33.1 | 31.8 | 32.5 |
| 97天 | 32.8 | 32.3 | 32.2 |
| 150天 | 32.4 | 32.0 | 32.5 |
| 285天 | 32.5 | 31.7 | 32.0 |
| 390天 | 32.2 | 31.6 | 31.8 |
| 525天 | 31.9 | 31.2 | 31.5 |
| 630天 | 31.8 | 31.2 | 31.7 |
综上，本发明的冻干蛋白酶K工艺，冻干粉的比活性在30U/mg以上，能在4℃下保存2年以上。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (1)
1.一种重组蛋白酶K的冻干工艺，其特征在于，
包括以下步骤：
S1、对蛋白酶k溶液进行纯化，并对蛋白酶k溶液进行浓缩；
所述步骤S1具体包括：使用亲和层析的方法进行纯化，将溶液装入透析袋中，透析袋外加peg20000，进行浓缩，并检测，控制溶液活性为3500～4500u/ml；
S2、加入等比例的蛋白酶冻干保存液；
S3、进行冻干程序：首先加入蛋白酶溶液进行预冻，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在-25～-15℃保持0.5-1.5h，在-15～-5℃保持5-7h，在-5～5℃保持3-5h，在0-10℃保持1～3h，在5～15℃保持1-3h，在10～20℃保持7～9h；结束后冻干完成；所述预冻的步骤包括在温度为-35～-25℃的条件下冷冻1.5～2.5h；
所述冻干保存液包括糖类、醇类、表面活性剂和缓冲液；
其中，所述糖类包括蔗糖和海藻糖；所述醇类包括甘露醇、山梨醇和叔丁醇；所述表面活性剂为Tween80；所述缓冲液为PVP缓冲液。
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