JP5066384B2 - 安定化酵素組成物 - Google Patents

Description

本発明は、安定化酵素組成物を対象とする。より詳細には、本発明は、コーヒーに由来する材料を用いた安定化酵素組成物を対象とする。この安定化酵素組成物は、特にコーヒー製品の製造に有用である。

食品用酵素は一般に、微生物発酵または植物もしくは動物の組織からの抽出によって生成される。粗酵素は一般に水溶液であり、遠心分離、膜限外ろ過、精密ろ過、塩析沈殿、溶媒沈殿などの技術によって精製し、濃縮することができる。次いで精製した酵素は、水性液体、乾燥顆粒粉末、または凝集した粒状形態など、販売可能な形態に標準化され、配合される。水性酵素濃縮物または塩沈殿物などの未配合調製物は、しばしば研究目的で使用されるが、その処理の困難さ、微生物増殖の可能性が高いこと、および／または保存中の活性の低下により、市販の酵素としては一般的ではない。酵素の安定化には、処理中および保存中の酵素活性の微生物増殖の抑制と酵素活性の保護の両方が関与する。酵素活性は、酸化、熱加水分解、およびタンパク質分解を含めたいくつかの自然なプロセスによって減少することがある。微生物増殖は、水溶液系においてより一般的であり、乾燥配合物においてはそれほど問題ではない。しかし、全ての酵素が容易に乾燥できるわけではなく、多くの場合、空気中の汚染物質がないことおよび使用が容易であることにより、水性配合物が好ましい。

食品として承認されたある種の材料または成分は、（１）精製、処理、保存、および／または乱用中の酵素活性を安定化し、（２）微生物増殖を抑制し、（３）活性成分を標準化し、かつ／または（４）酵素のより好都合な分散を促進するために、液体酵素配合物または乾燥酵素配合物に加えることができる。このような材料または成分には、製品中の微生物繁殖を抑制する抗菌剤、乾燥、保存、または乱用中の酵素活性を維持する安定剤、酵素の湿潤または分散を助ける分散剤、配合物のｐＨおよびその使用中のｐＨを制御する緩衝剤、ならびに活性を標準レベルまで調節し、酵素を好都合に分散させる充てん剤／標準化剤が含まれる。食品用抗菌剤の具体例には、ソルビン酸、プロピオン酸、ソルビン酸カリウム、エリソルビン酸ナトリウムが含まれる。他の安定剤には、スクロースおよびラクトースなどの糖、グリセロール、ソルビトール、マンニトールなどのポリオール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウムなどの塩、クエン酸などの有機酸、脱脂乳および乳漿タンパク濃縮物などのタンパク質性材料、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールなどのオリゴマー、ならびにベタインおよびγ−アミノ二酪酸などの両性材料が含まれる。安定剤の機構（作用の形態）は、必ずしもよく知られているとは限らないが、酵素タンパク質（またはいくつかの場合には、活性に必要とされる非タンパク質存在物（ｅｎｔｉｔｙ））を、温度極限、乾燥、せん断、浸透ストレス、ｐＨストレス、イオン勾配、タンパク質分解、および他の有害な力による変性または失活から保護するものと思われる。緩衝剤には、酢酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸、炭酸カルシウム等が含まれる。分散剤には、レシチン、サポニン等が含まれる。酵素調製物を乾燥すべき場合には、その配合物または安定化用成分を乾燥の前に水性液体に加えるのが好ましい。というのは、それらは酵素とより良好に混合し、乾燥中、安定剤が酵素を保護することができるからである。

可溶性コーヒーは、インスタントコーヒーとも呼ばれ、より従来型の焙煎し挽いたコーヒー（Ｒ＆Ｇ）の好都合な代替品である。しかしインスタントコーヒーは、素早く調製できる好都合さとＲ＆Ｇ豆の強い香りとをしばしば引き換えにする。可溶性コーヒーは、一般に、焙煎し挽いたコーヒー（Ｒ＆Ｇ）を抽出し熱加水分解し、その後その抽出物を分離し乾燥することによって製造される。可溶性コーヒーは、高度な処理およびそれに関連する損失により、しばしばアンバランスな風味および香気を有することがある。このような処理に使用される高温および高圧は、しばしば望ましくない異臭を生じ、それによって従来のＲ＆Ｇコーヒーと比較して質の低い製品を製造する。

可溶性コーヒーの質の低さは、長年の問題となっている。望ましくない異臭をなくし、コーヒーの風味および香味をできる限り保持する可溶性コーヒーの高収率処理を設計するために、様々な試みがなされてきた。可溶性コーヒーの製造における酵素の使用は、長年のこの問題を解決する試みにおいて探求されてきたものである。

例えば、ケロッグ（Ｋｅｌｌｏｇｇ）の特許文献１には、コーヒー材料を処理するためにタカジアスターゼなどの変換酵素を使用する、可溶性コーヒーの製造が記載されている。この処理は、高圧蒸気（１５ｐｓｉ）を使用してコーヒー豆マトリックスを軟化し、ほぐした後冷却し、続いて実質的には６５℃を上回らない、一般には４８および５４℃の間の温度で、酵素を用いて処理するものである。

コルトン（Ｃｏｌｔｏｎ）の特許文献２には、挽いたコーヒーを、「蒸気爆発（ｓｔｅａｍ ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ）」の前処理にかけ、次いで大気圧まで急速に減圧した後、コーヒー成分を可溶化するために酵素を使用する処理が記載されている。使用される酵素には、アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、セロビアーゼ、ペクチナーゼ、およびリパーゼが含まれる。

スモール（Ｓｍａｌｌ）らの特許文献３には、最終的な焙煎の前に、未焙煎コーヒー豆または部分的に焙煎したコーヒー豆を酵素で処理することによってＲ＆Ｇコーヒーを製造する方法が記載されている。使用される酵素には、細胞壁溶解酵素、細胞に保存された成分を溶解する酵素、またはフェノールオキシダーゼ酵素が含まれる。細胞壁溶解酵素には、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、グルカナーゼ、マンナーゼ、およびリグニナーゼが含まれる。細胞に保存された成分を溶解する酵素には、アミラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、デキストラナーゼ、およびプロテアーゼが含まれる。フェノールオキシダーゼ酵素には、チロシナーゼ、フェノラーゼ、ならびに茶、リンゴ果汁、ナシ果汁、およびブドウ果汁など他の抽出物が含まれる。

微生物の酵素生成のための発酵栄養分としての使用済みコーヒー粉砕物など、コーヒー材料の使用が報告されている。例えば、非特許文献１を参照されたい。

より最近では、膜透過技術と組み合わせた加水分解処理で、酵素を使用して調製する可溶性コーヒー抽出物が調製されている（本明細書に参照として組み込む特許文献４を参照されたい）。焙煎コーヒー固体を微細に湿式粉砕して、コーヒースラリーを形成する。有効量の適切な酵素を用いてコーヒースラリーを処理して反応混合物を形成し、次いで約２０から約９０℃で処理して、焙煎コーヒー固体のコーヒー成分を加水分解して、可溶性コーヒー材料を形成する。可溶性コーヒー材料を水で抽出し、次いで半透膜を使用して、酵素および他の不溶性微粒子を含む濃縮水と、精製した可溶性コーヒー抽出物を含む透過水とに分離する。この処理に特に有用な酵素には、マンナナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、ヌクレアーゼ、およびリパーゼなどの加水分解酵素が含まれる。この処理は、熱処理と比較して、同等の可溶化収率を維持しながら、望ましくない熱劣化化合物なしに、よりバランスの取れた優れた風味を有する可溶性コーヒーを提供する。

生成物にかける入熱を著しく低減することによって、可溶性コーヒー製造技術分野の多くの制限を克服することが可能となるが、それをコーヒー処理に組み込むことは、ある程度の複雑さを伴うことがある。酵素タンパク質それ自体は分子量が大きく、可溶性コーヒー処理によって除去されるはずだが、一般的な配合成分または安定化成分の多くは分子量が小さく、最終製品中に残留することになる。特に、貯蔵寿命保存中の酵素活性を安定化するために使用される成分は、完成した製品中に持ち越されることがあり、望ましくない質の悪影響を生じ得る。例えば、特許文献４に記載される処理は膜分離を使用するが、このような配合成分は膜を通過し、可溶性コーヒー製品中で濃縮されることがある。マルトデキストリンなど、初めは不溶性であるこのような配合剤でも、酵素処理によって一部可溶化され、コーヒー製品中に現れることがある。このような配合剤を除去することは、処理の複雑さおよび費用を増大することにもなる。

その結果、このような酵素の形成を安定化するために通常使用される従来の配合成分を使用せずに、酵素を用いて、Ｒ＆Ｇコーヒーに類似した強いコーヒーの風味および香味を保持する可溶性コーヒーを効率的に製造する方法を提供することが依然として求められている。さらに、費用および単位操作を低減する、可溶性コーヒーの簡易な製造方法を提供することが依然として求められている。

米国特許第２，２８２，１３８号明細書 米国特許第４，９８３，４０８号明細書 米国特許第４，９０４，４８４号明細書 欧州特許出願公開第０５１０６５６３．９号明細書 Regalado et al., J. Sci. Food Agr., 80:9, pp. 1343-1350 (2000)

本発明は、安定化酵素組成物を対象とする。より詳細には、本発明は、コーヒー由来材料を用いて安定化した酵素組成物を対象とする。本発明の安定化酵素組成物は、コーヒー由来配合成分のみを含有するが、従来の安定化配合物と同等の活性成分の安定性を有する。本発明の安定化酵素組成物は、従来の安定剤および他の安定性強化添加剤の包含を回避することが望ましい適用例において使用することができる。安定化酵素組成物は、特に、可溶性コーヒーおよび他のコーヒー製品の酵素的製造に有用である。

本発明は、酵素および酵素を安定化する有効量のコーヒー由来材料を含む安定化酵素組成物を提供する。好ましくはこの安定化酵素は、本質的に酵素および酵素を安定化する有効量のコーヒー由来材料からなり、水溶液または懸濁液、乾燥粉末、乾燥顆粒、あるいは乾燥粉末または乾燥顆粒のコーヒー由来油中懸濁液の形態である。

本発明はまた、
（１）コーヒー固体を処理して、コーヒー固体を含有するコーヒースラリーを形成するステップと、
（２）酵素および酵素を安定化する有効量のコーヒー由来材料を含む安定化酵素組成物の形態の有効量の酵素を用いて、コーヒー固体を加水分解するのに十分な温度および時間でそのコーヒースラリーを処理して、可溶性コーヒー抽出物材料を形成するステップと、
（３）その可溶性コーヒー抽出物材料を処理して、可溶性コーヒー抽出物を得るステップと
を含む、可溶性コーヒー抽出物を製造する方法を提供する。

本発明はまた、
（１）焙煎コーヒー固体を微細に湿式粉砕して、コーヒー固体を含有するコーヒースラリーを形成するステップと、
（２）酵素および酵素を安定化する有効量のコーヒー由来材料を含む安定化酵素組成物の形態の有効量の酵素を用いて、コーヒー固体を加水分解するのに十分な温度および時間でそのコーヒースラリーを処理して、可溶性コーヒー抽出物材料を形成するステップと、
（３）その可溶性コーヒー抽出物材料を、濃縮水と、可溶性コーヒー抽出物を含む透過水とに分離するステップと
を含む、可溶性コーヒー抽出物を製造する方法を提供する。

本発明はまた、
（１）微細粉砕した焙煎コーヒー固体を、酵素および酵素を安定化する有効量のコーヒー由来材料を含む安定化酵素組成物の形態の有効量の酵素を用いて容器中で処理して、コーヒー固体を加水分解して、可溶性コーヒー抽出物を含有する可溶性コーヒー抽出物材料を形成するステップと、
（２）その可溶性コーヒー抽出物材料を半透膜分離装置を通して循環させて、濃縮水と、可溶性コーヒー抽出物を含有し、かつ連続的に集められる透過水とを連続的に形成し、少なくとも一部の濃縮水を容器中で再利用するステップと
を含む、可溶性コーヒー抽出物を半連続的または連続的に製造する方法を提供する。

先に指摘したように、本発明は、コーヒー由来材料を用いて安定化した酵素組成物を対象とする。本発明の安定化酵素組成物は、従来の安定剤および他の安定性強化添加剤の包含または使用を回避することが望ましい適用例において使用することができる。したがって、本発明の安定化酵素組成物は、コーヒー由来材料が処理中および最終製品において許容できる限り、様々な食品、医薬品、化粧品等の製造に使用することができる。これらの安定化酵素組成物は、コーヒー由来材料だけを使用して、保存および／または乱用中の所望の酵素安定性および酵素活性を依然として維持しながら、従来の安定剤を回避するものである。

安定化酵素組成物は、酵素配合と通常関連する従来の安定剤を含有しない、酵素を使用する可溶性コーヒーおよび他のコーヒー製品の製造に特に有用である。したがって、本発明の安定化酵素組成物は、コーヒー固体を酵素処理して、その中のコーヒー材料を加水分解するのに特に有用である。

本発明はまた、従来の安定剤が望ましくない食品産業、製薬産業、化粧品産業、および他の産業において有用な酵素の調製を安定化するために使用することができる。この方法を使用して安定化することができる食品の調製に特に有用な酵素には、マンナナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ（例えば、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビノガラクタナーゼ）、ヌクレアーゼ、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、アミラーゼ、およびリガナーゼ、ならびにそれらの混合物が含まれる。本発明のコーヒー由来材料で安定化した酵素組成物を使用して、従来の酵素安定剤を使用せずに可溶性コーヒー製品を容易に調製することができる。

酵素組成物の安定化に有用なコーヒー由来材料には、例えば、可溶性コーヒー、焙煎し挽いたコーヒー、コーヒー油、使用済み（すなわち部分的に抽出された）コーヒー粉砕物、挽いた未焙煎コーヒー豆、水性コーヒー抽出物、未焙煎コーヒー豆抽出物等、ならびにそれらの混合物が含まれ、その抽出物または他のコーヒー材料は、所望により濃縮することができる。当然のことながら、このようなコーヒー由来材料は、本発明が最終製品からなくそうとする従来の安定剤を含有する酵素組成物を含むべきではなく、またはそれを用いて調製されるべきではない。したがって、例えば本発明の酵素組成物を安定化するのに使用される可溶性コーヒー材料は、従来の安定化酵素組成物を使用して調製された可溶性コーヒーに由来するべきではない。

本発明の安定化酵素組成物は、水性組成物として配合することができ、または固体組成物（例えば、粉末または凝集粒子）を形成するために乾燥することもできる。一般にこのような組成物は、全組成物に対して酵素を約１から約２５パーセントおよびコーヒー材料を約１０から約９９パーセント含有する。一般に水性配合物では、活性な酵素タンパク質は、全配合物の約１から約２５パーセントを構成し、コーヒー由来材料は、全配合物の約１０から約５０パーセント（好ましくは、約２０から約４０パーセント）を構成する。乾燥配合物では、活性な酵素タンパク質は、全配合物の約１から約２５パーセントを構成し、コーヒー由来材料は、全配合物の約７５から約９９パーセントを構成する。乾燥形態では、コーヒー由来材料は、好ましくは乾燥酵素組成物の形成中（例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥等による）に存在する。水性組成物は、好ましくは冷蔵または冷凍条件下で保存され、乾燥組成物は一般に周囲条件、冷蔵条件、または冷凍条件下で保存される。

本発明において、「従来の安定剤」には、製品中の微生物増殖を抑制する従来の抗菌剤、および乾燥、保存、または乱用中の酵素活性を維持する従来の安定剤が含まれる。特定の理論に拘泥するものではないが、本発明で使用されるコーヒー由来材料は、これらの機能の両方（すなわち、微生物増殖を抑制し、かつ保存および／または乱用中の酵素活性を保存する）を果たすと思われる。やはり特定の理論に拘泥するものではないが、コーヒー由来材料は、酵素配合物中の、例えば緩衝剤および分散剤などの他の機能も有する。したがって、本発明のコーヒー由来安定剤は、酵素タンパク質（またはいくつかの場合には、活性に必要とされる非タンパク質存在物（ｅｎｔｉｔｙ））を、温度極限、乾燥、せん断、浸透ストレス、ｐＨストレス、イオン勾配、タンパク質分解、および他の有害な力による変性または失活から保護するものと思われる。

本発明の安定化酵素が可溶性コーヒー抽出物を調製するのに使用されるとき、未精製の抽出材料は、可溶性コーヒー抽出物、酵素、および他の不溶性微粒子を含む。当然のことながら酵素組成物はコーヒー由来材料を用いて安定化されるので、従来の安定剤は存在せず、本質的には非コーヒー材料を含まない可溶性コーヒー抽出物を得るために、酵素および他の不溶性微粒子を従来の手段によって分離することができる。所望のコーヒー抽出物は、好ましくは、反応混合物を半透膜に通過させることによって他の成分から分離することができる（特許文献４参照）。その膜は、水溶性糖類、コーヒー抽出物、および他の材料を透過させながら酵素および他の不溶性物質を保持することができる細孔寸法を備えるならば、いかなるタイプの材料でもよい。一般に、約０．８ミクロン未満の公称孔径を有する膜が適するはずである。例えば、約２０，０００から約５０，０００ダルトンの分子量カットオフを有するポリエーテルスルホンから製造された膜が、可溶性コーヒー抽出物を分離するのに適している。本発明の方法で使用するのに適した好ましいポリエーテルスルホン膜は、Ｓｅｐｒｏ，Ｉｎｃ．（Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ）から市販されている。当然のことながら、他の構成材料の膜を使用してもよい。この膜は、クロスフロー膜分離セル内、あるいはスパイラルモジュール、中空線維システム、管束、またはプレートおよびフレームモジュールなど、膜分離に使用することができる他の装置内に収容することができる。

本発明の利点および実施形態を、以下の実施例によってさらに説明するが、本明細書に記載の特定の材料およびその量、ならびに他の条件および詳細は、本発明を過度に制限すると解釈されるべきではない。全ての部、比、およびパーセントは、別段の指定がない限り重量によるものとする。特許および公開済み特許出願を含めた全ての刊行物を、参照により本明細書に組み込む。

冷凍した未配合のマンナナーゼ酵素（ＦＵＭ：ＣｈｅｍＧｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤのＣｈｅｍＧｅｎ ＣＬ１６０）を使用した。ＦＵＭ酵素は、レンタス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）発酵からのものであり、細胞および細胞片を遠心分離によって除去し、その後膜限外ろ過を使用して酵素を濃縮および精製し、他の材料は添加しなかった。解凍した酵素を、脱イオン水（サンプル１）、およびＫｅｎｃｏ（登録商標）Ｒｅａｌｌｙ Ｒｉｃｈの小売の可溶性コーヒー１０％を含有する脱イオン水（サンプル２）で、１：２０に希釈した。両方の溶液のサンプルを、沸騰している水浴中に３０秒間浸し、次いですぐに氷浴中で冷却した。処理した溶液ならびにサンプル１の非加熱溶液（すなわち対照）を、カロブガム（ｃａｒｏｂ ｇｕｍ）を用いた粘度アッセイを使用して、マンナナーゼ活性に関してアッセイした。対照と比較すると、処理したサンプル１は、最初の酵素活性の約３３％を失ったのに対して、コーヒー由来材料で安定化したサンプル２は、最初の酵素活性の約２％しか失わなかった（すなわち、実験的制限内では活性が本質的に変化しなかった）。

この実施例は、コーヒー由来材料によって安定化した乾燥酵素配合物の調製を例示するものである。実施例１の冷凍した未配合のマンナナーゼ酵素（「ＦＵＭ」）酵素を使用した。冷凍したＦＵＭの一部分を解凍し、以下の個々の成分（２０パーセント）を、解凍したＦＵＭサンプルに添加することによって、５種類の乾燥（固体）配合物を調製した。

（１）可溶性コーヒー（Ｍａｘｗｅｌｌ Ｈｏｕｓｅ（登録商標））、
（２）ソルビトールおよび塩化ナトリウム（各１０％）、
（３）シリカ（４０から１００メッシュ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、
（４）セルロース（Ｎｅｏｃｅｌ（商標）粉末、Ｍｉｎｇｔａｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ならびに
（５）焙煎し挽いた（Ｒ＆Ｇ）コーヒー（−３０メッシュまで乾燥粉砕したＭａｘｗｅｌｌ Ｈｏｕｓｅ（登録商標））
サンプル２から４を、酵素配合に使用される一般的な安定剤と配合した。各調製物を十分に混合し、次いでＶｉｒＴｉｓ Ｍｏｄｅｌ ２５ＥＳ凍結乾燥器内ですぐに凍結乾燥させた。凍結乾燥した配合物の一部分を２０℃および５０℃で保存し、酵素活性のアッセイおよび微生物学的アッセイのために、各サンプルを異なる時間間隔で回収した。

酵素活性を、新たに調製したローカストビーンガム（ｌｏｃｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍ）水溶液（１％、２０℃で最初の粘度が２８００から３５００ｃＰ）を用いた粘度アッセイを使用して測定した。酵素配合物を水で１：１０に希釈し、十分に混合し、次いで必要に応じてさらに希釈した。希釈したサンプルを調製直後にアッセイした。２０℃でガム溶液３０ｍｌを入れた管に、所与の酵素溶液の適切な希釈液２５マイクロリットルを「時間ゼロ」で添加した。酵素配合物の適切な希釈液（一般に約１：１００）は、約５から１５分でガム粘度を５００ｃＰ未満に低減するのに効果があった。

各ガム−酵素溶液を、約３０秒間混合し、次いでＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＤＶＩＩ＋粘度計（２０ＲＰＭのＳｐｉｎｄｌｅ６）で分析した。粘度対時間をＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｗｉｎｇａｔｈｅｒソフトウェアを使用して記録した。相対的な酵素活性を、５００ｃＰまでの粘度対時間曲線の線形フィットの傾きおよび／または５００ｃＰに達するのに必要な時間として決定した。傾きの反応は酵素希釈に対して必ずしも直線ではないため、比較サンプルおよび参照としての対照を、好ましくは同希釈（一般に約１：１００）で測定した。冷凍乾燥に関与する濃縮係数により、乾燥サンプルは、活性の損失がないと仮定すれば、最初のＦＵＭサンプル（すなわち１００）の単位重量当たり約２．５倍（すなわち２５０）の活性を有するはずである。結果を以下の表１に示す。

コーヒー材料で安定化した２０℃で保存したサンプルは、驚くべきことにほぼ３ヶ月保存した後でも、他の配合物より多少高い活性を有している。

５０℃という厳しい温度で保存した配合物は、２０℃で保存したものよりも著しく活性が低かった。しかし驚くべきことには、コーヒーをベースとする配合物は、非コーヒー材料配合物と比較して、高いパーセントの活性（すなわち、２０℃の保存で残っている約６０％超の活性）を保持した。したがって、乾燥配合物中のコーヒー由来材料は、２０℃および５０℃の保存温度で安定剤として働いた。

微生物学的安定性を、ＡＯＡＣ法９６６．２３を使用して細菌の全平板計数（ＴＰＣ）を決定することによって評価した。最初の冷凍ＦＵＭは、９８００計数／ｇｍのＴＰＣを有していた。冷凍乾燥処理によって、乾物濃度が２．５倍増大した。表２は、２０℃で３週間および９週間と、５０℃で３週間保存したサンプル中の微生物ＴＰＣを示すものである。

全乾燥サンプルが、ＴＰＣの著しい減少を示した（濃縮係数のみによる増加とは対照的）。コーヒー材料を配合したサンプルは、他の配合材料と同程度であった。５０℃で保存したサンプルは、２０℃で保存したものよりかなり計数が低かった。９週間の全アッセイ中、２０℃で保存した乾燥サンプルは、３００ＴＰＣ／ｇｍ未満であった。これらの乾燥サンプルは水分活性が非常に低いので、微生物増殖が抑制される。全乾燥サンプルは、容認できる程低い微生物ＴＰＣを有する。

この実施例は、コーヒー由来材料によって安定化した液体酵素配合物の調製を示すものである。実施例１の冷凍した未配合のマンナナーゼ酵素を解凍し、以下の個々の成分（２０パーセント）を添加することによって、液体配合物を調製した。

（１）可溶性コーヒー（Ｍａｘｗｅｌｌ Ｈｏｕｓｅ（登録商標））、
（２）ソルビトールおよび塩化ナトリウム（各２０％）、ならびに
（３）対照のＦＵＭ（添加剤なし）
水性液体配合物の部分を４、２０、および５０℃で保存し、実施例１と同じ分析技術を使用する酵素活性のアッセイおよび微生物学的アッセイのために、各サンプルを異なる時間間隔で回収した。酵素活性および生物学的結果を、それぞれ表３および４に示す。

異なる時間および温度で保存した液体サンプルの酵素活性を表３に示す。配合成分の希釈効果によって、添加剤に効果がないと仮定すれば、配合された液体は対照（すなわち未配合のＦＵＭ）の活性の約６０％を有すると予測されよう。

４℃で保存したサンプルについては、未配合のＦＵＭは、７週間を超えて保存した後でも高いパーセントの対照活性（すなわち９７％超）を保持していた。驚くべきことには、４℃で７週間を超えて保存した可溶性コーヒー配合物は、７３％を超える対照活性を有しており、これは、諸成分に効果がないとすれば予測した６０％よりも高い。４℃で保存した塩／ソルビトール配合物は、４７．６％の対照活性を有していた。

５０℃で８週間の厳しい条件下での保存については、未配合のＦＵＭは１１％の対照活性しか保持していなかった。可溶性コーヒー配合物は、５０℃では事実上不溶性ゲルを形成し、本質的に全ての活性を失った。２０℃での保存については、未配合のＦＵＭ中に著しい微生物増殖があり（以下を参照のこと）、約３２％の対照酵素活性を保持しているものの、この材料は、微生物増殖により許容できないものとなろう。可溶性コーヒー配合物は、１０％の対照活性しか保持しておらず、部分的に不溶性ゲルが形成された。

このデータに基づけば、可溶性コーヒーは、冷蔵条件（４℃）で保存された水性液体配合物中では効果的な酵素活性安定剤であることがわかる。しかし、室温（２０℃）保存またはより厳しい条件（５０℃）では効果的ではない。

表４に示されるように、未配合の対照のＦＵＭは、２０℃で保存した場合には微生物学的に不安定であり、３週間の内に全平版計数は劇的に増加した。しかし、４℃で保存した未配合の対照は６０％を超えるＴＰＣの減少を示し、５０℃で保存した場合には９９％であった。これは、最初に存在する微生物の一部分が保存中に死滅することによると推測される。それとは逆に、両方の配合サンプルは、２０℃で３週間保存した場合に良好な微生物安定性を示し、可溶性コーヒー配合物の方はいくらか低いＴＰＣをもたらした。したがって４０重量％の可溶性コーヒーは、２０℃での保存中、微生物増殖を抑制する。６週間の保存では、各配合サンプルはＴＰＣにわずかな変化を示した。

Claims (9)

1. 酵素およびコーヒー由来材料を含む安定化酵素組成物であって、
   前記組成物は乾燥形態であり、
   前記酵素は１から２５パーセント、前記コーヒー由来材料は７５から９９パーセント含まれることを特徴とする安定化酵素組成物。
2. 前記酵素は加水分解酵素であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 前記加水分解酵素は、マンナナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビノガラクタナーゼ、ヌクレアーゼ、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、アミラーゼ、リグニナーゼ、およびそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記コーヒー由来材料は、可溶性コーヒー、焙煎し挽いたコーヒー、コーヒー油、使用済みコーヒー粉砕物、挽いた未焙煎コーヒー豆、水性コーヒー抽出物、未焙煎コーヒー豆抽出物、およびそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
5. （１）焙煎コーヒー固体を処理して、コーヒー固体を含有するコーヒースラリーを形成するステップ、
   （２）請求項１から４のいずれか一項に記載の安定化酵素組成物の形態の酵素を用いて、コーヒー固体を加水分解するのに十分な温度および時間で前記コーヒースラリーを処理して、可溶性コーヒー抽出物材料を形成するステップ、
   （３）前記可溶性コーヒー抽出物材料を処理して、可溶性コーヒー抽出物を得るステップ、
   を含むことを特徴とする可溶性コーヒー抽出物を製造する方法。
6. ステップ（１）のコーヒースラリーは、焙煎コーヒー固体を湿式粉砕することによって形成され、ステップ（３）の可溶性コーヒー抽出物は、前記可溶性コーヒー抽出物材料を、濃縮水と、前記可溶性コーヒー抽出物を含む透過水とに分離することによって得られることを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 前記可溶性コーヒー抽出物材料の、濃縮水および透過水への分離は、２０，０００から５０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する半透膜を使用して実施されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. （１）微細粉砕したコーヒー固体を、請求項１から４のいずれか一項に記載の安定化酵素組成物の形態の酵素を用いて処理して、コーヒー固体を加水分解して、可溶性コーヒー抽出物を含有する可溶性コーヒー抽出物材料を形成するステップ、
   （２）前記可溶性コーヒー抽出物材料を半透膜分離装置を通して循環させて、濃縮水と、可溶性コーヒー抽出物を含有し、かつ連続的に集められる透過水とを連続的に形成し、少なくとも一部の濃縮水を容器中で再利用するステップ、
   を含むことを特徴とする可溶性コーヒー抽出物を半連続的または連続的に製造する方法。
9. 前記半透膜は、２０，０００から５０，０００ダルトンの分子量カットオフを有することを特徴とする請求項８に記載の方法。