KR20140081772A - 안정화된 효소 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 커피-유래의 물질에 의해 안정화된 효소 조성물을 제공한다. 본 발명의 안정화된 효소 조성물은 볶은 커피 고형분으로부터 가용성 커피를 제조하는데 있어서 특히 유용하다.

Description

안정화된 효소 조성물 {Stabilized Enzyme Compositions}
본 발명은 안정화된 효소 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 커피-유래의 물질에 의해 안정화된 효소 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 안정화된 효소 조성물은 커피 제품의 제조에 있어서 특히 유용하다.
식품 등급의 효소는 전형적으로 미생물 발효에 의해 또는 식물 또는 동물 조직으로부터의 추출에 의해 제조된다. 전형적으로 수용액 중에 존재하는 조(crude) 효소는 원심분리, 막 한외여과, 미세여과, 염 침전 및 용매 침전 등과 같은 기술에 의해 정제 및 농축될 수 있다. 이어서, 정제된 효소는 판매가능한 형태, 예를 들면 수성 유체, 건조된 과립화 분말 또는 응집된 과립 형태로 표준화 및 제제화된다. 수성 효소 농축물 또는 염 침전물과 같은 제제화되지 않은 조제는 흔히 연구 목적으로 사용되지만, 취급상의 어려움, 높은 미생물 성장 가능성 및/또는 저장 동안의 활성 감소로 인해 일반적으로 시판 효소로는 사용되지 않는다. 효소의 안정화는 가공 및 저장 동안 미생물 성장의 억제 및 효소 활성의 보존 둘 다를 포함한다. 효소 활성은 산화, 열 가수분해, 및 단백질분해를 비롯한 다수의 자연적인 과정으로 인해 감소될 수 있다. 미생물 성장은 수성 시스템에서 이루어지는 것이 보다 일반적이며 건조 제제에서는 그보다 덜 행해진다. 그러나, 모든 효소가 쉽게 건조될 수 있는 것은 아니며, 많은 경우에서 수성 제제가 풍매성 오염원의 결여 및 사용의 용이성으로 인해 바람직할 수 있다.
(1) 정제, 가공, 저장 및/또는 남용 동안 효소 활성의 안정화, (2) 미생물의 성장 억제, (3) 활성 성분의 표준화 허용 및/또는 (4) 효소의 더 편리한 제조의 촉진을 위해, 식품으로 승인된 여러 물질 또는 성분을 액상 또는 건조된 효소 제제에 첨가할 수 있다. 이러한 물질 또는 성분으로는 제품 중의 미생물의 성장을 억제하는 항미생물제, 건조, 저장 또는 남용 동안 효소 활성을 보존하는 안정화제, 효소의 습윤 또는 분산을 돕는 분산제, 사용 동안 제제의 pH를 조절하는 완충제, 및 활성을 조절하여 효소가 표준 수준으로 편리하게 제조되게끔 하는 벌크화제/표준화제가 포함된다. 식품 등급의 항미생물제의 예로는 소르브산, 프로피온산, 소르브산칼륨, 에리토르브산나트륨을 들 수 있다. 다른 안정화제로는 슈가, 예를 들면 수크로스 및 락토스, 폴리올, 예를 들면 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 염, 예를 들면 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 유기산, 예를 들면 시트르산, 단백질성 물질, 예를 들면 무지방 우유, 및 유장 단백질 농축물 등, 올리고머, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 및 양쪽성 물질, 예를 들면 베타인 및 감마-아미노디부티레이트를 들 수 있다. 안정화의 기전 (작용 방식)이 항상 잘 알려져 있는 것은 아니지만, 상기 기전은 효소 단백질 (또는 몇몇 경우에는 활성에 필요한 비-단백질성 부분)이 극단적인 열, 건조, 전단변형, 삼투 스트레스, pH 스트레스, 이온 농도구배, 단백질분해 및 다른 불리한 작용력에 의해 변형되거나 또는 불활성화되지 않도록 하는 것을 포함하는 것으로 보인다. 완충제로는 아세트산, 아세트산나트륨, 인산나트륨, 황산 및 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 분산제로는 레시틴 및 사포닌 등을 들 수 있다. 효소 조제를 건조하는 경우, 건조에 앞서 수성 액체에 제제화 또는 안정화 성분을 첨가하는 것이 바람직할 수 있는데, 그 이유는 상기 성분이 효소와 더 잘 혼합되며 안정화제는 건조 동안 효소를 보호할 수 있기 때문이다.
인스턴트 커피라고도 부르는 가용성 커피는 보다 전통적인 것으로 여겨지는 볶아서 분쇄한 커피 (R&G)에 대한 편리한 대체물이다. 그러나, 인스턴트 커피는 흔히 빠르고 편리하게 제조할 수 있지만 R&G 원두의 강한 향미는 없다. 가용성 커피는 전형적으로 볶아서 분쇄한 (R&G) 커피를 추출해서 열 가수분해한 다음, 추출물을 분리 및 건조함으로써 만들어진다. 흔히 가용성 커피는 가공 및 관련 공정에서 고도로 손실되기 때문에 향미와 향기의 균형이 맞지 않을 수 있다. 이러한 공정에 사용된 높은 온도 및 압력은 흔히 바람직하지 않은 악취를 발생시키므로 전통적인 R&G 커피에 비해 제품의 품질을 저하시킨다.
가용성 커피의 열등한 품질은 오랫동안 문제가 되어 왔다. 바람직하지 않은 악취를 제거하고 커피의 향미 및 향기를 가능한 많이 보유하는, 가용성 커피를 고 수율로 제조하는 공정을 설계하기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔다. 이러한 오랫동안의 문제를 해결하기 위한 시도로서 가용성 커피의 제조에서 효소를 사용하는 것에 대한 연구가 수행되어 왔다.
예를 들면, 켈로그(Kellogg)의 미국특허 제2,282,138호에는 타카(taka) 디아스타제와 같은 전환 효소를 사용해서 커피 재료를 처리함으로써 가용성 커피를 제조하는 것에 대하여 기술되어 있다. 이 공정은 고압 증기 (15 psi)를 사용해서 커피 원두 매트릭스를 연화시켜 성기게 만들고, 냉각한 다음, 실질적으로 65 ℃를 초과하지 않는 온도, 전형적으로는 48 내지 54 ℃의 온도에서 효소로 처리한다.
콜튼(Colton)의 미국특허 제4,983,408호에는 분쇄 커피를 "증기 폭발(steam explosion)"로 전처리하고, 대기압으로 급속히 감압한 다음, 효소를 사용해서 커피 성분을 용해시키는 공정이 기술되어 있다. 사용된 효소로는 아밀라제, 헤미셀룰라제, 셀룰라제, 프로테아제, 셀로비아제, 펙티나제 및 리파제를 들 수 있다.
스몰(Small) 등의 미국특허 제4,904,484호에는 커피 생원두 또는 부분적으로 볶아진 커피 원두를 효소로 처리한 다음 마지막으로 볶아냄으로써 R&G 커피를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 사용된 효소로는 세포벽 분해 효소, 세포 저장성분 분해 효소 또는 페놀 옥시다제 효소를 들 수 있다. 세포벽 분해 효소로는 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 펙티나제, 글루카나제, 만나제 및 리그니나제를 들 수 있다. 세포 저장성분 분해 효소로는 아밀라제, 글루코시다제, 만노시다제, 덱스트라나제 및 프로테아제를 들 수 있다. 페놀 옥시다제 효소로는 티로시나제, 페놀라제, 및 다른 추출물, 예를 들면 차, 사과 주스, 배 주스 및 포도 주스를 들 수 있다.
효소의 미생물적 제조에서 커피 물질, 예컨대 사용된 커피의 분쇄물을 발효 영양소로서 사용하는 것에 대하여 보고되었다. 예를 들면, 문헌 [Regalado et al., J. Sci. Food Agr., 80:9, pp. 1343-1350 (2000)]을 참조한다.
보다 최근에는, 막 투과 기술과 연계된 가수분해 공정에서 효소를 사용해서 제조된 가용성 커피 추출물이 제조되었다 (2005년 7월 18일 출원되었으며 본원에 참고로 포함되는 유럽 특허출원 제05106563.9호 참조). 볶은 커피 고형분을 미세하게 습윤 분쇄하여 커피 슬러리를 형성시킨다. 커피 슬러리를 유효량의 적합한 효소로 처리하여 반응 혼합물을 형성시킨 다음, 이를 약 20 ℃ 내지 약 90 ℃에서 처리하여 볶은 커피 고형분의 커피 성분을 가수분해함으로써 가용성 커피 물질을 형성시킨다. 물을 사용해서 가용성 커피 물질을 추출한 다음, 반-투과성 막을 사용해서 효소 및 다른 불용성 미립자를 포함하는 보유물과, 정제된 가용성 커피 추출물을 포함하는 투과물로 분리한다. 이러한 공정에 특히 유용한 효소로는 히드롤라제, 예를 들면 만나나제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 프로테아제, 펙티나제, 뉴클레아제 및 리파제를 들 수 있다. 이러한 공정에 의해, 바람직하지 않은 열 분해 화합물이 생성되지 않고 열 공정에 비해 보다 균형잡힌 우수한 향미를 가지며 그에 필적하는 용해 수율을 유지하는 가용성 커피가 제공된다.
효소를 사용하면, 유입되는 열에 생성물이 노출되는 것을 상당히 감소시킴으로써 가용성 커피 제조 기술의 한계점들 중 많은 것을 극복할 수 있지만, 효소가 포함되면 커피 제조 공정이 다소간 복잡해질 수 있다. 효소 단백질은 그 자체로 높은 분자량을 가지며 가용성 커피의 제조 공정에 의해 제거될 것이지만, 전형적인 제제화 또는 안정화 성분들 중 다수는 낮은 분자량을 가지며, 최종 제품 중에 존재하게 될 것이다. 구체적으로, 보존 기한 동안 효소 활성을 안정화하는데 사용된 성분은 최종 제품 중에 포함될 수 있으며, 품질 면에서 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 있다. 예를 들면, 유럽 특허출원 제05106563.9호에 기재된 공정은 막 분리를 이용하지만, 상기 제제화 성분은 막을 통과하여 가용성 커피 제품 중에 농축될 수 있다. 말토덱스트린과 같은 초기 불용성 제제화 물질조차도 효소 공정에 의해 부분적으로 용해될 수 있으며, 커피 제품 중에 존재하는 것으로 보인다. 이러한 제제화 물질을 제거하면 공정의 복잡성 및 비용이 또한 증가하게 될 것이다.
미국특허 제2,282,138호 미국특허 제4,983,408호 미국특허 제4,904,484호 유럽 특허출원 제05106563.9호
Regalado et al., J. Sci. Food Agr., 80:9, pp. 1343-1350 (2000)
효소를 사용하는 R&G 커피와 유사한 강한 커피 향미 및 향기를 보유하지만 이러한 효소 제제를 안정화하는데 일반적으로 사용되는 통상의 제제화 성분이 필요없는 가용성 커피를 제조하는 효과적인 방법이 필요한 실정이다. 또한, 비용 및 단위 조작을 감소시킨, 가용성 커피의 간단한 제조 방법이 여전히 요망된다.
본 발명은 안정화된 효소 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 커피-유래의 물질에 의해 안정화된 효소 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 안정화된 효소 조성물은 활성 성분의 안정성이 종래의 안정화된 제제의 안정성에 필적하지만 커피-유래의 제제화 성분만을 함유한다. 본 발명의 안정화된 효소 조성물은 통상의 안정화제 및 다른 안정성-증진용 첨가제를 포함시키지 않는 것이 요구되는 임의의 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 안정화된 효소 조성물은 효소에 의해 가용성 커피 및 다른 커피 제품을 제조하는데 있어서 특히 유용하다.
본 발명은 효소 및 이 효소를 안정화시키는 유효량의 커피-유래의 물질을 포함하는 안정화된 효소 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 안정화된 효소는 본질적으로 효소 및 이 효소를 안정화시키기 위한 유효량의 커피-유래의 물질로 구성되며, 수성 용액 또는 현탁액, 건조된 분말, 건조된 과립, 또는 커피-유래의 오일 중 건조된 분말 또는 건조된 과립의 현탁액의 형태로 존재한다.
또한, 본 발명의 방법은
(1) 커피 고형분을 처리하여 커피 고형분을 함유하는 커피 슬러리를 형성시키는 단계;
(2) 커피 고형분을 가수분해하여 가용성 커피 추출 물질을 형성시키기에 충분한 온도 및 시간 하에 커피 슬러리를, 효소 및 이 효소를 안정화시키기 위한 유효량의 커피-유래의 물질을 포함하는 안정화된 효소 조성물 형태의 유효량의 효소로 처리하는 단계; 및
(3) 가용성 커피 추출 물질을 처리하여 가용성 커피 추출물을 얻는 단계
를 포함하는, 가용성 커피 추출물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
(1) 볶은 커피 고형분을 미세하게 습윤 분쇄하여 커피 고형분을 함유하는 커피 슬러리를 형성시키는 단계;
(2) 커피 고형분을 가수분해하여 가용성 커피 추출 물질을 형성시키기에 충분한 온도 및 시간 하에 커피 슬러리를, 효소 및 이 효소를 안정화시키기 위한 유효량의 커피-유래의 물질을 포함하는 안정화된 효소 조성물 형태의 유효량의 효소로 처리하는 단계; 및
(3) 가용성 커피 추출 물질을 보유물과, 가용성 커피 추출물을 포함하는 투과물로 분리하는 단계
를 포함하는, 가용성 커피 추출물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은
(1) 볶은 커피의 미세하게 분쇄된 고형분을, 용기 중에서 효소 및 이 효소를 안정화시키기 위한 유효량의 커피-유래의 물질을 포함하는 안정화된 효소 조성물 형태의 유효량의 효소로 처리하여 커피 고형분을 가수분해함으로써 가용성 커피 추출물을 함유하는 가용성 커피 추출 물질을 형성시키는 단계; 및
(2) 가용성 커피 추출 물질을 반-투과성 막 분리 장치를 통해 순환시켜 보유물과 투과물을 연속적으로 형성시키는 단계
를 포함하며, 투과물은 가용성 커피 추출물을 함유하며 연속적으로 수획되고 보유물의 적어도 일부는 용기로 재순환되는 것인, 가용성 커피 추출물의 제조를 위한 반-연속식 또는 연속식 방법도 제공한다.
본 발명에 의해, 효소를 사용하는 R&G 커피와 유사한 강한 커피 향미 및 향기를 갖지만 이러한 효소 제제를 안정화하는데 일반적으로 사용되는 통상의 제제화 성분이 필요 없고, 비용이 저렴하며, 단위 조작 면에서도 간단한 가용성 커피 제조 방법을 제공할 수 있게 되었다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명은 커피-유래의 물질에 의해 안정화된 효소 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 안정화된 효소 조성물은 통상의 안정화제 및 기타 안정성-증진용 첨가제를 포함시키거나 사용하는 것을 피하고자 하는 임의의 용도로 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 안정화된 효소 조성물은, 커피-유래의 물질이 가공 공정과 최종 제품에서 허용될 수 있는 한도에서 각종 식품, 의약품, 미용 제품 등의 제조에 이용될 수 있다. 이러한 안정화된 효소 조성물은 저장 동안에 원하는 효소 안정성 및 활성을 유지하고/하거나 오직 커피-유래의 물질만을 사용하여 통상의 안정화제 사용을 피한다.
효소 제제에 일반적으로 이용되는 통상의 안정화제를 함유하지 않는 본 발명의 안정화된 효소 조성물은 효소를 사용하여 가용성 커피 및 기타 커피 제품을 제조하는데 특히 유용하다. 따라서, 본 발명의 안정화된 효소 조성물은 커피 고형분을 효소로 처리하여 그 안의 커피 물질을 가수분해하는데 특히 유용하다.
또한, 본 발명은 통상의 안정화제가 바람직하지 않은 식품업, 제약업, 미용업 및 기타 산업에서 유용한 효소 제제를 안정화시키는데 사용될 수도 있다. 식품 제조에 특히 유용하고 상기 방법을 이용하여 안정화될 수 있는 효소에는, 만나나제, 셀룰라제, 글루카나제, 헤미셀룰라제, 리파제, 에스테라제, 프로테아제, 카르보하이드라제 (예를 들어 아라비나제, 갈락타나제, 아라비노-갈락타나제), 뉴클레아제, 펙티나제, 이소머라제, 아밀라제 및 리그니나제 뿐만이 아니라 이들의 혼합물 등도 포함된다. 커피-유래의 물질에 의해 안정화된 본 발명의 효소 조성물을 사용함으로써, 통상의 효소 안정화제를 사용하지 않고도 가용성 커피 제품을 쉽게 제조할 수 있다.
효소 조성물을 안정화시키는데 유용한 커피-유래의 물질에는, 예를 들어 가용성 커피, 볶아서 분쇄한 커피, 커피 오일, 사용된 (즉, 부분적으로 추출된) 커피의 분쇄물, 분쇄된 커피 생원두, 수성 커피 추출물, 커피 생원두 추출물 등 뿐만이 아니라 이들의 혼합물 등도 포함된다. 원한다면, 상기 추출물 또는 기타 커피 물질을 농축시킬 수 있다. 물론, 이러한 커피-유래의 물질은, 본 발명이 최종 제품에서 배제시키고자 하는 통상의 안정화제를 함유하는 효소 조성물을 포함하거나 그러한 효소 조성물을 사용하여 제조된 것이어서는 안된다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 효소 조성물을 안정화시키는데 사용되는 가용성 커피 물질이 통상적으로 안정화된 효소 조성물을 사용하여 제조된 가용성 커피로부터 유래된 것이어서는 안된다.
본 발명의 안정화된 효소 조성물은 수성 조성물로서 제제화될 수도 있고, 또는 이것을 건조시켜 고형 조성물 (예를 들어 분말 또는 응집된 입자)을 형성할 수도 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 전체 조성물을 기준으로 약 1 내지 약 25％의 효소 및 약 10 내지 약 99％의 커피 물질을 함유할 것이다. 일반적으로, 수성 제제의 경우에는 활성 효소 단백질은 전체 제제의 약 1 내지 약 25％로 포함되고 커피-유래의 물질은 전체 제제의 약 10 내지 약 50％ (바람직하게는 약 20 내지 약 40％)로 포함된다. 건조 제제의 경우에는 활성 효소 단백질은 전체 제제의 약 1 내지 약 25％로 포함되고 커피-유래의 물질은 전체 제제의 약 75 내지 약 99％로 포함된다. 건조된 형태의 경우, 건조된 효소 조성물을 형성하는 동안 (예를 들어 분무 건조, 동결 건조 등에 의함)에 커피-유래의 물질이 존재하는 것이 바람직하다. 수성 조성물은 냉장 조건 또는 동결 조건하에 저장하는 것이 바람직하고, 건조된 조성물은 일반적으로 주변 조건, 냉장 조건 또는 동결 조건하에 저장될 수 있다.
본 발명의 목적상, "통상의 안정화제"는 제품 중에서의 미생물 성장을 억제하는 통상의 항미생물제 및 건조, 저장 또는 사용시에 효소 활성을 보존하는 통상의 안정화제를 포함한다. 이론에 얽매이고 싶지는 않으나, 본 발명에 사용되는 커피-유래의 물질은 이러한 2가지 기능 (즉, 미생물 성장 억제 및 저장 및/또는 사용 동안의 효소 활성 보존)을 모두 수행한다고 여겨진다. 다시, 이론에 얽매이고 싶지는 않으나, 상기 커피-유래의 물질은 예를 들어 효소 제제 중에서의 완충제 및 분산제 등과 같은 다른 기능도 수행한다고 여겨진다. 따라서, 본 발명의 커피-유래의 안정화제는 효소 단백질 (또는 일부 경우에는 활성에 요구되는 비-단백질 부분)을 극단적인 열, 탈수, 전단변형, 삼투압 스트레스, pH 스트레스, 이온 농도구배, 단백질분해 및 기타 유해한 힘으로 인한 변성 또는 실활화로부터 보호한다고 여겨진다.
본 발명의 안정화된 효소를 사용하여 가용성 커피 추출물을 제조하는 경우, 정제되지 않은 추출 물질은 가용성 커피 추출물, 효소 및 기타 불용성 미립자를 포함한다. 물론, 효소 조성물이 커피-유래의 물질에 의해 안정화되기 때문에 통상의 안정화제는 존재하지 않으며, 효소와 기타 불용성 미립자는 통상의 수단에 의해 분리되어 커피 이외의 물질이 본질적으로 존재하지 않는 가용성 커피 추출물을 얻을 수 있다. 바람직하게는, 반응 혼합물을 예를 들어 2005년 7월 18일자로 출원된 유럽 특허 출원 제05106563.9호에 기재된 바와 같은 반-투과성 막에 통과시켜서 원하는 커피 추출물을 다른 성분들로부터 분리할 수 있다. 상기 막은 수용성 당류, 커피 추출물 및 기타 물질의 투과는 허용하면서 효소 및 기타 불용성 물질들은 보유할 수 있는 세공 크기를 갖는 임의의 유형의 물질일 수 있다. 일반적으로, 공칭 세공 크기가 약 0.8 미크론 미만인 막이 적합하다. 예를 들어, 분자량 컷-오프(cut-off)가 약 20,000 내지 약 50,000 달톤인 폴리에테르술폰으로 제조된 막이 가용성 커피 추출물의 분리에 적합하다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 바람직한 폴리에테르술폰 막은 세프로, 인크.(Sepro, Inc.) (미국 캘리포니아주 오션사이드 소재)에서 시판되고 있다. 물론, 다른 구성 재료의 막이 사용될 수도 있다. 상기 막은 예를 들어 나선형 권취 모듈, 중공사 시스템, 튜브형 번들 또는 플레이트 및 프레임 모듈 등과 같이 막 분리에 사용될 수 있는 횡류막(cross-flow-membrane) 분리 셀 또는 다른 유사한 장치 내에 함유될 수 있다.
본 발명의 이점 및 실시양태에 관하여는 하기 실시예를 통해 추가로 예시할 것이지만, 여기서 언급된 특정 재료 및 그의 양 뿐만이 아니라 기타 조건과 세부 사항이 본 발명을 부당하게 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 달리 지시하지 않는 한은 모든 부, 비율 및 백분율(％)은 중량 기준이다. 특허 및 공개된 특허 출원서 등을 비롯한 모든 간행물은 본원에 참고로 도입된다.
실시예 1: 동결된 비제제화 만나나제 효소 (FUM: ChemGen CL160, 미국 메릴랜드주 가이터스버그 소재의 켐젠 코포레이션(ChemGen Corp.))를 사용하였다. FUM 효소는 바실러스 렌투스(Bacillus lentus) 발효를 통해 얻었다. 원심분리하여 세포 및 잔해를 제거한 후에 막 한외여과를 통해 효소 농축 및 정제를 실시하였고, 다른 물질은 전혀 첨가하지 않았다. 해동시킨 효소를, 탈이온수 중에 (샘플 1) 또는 10％ 켄코(Kenco)® 리얼리 리치(Really Rich) 시판 가용성 커피를 함유하는 탈이온수 중에 (샘플 2) 1:20으로 희석시켰다. 이들 용액 둘다의 샘플을 비등하는 수조 중에 30초 동안 담궜다가 빙조에서 즉시 냉각시켰다. 상기 처리된 용액 및 샘플 1의 가열처리하지 않은 용액 (즉, 대조군)을, 캐럽(carob) 고무를 사용한 점도 검정법으로 만나나제 활성에 대하여 검정하였다. 대조군과 비교할 때, 처리된 샘플 1은 초기 효소 활성의 약 33％를 손실한 반면, 커피-유래의 물질에 의해 안정화된 샘플 2는 초기 효소 활성의 겨우 약 2％만을 손실하였다 (즉, 실험 한계 내에서 활성이 본질적으로 변화하지 않음).
실시예 2: 본 실시예는 커피-유래의 물질에 의해 안정화된 건조 효소 제제의 제조를 예시한다. 실시예 1의 동결된 비제제화 만나나제 효소 ("FUM")를 사용하였다. 동결된 FUM의 일부를 해동시키고, 해동된 FUM 샘플에 하기하는 개개의 성분을 첨가 (20％로 첨가)하여 5가지 건조 (고형) 제제를 제조하였다:
(1) 가용성 커피 (맥스웰 하우스(Maxwell House)®,
(2) 소르비톨 및 염화나트륨 (각각 10％씩),
(3) 실리카 (40 내지 100 메쉬, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)),
(4) 셀룰로스 (네오셀(Neocel)TM 분말, 밍태 케미칼(Mingtai Chemical), 및
(5) 볶아서 분쇄한 (R＆G) 커피 (맥스웰 하우스®, 약 30 메쉬로 건식 분쇄함).
샘플 2 내지 샘플 4를 효소 제제에 사용되는 전형적인 안정화제와 함께 제제화하였다. 각각의 제제를 잘 혼합한 후, 비르티스 모델(VirTis Model) 25ES 동결 건조기에서 즉시 동결 건조시켰다. 동결 건조된 제제의 일부를 20℃ 및 50℃에서 저장하였다. 상이한 시간 간격을 두고 샘플들을 꺼내서 효소 활성 및 미생물학적 검정을 실시하였다.
효소 활성은 새로 제조한 로커스트빈(locust bean) 고무 수용액 (1％, 20℃에서의 초기 점도 2800 내지 3500 cP)을 사용한 점도 검정법으로 측정하였다. 효소 제제를 물 중에 1:10으로 희석하여 잘 혼합하고, 이후에 필요에 따라서는 추가로 희석하였다. 제조 후에는 희석된 샘플들을 신속하게 검정하였다. 20℃에서 고무 용액 30 mL를 함유하는 튜브에, 주어진 효소 용액의 적합한 희석액 25 ㎕를 "시간 0"에서 첨가하였다. 효소 제제의 적합한 희석액 (일반적으로는 약 1:100)은 고무 점도를 약 5분 내지 15분 이내에 500 cP 미만으로 감소시키는데 효과적이었다.
각각의 고무-효소 용액을 약 30초 동안 혼합한 후에 브룩필드(Brookfield) DVII + 점도계 (스핀들(Spindle) 6, 20 RPM)로 분석하였다. 브룩필드 윙개더(Wingather) 소프트웨어를 이용하여 점도 대 시간을 기록하였다. 상대 효소 활성은 500 cP 및/또는 500 cP에 도달하는데 필요한 시간으로 점도 대 시간 곡선의 선형-작도 기울기로서 결정하였다. 기울기 응답이 효소 희석율과 반드시 선형 관계는 아니었기 때문에, 비교용 샘플과 참조용 대조군을 동일 희석률 (일반적으로는 1:100)에서 측정하는 것이 바람직하였다. 활성 손실이 없다고 추정되는 건조 샘플의 단위 중량 당 활성은, 동결 건조시에 수반된 농축 인자로 인해 초기 FUM 샘플 활성 (즉, 100)의 약 2.5배 (즉, 250)여야 했다. 이 결과를 하기 표 1에 나타내었다:
제제 첨가제 상대 활성 *
20℃에서 87일 저장 50℃에서 56일 저장
가용성 커피 271 167
소르비톨 및 염화나트륨† 198 118
실리카† 235 49
셀룰로스† 159 35
R＆G 커피 272 163
*FUM의 상대 활성은 100임. 제제는 농축 효과로 인해 활성이 100 초과일 수 있음.
†효소 제제에 사용되는 통상의 안정화제.
놀랍게도, 20℃에서 저장한 커피-물질 안정화된 샘플은 거의 3개월 저장 후일지라도 다른 제제에 비해 활성이 약간 더 높았다.
50℃의 극도의 온도에서 저장된 제제는 20℃에서 저장한 제제에 비하여 활성이 유의하게 덜하였다. 그러나, 놀랍게도, 상기 커피-기재의 제제는 비-커피 물질 제제에 비하여 활성을 더 높은 비율로 보유하였다 (즉, 20℃에서 저장시에 보유한 활성의 약 60％ 초과). 따라서, 건조 제제 중의 커피-유래의 물질은 20℃ 및 50℃의 저장 온도에서 안정화제로서 기능하였다.
AOAC 방법 966.23을 이용하여 미생물 TPC (Total Plate Count, 총 플레이트 수)를 결정함으로써 미생물학적 안정성을 평가하였다. 초기 동결된 FUM은 TPC가 9800 개/g이었다. 동결 건조 공정은 건조 물질 농도를 2.5배 증가시켰다. 하기 표 2는 20℃에서 3주 및 9주 동안 저장한 샘플 및 50℃에서 3주 동안 저장한 샘플 중에서의 미생물 TPC를 보여준다:
제제 첨가제 TPC /g *
20℃에서 저장 50℃에서
56일 동안 저장
3주 9주
가용성 커피 6300 <300 240
소르비톨 및 염화나트륨† 10,000 <300 750
실리카† 5500 <300 500
셀룰로스† 500 <300 100
R＆G 커피 6500 <300 380
*참조용 FUM 액체의 TPC/g은 9800이었음.
†효소 제제에 사용되는 통상의 안정화제.
모든 건조 샘플은 TPC에서의 유의한 감소를 나타내었다 (오직 농축 인자에 의해 증가한 값과는 대조적임). 커피 물질과 함께 제제화된 샘플은 다른 제제 물질과 동등하였다. 50℃에서 저장한 샘플에서의 계수는 20℃에서 저장한 샘플에 비해 훨씬 더 적었다. 20℃에서 9주 동안 저장하여 검정을 실시한 건조 샘플은 모두가 300 TPC/g 미만이었다. 이들 건조 샘플은 수분 활성이 매우 낮아서 미생물 성장이 억제된다. 건조된 샘플 모두에서 미생물 TPC는 허용가능한 수준으로 낮았다.
실시예 3: 본 실시예는 커피-유래의 물질에 의해 안정화된 액체 효소 제제의 제조를 예시한다. 실시예 1의 동결된 비제제화 만나나제 효소를 해동시키고, 하기하는 개개의 성분을 첨가 (20％로 첨가)하여 액체 제제를 제조하였다:
(1) 가용성 커피 (맥스웰 하우스(Maxwell House)®,
(2) 소르비톨 및 염화나트륨 (각각 10％씩), 및
(3) 대조군 FUM (첨가제 없음).
수성 액체 제제의 일부를 4℃, 20℃ 및 50℃에서 저장하였고, 상이한 시간 간격을 두고 샘플들을 꺼내서 실시예 1에서와 동일한 분석 기술로 효소 활성 및 미생물학적 검정을 수행하였다. 효소 활성 및 미생물학적 결과는 하기 표 3과 표 4에 각각 나타내었다:
제제 첨가제 상대 활성
4℃, 49일 20℃, 60일 50℃, 56일
대조군 97.5 31.9 11.1
소르비톨 및 염화나트륨† 47.6 32.3 19.0
가용성 커피 73.4 10.0 0
†효소 제제에 사용되는 통상의 안정화제.
제제 첨가제 TPC /g
4℃, 3주 20℃, 3주 50℃, 3주
대조군 3700 9.5×107 80
소르비톨 및 염화나트륨† 3600 530 270
가용성 커피 100 200 20
†효소 제제에 사용되는 통상의 안정화제.
여러 시간과 온도에서 저장된 액체 샘플에서의 효소 활성은 표 3에 나타내었다. 제제 성분들의 희석 효과로 인해, 제제화된 액체는 첨가제의 영향이 없다고 가정할 때 대조군 (즉, 비제제화 FUM) 활성의 약 60％를 보유할 것으로 예측되었다.
4℃에서 저장한 샘플의 경우, 비제제화 FUM의 활성은 7주 초과 저장 후일지라도 대조군 활성에 대하여 높은 비율(％) (즉, 97％ 초과)이었다. 놀랍게도, 7주 초과 동안 4℃에서 저장한 가용성 커피 제제에서의 활성은 대조군 활성의 73％ 초과였는데, 이것은 성분들이 영향을 주지 않는다고 가정할 때 60％로 예측되었던 값에 비하여 더 높은 것이다. 4℃에서 저장한 염화나트륨/소르비톨 제제의 활성은 대조군 활성의 47.6％였다.
50℃의 극도의 조건에서 8주 저장하는 동안, 비제제화 FUM은 대조군 활성의 11％만을 보유하였다. 가용성 커피 제제는 50℃에서 실제로 불용성인 겔을 형성하였고 본질적으로 모든 활성을 손실하였다. 20℃에서 저장하는 동안, 비제제화 FUM에서는 상당한 미생물 성장이 있었지만 (하기 참조), 대조군 효소 활성의 약 32％가 보유되었다. 이 물질은 미생물 성장 때문에 허용가능하지 않다. 상기 가용성 커피 제제는 대조군 활성의 10％만을 보유하였고 부분적으로 불용성인 겔이 형성되었다.
상기 데이타를 기초로 할 때, 가용성 커피는 냉장 조건 (4℃)하에 저장된 수성 액체 제제 중에서 효과적인 효소 활성 안정화제로 기능한다고 여겨진다. 그러나, 이것은 실온 (20℃) 저장 또는 보다 극도의 조건 (50℃)에서는 효과적이지 않다.
표 4에 나타난 바와 같이, 비제제화 대조군 FUM은 20℃에서 저장시에 미생물에 대해 불안정하여, 3주의 시간 동안 TPC가 급격하게 증가하였다. 그러나, 비제제화 대조군은 4℃에서 저장시에는 60％ 초과의 TPC 감소를 보였고, 50℃에서 저장시에는 99％ 초과의 TPC 감소를 보였다. 이것은, 초기에 존재하던 미생물의 일부가 저장 동안에 사멸했기 때문이라고 여겨진다. 반대로, 제제화된 샘플은 둘다 20℃에서 3주 동안 저장시에는 양호한 미생물 안정성을 보였고, 가용성 커피 제제에서 TPC가 약간 더 낮았다. 따라서, 40 중량％의 가용성 커피는 20℃ 저장 동안 미생물 성장을 억제한다. 20℃에서 6주 동안 저장했을 때, 상기 제제화된 샘플은 TPC 변화가 거의 없었다.

Claims (8)

1 중량% 내지 25 중량%의 효소 및 이 효소를 안정화시키기 위한 75 중량% 내지 99 중량%의 유효량의 커피-유래의 물질을 포함하는 건조된 형태의 안정화된 효소 조성물.
제1항에 있어서, 효소가 히드롤라제 효소인 안정화된 효소 조성물.
제2항에 있어서, 히드롤라제 효소가 만나나제, 셀룰라제, 글루카나제, 헤미셀룰라제, 리파제, 에스테라제, 프로테아제, 아라비나제, 갈락타나제, 아라비노-갈락타나제, 뉴클레아제, 펙티나제, 이소머라제, 아밀라제, 리그니나제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 안정화된 효소 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 커피-유래의 물질이 가용성 커피, 볶아서 분쇄한 커피, 커피 오일, 사용된 커피의 분쇄물, 분쇄된 커피 생원두, 수성 커피 추출물, 커피 생원두 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 안정화된 효소 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 20 ℃에서 저장시, 각각의 소르비톨 및 염화나트륨, 실리카, 및 셀룰로스 제제에 비하여 더 높은 상대 활성을 갖는 것인 안정화된 효소 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 50 ℃에서 저장시, 각각의 소르비톨 및 염화나트륨, 실리카, 및 셀룰로스 제제에 비하여 더 높은 상대 활성을 갖는 것인 안정화된 효소 조성물.
1 중량% 내지 25 중량%의 효소 및 이 효소를 안정화시키기 위한 10 중량% 내지 50 중량%의 유효량의 커피-유래의 물질을 함유하는 수성 조성물 형태의 안정화된 효소 조성물.
제7항에 있어서, 커피-유래의 물질이 가용성 커피, 볶아서 분쇄한 커피, 커피 오일, 사용된 커피의 분쇄물, 분쇄된 커피 생원두, 수성 커피 추출물, 커피 생원두 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 안정화된 효소 조성물.
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