CN117305278A - 一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117305278A
CN117305278A CN202311213751.7A CN202311213751A CN117305278A CN 117305278 A CN117305278 A CN 117305278A CN 202311213751 A CN202311213751 A CN 202311213751A CN 117305278 A CN117305278 A CN 117305278A
Authority
CN
China
Prior art keywords
beta
glucanase
solid preparation
preparation
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311213751.7A
Other languages
English (en)
Inventor
张红印
卢玉春
王凯利
谭竹青
苏盈盈
张钰
杨其亚
张晓云
赵利娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University
Original Assignee
Jiangsu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University filed Critical Jiangsu University
Priority to CN202311213751.7A priority Critical patent/CN117305278A/zh
Publication of CN117305278A publication Critical patent/CN117305278A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/02—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation containing fruit or vegetable juices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/70—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter
    • A23L2/84—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter using microorganisms or biological material, e.g. enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01039—Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase (3.2.1.39)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于酶制剂领域和食品添加剂领域，具体涉及一种β‑1，3‑葡聚糖酶固体制剂的制备方法及其应用；步骤为：在β‑1,3‑葡聚糖酶中加入甘油、海藻糖和甘氨酸，搅拌均匀后于‑20℃～‑80℃的条件下预冻2‑24h；预冻结束后，再进行真空冷冻干燥，经冷冻干燥后得到的产物即为基于β‑1，3‑葡聚糖酶的固体制剂。本发明首次实现了β‑1,3‑葡聚糖酶PeBgl1固体制剂在‑20℃保持90d酶活不低于90％，性状稳定，达到了市场商业化要求，便于生产、使用效果好；本发明对推进β‑1,3‑葡聚糖酶市场应用和发展具有重大意义。

Description

一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于酶制剂领域和食品添加剂领域，具体涉及一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法及其应用。
背景技术
β-1，3-葡聚糖是一种在自然界中广泛存在的高分子多糖，其主链是由葡萄糖在C1和C3位上通过β-1，3-糖苷键连接而成。由于β-1,3-糖苷键的连接方式及分子间的氢键相互作用，长链β-1,3-葡聚糖在天然状态下通常会呈现不同的螺旋型三级结构，这些特殊的三级结构赋予β-1,3-葡聚糖多样的生物功能，包括调节免疫力、促进肠道益生菌增殖，调节血糖平衡及降低胆固醇等。β-1,3-葡聚糖的生物活性及其特殊三级结构使其在食品、日化、医疗等领域受到广泛关注。
β-1,3-葡聚糖酶是一种在海洋大型藻类、真菌和植物中发现的，可以水解β-1,3-葡聚糖中的β-1,3-葡萄糖苷键的酶。β-1,3-葡聚糖酶在食品和医药领域有着广泛的应用价值，如制备低分子量β-1,3-葡寡糖、降低啤酒发酵液粘度、抑制果蔬采后病原真菌等。
但是关于酶制剂的研究一直是本领域的热点和难点；因为在工业化生产应用酶的时候，涉及到许多条件因素，比如温度、pH、光、金属离子以及各种氧化、还原剂等，均会对酶产生负面影响，所以如何提高酶的稳定性一直是个亟需解决的技术难题。
酶固体制剂化通过减少活性分子的结构变化，通常优选用于产品运输和储存。一般微生物固体制剂的制备可采用喷雾干燥法与冷冻干燥法。在这些干燥形式下，微生物可以方便地用于农业、工业和其他相关领域；但同时冷冻干燥会破坏细胞膜和蛋白质，从而降低酶的生存能力。因此，全面优化冷冻保护剂，以提高酶的存活和储存稳定性就显得尤为重要。
酶的主要应用是在洗涤剂、食品加工、动物营养、果汁和调味品、化妆品、医疗、制药、皮革、丝绸、化工等行业。只有当酶在温度、极端pH值以及在碱、酸、盐和表面活性剂存在的情况下稳定下来，工业化应用才是可行的。因此，需要能够稳定在不同条件下均具有活性的酶，酶的稳定性可以通过在非水环境中的稳定策略来提高，即可以采用将制剂固体化的形式。冷冻干燥，又称冻干，是一种依靠于样品中水升华的干燥过程，但针对冻干剂普遍面临的技术问题的产品稳定性较差；同时目前尚无β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的报道，且也没有对其冷冻保护剂的研究；
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于β-1，3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)的固体制剂及其制备方法，以提高酶的存活和储存稳定性，该法制备得到的β-1,3-葡聚糖酶固体制剂具有良好稳定性，可以在-20℃下保存90d，酶活保存率90％以上；解决了β-1,3-葡聚糖酶在常温下难保存的技术问题，可满足商业化生产和使用要求。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法，步骤如下：
首先在β-1,3-葡聚糖酶中加入甘油、海藻糖和甘氨酸，搅拌均匀后于-20℃～-80℃的条件下预冻2-24h；预冻结束后，再进行真空冷冻干燥，经冷冻干燥后得到的产物即为基于β-1，3-葡聚糖酶的固体制剂；所述甘油与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为0.5-1g：100mL，海藻糖与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为6-7g：100mL，甘氨酸与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为4-5g：100mL。
优选的，预冻的时间为12h。
优选的，所述甘油与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为1g：100mL，海藻糖与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为7g：100mL，甘氨酸与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为4g：100mL。
优选的，冻干燥处理的冷阱温度为-40℃--80℃，真空度为15-20Pa，干燥时间为48h。
所述β-1，3-葡聚糖降解酶的制备方法，步骤为：
(1)将重组工程菌涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，其中卡那霉素的终浓度为100μg/mL；经培养后挑取LB平板上长出的单克隆重组工程菌接种于LB液体培养基中，培养基中含有50μg/m的卡那霉素；于37℃，180rpm振荡培养12-16h，得到培养液；
将得到的培养液按照1：100的体积比转接到LB液体培养基中，培养基中含有50μg/m的卡那霉素；于37℃，180rpm培养3-4h，至OD值达到0.6-0.8之间；然后在LB液体培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使培养基中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的终浓度为0.8mM，在16℃培养20h，得到大肠杆菌培养液；
其中，将β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的编码基因，利用NcoI和XhoI酶切后，插入质粒pET-30a，得到表达重组表达载体，再导入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后，得到重组工程菌；
(2)首先大肠杆菌培养液于4℃，8000rpm下进行离心15min，倒掉上清液，保留菌体；然后用pH 7.0的5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液将菌体重悬得到重悬液，再于10000rpm、4℃条件下离心5min，倒掉上清液后，再次加入5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬菌体，其中缓冲液与菌体的用量比为2-3mL：1g，得到细胞悬液；
(3)使用细胞超声破碎细胞仪，对得到的细胞悬液进行细胞破碎处理；将细胞悬液的置于冰中，破碎仪振幅杆深入到细胞悬液中，不要使振幅杆贴壁；工作功率设置为30％，破碎3s，休息3s，持续30min；破碎结束后在11000rpm、4℃条件下离心20min，收集上清液；
(4)上清液用0.22μm的无菌滤头过滤，即获得β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1。
本发明所使用的β-1，3-葡聚糖酶(PeBgl1)均为通过上述方法制备的酶液。
本发明还提供了一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的用途；
本发明所制备的固体制剂用于提高果蔬出汁率和澄清度的用途，每毫升榨汁液中加入1-2g的β-1，3-葡聚糖酶固体制剂；所述果蔬包括苹果。
一种用于提高果蔬出汁率和澄清度的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂包括上述方法制备的β-1，3-葡聚糖酶固体制剂。
有益效果：
本发明首次实现了β-1,3-葡聚糖酶PeBgl1固体制剂在-20℃保持90d酶活不低于90％，性状稳定，达到了市场商业化要求，便于生产、使用效果好。本发明对推进β-1,3-葡聚糖酶市场应用和发展具有重大意义。
本发明中β-1,3-葡聚糖酶PeBgl1固体酶制剂配方中所涉及到各种成分成本低廉易得，均为食品级别来源，同时也符合食品安全和食品添加剂等相关国家标准要求，安全环保。此外，本发明提供的固体酶制剂制备工艺科学合理，简化了操作步骤；而且生产高效，几乎无酶活损失，大大提高了生产效率。本发明符合国家推广的节能环保、健康用酶、绿色经济的理念。
附图说明
图1为预冻温度-20℃和-80℃下对PeBgl1酶活的影响；不同小写字母代表差异显著(P＜0.05)。
图2为不同预冻时间对PeBgl1酶活的影响；预冻时间分别是0h、2h、12h、18h和24h；不同小写字母代表差异显著(P＜0.05)。
图3为不同保护剂对PeBgl1酶活的影响；注：CK：为对照组(蒸馏水)；Glycerine：甘油；Mannitol：甘露醇；Trehalose：海藻糖；Sorbitol：山梨糖醇；Glycine：甘氨酸；Ascorbicacid：抗坏血酸；Sucrose：蔗糖；PEG 20000：聚乙二醇20000；SDS：十二烷基磺酸钠；Phenylalanine：苯丙氨酸；Tween 20：吐温20；不同小写字母代表差异显著(P＜0.05)。
图4为最佳保护剂配方固体制剂在储存温度为4℃和-20℃时在不用天数下对PeBgl1固体酶活的影响；对应的不同天数分别为60d、75d和90d；不同小写字母代表差异显著(P＜0.05)。
图5为储存时间分别为90d和120d时PeBgl1固体制剂对苹果出汁率的影响；不同小写字母代表差异显著(P＜0.05)。
图6为储存时间分别为90d和120d时PeBgl1固体制剂对苹果澄清度的影响；不同小写字母代表差异显著(P＜0.05)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实验材料和试剂：海藻糖购自南京草本源生物科技有限公司，其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
本发明的β-1，3-葡聚糖降解酶(PeBgl1)来源于扩展青霉(Penicilliumexpansum，其来源自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：CGMCC NO.3.15686)，经鉴定属于糖苷水解酶GH128家族。β-1，3-葡聚糖降解酶的获取方法公开自专利202310052175.6。
β-1，3-葡聚糖降解酶的制备方法，步骤如下：
(1)将重组工程菌涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，其中卡那霉素的终浓度为100μg/mL；经培养后挑取LB平板上长出的单克隆重组工程菌接种于LB液体培养基中，培养基中含有50μg/m的卡那霉素；于37℃，180rpm振荡培养12-16h，得到培养液；
将得到的培养液按照1：100的体积比转接到LB液体培养基中，培养基中含有50μg/m的卡那霉素；于37℃，180rpm培养3-4h，至OD值达到0.6-0.8之间；然后在LB液体培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使培养基中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的终浓度为0.8mM，在16℃培养20h，得到大肠杆菌培养液；
其中，将β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的编码基因，利用NcoI和XhoI酶切后，插入质粒pET-30a，得到表达重组表达载体，再导入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后，得到重组工程菌；
(2)首先大肠杆菌培养液于4℃，8000rpm下进行离心15min，倒掉上清液，保留菌体；然后用pH 7.0的5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液将菌体重悬得到重悬液，再于10000rpm、4℃条件下离心5min，倒掉上清液后，再次加入5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬菌体，其中缓冲液与菌体的用量比为2-3mL：1g，得到细胞悬液；
(3)使用细胞超声破碎细胞仪，对得到的细胞悬液进行细胞破碎处理；将细胞悬液的置于冰中，破碎仪振幅杆深入到细胞悬液中，不要使振幅杆贴壁；工作功率设置为30％，破碎3s，休息3s，持续30min；破碎结束后在11000rpm、4℃条件下离心20min，收集上清液；
(4)上清液用0.22μm的无菌滤头过滤，即获得β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1。
实施例1：条件筛选：
(1)预冻温度和预冻时间对酶活稳定性的影响
将β-1,3-葡聚糖酶在分别在-20℃、-80℃的条件下预冻2h后，用封口膜密封后放入冷阱中，控制冷阱温度为-40℃，真空度为15Pa，启动冻干机，干燥时间为48h；冻干结束后，取出冻干粉末，测定其相对酶活。
将β-1,3-葡聚糖酶分别在预冻温度为-20℃和-80℃时测定相对酶活的变化。如图1所示，可以看出预冻温度不论是-20℃还是-80℃，对酶活稳定性没有显著影响。
(2)将β-1,3-葡聚糖酶分装到干燥的离心管中，将离心管放入-80℃的冰箱中，进行预冻；预冻时间分别设置为2h、6h、12h、18h、24h；预冻后在进行冷冻干燥，控制冷阱温度为-40℃，真空度为15Pa，启动冻干机，干燥时间为48h；冻干结束后，取出冻干粉末，测定其相对酶活。
根据图2中β-1,3-葡聚糖酶在不同预冻时间下的相对酶活变化曲线可以看出，在预冻时间为0h-12h期间，相对酶活逐渐升高并最终达到最优状态。然而，当预冻时间超过12h时，相对酶活反而开始下降；18h-24h时，相对酶活又呈现上升趋势，但仍低于12h时的酶活。综合考虑，最终选择12h作为PeBgl1固体制剂的预冻时间。
(3)不同保护剂对酶活稳定性的影响
(a)为了比较不同醇类对酶活的影响，向酶液中分别添加聚乙二醇、甘油、甘露醇和山梨醇，用量比均为1g：100mL。预冻12h后再进行冷冻干燥，控制冷阱温度为-40℃，真空度为15Pa，启动冻干机，干燥时间为48h；冻干结束后，取出冻干粉末，测定其相对酶活。
(b)为了比较不同糖类对酶活的影响，向酶液中分别加入海藻糖和蔗糖，用量比均为1g：100mL。预冻12h后再进行冷冻干燥，控制冷阱温度为-40℃，真空度为15Pa，启动冻干机，干燥时间为48h；冻干结束后，取出冻干粉末，测定其相对酶活。
(c)为了比较不同氨基酸和其他添加剂对酶活的影响，向酶液中分别加入抗坏血酸、甘氨酸、苯丙氨酸、吐温20和SDS，用量比均为1g：100mL。预冻12h后再进行冷冻干燥，控制冷阱温度为-40℃，真空度为15Pa，启动冻干机，干燥时间为48h；冻干结束后，取出冻干粉末，测定其相对酶活。
由图3可知，对照组(CK)中酶活力损失60.73％，甘油和甘露醇的保护作用明显优于聚乙二醇和山梨醇，因此醇类保护剂选择甘油和甘露醇作进一步浓度的确定。
糖类保护剂选择海藻糖，氨基酸类保护剂及其他添加剂选择甘氨酸。
(4)响应面交互分析在不同保护剂下PeBgl1固体制剂的最优配方
进一步确定甘油、海藻糖和甘氨酸组合使用的浓度的取值范围。使用DesignExpert 8.0.6软件中的Box-Behnken Design方法，设计试验方案，确定各因素的水平。在试验完成后，利用Design Expert 8.0.6软件进行数据分析，建立响应面模型，预测不同保护剂下PeBgl1固体制剂的最优配方。
以甘油浓度(A)，海藻糖浓度(B)，甘氨酸浓度(C)为影响因素，以酶活保留率(Y)为响应指标进行回归拟合，得到二次多项回归方程：
Y＝50.77+0.35A-3.87B-17.13C+4.78AB-8.77AC+6.09BC+4.30A2-16.39B2+15.12C2。
根据模型预测结果，选择酶活保留率最高的配方作为最优配方，进行后续试验验证。
响应面试验结果见表1，响应面回归模型的方差分析见表2.
表1响应面试验结果
表2响应面回归模型的方差分析
通过表1可看出响应面分析预测得到PeBgl1固体制剂最优保护剂复配方案为:甘油1g：100mL，海藻糖：7g:100mL，甘氨酸为4g:100mL，在该方案下预测得到的PeBgl1固体制剂酶活保留率为94.25％。
由表2可看出，回归模型的F值为3.73，检验了回归模型的良好性和合理性；模型显著性检验P值为0.0483<0.05，说明模型具有统计学意义；失拟项P值为0.8121>0.05，说明模型与试验拟合良好，不存在反转因素；R2为0.8275，表明反应中82.75％的变异性可以由模型解释。由此可见，这个回归方程可以代替试验的真实点来分析试验结果，可以用于预测和分析PeBgl1固体酶制剂的最优复配保护剂。
实施例2：
β-1,3-葡聚糖酶固体制剂的制备：
在β-1,3-葡聚糖酶中加入甘油、海藻糖和甘氨酸，其中甘油与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为1g：100mL，海藻糖与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为7g：100mL，甘氨酸与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为4g：100mL；
搅拌均匀后于-80℃的条件下预冻12h；预冻结束后，再进行冷冻干燥，控制冷阱温度为-40℃，真空度为15Pa，启动冻干机，干燥时间为48h；冻干结束后，取出冻干粉末，即为β-1,3-葡聚糖酶固体制剂。
实施例3：PeBgl1固体制剂在贮藏期间的存活率
基于实施例2制备的β-1,3-葡聚糖酶固体制剂，于4℃和-20℃条件下分别保存，在该制剂贮藏期的第60d，75d和90d测定该制剂的PeBgl1存活率。
图4为在4℃和-20℃条件下使用最佳保护剂配方的PeBgl1固体制剂酶活保留率的变化。随着储藏时间的延长，PeBgl1酶制剂的活力均有略微下降的趋势。在保藏60d后，固体酶制剂剩余活力在4℃有75.37％，在-20℃有98.64％；当保存90d后，固体酶制剂剩余活力在4℃有71.55％，在-20℃有90.15％。结果表明，PeBgl1酶固体制剂具有良好的储存性能。
实施例4：PeBgl1制剂在贮藏期间对苹果果汁的影响
挑选新鲜、无虫害、无腐烂苹果，用清水冲洗，去除果皮和果核，切成1cm3左右大小的块状，按料液比1g：1mL浸泡于0.1％的抗坏血酸水溶液中护色，浸泡时间为10-13min；然后混合榨汁后，取150μL的混合液，将其预热至55℃，在充分搅拌下加入实施例2制备的PeBgl1固体酶制剂0.2g进行酶解，酶解的时间为30min；苹果汁酶解后采用纱布过滤，得到滤液。
再将滤液采用85℃灭酶5min，冷却后6000r/min离心4min，得到澄清苹果汁。计算苹果汁的出汁率(以未加酶为对照组)。
出汁率的计算公式如下：
澄清度的测定：采用紫外-可见光分光光度计在660nm处测定苹果汁的透光率(％)，以蒸馏水为参比。
图5结果显示，与对照组(CK，55.4％)相比，-20℃条件下保存90d的固体PeBgl1酶制剂(solid，60.2％)能显著提高苹果果汁的出汁率。在-20℃条件下保存120d，PeBgl1酶制剂对苹果汁出汁率以及澄清度无不良影响。-20℃条件下保存90d的固体PeBgl1酶制剂能显著提高苹果汁的澄清度，对其实际应用具有重要意义。
说明：以上所述仅为本发明的优选实施案例和应用案例而己，并不局限于本发明，对于本领域及相关领域的科研与技术人员来说，本发明可以很容易有各种更改和变化。凡在本发明的思路和原则之内，所作的任何修改、等同替换、方法改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
首先在β-1,3-葡聚糖酶中加入甘油、海藻糖和甘氨酸，搅拌均匀后于-20℃～-80℃的条件下预冻2-24h；预冻结束后，再进行真空冷冻干燥，经冷冻干燥后得到的产物即为基于β-1，3-葡聚糖酶的固体制剂；所述甘油与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为0.5-1g：100mL，海藻糖与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为6-7g：100mL，甘氨酸与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为4-5g：100mL。
2.根据权利要求1所述的一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法，其特征在于，预冻的时间为12h。
3.根据权利要求1所述的一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法，其特征在于，所述甘油与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为1g：100mL。
4.根据权利要求1所述的一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法，其特征在于，海藻糖与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为7g：100mL。
5.根据权利要求1所述的一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法，其特征在于，甘氨酸与β-1,3-葡聚糖酶的用量关系为4g：100mL。
6.根据权利要求1所述的一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法，其特征在于，冻干燥处理的冷阱温度为-40℃-80℃，真空度为15-20Pa，干燥时间为48h。
7.根据权利要求1-6任一所述方法制备的β-1，3-葡聚糖酶固体制剂。
8.根据权利要求7所述的β-1，3-葡聚糖酶固体制剂用于提高果蔬出汁率和澄清度的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述果蔬包括苹果；固体制剂的添加量为：每毫升榨汁液中加入1-2g的β-1，3-葡聚糖酶固体制剂。
10.一种用于提高果蔬出汁率和澄清度的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂包括权利要求1-6任一所述方法制备的β-1，3-葡聚糖酶固体制剂。
CN202311213751.7A 2023-09-20 2023-09-20 一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法及其应用 Pending CN117305278A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311213751.7A CN117305278A (zh) 2023-09-20 2023-09-20 一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311213751.7A CN117305278A (zh) 2023-09-20 2023-09-20 一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117305278A true CN117305278A (zh) 2023-12-29

Family

ID=89236454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311213751.7A Pending CN117305278A (zh) 2023-09-20 2023-09-20 一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117305278A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105420111A (zh) 一种提高植物乳杆菌冻干存活率的复合保护剂及其制备方法
CN106754525B (zh) 副干酪乳杆菌n1115冻干粉发酵剂及其制备方法
BR112013033322B1 (pt) Processo para produzir derivados de quitina
CN102599335B (zh) 复合微生物发酵牧草饲料的制备方法
CN107006452A (zh) 一种人脐带间充质干细胞源外泌体冻干保存方法及其应用
CN102337313B (zh) 一种制备海藻糖的方法
CN109055227B (zh) 基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂及其保藏方法
CN112646789B (zh) 一种从神州草中提取超氧化物歧化酶的工业化生产方法
CN108203729B (zh) 一种巨藻抗氧化肽的制备方法
CN109504614A (zh) 一种本土酿酒酵母干粉的制备方法
CN103320419B (zh) 应用于高渗透压环境食品的共固定化凝胶颗粒及其应用
CN117305278A (zh) 一种β-1，3-葡聚糖酶固体制剂的制备方法及其应用
CN103602617A (zh) 一种直投式木葡萄糖酸醋杆菌发酵剂及其制备方法
JP2747206B2 (ja) 高血糖改善用組成物
JP4180108B1 (ja) 醗酵生成物の製造方法および醗酵生成物
CN105999281A (zh) 禽类活病毒用冻干保护剂、制备方法及应用
CN110151566A (zh) 一种含猪皮胶原多肽的护肤冻干粉及其制备
CN103397068B (zh) 一种蝇蛆肽的制备方法
CN112522114B (zh) 蛹虫草菌糠提取液和灵芝发酵产物及其制备方法和应用
CN112485451B (zh) 一种白介素6冻干校准品及其制备方法与冻干保护液
CN110699346A (zh) 葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法
ES2650273T3 (es) Método para la fermentación alcohólica de mosto de miel, con alto contenido de azúcar
CN113817710A (zh) 一种琼胶酶冻干保护剂及琼胶酶的保存方法
CZ288826B6 (cs) Směs nízkomolekulárních účinných látek z kvasinek a způsob její výroby
CN111690705A (zh) 一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination