CN109486747A - 一种间充质干细胞复苏保护液、制备方法和复苏方法 - Google Patents

一种间充质干细胞复苏保护液、制备方法和复苏方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞复苏保护液、制备方法和复苏方法。复苏保护液包括细胞培养原液、新鲜培养基、左旋肉碱和海藻糖。复苏方法包括：将冻存的间充质干细胞取出，先在42‑45℃放置至开始融化，然后转入37‑40℃放置至完全融化；然后加入复苏保护液混匀，离心，对沉淀进行清洗；向清洗好的间充质干细胞中加入复苏保护液，调整细胞密度后进行培养，24h后更换为完全培养基，然后按常规技术继续培养。本发明通过特定的组分组成的复苏保护液，各组分之间协同起作用，不仅仅作为复苏细胞使用，还可作为细胞清洗液使用。将复苏保护液与复苏方法结合对间充质干细胞进行复苏可明显提高细胞复苏后存在的细胞回收率和生物学活性。

Description

一种间充质干细胞复苏保护液、制备方法和复苏方法
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种间充质干细胞复苏保护液、制备方法和复苏方法。
背景技术
间充质干细胞细胞是具有自我复制能力和多向分化能力的干细胞，具有免疫原性低，细胞原始性强的优点，已经成为细胞治疗中的重要种子细胞。冻存与复苏是间充质干细胞发挥治疗作用的基础，尤其是细胞复苏后的回收率与生物学活性对间充质干细胞的治疗能力有重要的影响。目前对间充质干细胞进行复苏，一般都采用生理盐水、PBS缓冲液或培养基进行清洗，存在复苏后细胞回收率与生物学活性较低的缺点。因此，研究一种用于提高复苏后细胞回收率和生物学活性的间充质干细胞复苏保护液是亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种间充质干细胞复苏保护液、制备方法和复苏方法，可有效解决间充质干细胞复苏后存在的细胞回收率和生物学活性低的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种间充质干细胞复苏保护液，包括细胞培养原液、新鲜培养基、左旋肉碱和海藻糖，复苏保护液的pH值为7.2-7.6；其中，新鲜培养基和细胞培养原液的体积比为1:0.7-1.0，左旋肉碱和海藻糖的终浓度分别为1-5mg/mL、0.1-0.3mg/mL。
进一步地，新鲜培养基和细胞培养原液的体积比为1:1。
进一步地，左旋肉碱和海藻糖的终浓度分别为3mg/mL、0.2mg/mL。
进一步地，新鲜培养基为新鲜的完全培养基(生产商为Gibco)。
进一步地，细胞培养原液为培养完细胞，将细胞分离后剩余的培养基，其中VEGF含量高于60pg/mL，EGF含量高于25pg/mL，FGF含量高于80pg/mL，HGF含量高于760pg/mL，TGF含量高于70pg/mL，IGF-1含量高于0.03ng/mL。
进一步地，间充质干细胞为胎盘源间充质干细胞、乳牙源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞或子宫内膜源间充质干细胞。
上述间充质干细胞复苏保护液的制备方法包括以下步骤：将新鲜培养基和细胞培养原液混合，然后再加入左旋肉碱和海藻糖，混匀，然后调节溶液pH值为7.2-7.6，制得。
采用上述复苏保护液复苏间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
(1)将冻存的间充质干细胞取出，先在42-45℃放置至开始融化，然后转入37-40℃放置至完全融化；
(2)向步骤(1)所得物中加入复苏保护液，混匀，于4℃、500-800×g条件下离心3-5min，然后用复苏保护液对细胞进行清洗；
(3)向清洗好的间充质干细胞中加入复苏保护液，调整细胞密度后进行培养，24h后更换为完全培养基，然后按常规技术继续培养。
进一步地，步骤(1)中先在42℃放置至开始融化，然后转入37℃放置至完全融化。
本发明提供的间充质干细胞复苏保护液、制备方法和复苏方法，具有以下有益效果：
细胞经过冻存过程，细胞膜结构受损，透性增加，细胞复苏过程中的渗透压冲击会影响细胞活性，复苏后离心时的剪切力对细胞的冲击较大，从而加剧了细胞损伤甚至裂解死亡，造成复苏离心清洗后回收率下降或活性降低。
为了解决上述的问题，本发明中在复苏保护液中加入左旋肉碱，该成分在细胞复苏过程中能够起到平衡渗透压，保护复苏的细胞的作用，进而能够显著提升间充质干细胞的复苏回收率和复苏后细胞的生物学活性。
本发明中所加入的海藻糖能够在细胞表面形成独特的保护膜，可有效保护细胞膜的蛋白质分子结构及功能。
本发明复苏保护液中还加入了细胞培养原液，细胞培养原液是经过细胞培养过程的培养基，在细胞的培养过程中，会分泌大量的具有膜结构的囊泡至细胞培养原液中，细胞培养原液中包含多种因子蛋白，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子β、MAPK通路信号分子、RHO通路信号分子、Tie-2/TEK及细胞黏附分子等，能够降低复苏过程中对间充质干细胞的破坏，同时还可提高间充质干细胞的贴壁率，进而提高复苏后细胞的生物学活性和回收率。
本发明通过特定的组分组成的复苏保护液，各组分之间协同起作用，不仅仅作为复苏细胞使用，还可作为细胞清洗液使用，传统技术中对复苏的细胞常采用盐水或PBS缓冲液进行清洗，而本申请中则采用复苏保护液进行清洗，可以提高细胞的适应能力，提高细胞活性。
在细胞复苏过程中，先在42-45℃优选42℃条件下使冻存细胞液快速融化，当开始进入融化过程时，再将温度降为37-40℃，优选37℃，使冻存细胞液完全融化，通过这种复苏方式能够明显缩短细胞复苏的时间，且对细胞无任何损失，从而提高了活细胞的复苏回收率。
具体实施方式
实施例1
一种间充质干细胞复苏保护液，包括细胞培养原液、新鲜培养基、左旋肉碱和海藻糖，复苏保护液的pH值为7.2-7.6；其中，新鲜培养基和细胞培养原液的体积比为1:1，左旋肉碱和海藻糖的终浓度分别为1mg/mL、0.2mg/mL。
上述新鲜培养基为新鲜的完全培养基(生产商为Gibco)；细胞培养原液为培养完胎盘间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量为286.09pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量为32.09pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量为161.26pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量为7586.54pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量为78.53pg/mL，IGF-1含量为0.54ng/mL。
上述间充质干细胞复苏保护液的制备方法包括以下步骤：将新鲜培养基和细胞培养原液混合，然后再加入左旋肉碱和海藻糖，混匀，然后调节溶液pH值为7.2-7.6，制得。
采用上述复苏保护液复苏胎盘源间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
(1)开启两个水浴锅，温度分别调整至42℃和37℃；
(2)将液氮中保存的胎盘源间充质干细胞取出，放置于含少量液氮的白色塑料泡沫箱中保持低温；
(3)将白色泡沫箱移动至两个水浴锅旁，将含有细胞的冻存管(1-1.5mL)取出，先在42℃放置至开始融化(30-50s)，然后转入37℃放置至完全融化(30-60s)；
(4)将步骤(3)所得物吸至50mL离心管中，逐滴缓缓加入复苏保护液10mL，稍加混匀后，继续加入复苏保护液至总体积为40mL，然后于4℃、800×g条件下离心3min，然后用复苏保护液对细胞进行清洗；
(5)向清洗好的间充质干细胞中加入复苏保护液，调整细胞密度后放入培养瓶中进行培养，24h后更换为完全培养基，然后按常规技术继续培养。
实施例2
一种间充质干细胞复苏保护液，包括细胞培养原液、新鲜培养基、左旋肉碱和海藻糖，复苏保护液的pH值为7.2-7.6；其中，新鲜培养基和细胞培养原液的体积比为1:1，左旋肉碱和海藻糖的终浓度分别为3mg/mL、0.2mg/mL。
上述新鲜培养基为新鲜的完全培养基(生产商为Gibco)；细胞培养原液为培养完胎盘间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量高于260pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量高于30pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量高于150pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量高于7500pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量高于70pg/mL，IGF-1含量高于0.5ng/mL。
上述间充质干细胞复苏保护液的制备方法包括以下步骤：将新鲜培养基和细胞培养原液混合，然后再加入左旋肉碱和海藻糖，混匀，然后调节溶液pH值为7.2-7.6，制得。
采用上述复苏保护液复苏胎盘源间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
(1)开启两个水浴锅，温度分别调整至42℃和37℃；
(2)将液氮中保存的胎盘源间充质干细胞取出，放置于含少量液氮的白色塑料泡沫箱中保持低温；
(3)将白色泡沫箱移动至两个水浴锅旁，将含有细胞的冻存管(1-1.5mL)取出，先在42℃放置至开始融化(30-50s)，然后转入37℃放置至完全融化(30-60s)；
(4)将步骤(3)所得物吸入至50mL离心管中，逐滴缓缓加入复苏保护液10mL，稍加混匀后，继续加入复苏保护液至总体积为40mL，然后于4℃、800×g条件下离心3min，然后用复苏保护液对细胞进行清洗；
(5)向清洗好的间充质干细胞中加入复苏保护液，调整细胞密度后放入培养瓶中进行培养，24h后更换为完全培养基，然后按常规技术继续培养。
实施例3
一种间充质干细胞复苏保护液，包括细胞培养原液、新鲜培养基、左旋肉碱和海藻糖，复苏保护液的pH值为7.2-7.6；其中，新鲜培养基和细胞培养原液的体积比为1:1，左旋肉碱和海藻糖的终浓度分别为5mg/mL、0.2mg/mL。
上述新鲜培养基为新鲜的完全培养基(生产商为Gibco)；细胞培养原液为培养完胎盘间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量高于260pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量高于30pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量高于150pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量高于7500pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量高于70pg/mL，IGF-1含量高于0.5ng/mL。
上述间充质干细胞复苏保护液的制备方法包括以下步骤：将新鲜培养基和细胞培养原液混合，然后再加入左旋肉碱和海藻糖，混匀，然后调节溶液pH值为7.2-7.6，制得。
采用上述复苏保护液复苏胎盘源间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
(1)开启两个水浴锅，温度分别调整至42℃和37℃；
(2)将液氮中保存的胎盘源间充质干细胞取出，放置于含少量液氮的白色塑料泡沫箱中保持低温；
(3)将白色泡沫箱移动至两个水浴锅旁，将含有细胞的冻存管(1-1.5mL)取出，先在42℃放置至开始融化(30-50s)，然后转入37℃放置至完全融化(30-60s)；
(4)将步骤(3)所得物吸入至50mL离心管中，逐滴缓缓加入复苏保护液10mL，稍加混匀后，继续加入复苏保护液至总体积为40mL，然后于4℃、800×g条件下离心3min，然后用复苏保护液对细胞进行清洗；
(5)向清洗好的间充质干细胞中加入复苏保护液，调整细胞密度后放入培养瓶中进行培养，24h后更换为完全培养基，然后按常规技术继续培养。
实施例4
实施例4中与实施例1不同之处为：复苏保护液中采用的细胞培养原液为培养完乳牙源间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量为550pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量为42pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量为310pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量为5080pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量为650pg/mL，IGF-1含量为0.8ng/mL。
复苏保护液中其他组分及含量与实施例1相同，制备方法相同，但该实施例对乳牙源间充质干细胞进行复苏，复苏方法与实施例1相同。
实施例5
实施例5中与实施例2不同之处为：复苏保护液中采用的细胞培养原液为培养完乳牙源间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量为550pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量为42pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量为310pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量为5080pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量为650pg/mL，IGF-1含量为0.8ng/mL。
复苏保护液中其他组分及含量与实施例2相同，制备方法相同，但该实施例对乳牙源间充质干细胞进行复苏，复苏方法与实施例2相同。
实施例6
实施例6中与实施例3不同之处为：复苏保护液中采用的细胞培养原液为培养完乳牙源间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量为550pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量为42pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量为310pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量为5080pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量为650pg/mL，IGF-1含量为0.8ng/mL。
复苏保护液中其他组分及含量与实施例3相同，制备方法相同，但该实施例对乳牙源间充质干细胞进行复苏，复苏方法与实施例3相同。
实施例7
实施例7中与实施例1不同之处为：复苏保护液中采用的细胞培养原液为培养完脂肪源间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量为436pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量为29pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量为500pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量为760pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量为230pg/mL，IGF-1含量为0.04ng/mL。
复苏保护液中其他组分及含量与实施例1相同，制备方法相同，但该实施例对脂肪源间充质干细胞进行复苏，复苏方法与实施例1相同。
实施例8
实施例8中与实施例2不同之处为：复苏保护液中采用的细胞培养原液为培养完脂肪源间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量为436pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量为29pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量为500pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量为760pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量为230pg/mL，IGF-1含量为0.04ng/mL。
复苏保护液中其他组分及含量与实施例2相同，制备方法相同，但该实施例对脂肪源间充质干细胞进行复苏，复苏方法与实施例2相同。
实施例9
实施例9中与实施例3不同之处为：复苏保护液中采用的细胞培养原液为培养完脂肪源间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量为436pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量为29pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量为500pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量为760pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量为230pg/mL，IGF-1含量为0.04ng/mL。
复苏保护液中其他组分及含量与实施例3相同，制备方法相同，但该实施例对脂肪源间充质干细胞进行复苏，复苏方法与实施例3相同。
实施例10
实施例10中与实施例1不同之处为：复苏保护液中采用的细胞培养原液为培养完子宫内膜源间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量为60pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量为100pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量为1020pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量为3300pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量为430pg/mL，IGF-1含量为0.09ng/mL。
复苏保护液中其他组分及含量与实施例1相同，制备方法相同，但该实施例对脂肪源间充质干细胞进行复苏，复苏方法与实施例1相同。
实施例11
实施例11中与实施例2不同之处为：复苏保护液中采用的细胞培养原液为培养完子宫内膜源间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量为60pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量为100pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量为1020pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量为3300pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量为430pg/mL，IGF-1含量为0.09ng/mL。
复苏保护液中其他组分及含量与实施例2相同，制备方法相同，但该实施例对脂肪源间充质干细胞进行复苏，复苏方法与实施例2相同。
实施例12
实施例12中与实施例3不同之处为：复苏保护液中采用的细胞培养原液为培养完子宫内膜源间充质干细胞，将细胞分离后剩余的培养基(分离后的细胞用于冻存，复苏时采用的复苏保护液中的细胞培养原液便是培养过这批细胞的细胞原液)，细胞培养原液的保存期限不超过1年，其中VEGF(血管内皮生长因子)含量为60pg/mL，EGF(表皮生长因子)含量为100pg/mL，FGF(成纤维细胞生长因子)含量为1020pg/mL，HGF(肝细胞生长因子)含量为3300pg/mL，TGF(胰岛素样生长因子)含量为430pg/mL，IGF-1含量为0.09ng/mL。
复苏保护液中其他组分及含量与实施例3相同，制备方法相同，但该实施例对脂肪源间充质干细胞进行复苏，复苏方法与实施例3相同。
对比例1
胎盘间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
(1)将液氮冻存的胎盘源间充质干细胞取出，放置于含少量液氮的白色塑料泡沫箱中保持低温；
(2)将白色泡沫箱移动至水浴锅旁，将含有细胞的冻存管(1-1.5mL)取出，置于37℃水浴锅中不断摇动至内容物完全融化；
(3)将步骤(2)所得物吸至50mL离心管中，逐滴缓缓加入完全培养基10mL，稍加混匀后，继续加入完全培养基至总体积为40mL，然后于4℃、800×g条件下离心3min，然后用完全培养基对细胞进行清洗；
(4)向清洗好的间充质干细胞中加入完全培养基，调整细胞密度后放入培养瓶中进行培养。
对比例2
采用对比例1中的复苏方法对乳牙源间充质干细胞进行培养。
对比例3
采用对比例1中的复苏方法对脂肪源间充质干细胞进行培养。
对比例4
采用对比例1中的复苏方法对子宫内膜源间充质干细胞进行培养。
对比例5
对比例5中的复苏保护液与实施例1相同，但复苏方法有差异，以胎盘间充质干细胞为例，具体复苏过程包括以下步骤：
(1)将液氮冻存的胎盘源间充质干细胞取出，放置于含少量液氮的白色塑料泡沫箱中保持低温；
(2)将白色泡沫箱移动至水浴锅旁，将含有细胞的冻存管(1-1.5mL)取出，置于37℃水浴锅中不断摇动至内容物完全融化；
(3)将步骤(2)所得物吸至50mL离心管中，逐滴缓缓加入复苏保护液10mL，稍加混匀后，继续加入复苏保护液至总体积为40mL，然后于4℃、800×g条件下离心3min，然后用复苏保护液对细胞进行清洗；
(4)向清洗好的间充质干细胞中加入复苏保护液，调整细胞密度后放入培养瓶中进行培养，24h后更换为完全培养基，然后按常规技术继续培养。
对实施例1-12及对比例1-4复苏后的细胞进行检测，检测其活细胞回收率。
活细胞回收率＝复苏后活细胞总数/冻存前活细胞总数*100％
细胞活细胞回收率见表1-5。
表1实施例1-3中胎盘源间充质干细胞活细胞回收率
实施例1 实施例2 实施例3
活细胞回收率％ 95.1％ 95.3％ 94.9％
表2实施例4-6中乳牙源间充质干细胞活细胞回收率
实施例4 实施例5 实施例6
活细胞回收率％ 90.5％ 90.8％ 90.1％
表3实施例7-9中脂肪源间充质干细胞活细胞回收率
实施例7 实施例8 实施例9
活细胞回收率％ 92.2％ 92.8％ 91.8％
表4实施例10-12中子宫内膜源间充质干细胞活细胞回收率
实施例10 实施例11 实施例12
活细胞回收率％ 89.4％ 90.5％ 89.1％
表5对比例1-4中子宫内膜源间充质干细胞活细胞回收率
对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
活细胞回收率％ 77.1％ 80.0％ 74.9％ 72.7％ 83.5％
由表1-表5可知，采用本发明提供的复苏保护液和复苏方法对不同来源的间充质干细胞进行复苏，其活细胞回收率明显高于对比例中常规复苏方法复苏的活细胞回收率，也高于采用本发明提供的复苏保护液及常规复苏方法进行复苏后的细胞回收率，说明只有将本发明提供的复苏保护液及复苏方法同时用于复苏过程后，才能明显提高细胞活细胞回收率。
对实施例1、4、7、10以及对比例1-5进行贴壁率检测，细胞贴壁率的检测过程具体为：细胞复苏后对细胞进行计数，对复苏后的细胞进行清洗(对比例用完全培养基进行清洗，本发明用复苏保护液进行清洗)，得细胞沉淀，然后用完全培养基进行重悬，经过计数后接种培养，培养0.5h，1h，2h，4h，8h后分别用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，用新鲜的完全培养基重悬并用台酚蓝染色计数，计算细胞的贴壁率。
细胞贴壁率％＝贴壁培养后活细胞数/复苏后活细胞数*100％
细胞贴壁率结果见表6。
表6细胞贴壁率结果
通过表6可知，采用本发明提供的复苏保护液对不同来源的间充质细胞进行复苏和清洗，然后进行培养，培养过程中活细胞的贴壁率明显高于常规的复苏方法后细胞的贴壁率，也高于采用本发明复苏保护液但采用常规复苏方法复苏后进行贴壁培养的细胞贴壁率。由此可知，只有将本发明提供的复苏保护液及复苏方法同时用于复苏过程后，再进行贴壁培养，可明显提高活细胞的贴壁率。

Claims (9)

1.一种间充质干细胞复苏保护液，其特征在于，包括细胞培养原液、新鲜培养基、左旋肉碱和海藻糖，复苏保护液的pH值为7.2-7.6；其中，新鲜培养基和细胞培养原液的体积比为1:0.7-1.0，左旋肉碱和海藻糖的终浓度分别为1-5mg/mL、0.1-0.3mg/mL。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞复苏保护液，其特征在于，左旋肉碱和海藻糖的终浓度分别为3mg/mL、0.2mg/mL。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞复苏保护液，其特征在于，新鲜培养基和细胞培养原液的体积比为1:1。
4.根据权利要求1或3所述的间充质干细胞复苏保护液，其特征在于，新鲜培养基为完全培养基。
5.根据权利要求1或3所述的间充质干细胞复苏保护液，其特征在于，细胞培养原液为培养完细胞，将细胞分离后剩余的培养基，其中VEGF含量高于60pg/mL，EGF含量高于25pg/mL，FGF含量高于80pg/mL，HGF含量高于760pg/mL，TGF含量高于70pg/mL，IGF-1含量高于0.03ng/mL。
6.根据权利要求1所述的间充质干细胞复苏保护液，其特征在于，间充质干细胞为胎盘源间充质干细胞、乳牙源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞或子宫内膜源间充质干细胞。
7.权利要求1-6任一项所述的间充质干细胞复苏保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将新鲜培养基和细胞培养原液混合，然后再加入左旋肉碱和海藻糖，混匀，然后调节溶液pH值为7.2-7.6，制得。
8.采用权利要求1-6任一项所述的复苏保护液复苏间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将冻存的间充质干细胞取出，先在42-45℃放置至开始融化，然后转入37-40℃放置至完全融化；
(2)向步骤(1)所得物中加入复苏保护液，混匀，离心，然后用复苏保护液对细胞进行清洗；
(3)向清洗好的间充质干细胞中加入复苏保护液，调整细胞密度后进行培养，24h后更换为完全培养基，然后按常规技术继续培养。
9.根据权利要求8所述的间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，步骤(1)中先在42℃放置至开始融化，然后转入37℃放置至完全融化。
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