CN113186101B - 一种低温保护剂、制备方法及一种保藏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种低温保护剂、制备方法及一种保藏方法，属于病原菌种保藏技术领域。该低温保护剂包括：甘油、蔗糖、左旋肉碱以及PBS缓冲液，其中，甘油、蔗糖、左旋肉碱的摩尔比为(2‑9)：(0.2‑0.9)：(0.5‑2)。因为本发明涉及的低温保护剂原料廉价易得，而且显著提高了鼻疽诺卡菌的存活率，所以可以保证菌种的传代复苏。另外，与单一使用高浓度的甘油保护剂相比，因为本发明提供的低温保护剂克服了单一保护剂浓度高带来的毒性损伤，所以使用复合保护剂有效降低了保护剂毒性，提高了鼻疽诺卡菌的保藏效果，存活率高。

Description

一种低温保护剂、制备方法及一种保藏方法
技术领域
本发明属于病原菌种保藏技术领域，具体涉及一种低温保护剂、制备方法及一种保藏方法。
背景技术
目前微生物菌(毒)种保藏方法有20余种，从总体上可分为四类：传代培养保藏法、干燥保藏法、冷冻干燥法和低温保藏法。
传代法保藏菌种时间较短，在反复传代和适应的过程中易发生变异，该方法简便易行，特殊微生物如不耐冷冻和干燥处理的微生物仍用该法保藏。干燥保藏法适用范围窄，某些苛养菌(厌氧菌、弧菌属等)保藏过程出现菌种变异、退化，甚至死亡的现象，直接影响后续工作的开展。冷冻干燥法是目前长期保藏细菌、酵母、真菌、病毒和立克次体的常用方法，即使对一些很难保藏的致病菌，如脑膜炎球菌、淋病球菌等亦能保藏。但该方法操作步骤繁琐，且需专用的设备来冷冻和干燥，成本较高，操作过程中易产生气溶胶等生物风险，普通生物学实验室难以实现。与上述三种方法相比，低温保藏法在实验室研究中最为常用，该方法保藏时间长，适用范围广，生物信息变异率低。
鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)在临床中分离率最高，较其他菌更易侵袭正常宿主，近年来鼻疽诺卡菌感染病例报道具有上升趋势。目前，关于低温保护剂的种类和浓度、冻存温度等在低温保藏中对鼻疽诺卡菌的影响并没有研究支撑。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种低温保护剂、制备方法及一种保藏方法。
本发明提供了一种低温保护剂，用于保存诺卡菌属的菌，具有这样的特征，包括：甘油、蔗糖、左旋肉碱以及PBS缓冲液，其中，甘油、蔗糖、左旋肉碱的摩尔比为(2-9)：(0.2-0.9)：(0.5-2)。
在本发明提供的低温保护剂中，还具有这样的特征：其中，甘油、蔗糖、左旋肉碱的摩尔比为(2-3)：(0.2-0.3)：(0.6-0.7)。
在本发明提供的低温保护剂的制备方法中，还具有这样的特征：低温保护剂包括：2.82M甘油、0.292M蔗糖、0.62M左旋肉碱以及磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
在本发明提供的低温保护剂中，还具有这样的特征：其中，甘油、蔗糖、左旋肉碱、PBS缓冲液的摩尔体积比为(2-9)mol：(0.2-0.9)mol：(0.5-2)mol：1L。
在本发明提供的低温保护剂中，还具有这样的特征：其中，诺卡菌属的菌为鼻疽诺卡菌。
本发明提供了一种低温保护剂的制备方法，用于制备上述低温保护剂，具有这样的特征：将甘油溶于PBS缓冲液，灭菌后，得A溶液；将蔗糖溶于PBS缓冲液，灭菌后，得B溶液；将左旋肉碱溶于PBS缓冲液，灭菌后，得C溶液；将A溶液、B溶液、C溶液混合均匀，即得低温保护剂。
在本发明提供的低温保护剂的制备方法中，还具有这样的特征：其中，A溶液、B溶液及C溶液的体积比为1：(0.5-2)：(0.5-2)。
在本发明提供的低温保护剂的制备方法中，还具有这样的特征：其中，A溶液、B溶液及C溶液的体积比为1：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)，优选1：1：1。
在本发明提供的低温保护剂的制备方法中，还具有这样的特征：2M～3M甘油经121℃高温高压15min灭菌，0.2M～0.3M蔗糖经115℃高温高压15min灭菌，0.6M～0.7M左旋肉碱采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤灭菌，并将分别配制的原料进行1：1：1等体积混合均匀，得到低温保护剂。
本发明提供了一种保藏方法，用于低温保存诺卡菌属的菌，具有这样的特征，包括如下步骤：将上述低温保护剂与菌悬液混合，震荡均匀后，在-70℃～-90℃进行保藏，优选-80℃。
在本发明提供的保藏方法中，还具有这样的特征：其中，低温保护剂与菌悬液的体积比为1：(0.5-2)，优选1：1。
在本发明提供的保藏方法中，还具有这样的特征：其中，菌悬液的浓度为107cfu/mL-109cfu/mL，优选108cfu/mL。
在本发明提供的保藏方法中，将低温保护剂与浓度为108cfu/ml的菌悬液进行1：1等体积混合，震荡均匀后置于-80℃冰箱或液氮中保藏；复苏使用时，将冻存管取出采用37℃水浴复温3-5min至溶液体系完全融化，然后进行菌种传代培养。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的一种低温保护剂、制备方法及一种保藏方法，该低温保护剂包括：甘油、蔗糖、左旋肉碱以及PBS缓冲液，其中，甘油、蔗糖、左旋肉碱的摩尔比为(2-9)：(0.2-0.9)：(0.5-2)，因为本发明涉及的低温保护剂原料廉价易得，而且显著提高了鼻疽诺卡菌的存活率，所以可以保证菌种的传代复苏。另外，与单一使用高浓度的甘油保护剂相比，因为本发明提供的低温保护剂克服了单一保护剂浓度高带来的毒性损伤，所以使用复合保护剂有效降低了保护剂毒性，提高了鼻疽诺卡菌保藏效果，存活率高。
进一步地，溶液体系中甘油和左旋肉碱为渗透型保护剂，可渗透至细胞内，降低细胞内外未冻结溶液中电解质的浓度，蔗糖属于非渗透型保护剂，不进入细胞，在冻结过程中用于降低冰点，减少冰晶的形成。
附图说明
图1是本发明的测试例3中鼻疽诺卡菌的降温速率测试结果图；以及
图2是本发明的测试例4中鼻疽诺卡菌的反复冻融次数测试结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明一种低温保护剂、制备方法及一种保藏方法作具体阐述。
下述实施例中采用的鼻疽诺卡菌(革兰氏阳性菌)由中国疾病预防控制中心提供。
<实施例>
一种低温保护剂的制备方法：
具体包括如下步骤：
步骤1，配制低温保护剂，包括如下子步骤：
配制甘油溶液：用移液枪取10mL、20mL、30mL甘油分别置于100mL锥形瓶中，添加30mL PBS溶液，搅拌溶解后加PBS溶液定容于50mL容量瓶中，经121℃高温高压15min灭菌，得到浓度为2.82M、5.64M、8.46M的甘油溶液。
配制蔗糖溶液：用电子天平称量5g、10g、15g蔗糖分别置于100mL锥形瓶中，加入30mL PBS溶液，搅拌溶解后加PBS溶液定容于50mL容量瓶中，经115℃高温高压15min灭菌，得到浓度为0.292M、0.584M、0.876M的蔗糖溶液。
配制左旋肉碱溶液：用电子天平称量5g、10g、15g左旋肉碱分别置于100mL锥形瓶中，采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤灭菌，得到浓度为0.62M、1.24M、1.86M左旋肉碱溶液。
配制复合保护剂：使用minitab设计正交实验，将分别配制的低温保护剂进行等体积1：1：1混合均匀，得到复合保护剂。
步骤2，富集鼻疽诺卡菌，具体步骤如下：
从-80℃冰箱中取出一代鼻疽诺卡菌，空气复温1min～2min，用接种环挑取少量菌种，采用三区划线法涂布在BHI平板上，放于CO2培养箱，37℃下培养48h。从BHI平板上挑取鼻疽诺卡菌单菌落接种于BHI液体培养基中，200r/min，37℃，过夜培养24h。按照1:100的体积比例转接至新的BHI液体培养基中，培养至对数生长期。再用高速离心机5411xg离心10min，去上清，PBS洗涤3次后留菌体。用PBS调配菌悬液，使菌液浓度达到108cfu/mL。
步骤3，保藏鼻疽诺卡菌，具体步骤如下：
取2mL冻存管，将低温保护剂与浓度为108cfu/mL的菌悬液各取0.8mL进行1：1等体积混合，震荡均匀后置于-80℃冰箱或液氮中保藏。
步骤4，复苏低温保藏后的鼻疽诺卡菌，具体步骤如下：
复苏使用时，将2mL冻存管取出后，采用37℃水浴复温3min-5min至溶液体系完全融化，然后进行菌种传代培养。
<测试例1>
单一保护剂对鼻疽诺卡菌的存活率测试
测试方法：将实施例步骤3中的低温保护剂替换为如表1中不同浓度的单一保护剂，并与鼻疽诺卡菌的菌悬液进行低温保藏后，进行存活率影响测试。
测试结果如表1所示。
表1单一保护剂对鼻疽诺卡菌低温保藏后的存活率
Figure BDA0003022108090000071
由表1可知，采用任意单一保护剂都可以显著提高鼻疽诺卡菌的存活率，在未使用低温保护剂的PBS对照组中，鼻疽诺卡菌的存活率仅为47.47％，添加甘油，蔗糖，左旋肉碱作为保护剂的实验组中，低温保藏效果相似，存活率均在49％以上，均优于PBS对照组的存活率47.47％。最适的单一保护剂为5.64M的甘油和0.584M的蔗糖，使用这两种浓度的单一保护剂后，使冻存后的鼻疽诺卡菌的存活率分别提高至75.25％和70.69％。
<测试例2>
复合保护剂对鼻疽诺卡菌的存活率测试
测试方法：将实施例得到的复合保护剂按照表2所示的9种不同配方与鼻疽诺卡菌的菌悬液进行低温保藏后，并进行正交实验及存活率影响测试。
测试结果如表2所示。
表2复合保护剂对鼻疽诺卡菌低温保藏后的存活率
Figure BDA0003022108090000081
其中a、b、c、d标注显著性差异。
由表2可知，在配方1中，浓度为2.82M的甘油、0.292M的蔗糖、0.62M的左旋肉碱的存活率相比较其他配方，存活率最高，最高可达95.61％。
根据表2对三因素正交实验进行统计分析，其分析结果如表3所示。
表3三因素实验统计分析结果
Figure BDA0003022108090000082
由表3可知，在复合保护剂中，影响鼻疽诺卡菌冷冻存活率的主次次序为：蔗糖>左旋肉碱>甘油，不同单一的保护剂发挥的作用不同，但又相互协同。
<测试例3>
鼻疽诺卡菌的降温速率测试
测试方法：选取保藏效果最好的单一保护剂甘油作为保护剂，采用温度采集仪与热电偶搭建试验台测量降温速率，将温度采集仪设置为每15秒记录一次温度变化，获得降温曲线后通过一阶求导得到降温速率-1.635℃/min、-2.775℃/min、-3.677℃/min、-110℃/min。
图1为本测试例3中鼻疽诺卡菌的降温速率测试结果图。
如图1所示，在四种降温速率中，降温速率为-3.677℃/min、-110℃/min时，鼻疽诺卡菌的存活率较高，保藏效果最好，且使用低温保护剂后菌种存活率均高于PBS对照组，在降温速率为-3.677℃/min、-110℃/min时，两组菌种存活率可达70％以上，在降温速率为-110℃/min时，存活率最高。
<测试例4>
鼻疽诺卡菌的反复冻融测试
测试方法：在反复冻融实验中，加入保护剂的菌悬液采用-3.677℃/min的降温速率降至-80℃，随后置于-80℃冰箱中冻存，每隔48h取出，置于37℃水浴锅中，采用25℃/min的复温速率使其完全复苏计数，得到鼻疽诺卡菌在反复冻融过程中活菌的下降趋势。冻存实验过程中应注意无菌操作，避免产生污染，影响存活菌计数。将2.82M的甘油、0.292M的蔗糖、0.93M的左旋肉碱以及PBS缓冲液分别对鼻疽诺卡菌进行4次反复冻融测试，测试结果如图2所示。
图2为本测试例4中鼻疽诺卡菌的反复冻融测试结果图。
如图2所示，鼻疽诺卡菌的冻存存活率均随着反复冻融次数的增加而降低。PBS对照组下降幅度最大，在第四次冻融过程中存活率就从29.03％降为2.65％，而添加保护剂后第四次冻融时的菌种存活率还可以达到20％以上。
实施例的作用与效果
根据本实施例所涉及的一种低温保护剂、制备方法及一种保藏方法，因为该低温保护剂包括：甘油、蔗糖、左旋肉碱以及PBS缓冲液，其中，甘油、蔗糖、左旋肉碱的摩尔比为(2-9)：(0.2-0.9)：(0.5-2)，所以本实施例涉及的低温保护剂原料廉价易得，显著提高了鼻疽诺卡菌的存活率，保证了菌种的传代复苏，同时，与单一使用高浓度的甘油保护剂相比，克服了单一保护剂浓度高带来的毒性损伤，使用复合保护剂有效降低了保护剂毒性，提高了鼻疽诺卡菌保藏效果，存活率高。
进一步地，根据本实施例提供的保护剂，复合保护剂的保藏效果要优于单一保护剂，鼻疽诺卡菌最优复合保护剂体系的配方为0.292M的蔗糖、0.62M的左旋肉碱、2.82M的甘油。
进一步地，根据本实施例提供的鼻疽诺卡菌的低温保藏方法，可以更好的控制菌种保藏质量，有利于开展下游科学实验和提升实验结果的可靠性。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种低温保护剂，用于保存诺卡菌属的菌，其特征在于，由甘油、蔗糖、左旋肉碱以及PBS缓冲液组成，
其中，所述低温保护剂由低温保护剂制备方法制备得到，所述低温保护剂制备方法为：
将所述甘油溶于所述PBS缓冲液，灭菌后，得A溶液，所述A溶液的浓度为2-9 mol/L；
将所述蔗糖溶于所述PBS缓冲液，灭菌后，得B溶液，所述B溶液的浓度为0.2-0.9 mol/L；
将所述左旋肉碱溶于所述PBS缓冲液，灭菌后，得C溶液，所述C溶液的浓度为0.5-2mol/L；
将所述A溶液、所述B溶液、所述C溶液等体积混合均匀，即得所述低温保护剂。
2.一种保藏方法，用于低温保存诺卡菌属的菌，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的低温保护剂与菌悬液混合，震荡均匀后，在-70℃~-90℃进行保藏。
3.根据权利要求2所述的保藏方法，其特征在于：
其中，所述低温保护剂与所述菌悬液的体积比为1：（0.5-2）。
4.根据权利要求2所述的保藏方法，其特征在于：
其中，所述菌悬液的浓度为107cfu/mL-109cfu/mL。
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