CN115786204B - 一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂与冻干方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂与冻干方法，属于微生物菌种资源保藏技术领域。本发明提供的适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂，以水为溶解剂，包括如下浓度的成分：胎牛血清50～150mL/L、脱脂乳40～120g/L、海藻糖30～90g/L、甘露醇40～100g/L、聚乙烯吡咯烷酮10～50g/L、氯化钠5～40g/L。本发明提供的弧菌冻干保护剂与冻干方法适用范围广、步骤简单易操作、成本低、实用性强、保存效率高，可用于对多种来源弧菌菌株的同步保存，避免了因保存不当和超低温条件限制而导致的菌种资源丢失。

Description

一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂与冻干方法

技术领域

本发明涉及微生物菌种资源保藏技术领域，尤其涉及一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂与冻干方法。

背景技术

弧菌(Vibrio sp.)是一种具有显著生物多样性的喜盐细菌，为革兰氏阴性，营化能异养和兼性厌氧性，细胞呈现短杆状、弯曲状、S形或螺旋形等多形态。大部分弧菌靠鞭毛运动，多为单端极生鞭毛。现已报道的弧菌属种类有137种，根据遗传相似度可以将其划分为14个弧菌簇群(Vibrio clades)，100多个种。在世界各地的海洋、河口及淡水系统中自然存在，且为多数脊椎动物和无脊椎动物的病原体和共生体，可导致多种海洋动物患病。在现已报道的海水养殖动物中，近50％的致病原为弧菌，主要包括霍乱弧菌(V.cholerae)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、费氏弧菌(V.fischeri)、创伤弧菌(V.vulnificus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)和副溶血弧菌(V.parahemolyticus)等，这些病原菌被认为是海水养殖产业的“灾祸之源”，可导致多种水产养殖动植物大规模死亡。其中由副溶血性弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌和哈维伊弧菌引起的弧菌病可引起50多种经济鱼类疾病，给水产养殖业的健康发展造成严重威胁。另外，在海洋系统中，弧菌作为其他生物体中的共生菌、益生菌和致病菌，参与多种大分子有机物的降解过程，是生物地球化学循环的重要媒介。因此，它们的菌株经常被用作细菌发光、群体感应、多染色体基因组的生物模型。

菌种保藏和管理是微生物工作者普遍关注的问题，它要求菌种在保藏和管理过程中不灭亡、不被污染，并保持较高的存活率及遗传稳定性，以便长期开发使用。而由于微生物种质资源长期保藏困难，遗传变异几率较大，直接影响菌株的遗传稳定性和科学研究的持续性。弧菌的生理代谢功能和毒力作用除由遗传基因决定以外，环境胁迫作用也对其起到决定性作用，多种毒力和生理代谢表型的体现是由基因修饰决定的。目前国际上正大力推广的是液氮超低温保藏法，此方法在超低温条件下(-150℃-196℃)能使微生物的代谢降到最低水平，因而菌种基本上不发生变异。但由于弧菌具有强烈的内源性呼吸作用，在低温下容易死亡。并且由于其为革兰氏阴性细菌，并没有形成芽孢的能力，且阴性菌的细胞膜结构使得其对于温度的敏感度较强，低温保存和超低温保藏都将在一定程度上对细菌造成伤害，并且长期的低温保存容易使得细菌进入活的不可培养状态，加大菌株保藏难度。因此，长期有效的保藏弧菌资源是为进一步对其病原病理学及致病机制研究的基础保障。

真空冷冻干燥技术是现阶段公认的一种保存效果好、保藏成本低、技术应用范围广的微生物种质长期保藏方法。但面对具有不同遗传代谢属性的多种弧菌菌株，不同类别的弧菌所需要的最佳保护剂与冻干条件也不尽相同。因此，优化形成可适用于不同弧菌的通用保护剂配方及冻干方法，成为生产实践与科研活动中提供适合多种菌株通用的有效冻干保护剂与保藏方法的核心技术之一。但目前大部分研究仍停留在单一菌株的真空冷冻干燥保藏技术，涉及多种弧菌的冻干保存方法鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂与冻干方法，用于海水弧菌菌株的真空冷冻干燥保藏，可实现对不同类别弧菌的同步真空冷冻干燥保藏。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂，以水为溶解剂，包括如下浓度的成分：胎牛血清50～150mL/L、脱脂乳40～120g/L、海藻糖30～90g/L、甘露醇40～100g/L、聚乙烯吡咯烷酮10～50g/L、氯化钠5～40g/L。

优选的，所述弧菌包括鳗弧菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、欧文氏弧菌、坎贝氏弧菌、溶藻弧菌、轮虫弧菌、霍乱弧菌和大菱鲆弧菌中的一种或几种。

本发明还提供了一种所述的真空冷冻干燥保护剂的配置方法，包括如下步骤：

(1)将脱脂乳、海藻糖、甘露醇和氯化钠溶解于无菌蒸馏水中，灭菌，得到灭菌溶液；

(2)将所述灭菌溶液与胎牛血清、聚乙烯吡咯烷酮混合，得到真空冷冻干燥保护剂。

优选的，所述聚乙烯吡咯烷酮经过0.20～0.24μm滤膜过滤。

本发明还提供了一种所述的真空冷冻干燥保护剂或所述的配置方法得到的真空冷冻干燥保护剂的使用方法，包括如下步骤：

(1)将弧菌菌液与所述真空冷冻干燥保护剂按照体积比1:1～3混合；

(2)将步骤(1)的混合物依次进行冷冻和真空冷冻干燥处理。

优选的，所述弧菌菌液的浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/ml。

优选的，所述冷冻前还包括预冷，所述预冷的温度为-18～-22℃，时间为2～4h。

优选的，所述冷冻的温度为-70～-90℃，时间为2～6h。

优选的，所述真空冷冻干燥进行两次，第一次真空冷冻干燥的温度为-30～-36℃，时间为16～20h，真空度为0.2～0.4mbar；第二次真空冷冻干燥的温度为-36～-42℃，时间为4～8h，真空度为0.05～0.15mbar。

本发明提供一种适用于弧菌的冻干保护剂，该保护剂含有的糖醇类物质具有良好的亲水性，可通过氢键结合水和细胞产生亲和力而达到稳定细胞构型的目的，也有利于较快复水和修复受损细胞。同时，为了实现对不同代谢属性的多种弧菌起到保护作用，依据弧菌属细菌的生理属性，不仅加入脱脂乳和血清等复合组分，并加入聚乙烯吡咯烷酮作为缓冲剂和稳定剂，以及加入氯化钠作为渗透压调节剂。不同功能组分的组合不仅有利于提高细胞悬液的均质性和扩大细胞间隙，同时也有利于保护海洋源革兰氏阴性菌细胞膜和细胞内结构与功能蛋白的完整性，提高保护剂的适用范围。

本发明还提供一种适用于弧菌的冻干与存储方法，所采用先预冷后冷冻以及梯度冻干的方式能有效减轻冷冻损伤和干燥应力损失，显著降低了冷冻、冻干和存储过程中的细菌活力损失，低温(4～8℃)存储期间菌体复苏率无显著下降，对多种弧菌菌种的长期冻干保藏表现出良好的效果。

本发明所提供的弧菌冻干保护剂与冻干方法适用范围广、步骤简单易操作、成本低、实用性强、保存效率高，可用于对多种来源弧菌菌株的同步保存，避免了因保存不当和超低温条件限制而导致的菌种资源丢失。

具体实施方式

本发明提供了一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂，以水为溶解剂，包括如下浓度的成分：胎牛血清50～150mL/L、脱脂乳40～120g/L、海藻糖30～90g/L、甘露醇40～100g/L、聚乙烯吡咯烷酮20～50g/L、氯化钠5～40g/L。

在本发明中，所述适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂，以水为溶解剂，优选以无菌蒸馏水为溶解剂，优选包括如下浓度的成分：所述胎牛血清为50～150mL/L，优选为80～110mL/L，进一步优选为90～100mL/L；所述脱脂乳为40～120g/L，优选为80～110g/L，进一步优选为90～100g/L；所述海藻糖为30～90g/L，优选为50～70g/L，进一步优选为60g/L；所述甘露醇为40～100g/L，优选为50～70g/L，进一步优选为60g/L；所述聚乙烯吡咯烷酮为10～50g/L，优选为15～25g/L，进一步优选为20g/L；所述氯化钠为5～40g/L，优选为20～30g/L，进一步优选为25g/L。

在本发明中，所述弧菌包括鳗弧菌(V.anguillarum)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、灿烂弧菌(V.splendidus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、欧文氏弧菌(V.owensii)、坎贝氏弧菌(V.campbellii)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、轮虫弧菌(V.rotiferianus)、霍乱弧菌(V.cholerae)和大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)中的一种或几种。

本发明还提供了一种所述的真空冷冻干燥保护剂的配置方法，包括如下步骤：

(1)将脱脂乳、海藻糖、甘露醇和氯化钠溶解于无菌蒸馏水中，灭菌，得到灭菌溶液；

(2)将所述灭菌溶液与胎牛血清、聚乙烯吡咯烷酮混合，得到真空冷冻干燥保护剂。

在本发明中，所述灭菌的温度优选为100～110℃，进一步优选为106℃。所述灭菌的时间优选为25～35min，进一步优选为30min。

在本发明中，所述灭菌溶液优选在冷却后与胎牛血清、聚乙烯吡咯烷酮混合。

在本发明中，所述胎牛血清优选为无菌的胎牛血清。

在本发明中，所述聚乙烯吡咯烷酮经过0.20～0.24μm滤膜过滤，优选经过0.22μm滤膜过滤。

本发明还提供了一种所述的真空冷冻干燥保护剂或所述的配置方法得到的真空冷冻干燥保护剂的使用方法，包括如下步骤：

(1)将弧菌菌液与所述真空冷冻干燥保护剂按照体积比1:1～3混合；

(2)将步骤(1)的混合物依次进行冷冻和真空冷冻干燥处理。

在本发明中，所述弧菌菌液优选采用如下方法制备：将弧菌接种于添加10～20g/L氯化钠的TSB液体培养基中，于28℃条件下培养至OD值为1.0时离心收集菌体，利用无菌PBS溶液洗涤3次后重悬，并调节终浓度为10⁸～10¹⁰CFU/mL(OD≈0.8)。

在本发明中，制备得到弧菌菌液后优选立即与所述真空冷冻干燥保护剂按照体积比1:1～3混合，所述体积比进一步优选为1:2。

在本发明中，所述弧菌菌液的浓度优选为1×10⁹CFU/ml。

在本发明中，所述弧菌菌液与所述真空冷冻干燥保护剂混合后优选分装于西林瓶内。

在本发明中，所述分装的量优选为1～1.5mL/瓶，进一步优选为1mL/瓶。

在本发明中，所述冷冻前还包括预冷，所述预冷的温度为-18～-22℃，优选为-20℃，时间为2～4h，优选为3h。

在本发明中，所述冷冻的温度为-70～-90℃，优选为-80℃，时间为2～6h，优选为3～4h。

在本发明中，所述真空冷冻干燥进行两次，第一次真空冷冻干燥的温度为-30～-36℃，优选为-32～-34℃，时间为16～20h，优选为18h，真空度为0.2～0.4mbar，优选为0.3mbar；第二次真空冷冻干燥的温度为-36～-42℃，优选为-39℃，时间为4～8h，优选为6h，真空度为0.05～0.15mbar，优选为0.1～0.2mbar。

本发明还提供了所述真空冷冻干燥处理后的菌粉的储藏方法，冻干完成后继续运转真空泵，并通过外部旋钮将置于西林瓶上端的乳胶密封盖进行压紧，以完成在冻干腔内对冻干菌粉的真空密封。随后关闭真空泵打开干燥舱，取出密封的西林瓶，并在乳胶密封盖外层加封铝盖，在巩固真空密封度的同时也进一步防止长期存储过程中的空气泄漏导致的菌株失活，延长冻干菌粉的保藏时间。所述储藏的温度为4～8℃，优选为4℃。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

分别将脱脂乳、海藻糖、甘露醇和氯化钠溶解于无菌蒸馏水中，震荡混匀后将溶液置于106℃条件下灭菌30min，随后将冷却后的灭菌溶液与无菌胎牛血清和经0.22μm滤膜过滤的聚乙烯吡咯烷酮溶液进行混合，配置成终浓度为110mL/L胎牛血清、80g/L脱脂乳、60g/L海藻糖、60g/L甘露醇、20g/L聚乙烯吡咯烷酮、20g/L氯化钠的冻干保护剂溶液。

挑取活化后的欧文氏弧菌(V.owensii)单菌落接种于添加10.0g/L氯化钠的TSB液体培养基中，于28℃条件下培养20h，此时菌悬液OD值为0.76，离心收集菌体，并利用无菌PBS溶液洗涤3次后重悬制备50mL细菌悬液，通过涂布计数测得菌液中欧文氏弧菌的初始浓度为3.6×10⁹CFU/mL。

将欧文氏弧菌菌悬液与所述冻干保护剂溶液按1:2体积比进行混合，混匀后分装到西林瓶内，每瓶1mL。同步准备一份不含保护剂的欧文氏弧菌菌悬液作为冻干比较组。将西林瓶置于-20℃条件下预冷2h，随即转入-80℃超低温冰箱内冷冻2h，而后进行冻干，冻干条件为：主冻干真空度0.2mbar，冻干时间20h，冻干温度-36℃，二次干燥真空度0.1mbar，冻干时间4h，冻干温度-42℃。冻干完成后密封保藏于4℃避光条件下。

于冻干后的第0天、60天、120天和240天随机选取3瓶测定保存样品的活菌数，并计算欧文氏弧菌的存活率，结果如表1所示。

表1欧文氏弧菌冻干菌粉存活率统计结果

实验结果显示，未添加冻干保护剂的对照组欧文氏弧菌冻干后经检测存活率小于1％。结合表1可知，实验组欧文氏弧菌冻干后的平均存活率为44.1％，存活率在60天后的平均存活率为37.9％，120天后的平均存活率为37.4％，240天后的平均存活率为36.5％，呈现平缓降低趋势，表现出较好的冻干保护效果和存储稳定性。

实施例2

挑取活化后的坎贝氏弧菌(V.campbellii)单菌落接种于添加15.0g/L氯化钠的TSB液体培养基中，于28℃条件下培养20h，菌悬液OD值为0.81，离心收集菌体，并利用无菌PBS溶液洗涤3次后重悬制备50mL细菌悬液，通过涂布计数测得菌液中坎贝氏弧菌的初始浓度为4.3×10⁹CFU/mL。

制备终浓度为90mL/L胎牛血清、100g/L脱脂乳、50g/L海藻糖、60g/L甘露醇、15g/L聚乙烯吡咯烷酮、25g/L氯化钠的冻干保护剂溶液。

将坎贝氏弧菌菌悬液与所述冻干保护剂溶液按1:2体积比进行混合，混匀后分装到西林瓶内，每瓶1.5mL。同步准备一份不含保护剂的坎贝氏弧菌菌悬液作为冻干比较组。随后将西林瓶置于-20℃条件下预冷2h，随即转入-80℃超低温冰箱内冷冻4h，而后进行冻干，冻干条件为：主冻干真空度0.2mbar，冻干时间18h，冻干温度-36℃，二次干燥真空度0.1mbar，冻干时间6h，冻干温度-42℃。冻干完成后密封保藏于4℃避光条件下。

于冻干后的第0天、60天、120天和240天随即选取3瓶测定保存样品的活菌数，并计算坎贝氏弧菌的存活率，结果如表2所示。

表2坎贝氏弧菌冻干菌粉存活率统计结果

试验结果显示，未添加冻干保护剂的对照组坎贝氏弧菌冻干后存活率小于1％，而实验组坎贝氏弧菌冻干后的平均存活率为39.6％，在60天后的平均存活率为38.8％，120天后的平均存活率为38.3％，240天后的平均存活率为35.9％，均无明显降低，展现出良好的存储稳定性。

实施例3

挑取活化后的霍乱弧菌(V.cholerae)单菌落接种于添加10.0g/L氯化钠的TSB液体培养基中，于28℃条件下培养24h，OD值为0.83，离心收集菌体，并利用无菌PBS溶液洗涤3次后重悬制备50mL细菌悬液，通过涂布计数测得菌液中霍乱弧菌浓度为6.4×10⁹CFU/mL。

制备终浓度为100mL/L胎牛血清、90g/L脱脂乳、60g/L海藻糖、50g/L甘露醇、25g/L聚乙烯吡咯烷酮、30g/L氯化钠的冻干保护剂溶液。

将霍乱弧菌菌悬液与所述冻干保护剂溶液按1:1体积比进行混合，混匀后分装到西林瓶内，每瓶1.5mL。同步准备一份不含保护剂的坎贝氏弧菌菌悬液作为冻干比较组。随后将西林瓶置于-20℃条件下预冷2h，随即转入-80℃超低温冰箱内冷冻6h，而后进行冻干，冻干条件为：主冻干真空度0.4mbar，冻干时间16h，冻干温度-32℃，二次干燥真空度0.2mbar，冻干时间8h，冻干温度-36℃。冻干完成后密封保藏于4℃避光条件下。

于冻干后的第0天、60天、120天和240天随即选取3瓶测定保存样品的活菌数，并计算霍乱弧菌的存活率。

表3霍乱弧菌冻干菌粉存活率统计结果

由表3可知，霍乱弧菌冻干后的平均存活率为47.4％，在60天后的平均存活率为44.8％，120天后的平均存活率为40.8％，240天后的平均存活率为40.0％，冻干保护效果良好，细菌存活率均处于较高水平。而未添加冻干保护剂的对照组霍乱弧菌冻干后存活率小于1％。表明该保护剂和冻干方法的保护作用明显。

实施例4

2020年6月，山东省威海市某大菱鲆养殖厂出现鳍部充血溃烂并伴有肠炎腹水等症状，从养殖池内挑取具有典型患病症状的大菱鲆，低温充氧打包带回。用无菌刀片刮取溃烂鳍部，并用无菌注射器抽取病鱼肠积液，每4条鱼混为一个样品。用无菌1.5％氯化钠溶液进行稀释后涂布在TSB固体培养基上，28℃条件下培养24h后挑取优势菌单菌落。将优势菌单菌落重新划线在新的TSB固体平板上进行传代纯化3次。对获得的纯培养物进行生理生化测定与管家基因16s rDNA和gyrB序列分析，确定鳍部充血溃烂和肠炎腹水的主要病原分别为鳗弧菌和大菱鲆弧菌。

分别制备两种成分不同的冻干保护剂。本发明所述冻干保护剂(以水为溶剂)各组分终浓度为100mL/L胎牛血清、100g/L脱脂乳、50g/L海藻糖、50g/L甘露醇、20g/L聚乙烯吡咯烷酮、30g/L氯化钠。对比保护剂(以水为溶剂)组分浓度为60g/L脱脂乳、40g/L海藻糖。

将保护剂溶液分别与浓度为4.2×10⁹CFU/mL鳗弧菌和3.5×10⁹CFU/mL大菱鲆弧菌菌液按体积比1:1进行混合并分装到西林瓶内。随后将西林瓶置于-20℃条件下预冷2h，随即转入-80℃超低温冰箱内冷冻3h，而后进行冻干，冻干条件为：主冻干真空度0.3mbar，冻干时间20h，冻干温度-34℃，二次干燥真空度0.1mbar，冻干时间4h，冻干温度-42℃。冻干完成后密封保藏于4℃避光条件下。并于冻干后的第0天、60天、120天和240天对保存样品的活菌数进行检测，计算鳗弧菌和大菱鲆弧菌的存活率。

表4鳗弧菌和大菱鲆弧菌冻干菌粉存活率统计结果

本次试验结果证明，通过本发明方法获得的鳗弧菌和大菱鲆弧菌临床分离株的冻干菌粉低温保藏0天、60天、120天和240天的平均存活率均高于36.1％，对临床弧菌分离株具有较佳的冻干保存效果。而对比保护剂冻干后第0天鳗弧菌和大菱鲆弧菌的存活率分别为8.26％和11.79％，存活率较低，不符合长期存储要求。

实施例5

2021年4月，浙江省宁波市某南美白对虾苗种场出现细菌性玻化症，从患病苗种池内挑取具有典型症状的虾苗置于灭菌海水中，随后于无菌超净工作台内剥取5-10条对虾肝胰腺加入离心管中，研磨均匀后加入1mL无菌1.5％氯化钠溶液并震荡均匀。吸取100μL混合液涂布于TSB琼脂培养基上进行细菌分离，每份样品平行涂布3个平板。每个平板挑取具有菌落形态差异的2-3株优势菌单菌落重悬于20％甘油溶液中，密封打包低温带回黄海水产研究所实验室，并再次转接到新的培养基上进行纯化培养。对获得的纯培养物进行生理生化测定与管家基因16s rDNA、gyrB和topA序列分析，其中优势度最高的3种病原菌为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和轮虫弧菌。

制备终浓度为80mL/L胎牛血清、100g/L脱脂乳、60g/L海藻糖、60g/L甘露醇、20g/L聚乙烯吡咯烷酮、30g/L氯化钠的冻干保护剂溶液，将保护剂溶液与3.7×10⁹CFU/mL哈维氏弧菌、4.2×10⁹CFU/mL副溶血弧菌和5.5×10⁹CFU/mL轮虫弧菌菌液按体积比1:2进行混合并分装到标记后的西林瓶内。

随后将西林瓶置于-20℃条件下预冷3h，随即转入-80℃超低温冰箱内冷冻3h，而后进行冻干，冻干条件为：主冻干真空度0.2mbar，冻干时间20h，冻干温度-36℃，二次干燥真空度0.1mbar，冻干时间4h，冻干温度-42℃。冻干完成后密封保藏于4℃避光条件下。并于冻干后的第0天、60天、120天和240天对保存样品的活菌数进行检测，计算哈维氏弧菌、副溶血弧菌和轮虫弧菌的存活率。

本次试验结果证明，通过本方法获得的哈维氏弧菌、副溶血弧菌和轮虫弧菌临床分离株的冻干菌粉低温保藏0天、60天、120天和240天的平均存活率均高于35.4％，取得较好的冻干保存效果，表明在多种弧菌菌种同步冻干保存的应用效果明显。

表5哈维氏弧菌、副溶血弧菌和轮虫弧菌冻干菌粉存活率统计结果

实施例6

2021年11月，福建省霞浦市某渔场内吊笼养殖刺参出现化皮死亡，挑选吊笼内具有典型化皮症状的刺参，打包低温带回霞浦县渔业推广站实验室进行病原菌分离。在超净工作台内，用无菌解剖刀刮取刺参体表化皮部位置于无菌离心管内，随后加入1mL无菌1.5％氯化钠溶液并震荡均匀。吸取100μL混合液涂布于TSB琼脂培养基上进行细菌分离，每份样品平行涂布3个平板。每个平板挑取具有菌落形态差异的2-3株优势菌单菌落重悬于20％甘油溶液中，密封打包低温带回黄海水产研究所实验室，并对细菌进行生理生化测定与管家基因16s rDNA和gyrB序列分析，其中优势度最高的2种细菌为灿烂弧菌和溶藻弧菌。

制备终浓度为80mL/L胎牛血清、110g/L脱脂乳、50g/L海藻糖、50g/L甘露醇、25g/L聚乙烯吡咯烷酮、25g/L氯化钠的冻干保护剂溶液，将保护剂溶液与浓度为6.2×10⁹CFU/mL灿烂弧菌和2.8×10⁹CFU/mL溶藻弧菌菌液按体积比1:1进行混合并分装到标记后的西林瓶内，并于-20℃低温预冷2h后转入-80℃冷冻4h，随即进行冷冻干燥(主冻干0.2mbar、-36℃、18h，二次干燥0.1mbar、-42℃、6h)。冻干完成后密封保藏于4℃避光条件下。并于冻干后的第0天、60天、120天和240天对保存样品的活菌数进行检测并计算存活率。

同步制备浓度为80g/L脱脂乳、20g/L柠檬酸钠的保护剂溶液(以水为溶剂)作为对比。将上述菌液与该保护剂溶液以1:1的比例混匀，置于-80℃冷冻6h后进行冻干，主、副冻干参数分别为：0.100mbar、18h和0.034mbar、2h。冻干完成后对样品的活菌数进行检测并计算存活率。

表6灿烂弧菌和溶藻弧菌冻干菌粉存活率统计结果

本次试验结果显示，对比冻干方法对灿烂弧菌和溶藻弧菌的初始冻干存活率(第0天)分别为6.59％和8.21％，存活率低，不符合长期存储要求。

通过本发明所述方法获得的灿烂弧菌和溶藻弧菌临床分离株的冻干菌粉低温保藏0天、60天、120天和240天的平均存活率均高于34.6％，冻干保护效果比较理想。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂，其特征在于，以水为溶解剂，包括如下浓度的成分：胎牛血清50~150 mL/L、脱脂乳40~120 g/L、海藻糖30~90 g/L、甘露醇40~100 g/L、聚乙烯吡咯烷酮10~50 g/L和氯化钠5~40 g/L。

2.一种权利要求1所述的真空冷冻干燥保护剂的配置方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将脱脂乳、海藻糖、甘露醇和氯化钠溶解于无菌蒸馏水中，灭菌，得到灭菌溶液；

（2）将所述灭菌溶液与胎牛血清和聚乙烯吡咯烷酮混合，得到真空冷冻干燥保护剂；

所述真空冷冻干燥保护剂中胎牛血清的浓度为50~150 mL/L、脱脂乳的浓度为40~120g/L、海藻糖的浓度为30~90 g/L、甘露醇的浓度为40~100 g/L、聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10~50 g/L、氯化钠的浓度为5~40 g/L。

3.如权利要求2所述的配置方法，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮经过0.20~0.24μm滤膜过滤。

4.一种权利要求1所述的真空冷冻干燥保护剂或权利要求2或3所述的配置方法得到的真空冷冻干燥保护剂的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将弧菌菌液与权利要求1所述的真空冷冻干燥保护剂或权利要求2或3所述的配置方法得到的真空冷冻干燥保护剂按照体积比1:1~3混合；

（2）将步骤（1）的混合物依次进行冷冻和真空冷冻干燥处理。

5.如权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述弧菌菌液的浓度为1×10⁸~1×10¹⁰CFU/ml。

6.如权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述冷冻前还包括预冷，所述预冷的温度为-18~-22℃，时间为2~4h。

7.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述冷冻的温度为-70~-90℃，时间为2~6h。

8.如权利要求4~7任一项所述的使用方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥进行两次，第一次真空冷冻干燥的温度为-30~-36℃，时间为16~20h，真空度为0.2~0.4mbar；第二次真空冷冻干燥的温度为-36~-42℃，时间为4~8h，真空度为0.05~0.15mbar。