CN109722427A - 一种纳豆激酶冻干粉的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种纳豆激酶冻干粉的制备方法，涉及发酵技术领域。所述纳豆激酶冻干粉的制备方法包括以下步骤：取纳豆菌液态发酵得到的发酵液进行离心分离，得不含菌体和不溶物的粗菌液；将所述粗菌液经二级膜分离处理，得到浓缩液；将保护剂溶于所述浓缩液中，得混合溶液；将所述混合溶液初步冷冻至混合溶液完全凝固，得冷冻物；将所述冷冻物冷冻干燥，得纳豆激酶冻干粉。本发明提出的制备方法简单易操作，制备的纳豆激酶冻干粉水分分布均匀且含水量较低，易于长期有效保存，且具有较高的纯度和酶活力。

Description

一种纳豆激酶冻干粉的制备方法

技术领域

本发明涉及发酵技术领域，特别涉及一种纳豆激酶冻干粉的制备方法。

背景技术

纳豆激酶又名枯草杆菌蛋白酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。

目前市场上所售的纳豆激酶类产品大部分是由纳豆经固态发酵后干燥制得的纳豆激酶干粉。其中，传统的高温干燥方法会严重损伤纳豆激酶的活性，导致产品酶活性较低；低温真空干燥虽然对纳豆激酶活性损失较少，但低温真空干燥处理时，容易使纳豆激酶产品表面结块，致使产品中水分分布不均匀、产品内部干燥不充分，进而导致产品不易长期储存。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种纳豆激酶冻干粉的制备方法，旨在解决现有的纳豆激酶冻干粉酶活低以及干燥效果差以致不易长期储存的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种纳豆激酶冻干粉的制备方法，所述纳豆激酶冻干粉的制备方法包括以下步骤：

取纳豆菌液态发酵得到的发酵液进行离心分离，得不含菌体和不溶物的粗菌液；

将所述粗菌液经二级膜分离处理，得到浓缩液；

将保护剂溶于所述浓缩液中，得混合溶液；

将所述混合溶液初步冷冻至混合溶液完全凝固，得冷冻物；

将所述冷冻物冷冻干燥，得纳豆激酶冻干粉。

优选地，所述将所述粗菌液经二级膜分离处理，得到浓缩液的步骤包括：

将所述粗菌液通过截留分子量为45～50KDa的超滤膜过滤，收集透过液；

将所述透过液通过截留分子量为15～10KDa的超滤膜浓缩，得到浓缩液。

优选地，所述将保护剂溶于所述浓缩液中，得混合溶液的步骤中，所述保护剂为以下物质中的一种或者几种的混合物：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、葡聚糖、聚乙二醇、聚维酮和甘氨酸。

优选地，所述将保护剂溶于所述浓缩液中，得混合溶液的步骤中，每100ml所述浓缩液中加入所述保护剂(4～15)g。

优选地，所述将所述混合溶液初步冷冻至混合溶液完全凝固，得冷冻物的步骤中，所述初步冷冻的温度为-75℃～-80℃，所述初步冷冻的时间为8～16h。

优选地，所述将所述冷冻物冷冻干燥，得纳豆激酶冻干粉的步骤中，所述冷冻干燥的温度为-40℃～-60℃，所述冷冻干燥的时间为24～72h。

优选地，所述将所述冷冻物冷冻干燥，得纳豆激酶冻干粉的步骤中，所述纳豆激酶冻干粉的含水量小于6％。

优选地，所述取纳豆菌液态发酵得到的发酵液进行离心分离，得不含菌体和不溶物的粗菌液的步骤中，所述纳豆菌液态发酵的步骤包括：

取高酶活的菌种接种于培养基中培养，形成菌落；

在所述菌落中挑取单菌落扩大培养，形成种子液；

将所述种子液接种于发酵培养基中培养，得发酵液。

优选地，所述将所述种子液接种于发酵培养基中培养，得发酵液的步骤中，

所述发酵培养基包括：黄豆粉1.0～3.0g，蔗糖1.0～3.0g，甘油0.2～0.6g，磷酸二氢钾0.1～0.3g，磷酸氢二钾0.7～2.0g，氯化钙0.01～0.03g以及硫酸镁0～0.1g，且所述发酵培养基pH值为7.0～7.5。

优选地，所述将所述种子液接种于发酵培养基中培养，得发酵液的步骤中，

所述培养温度为25～40℃；

所述培养的时间为24～72h。

本发明技术方案中，通过将液态发酵得到的纳豆激酶液态发酵液膜分离纯化，再加入保护剂后经冷冻、冷冻干燥处理的方法制备纳豆激酶冻干粉，制备工艺简单易操作，制备的纳豆激酶冻干粉水分分布均匀且含水量较低，易于长期有效保存。同时，通过液态发酵得到的发酵液酶活性更高、更易于分离出杂质以提高纳豆激酶含量，且采用的膜分离技术不仅不会损伤酶活，而且可以更进一步地富集发酵液中纳豆激酶含量，使得纳豆激酶冻干粉具有较高的纯度和酶活力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提出的纳豆激酶冻干粉的制备方法的一实施例的流程示意图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

目前市场上所售的纳豆激酶类产品大部分是由纳豆经固态发酵后干燥制得的纳豆激酶干粉。由于传统的高温干燥方法会严重损伤纳豆激酶的活性，导致产品酶活性较低，而对纳豆激酶活性损失较少的低温真空干燥容易使纳豆激酶产品表面结块，致使产品中水分分布不均匀、产品内部干燥不充分，进而导致产品不易长期储存。

为解决上述问题，制备出高活性、保质期长的纳豆激酶冻干粉，本发明提出了一种纳豆激酶冻干粉的制备方法，结合图1提供的纳豆激酶冻干粉的制备方法的一实施例的流程示意图，可知，所述纳豆激酶冻干粉的制备方法包括以下步骤：

步骤S10、取纳豆菌液态发酵得到的发酵液进行离心分离，得不含菌体和不溶物的粗菌液。

纳豆激酶是一种由纳豆枯草杆菌产生的蛋白酶，目前一般采用固体发酵的方式进行制备，由于发酵产物中含有许多菌体和不溶物杂质，因此，需要对其进行杂质分离，提高其中纳豆激酶含量，才能进一步提高最终的纳豆激酶冻干粉的纯度和酶活性，液体发酵相较固体发酵具有杂质少且易于除杂的优点，因此，在本实施例中，发酵方式采用液态发酵法，从而可以得到更高纳豆激酶含量的发酵液。

进一步地，在实施所述纳豆菌液态发酵的步骤时，在本发明提出的另一实施例中，该步骤还可以通过以下步骤具体实施：

步骤S100、取高酶活的菌种接种于培养基中培养，形成菌落；

步骤S200、在所述菌落中挑取单菌落扩大培养，形成种子液；

步骤S300、将所述种子液接种于发酵培养基中培养，得发酵液。

其中，步骤S300中，所采用的发酵培养基可以包括：黄豆粉1.0～3.0g，蔗糖1.0～3.0g，甘油0.2～0.6g，磷酸二氢钾0.1～0.3g，磷酸氢二钾0.7～2.0g，氯化钙0.01～0.03g以及硫酸镁0～0.1g，且所述发酵培养基pH值为7.0～7.5。

且在具体培养时，培养的工艺参数可以优选为：培养温度为25～40℃；培养的时间为24～72h。

此外，在去除发酵液中的杂质时，可以通过过滤、静置沉淀或者离心分离的方式进行，在本实施中，优选为离心分离。且在具体实施时，离心机的转速可以设置为8000～12000r/min，离心时间可以设置为10～20min。

步骤S20、将所述粗菌液经二级膜分离处理，得到浓缩液。

发酵液在经过离心分离除去其中的菌体和一些不溶物后，得到的粗菌液中仍然包含一些大分子杂质或小分子杂质，为了进一步提高其中纳豆激酶的含量以提升纳豆激酶冻干粉中纳豆激酶的纯度，需要进一步纯化，纯化的方法可以是离子交换层析法、凝胶柱层析法或者盐析法，在本实施例中，优选为二级膜分离法。膜分离技术是通过膜孔大小起到分离作用，由于分离过程中无相变化，并不会降低纳豆激酶的酶活性，因此可以最大程度地保留纳豆激酶的活性，进而提高纳豆激酶冻干粉的酶活性；而且鉴于超滤膜具有可以反复使用、处理量大、处理时间短的优点，因此，膜分离技术有助于连续化生产纳豆激酶冻干粉。

在具体实施时，步骤S20可以包括以下步骤：

将所述粗菌液通过截留分子量为45～50KDa的超滤膜过滤，收集透过液；

将所述透过液通过截留分子量为15～10KDa的超滤膜浓缩，得到浓缩液。

需要说明的是，比膜孔小的物质和溶剂可以通过超滤膜，通过超滤膜的溶液即为透过液；反之，比膜孔大的物质被截留，被截留的溶液即为浓缩液。纳豆激酶的分子量通常在10～50KDa的范围内，因此，在本实施例中，分别选用截留分子量为45～50KDa的超滤膜和截留分子量为15～10KDa的超滤膜，经两道超滤膜处理后，大部分纳豆激酶被留在能通过截留分子量为45～50KDa的超滤膜而不能通过截留分子量为15～10KDa的超滤膜的这一部分溶液中。

步骤S30、将保护剂溶于所述浓缩液中，得混合溶液。

其中，所述保护剂为以下物质中的一种或者几种的混合物：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、葡聚糖、聚乙二醇、聚维酮和甘氨酸。

纳豆激酶在溶液中、干燥过程中以及空气中容易变性而失去酶活，为提高纳豆激酶冻干粉的酶活性，以及长时间保证纳豆激酶冻干粉在存储期间酶活性不会降低过快，可以在浓缩液中添加一定量的保护剂以保护纳豆激酶的酶活不被损伤，该保护剂可以是糖类、醇类、聚合物类以及氨基酸类中的一种或几种的混合物，在本实施例中，优选为以下物质中的一种或者几种的混合物：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、葡聚糖、聚乙二醇、聚维酮和甘氨酸，即可以是葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、葡聚糖、聚乙二醇、聚维酮和甘氨酸中的任意一种作为保护剂，也可以是上述物质中的任意几种的混合物，其种类数可以是2～12种。

此外，上述保护剂的添加量优选为：每100ml所述浓缩液中加入所述保护剂(4～15)g。也就是说，加入的保护剂重量占浓缩液体积的百分比为4～15％(w/v)。

步骤S40、将所述混合溶液初步冷冻至混合溶液完全凝固，得冷冻物。

步骤S50、将所述冷冻物冷冻干燥，得纳豆激酶冻干粉。

其中，所述初步冷冻的温度优选为-75℃～-80℃；所述初步冷冻的时间优选为8～16h；所述冷冻干燥的温度优选为-40℃～-60℃；所述冷冻干燥的时间优选为24～72h。

纯化处理后的纳豆激酶溶液经过干燥即能得到纳豆激酶冻干粉。确保纳豆激酶冻干粉质量的重要因素在于：在干燥过程中，如何保证纳豆激酶酶活不降低、如何使冻干粉中各处的干燥程度保持一致以及如何使冻干粉的含水量尽可能地降低。在本实施例中，优选为先初步冷冻制得冷冻物后再进行冷冻干燥，如此，先由液态转为固态，再进行干燥处理，即能使各处的水分均匀减少，从而避免了表面水分减少过快以至于表面结块，从而导致内部水分被锁住无法挥干的情况，进而使冻干粉的水分可以尽可能降低，在本发明的其中一实施例中，所述纳豆激酶冻干粉的含水量小于6％，而冻干粉的水分含量越低，纳豆激酶就越不容易发生变性失活，从而有效延长了冻干粉的有效期。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

取纳豆菌液态发酵得到的发酵液于8000r/min离心20min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为50KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为10KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入10％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为葡萄糖。将混合溶液置于-80℃下初步冷冻8h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-40℃条件下冷冻干燥24h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为3％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为7270FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在72天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

实施例2

取纳豆菌液态发酵得到的发酵液于12000r/min离心10min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为45KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为15KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入4％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为木糖醇。将混合溶液置于-75℃下初步冷冻16h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-60℃条件下冷冻干燥72h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为1％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为7389FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在78天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

实施例3

取纳豆菌液态发酵得到的发酵液于10000r/min离心15min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为48KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为12KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入15％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为葡聚糖。将混合溶液置于-78℃下初步冷冻10h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-50℃条件下冷冻干燥36h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为2％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为7001FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在84天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

实施例4

取纳豆菌液态发酵得到的发酵液于9000r/min离心18min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为46KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为14KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入6％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为葡萄糖。将混合溶液置于-76℃下初步冷冻12h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-55℃条件下冷冻干燥48h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为2％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为6310FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在71天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

实施例5

取纳豆菌液态发酵得到的发酵液于9000r/min离心12min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为50KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为10KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入8％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为甘氨酸。将混合溶液置于-80℃下初步冷冻14h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-45℃条件下冷冻干燥55h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为3％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为7286FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在76天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

实施例6

取纳豆菌液态发酵得到的发酵液于9000r/min离心12min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为50KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为10KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入12％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为蔗糖、聚维酮、木糖醇、乳糖和麦芽糖的混合物。将混合溶液置于-80℃下初步冷冻15h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-45℃条件下冷冻干燥60h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为4％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为6896FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在81天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

实施例7

取纳豆菌液态发酵得到的发酵液于8000r/min离心12min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为50KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为10KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入14％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为果糖、甘露醇、甘氨酸和聚维酮的混合物。将混合溶液置于-80℃下初步冷冻14h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-50℃条件下冷冻干燥36h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为6％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为6571FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在72天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

实施例8

取纳豆菌液态发酵得到的发酵液于9000r/min离心12min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为50KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为10KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入8％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为山梨醇和聚乙二醇的混合物。将混合溶液置于-80℃下初步冷冻14h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-50℃条件下冷冻干燥40h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为4％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为6381FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在69天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

实施例9

取高酶活的纳豆菌菌种接种于斜面培养基中培养形成菌落；在所述菌落中挑取单菌落扩大培养，形成种子液；将所述种子液接种于发酵培养基中，在37℃下培养36h，得发酵液。其中，发酵培养基的组分包括：黄豆粉1.0g，蔗糖1.0g，甘油0.2g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.7g，氯化钙0.01g，硫酸镁0.1g，pH值7.5。

将上述发酵液于8000r/min离心20min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为50KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为10KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入10％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为葡萄糖。将混合溶液置于-80℃下初步冷冻8h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-40℃条件下冷冻干燥24h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为3％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为6645FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在74天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

实施例10

取高酶活的纳豆菌菌种接种于斜面培养基中培养形成菌落；在所述菌落中挑取单菌落扩大培养，形成种子液；将所述种子液接种于发酵培养基中，在25℃下培养72h，得发酵液。其中，发酵培养基的组分包括：黄豆粉3.0g，蔗糖3.0g，甘油0.6g，磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钾2.0g，氯化钙0.03g，pH值7.0。

将上述发酵液于8000r/min离心20min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为50KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为10KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入10％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为葡萄糖。将混合溶液置于-80℃下初步冷冻8h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-40℃条件下冷冻干燥24h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为2％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为6970FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在76天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

实施例11

取高酶活的纳豆菌菌种接种于斜面培养基中培养形成菌落；在所述菌落中挑取单菌落扩大培养，形成种子液；将所述种子液接种于发酵培养基中，在40℃下培养24h，得发酵液。其中，发酵培养基的组分包括：黄豆粉2.0g，蔗糖2.0g，甘油0.4g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾1.2g，氯化钙0.02g，硫酸镁0.05g，pH值7.2。

将上述发酵液于8000r/min离心20min得到不含菌体和不溶物的粗菌液。将粗菌液通过截留分子量为50KDa的超滤液，取透过液；再将透过液通过截留分子量为10KDa的超滤膜，收集浓缩液。取浓缩液并向其中加入10％(w/v)的保护剂，搅拌混匀得混合溶液，其中，所述保护剂为葡萄糖。将混合溶液置于-80℃下初步冷冻8h，使得混合溶液完全凝固形成冷冻物。再将冷冻物放入冷冻干燥设备中，-40℃条件下冷冻干燥24h，得到纳豆激酶冻干粉。

通过干燥失重测定法测得上述纳豆激酶冻干粉的含水量为2％；且根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法测得纳豆激酶冻干粉的酶活力为7470FU/g。

将上述纳豆激酶冻干粉于0～4℃条件下储存，并进行稳定性试验，测得上述纳豆激酶冻干粉在70天时酶活仍具有初始酶活的95％以上。

综上所述，本发明提供的制备方法制备的纳豆激酶冻干粉具有高活性和长效保质期。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种纳豆激酶冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取纳豆菌液态发酵得到的发酵液进行离心分离，得不含菌体和不溶物的粗菌液；

将所述粗菌液经二级膜分离处理，得到浓缩液；

将保护剂溶于所述浓缩液中，得混合溶液；

将所述混合溶液初步冷冻至混合溶液完全凝固，得冷冻物；

将所述冷冻物冷冻干燥，得纳豆激酶冻干粉。

2.如权利要求1所述的纳豆激酶冻干粉的制备方法，其特征在于，所述将所述粗菌液经二级膜分离处理，得到浓缩液的步骤包括：

将所述粗菌液通过截留分子量为45～50KDa的超滤膜过滤，收集透过液；

将所述透过液通过截留分子量为15～10KDa的超滤膜浓缩，得到浓缩液。

3.如权利要求1所述的纳豆激酶冻干粉的制备方法，其特征在于，所述将保护剂溶于所述浓缩液中，得混合溶液的步骤中，所述保护剂为以下物质中的一种或者几种的混合物：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、葡聚糖、聚乙二醇、聚维酮和甘氨酸。

4.如权利要求1所述的纳豆激酶冻干粉的制备方法，其特征在于，所述将保护剂溶于所述浓缩液中，得混合溶液的步骤中，每100ml所述浓缩液中加入所述保护剂(4～15)g。

5.如权利要求1所述的纳豆激酶冻干粉的制备方法，其特征在于，所述将所述混合溶液初步冷冻至混合溶液完全凝固，得冷冻物的步骤中，所述初步冷冻的温度为-75℃～-80℃，所述初步冷冻的时间为8～16h。

6.如权利要求1所述的纳豆激酶冻干粉的制备方法，其特征在于，所述将所述冷冻物冷冻干燥，得纳豆激酶冻干粉的步骤中，所述冷冻干燥的温度为-40℃～-60℃，所述冷冻干燥的时间为24～72h。

7.如权利要求1所述的纳豆激酶冻干粉的制备方法，其特征在于，所述将所述冷冻物冷冻干燥，得纳豆激酶冻干粉的步骤中，

所述纳豆激酶冻干粉的含水量小于6％。

8.如权利要求1所述的纳豆激酶冻干粉的制备方法，其特征在于，所述取纳豆菌液态发酵得到的发酵液进行离心分离，得不含菌体和不溶物的粗菌液的步骤中，所述纳豆菌液态发酵的步骤包括：

取高酶活的菌种接种于培养基中培养，形成菌落；

在所述菌落中挑取单菌落扩大培养，形成种子液；

将所述种子液接种于发酵培养基中培养，得发酵液。

9.如权利要求8所述的纳豆激酶冻干粉的制备方法，其特征在于，所述将所述种子液接种于发酵培养基中培养，得发酵液的步骤中，

所述发酵培养基包括：黄豆粉1.0～3.0g，蔗糖1.0～3.0g，甘油0.2～0.6g，磷酸二氢钾0.1～0.3g，磷酸氢二钾0.7～2.0g，氯化钙0.01～0.03g以及硫酸镁0～0.1g，且所述发酵培养基pH值为7.0～7.5。

10.如权利要求7所述的纳豆激酶冻干粉的制备方法，其特征在于，所述将所述种子液接种于发酵培养基中培养，得发酵液的步骤中，

所述培养温度为25～40℃；

所述培养的时间为24～72h。