CN101191126A - 一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法 - Google Patents
一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101191126A CN101191126A CNA2006101282918A CN200610128291A CN101191126A CN 101191126 A CN101191126 A CN 101191126A CN A2006101282918 A CNA2006101282918 A CN A2006101282918A CN 200610128291 A CN200610128291 A CN 200610128291A CN 101191126 A CN101191126 A CN 101191126A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phosphoric acid
- damping fluid
- acid buffer
- hpo
- nah
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法是，在温度为0－4℃的条件下，进行均浆、提取上清液、盐析、溶解、超滤而后制成新鲜大蒜的蒜氨酸粗液，把大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S－200凝胶柱进行分离：并用pH6－8的缓冲液以10－60mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，收集洗脱液组分，再把它透析得到纯化的蒜氨酸酶。本发明用来分离纯化蒜氨酸酶的操作简便易行，使用本发明中的方法，可以根据需要分离纯化蒜氨酸酶量的多少装成不同大小的凝胶柱，以满足产业化生产的需要。
Description
技术领域
本发明属于新鲜大蒜中所含成分的分离纯化方法，尤其涉及新鲜大蒜中的蒜氨酸酶的分离纯化方法。
背景技术
1948年Arthur Stoll和Ewald Seebeck发现大蒜中存在一种酶，并把它命名为蒜氨酸酶。之后对蒜氨酸酶的研究一直没有中断，后来研究发现蒜氨酸酶(EC.4·4·1·4)是存在于大蒜中的一种内源酶，全称为S-烷基-L-半胱氨酸亚砜酶，其是一种均一的二聚体糖蛋白，大约占蒜中可溶性蛋白质的10-12％。完整无损的大蒜中，蒜氨酸酶和它的天然底物S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(蒜氨酸)等存在于大蒜的不同部位，蒜氨酸酶存在于液泡组织中，而底物则存在于细胞质中，只有当大蒜破损，两者才能相互接触，蒜氨酸酶通过氨酰基中间体与其辅助因子5’-磷酸吡哆醛结合在一起，经受β-消除-去氨基作用裂解底物成硫代亚磺酸酯。硫代亚磺酸酯类(R-S-S(O)-R)决定了大蒜的绝大部分特性，是大蒜特有的风味物质，是大蒜产生的各种含硫化合物的前体物质，也是大蒜具有许多生物活性功能的原因。故在大蒜加工过程中，蒜氨酸酶对于能否生产出硫代亚磺酸酯保留率较高的优质干燥大蒜制品至关重要，所以对大蒜中蒜氨酸酶进行分离纯化，以便对其性质进行研究，将具有非常重要的理论意义和实践意义。但直到80年代后才将此酶纯化为均一的酶，且纯化步骤较为烦琐。一般要对蒜氨酸酶粗酶液采用亲和层析的方法进行初步纯化，后采用Supherdex200凝胶柱层析才能得到纯度很高的蒜氨酸酶(如KuettnerBartholomeus E.的制备方法)。有人采用Sephadex G-200柱层析分离纯化了蒜氨酸酶，但此方法仅限于实验室分析，不能用于产业化生产。Rabinkov曾采用克隆技术将蒜氨酸酶克隆出来，这种方法较复杂。
发明内容
本发明目的是提供一种操作较简单的蒜氨酸酶的一步分离纯化方法，并且使分离纯化制得的蒜氨酸酶可达到电泳纯；而且这种方法可以使用于产业化生产。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：这种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法是，在温度为0-4℃的条件下，按以下步骤完成：
a、均浆：把新鲜的大蒜粉碎，按每千克新鲜大蒜加入800-1200mL pH6-8
的缓冲液的量计算，在粉碎后的新鲜大蒜内加入缓冲液，同时进行搅拌使它们混合均匀；
b、提取上清液：将经步骤a所得物质进行冷冻离心处理，而后提取上清液；
c、盐析：在步骤b中提取的上清液内加入饱和硫酸胺溶液，加入同时进行搅拌；
d、溶解：把经过盐析后得到的上清液做冷冻离心处理，而后去掉上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液内；
e、超滤：把溶解后的滤饼用截留分子量为1万-5万的滤膜过滤，得到截留物，即为新鲜大蒜的蒜氨酸粗液；
f、分离纯化：把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离：并用pH6-8的缓冲液以10-60mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，收集洗脱液组分；再把它透析得到纯化的蒜氨酸酶。
在步骤a中所加入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH2PO4、Na2HPO4、甘油、NaCl、EDTA，和磷酸吡哆醛配制而成；在粉碎后的新鲜大蒜中加入缓冲液时，搅拌速度为每分鐘5000-10000转；
在步骤b中，均浆后的物质冷冻离心3-57分钟；
在步骤d中，把经过盐析后的物质，做冷冻离心的时间为10-50分钟；滤饼重新溶入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH2PO4、Na2HPO4、蔗糖、NaCl和磷酸吡哆醛制成；
在步骤e中，应将溶解后的滤饼先做冷冻离心处理，而后再进行超滤，超滤是在压力为0.25MPa的情况下操作的；
在步骤f中，缓冲液由NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、、磷酸吡哆醛制成。
在步骤a中所加入的磷酸缓冲液，其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由50-80mM的NaH2PO4、50-80mM的Na2HPO4、8-12％v/v的甘油、4-6％w/v的NaCl、4-6mM的EDTA、4-6μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤c中，所加入饱和硫酸胺溶液为30-60％的饱和硫酸胺溶液；
在步骤d中，滤饼重新溶入的磷酸缓冲液其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由55-65mM的NaH2PO4和55-65mM的Na2HPO4、8-12％v/v的蔗糖，1-5％w/v的NaCl、1-10μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤f中所采用的缓冲液其配制比例为：1000mL的缓冲液由50-80mM的NaH2PO4、50-80mM的Na2HPO4、1-5％w/v的NaCl、10-40μM的磷酸吡哆醛配制而成。
在步骤a中所加入的磷酸缓冲液，其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由50-60mM的NaH2PO4、60-65mM的Na2HPO4、10-12％v/v的甘油、4-6％w/v的NaCl、4-6mM的EDTA、5μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中滤饼重新溶入的磷酸缓冲液其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由60-65mM的NaH2PO4、55-60mM的Na2HPO4、10％v/v的蔗糖，1-5％w/v的NaCl、5-10μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤f中所采用的缓冲液其配制比例为：1000mL的缓冲液由55-70mM的NaH2PO4、60-70mM的Na2HPO4、1-2％w/v的NaCl、20-30μM的磷酸吡哆醛配制而成。
在步骤f中，如若对3-15mL经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液进行分离纯化时，应将处理好的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成1-2×100-200cm的柱缓冲液应以20-40mL/h流速进行梯度洗脱，洗脱体积在128-250mL的范围内收集洗脱液组分。
本发明用来分离纯化蒜氨酸酶的操作简便易行，仅采用一步凝胶柱层析就可以得到纯化的蒜氨酸酶，且此纯化出来的蒜氨酸酶纯度高，反相HPLC图谱测定结果表明蒜氨酸酶保留时间为3.458min，经过Sephacryl S-200凝胶柱一步分离蒜氨酸酶可达到很好的纯化效果。SDS-PAGE电泳显示经Sephacryl S-200分离纯化后新鲜大蒜的蒜氨酸酶达到电泳纯，显示单带，蒜氨酸酶亚基相对分子质量为53.8kDa，可作为一种新的蒜氨酸酶的分离纯化技术手段来对蒜氨酸酶进行分离纯化，具有很大的应用前景。使用本发明中的方法，可以根据需要分离纯化量的多少装成不同大小的凝胶柱，因此满足了产业化生产的需要。
附图说明
图1为测定蒜氨酸酶纯度的反相HPLC图谱；
图2为分离纯化的蒜氨酸酶SDS-PAGE结果。
具体实施方式
实施例1：以新鲜大蒜为原料按照下述方法和工艺条件制取蒜氨酸酶：
a、把新鲜大蒜粉碎，而后按照1千克新鲜大蒜加入800mLpH6的缓冲液A的量，在其内加入缓冲液A，并以5000转/分的速度搅拌0.5分钟。
b、提取上清液：将经步骤a所得物质进行冷冻离心5-10分钟，而后提取上清液；
c、盐析：把由步骤b中提取的上清液内加入30％饱和硫酸胺溶液，同时进行搅拌；
d、溶解：把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理10-20分钟，而后去掉其上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量为：从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于600mL的缓冲液B内。
e、超滤：把滤饼溶解后的物质，用截留分子量为1万的滤膜过滤，得到截留物，即为新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离纯化：取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液3mL上柱，将处理好的SephacrylS-200凝胶柱填料装成1×100cm的柱，用pH6的缓冲液C以10mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体积100mL-200mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨酸酶。
本实施例的所有步骤均在0℃的温度条件下操作。
步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由50-55mM的NaH2PO4、50-55mM的Na2HPO4、8-9％v/v的甘油、4％w/v的NaCl、4-5mM的EDTA、4μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由55mM的NaH2PO4、55mM的Na2HPO4、8％v/v的蔗糖、1％w/v的NaCl、1μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由50mM的NaH2PO4、50mM的Na2HPO4、1％w/v的NaCl、10μM的磷酸吡哆醛配制而成。
实施例2：本实施例中的分离纯化步骤与实施例1相同，其工艺条件如下：a、均浆：在粉碎的新鲜大蒜中按照1千克新鲜大蒜加入1200mLpH8的缓冲液A的量操作，在其内加入缓冲液A时，以10000转/分的速度搅拌。
b、提取上清液：将经步骤a所得物质进行冷冻离心57分钟，而后提取上清液；
c、盐析：把由步骤b中提取的上清液内加入60％饱和硫酸胺溶液，同时进行搅拌；
d、溶解：把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理50分钟，而后去掉其上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量为：从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于1400mL的缓冲液B内。
e、超滤：把滤饼溶解后的物质，以操作压力为0.25MPa，用截留分子量为5万的滤膜过滤，得到新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离纯化时：取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液15mL上柱，将处理好的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成2×200cm的柱，用pH8的缓冲液C以60mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体积300mL-400mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨酸酶。
本实施例的所有步骤均在4℃的温度条件下操作。
步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由80mM的NaH2PO4、80mM的Na2HPO4、12％v/v的甘油、6％w/v的NaCl、6mM的EDTA、6μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由65mM的NaH2PO4、65mM的Na2HPO4、12％v/v的蔗糖、5％w/v的NaCl、10μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由80mM的NaH2PO4、80mM的Na2HPO4、5％w/v的NaCl、40μM的磷酸吡哆醛配制而成。
实施例3：本实施例中的分离纯化步骤与实施例1相同，其工艺条件如下：
a、均浆：在粉碎的新鲜大蒜中按照1千克新鲜大蒜加入1000mLpH7.0的缓冲液A的量操作，在其内加入缓冲液A时，以8000转/分的速度搅拌1分钟；
b、提取上清液：将经步骤a所得物质进行冷冻离心30分钟，而后提取上清液；
c、盐析：把由步骤b中提取的上清液内加入45％饱和硫酸胺溶液，同时进行搅拌；
d、溶解：把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理30分钟，而后去掉其上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量为：从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于1000mL的缓冲液B内。
e、超滤：把滤饼溶解后的物质，以操作压力为0.25MPa，用截留分子量为3万的滤膜过滤，得到截留物，即为新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离纯化时：每次取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液9mL上柱，应将处理好的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成1.6×150cm的柱，用pH7.0的缓冲液C以30mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体积128mL-143mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨酸酶。
本实施例的所有步骤均在2℃的温度条件下操作。
步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由60mM的NaH2PO4、60mM的Na2HPO4、10％v/v的甘油、5％w/v的NaCl、5mM的EDTA、5μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由60mM的NaH2PO4、60mM的Na2HPO4、10％v/v的蔗糖、1％w/v的NaCl、5μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由60mM的NaH2PO4、60mM的Na2HPO4、1％w/v的NaCl、25μM的磷酸吡哆醛配制而成。
实施例4：本实施例中的分离纯化步骤与实施例1相同，其工艺条件如下：
a、均浆：在粉碎的新鲜大蒜中按照1千克新鲜大蒜加入900mLpH7.0的缓冲液A的量操作，在其内加入缓冲液A时，以7000转/分的速度搅拌1.5分钟；
b、提取上清液：将经步骤a所得物质先采用3000转/分的速度进行冷冻离心3分钟，再采用10000转/分的速度冷冻离心10分钟，而后提取上清液；
c、盐析：把由步骤b中提取的上清液内加入35％饱和硫酸胺溶液，同时进行20分钟搅拌；
d、溶解：把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理20分钟，而后去掉其上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量为：从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于700mL的缓冲液B内。
e、超滤：把滤饼溶解后的物质，以操作压力为0.25MPa，用截留分子量为2万的滤膜过滤，得到新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离纯化时：每次取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液5mL上柱，并把处理好的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成1.5×160cm的柱，用pH6的缓冲液C以20mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体积110mL-120mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨酸酶。
本实施例的所有步骤均在1℃的温度条件下操作。
步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由55mM的NaH2PO4、55mM的Na2HPO4、9％v/v的甘油、5％w/v的NaCl、4mM的EDTA、6μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由58mM的NaH2PO4、62mM的Na2HPO4、9％v/v的蔗糖、2％w/v的NaCl、2μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由55mM的NaH2PO4、55mM的Na2HPO4、3％w/v的NaCl、15μM的磷酸吡哆醛配制而成。
实施例5：本实施例中蒜氨酸酶的分离纯化步骤与实施例1相同，其工艺条件为：
a、均浆：在粉碎的新鲜大蒜中按照1千克新鲜大蒜加入1100mLpH7.0的缓冲液A的量操作，在其内加入缓冲液A时，以9000转/分的速度搅拌2分钟；
b、提取上清液：将经步骤a所得物质先采用4000转/分的速度进行冷冻离心7分钟，再采用20000转/分的速度冷冻离心30分钟，而后提取上清液；
c、盐析：把由步骤b中提取的上清液内加入50％饱和硫酸胺溶液，同时进行30分钟搅拌；
d、溶解：把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理40分钟，而后去掉其上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量为：从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于1100mL的缓冲液B内。
e、超滤：把滤饼溶解后的物质，先做冷冻离心处理15分钟，而后以操作压力为0.25MPa，用截留分子量为4万的滤膜过滤，得到新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离纯化时：每次取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液10mL上柱，并把处理好的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成1.5×180cm的柱，用pH7的缓冲液C以40mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体积130mL-150mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨酸酶。
本实施例的所有步骤均在3℃的温度条件下操作。
步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由65mM的NaH2PO4、70mM的Na2HPO4、11％v/v的甘油、6％w/v的NaCl、5mM的EDTA、6μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由62mM的NaH2PO4、57mM的Na2HPO4、11％v/v的蔗糖、4％w/v的NaCl、8μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由65mM的NaH2PO4、65mM的Na2HPO4、4％w/v的NaCl、30μM的磷酸吡哆醛配制而成。
实施例6：本实施例中蒜氨酸酶的分离纯化步骤与实施例1相同，其工艺条件为：
a、均浆：在粉碎的新鲜大蒜中按照1千克新鲜大蒜加入1050mLpH7.0的缓冲液A的量操作，在其内加入缓冲液A时，以9500转/分的速度搅拌2分钟；
b、提取上清液：将经步骤a所得物质先采用3500转/分的速度进行冷冻离心5分钟，再采用18000转/分的速度冷冻离心35分钟，而后提取上清液；
c、盐析：把由步骤b中提取的上清液内加入55％饱和硫酸胺溶液，同时进行40分钟搅拌；
d、溶解：把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理30分钟，而后去掉其上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量为：从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于800mL的缓冲液B内。
e、超滤：把滤饼溶解后的物质，先做冷冻离心处理15分钟，而后以操作压力为0.25MPa，用截留分子量为3万的滤膜过滤，得到新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离纯化时：每次取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液12mL上柱，并把处理好的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成1.8×160cm的柱，用pH7的缓冲液C以50mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体积330mL-350mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨酸酶。
本实施例的所有步骤均在4℃的温度条件下操作。
步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由70mM的NaH2PO4、75mM的Na2HPO4、8％v/v的甘油、5％w/v的NaCl、5mM的EDTA、5μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由58mM的NaH2PO4、61mM的Na2HPO4、10％v/v的蔗糖、2％w/v的NaCl、6μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由70mM的NaH2PO4、75mM的Na2HPO4、2％w/v的NaCl、20μM的磷酸吡哆醛配制而成。
实施例7：本实施例中：
在步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由52mM的NaH2PO4、78mM的Na2HPO4、9％v/v的甘油、5％w/v的NaCl、6mM的EDTA、2.5μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由63mM的NaH2PO4、54mM的Na2HPO4、9％v/v的蔗糖、3％w/v的NaCl、4μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由76mM的NaH2PO4、52mM的Na2HPO4、3％w/v的NaCl、35μM的磷酸吡哆醛配制而成。本实施例中的分离纯化步骤，及其他工艺条件均与实施例1相同。
实施例8：本实施例中：
在步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由50mM的NaH2PO4、60mM的Na2HPO4、10％v/v的甘油、4％w/v的NaCl、4mM的EDTA、5μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由65mM的NaH2PO4、55mM的Na2HPO4、10％v/v的蔗糖、5％w/v的NaCl、10μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由70mM的NaH2PO4、70mM的Na2HPO4、2％w/v的NaCl、30μM的磷酸吡哆醛配制而成。本实施例中的分离纯化步骤，及其他工艺条件均与实施例3相同。
实施例9：本实施例中：
在步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由60mM的NaH2PO4、65mM的Na2HPO4、12％v/v的甘油、6％w/v的NaCl、6mM的EDTA、5μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由60mM的NaH2PO4、60mM的Na2HPO4、10％v/v的蔗糖、1％w/v的NaCl、5μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由55mM的NaH2PO4、60mM的Na2HPO4、1％w/v的NaCl、20μM的磷酸吡哆醛配制而成。本实施例中的分离纯化步骤及其他工艺条件均与实施例6相同。
Claims (5)
1.一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法，其特征是，在温度为0-4℃的条件下，按以下步骤完成：
a、均浆：把新鲜的大蒜粉碎，按每千克新鲜大蒜加入800-1200mL pH6-8的缓冲液的量计算，在粉碎后的新鲜大蒜内加入缓冲液，同时进行搅拌使它们混合均匀；
b、提取上清液：将经步骤a所得物质进行冷冻离心处理，而后提取上清液；
c、盐析：在步骤b中提取的上清液内加入饱和硫酸胺溶液，加入同时进行搅拌；
d、溶解：把经过盐析后得到的上清液做冷冻离心处理，而后去掉上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液内；
e、超滤：把溶解后的滤饼用截留分子量为1万-5万的滤膜过滤，得到截留物，即为新鲜大蒜的蒜氨酸粗液；
f、分离纯化：把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离：并用pH6-8的缓冲液以10-60mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，收集洗脱液组分；再把它透析得到纯化的蒜氨酸酶。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征是，在步骤a中所加入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH2PO4、Na2HPO4、甘油、NaCl、EDTA，和磷酸吡哆醛配制而成；在粉碎后的新鲜大蒜中加入缓冲液时，搅拌速度为每分鐘5000-10000转；
在步骤b中，均浆后的物质冷冻离心3-57分钟；
在步骤d中，把经过盐析后的物质，做冷冻离心的时间为10-50分钟；滤饼重新溶入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH2PO4、Na2HPO4、蔗糖、NaCl和磷酸吡哆醛制成；
在步骤e中，应将溶解后的滤饼先做冷冻离心处理，而后再进行超滤，超滤是在压力为0.25MPa的情况下操作的；
在步骤f中，缓冲液由NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、、磷酸吡哆醛制成。
3.根据权利要求2所述的分离纯化方法，其特征是，在步骤a中所加入的磷酸缓冲液，其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由50-80mM的NaH2PO4、50-80mM的Na2HPO4、8-12％v/v的甘油、4-6％w/v的NaCl、4-6mM的EDTA、4-6μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤c中，所加入饱和硫酸胺溶液为30-60％的饱和硫酸胺溶液；
在步骤d中，滤饼重新溶入的磷酸缓冲液其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由55-65mM的NaH2PO4和55-65mM的Na2HPO4、8-12％v/v的蔗糖，1-5％w/v的NaCl、1-10μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤f中所采用的缓冲液其配制比例为：1000mL的缓冲液由50-80mM的NaH2PO4、50-80mM的Na2HPO4、1-5％w/v的NaCl、10-40μM的磷酸吡哆醛配制而成。
4.根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征是，在步骤a中所加入的磷酸缓冲液，其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由50-60mM的NaH2PO4、60-65mM的Na2HPO4、10-12％v/v的甘油、4-6％w/v的NaCl、4-6mM的EDTA、5μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中滤饼重新溶入的磷酸缓冲液其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由60-65mM的NaH2PO4、55-60mM的Na2HPO4、10％v/v的蔗糖，1-5％w/v的NaCl、5-10μM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤f中所采用的缓冲液其配制比例为：1000mL的缓冲液由55-70mM的NaH2PO4、60-70mM的Na2HPO4、1-2％w/v的NaCl、20-30μM的磷酸吡哆醛配制而成。
5.根据权利要求1、2、3、4所述的分离纯化方法，其特征是，在步骤f中，如若对3-15mL经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液进行分离纯化时，应将处理好的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成1-2×100-200cm的柱；缓冲液应以20-40mL/h流速进行梯度洗脱，洗脱体积在128-250mL的范围内收集洗脱液组分。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2006101282918A CN101191126A (zh) | 2006-11-28 | 2006-11-28 | 一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2006101282918A CN101191126A (zh) | 2006-11-28 | 2006-11-28 | 一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101191126A true CN101191126A (zh) | 2008-06-04 |
Family
ID=39486328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2006101282918A Pending CN101191126A (zh) | 2006-11-28 | 2006-11-28 | 一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101191126A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102321592A (zh) * | 2011-09-28 | 2012-01-18 | 张介眉 | 从葱白中提取葱酶的方法 |
| CN102743744A (zh) * | 2011-04-20 | 2012-10-24 | 上海医药工业研究院 | 蒜氨酸酶的应用及一种药物组合物 |
| CN104435612A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-03-25 | 遵义医学院 | 一种排毒养颜胶囊的制备工艺 |
| WO2015053431A1 (ko) * | 2013-10-08 | 2015-04-16 | (주)태영에프에이 | 마늘 유래 알리이나아제의 제조방법 |
-
2006
- 2006-11-28 CN CNA2006101282918A patent/CN101191126A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102743744A (zh) * | 2011-04-20 | 2012-10-24 | 上海医药工业研究院 | 蒜氨酸酶的应用及一种药物组合物 |
| CN102743744B (zh) * | 2011-04-20 | 2015-04-08 | 上海医药工业研究院 | 蒜氨酸酶的应用及一种药物组合物 |
| CN102321592A (zh) * | 2011-09-28 | 2012-01-18 | 张介眉 | 从葱白中提取葱酶的方法 |
| WO2015053431A1 (ko) * | 2013-10-08 | 2015-04-16 | (주)태영에프에이 | 마늘 유래 알리이나아제의 제조방법 |
| CN104435612A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-03-25 | 遵义医学院 | 一种排毒养颜胶囊的制备工艺 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111187366B (zh) | 一种黄精多糖的双水相萃取方法 | |
| CN100480276C (zh) | 一种制备高纯黄芪多糖的方法 | |
| CN105924498B (zh) | 一种具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法 | |
| CN101191126A (zh) | 一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法 | |
| CN101781351B (zh) | 一种从西洋参中提取人参皂甙Rb1的方法及其粉针剂 | |
| CN105622517A (zh) | 一种同时从紫山药中提取色素、多糖、尿囊素的方法 | |
| CN110642962B (zh) | 一种杂豆类果胶多糖的分离纯化方法 | |
| CN106566858B (zh) | 一种制备高支低芳寡肽的方法 | |
| CN112679564B (zh) | 一种人参特有化合物精氨酸糖苷af的分离纯化方法 | |
| CN102382178B (zh) | 一种唾液酸糖肽的分离方法 | |
| CN102461898A (zh) | 一种从枣果中提取黄酮的工艺方法 | |
| CN101337995A (zh) | 从大枣中提取低聚糖的方法 | |
| CN104876843A (zh) | 一种从胭脂萝卜籽中制备高纯度莱菔素的方法 | |
| CN105755073A (zh) | 从卵清蛋白中制备n-连接聚糖的高效分离制备及聚糖 | |
| CN102002072A (zh) | 一种从枣核中提取黄酮的工艺方法 | |
| CN106539848A (zh) | 一种甜柿黄酮的制备方法 | |
| CN101456898B (zh) | 一种使用氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法 | |
| CN102242104A (zh) | 一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的提取方法 | |
| CN111040011A (zh) | 一种高纯度人参皂苷Rg1的精制方法 | |
| CN109810014B (zh) | 一种枸杞子中二咖啡酰亚精胺类化合物选择性富集方法 | |
| CN113440547B (zh) | 采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法 | |
| CN107213180B (zh) | 一种三七黄酮的分离提取方法 | |
| CN101073666B (zh) | 一种制备胰激肽原酶原料药的方法 | |
| CN102115736B (zh) | 一种植物叶绿素酶的纯化方法 | |
| CN101560508A (zh) | 一种高纯度木瓜蛋白酶的提取方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20080604 |