CN103710368A

CN103710368A - 哺乳动物细胞表达的人激肽释放酶和编码基因及其应用

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Publication number: CN103710368A
Application number: CN201310746269.XA
Authority: CN
Inventors: 马永; 王安良; 孙芳; 范宇; 马骏; 徐春林; 陈晨; 王耀方
Original assignee: CHANGZHOU GENSUN INSTITUTE OF BIOMEDICINE Co Ltd; ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Current assignee: ZonHon Biopharma Institute Inc.
Priority date: 2013-12-30
Filing date: 2013-12-30
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-12-30
Also published as: CN103710368B

Abstract

本发明涉及一种哺乳动物细胞表达的人激肽释放酶-1，编码基因、表达方式、纯化工艺，以及重组蛋白检测方法和应用。激肽释放酶是一种丝氨酸蛋白酶，在人体组织中起着十分重要的生理作用。传统的组织提取方式常存在着免疫原性较高或来源困难、难以克服病毒污染等问题；而一般的哺乳动物细胞表达的人激肽释放酶-1也存在着表达量低或者活性较低的缺陷。为此，本发明提供了如SEQ ID NO：1所示的重组hK1的编码基因，以及专为此设计的表达、纯化、重组蛋白检测方法及应用，与现有技术相比，本发明的重组hK1具有较高的表达量及活性，且本发明建立的纯化工艺和重组人激肽释放酶-1药品检测方法为该药品开发过程中细胞株开发、工艺优化、临床前和临床研究以及工业化生产建立了基础。

Description

哺乳动物细胞表达的人激肽释放酶和编码基因及其应用

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种哺乳动物细胞表达的人激肽释放酶-1，编码基因、表达方法和纯化工艺，以及重组蛋白微量检测方法和应用。

背景技术

激肽释放酶（Kallikrein，KLK）是一种丝氨酸蛋白酶，能使激肽原释放出激肽，它具有很高的生理活性，在人体组织中起着十分重要的生理作用。正常情况下，激肽释放酶大部分是以无活性的前体形式存在。体内的激肽释放酶主要分为两类：血浆激肽释放酶(Plasma Kallikrein))和组织激肽释放酶(Tissue Kallikrein)。两种酶在分子量大小、底物特异性、免疫学特征和释放出的激肽方面都不同。血浆激肽释放酶可参与血凝块的表面激活、纤维蛋白溶解、激肽生成和炎症过程。组织激肽释放酶广泛存在于肾、胰腺、胃肠道黏膜及中枢神经系统等许多组织中，它以激肽原酶原的形式在组织中合成，再经胰蛋白酶激活形成组织激肽释放酶，并可释放至血液循环。

临床中应用的组织激肽酶1（KLK1）主要来源于猪胰脏提取（例如，常州千红制药，商品名“怡开”）及人尿液中提取（例如，广东天普制药，商品名“凯力康”），二者分别可用于改善微循环等糖尿病并发症以及急性轻-中度缺血性脑卒中疾病的治疗。但是从猪胰脏中提取和纯化猪激肽原酶，过程繁琐且含量很低，由于种属差异，猪激肽释放酶注射具有免疫原性；人尿提取的激肽释放酶-1虽然在蛋白结构、生物活性、免疫反应以及治疗效果等方面都必将优于猪胰激肽释放酶，但是药品来源多数国家难以接受，并且也难以克服病毒污染等缺点。因此要获得高效价廉的重组hK1蛋白，须通过基因工程技术大量制备和生产，使其在大量应用中成为可能。

目前以哺乳动物为代表的真核细胞表达系统的开发是生物制药产业的发展趋势，采用哺乳动物细胞表达既能保证重组蛋白质二硫键的正确配对和蛋白质折叠，又能保证蛋白质的糖基化，从而使由哺乳动物细胞表达的重组蛋白与天然蛋白在结构和功能上保持很高的一致性。发达国家药物市场中，通过哺乳类动物细胞培养表达的生物药物已达到各类生物药物总数的60％左右，市场份额已接近70％。哺乳动物细胞高效表达和大规模培养技术已成为当今生物制药领域最重要的关键技术之一。中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)表达系统以重组基因高效扩增及表达、重组蛋白与天然蛋白相近、蛋白胞外分泌利于后期纯化、培养方式简便等特点逐渐成为生产糖蛋白最主要的表达系统。但由于种属差异，以人激肽释放酶天然基因序列转入CHO中表达是难以进行高效的表达的。Lu等1996年（Lu HS，etal Purification and characterization of human tissue prokallikrein and kallikrein isoforms expressed in Chinese hamster ovary cells.Protein Expr.Purif.19968(2):227-237.）在CHO中表达激肽释放酶前体（prokallikrein），经嗜热菌蛋白酶酶切激活后，所获得的激肽释放酶hK1同天然品相比活性无明显区别，但hK1蛋白不均一，蛋白分子量和电荷有差别；李体远等2002年（人组织激肽释放酶基因在哺乳动物细胞中的表达，中国生物工程杂志，200212(6):65-68）构建的带有荧光蛋白基因的激肽释放酶于CHO细胞中表达获得成功，但应用价值不高，表达量也较低；较为相近的利用CHO系统表达hK1蛋白的研究为广州天普生化医药公司制备的hK1蛋白（中国专利201010198962.4），所表达的蛋白生物活性较低，并且表达量远远不能达到工业化的生产需求。除此之外，广州天普生化医药公司在生产重组hK1前期，筛选重组hK1单克隆宿主细胞以及种子培养，培养基中均含有胎牛血清，引入了很多动物源蛋白，具有很多潜在的危险；同时，在扩大制备重组hK1过程中，又采用无血清培养基，这种制备重组hK1的形式已经远远不适应现代医药工业的发展。本申请从转染，筛选以及扩大制备重组hK1均使用化学成分限定培养基，不仅有利于重组hK1制备过程中的下游纯化，减少血清的外源病毒污染等潜在风险；而且使得生产重组hK1的过程控制严格按照GMP要求进行管理和生产。

发明内容

为了克服现有技术的上述不足之处，本发明首先通过密码子优化的方式，提供一种能在CHO细胞表达系统高效分泌表达重组hK1的编码基因，其次是其可用于生产应用的表达、纯化的方法。

本发明提供了一种重组hK1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了编码上述所述重组hK1基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。该序列是专为哺乳动物细胞表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主细胞中的表达效率。

优选的，本发明还在上述所述编码重组hK1基因之前加入分泌信号肽，优选地，本发明的分泌信号肽序列是专为CHO分泌表达到胞外的信号肽；更优选地，本发明的分泌信号肽序列经过CHO表达系统优化得到的信号肽序列，相比之下显著提高异源基因在宿主细胞中的分泌效率。所述分泌信号肽其碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的也提供一种含有上述所述编码重组hK1的基因或带有分泌信号肽的编码重组hK1的基因的载体；优选的，所述的载体为pcDNA3.1(+)，p3×FLAG-CMV13，pCHO1.0，更优选为pCHO1.0。

本发明还提供了包含有上述所述载体的CHO细胞株；优选地，所述细胞株选自CHO-K1和CHO-S细胞株；更优选地，所述细胞株选自CHO-S细胞株。

本发明的另一个目的是提供一种重组hK1蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：

A.构建含有上述所述编码重组hK1的基因或带有分泌信号肽的编码重组hK1的基因的载体；

B.将步骤A的载体线性化后转入CHO宿主细胞中，并在合适的条件下培养；

C.回收纯化目的蛋白。

上述所述载体优选为p3×FLAG-CMV13，pCHO1.0。

上述所述宿主细胞优选为CHO-K1，CHO-S细胞。

本发明的另一个目的是提供一种含有重组蛋白宿主细胞的微载体高密度培养工艺，所述培养工艺如下：

A.将上述所述细胞宿主接入培养基中，置于培养箱内进行培养。

B.取对数生长期的细胞接入含有3-5g/L微载体的细胞悬浮培养瓶中进行扩大培养，细胞接种数为1～5×10⁵/mL，培养基为含有5～10%FBS的DMEM/F12，转速为45～130rpm，置于培养箱内搅拌培养。

C.当细胞于微载体汇合度大于90%以上，换无血清培养基进行培养。

D.收集含有重组人激肽释放酶的培养基，高速离心并进行预处理。

本发明的另一个目的是提供一种含有重组蛋白宿主细胞的高密度悬浮培养工艺，所述培养工艺如下：

A.将上述所述细胞株CHO-S接种于CD FortCD培养基培养；

B.当细胞密度达到5×10⁶/mL后，每隔一天流加2g/L的葡萄糖;

C.检测细胞的活率和密度，直到细胞的活率低于70%时，收集含有重组人激肽释放酶的培养基，高速离心并进行预处理。

本发明的另一个目的是提供一种准确度较高的运用ELISA测定蛋白质浓度以及利用上述ELISA方法进行高通量筛选高表达重组hK1的单克隆宿主细胞系的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

A.取已知浓度的人激肽释放酶-1蛋白的标准品获得系列浓度的标准溶液，取所述标准溶液包被酶标板，孵育、洗板、封闭；

B.加入经稀释的人激肽释放酶1第一抗体，孵育后洗板加入经稀释的酶标记的第二抗体，再次孵育后洗板加入所述酶的底物和双氧水反应一段时间后，测得荧光值，获得标准曲线；

C.取待测蛋白质获得待测溶液，包被酶标板，孵育、洗板、封闭后，加入所述第一抗体，孵育后洗板加入第二抗体，再次孵育后洗板加入所述酶的底物和双氧水反应一段时间后，测得荧光值；与所述标准曲线比较，获得所述蛋白质的浓度。

通过比较含重组hK1基因的单克隆细胞株的培养上清中的目的蛋白的浓度，可筛选出含有优化后重组hK1基因的高表达的单克隆宿主细胞株。

优选地，所述第一稀释比例为1:2000～1：5000。

优选地，所述第二稀释倍数为1：50000～1：100000。

所述酶标记抗体中的酶可以为辣根过氧化酶HRP、碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP等。优选地，所述酶标记抗体的酶选用辣根过氧化酶HRP。

优选地，所述底物激发波长为510～550nm，发射波长为570nm～610nm。更优选地，所述底物激发波长为530nm，发射波长为590nm。

本发明的另一个目的是提供一种重组hK1蛋白纯化工艺，所述纯化工艺如下：

A.首先对收集到的培养基进行离心收集，并浓缩过0.2μm滤膜，去除病毒和宿主残留DNA。

B.接着用阴离子Q柱从步骤A经过预处理的培养基中捕获重组hK1蛋白，并进一步去除病毒和宿主残留DNA等。

C.然后用疏水phenyl柱对上一步收集到的糖基化修饰程度不同的重组hK1蛋白进行分离。

D.最后可以进一步用Benzamidine柱对上一步收集到的糖基化修饰程度不同的重组hK1进一步精纯。

技术效果：

本申请采用了进行过密码子优化的hK1编码基因，大大提高了表达量，并且所表达的到蛋白活性也较现有技术中的其他表达系统表达的蛋白活性有了很大提升；本申请同时采用褐家鼠Anionic trypsin-1蛋白的信号肽作为重组hK1的分泌信号肽，针对CHO表达系统分别对hK1基因及分泌信号肽基因进行密码子优化，从而进一步提高了蛋白的分泌表达的程度；另外，由于二氢叶酸还原酶（DHFR）能够被叶酸类似物氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)所抑制，将目的基因与DHFR基因的重组质粒转化CHO细胞，利用不断提高MTX的浓度选择抗MTX的细胞系。由于DHFR基因与目的基因一起扩增，通过扩增基因DHFR即可达到扩增重组hK1基因的目的，从而使重组hK1在CHO高水平表达。此外，本申请提供了两种CHO宿主细胞扩大培养的方法，通过重组CHO细胞微载体扩大培养及重组CHO细胞悬浮培养技术，提高了单位空间内的细胞密度，使重组hK1蛋白表达量显著增高，从而节约成本，提高效率，达到工业化生产应用的需求。

其次，本发明建立了稳定的间接ELISA方法进行检测微量重组hK1，该方法可以用来在开发重组人激肽释放酶-1药品宿主细胞株中，评估含有重组hK1基因单克隆宿主细胞株生产能力，也可以用来开发重组人激肽释放酶-1药品工艺中，测定重组hK1蛋白含量或浓度，以及在重组人激肽释放酶-1药品临床前和临床研究中，检测动物和人体血浆中重组hK1的蛋白残留量，均具有较高的准确度及灵敏度。

附图说明

图1表示密码子优化前后重组hK1核苷酸序列比较。

其中原始序列对应的行为hK1天然基因核苷酸序列，即密码子优化前的序列；优化序列对应的行为本发明的重组hK1的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。

图2-a，2-b为密码子优化前后重组hK1基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中CAI指数。

其中，图2-a表示hK1天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞CHO表达系统中CAI指数经程序计算为0.84；图2-b表示优化后的本发明的重组hK1密码子在哺乳动物细胞CHO表达系统中CAI指数经程序计算为0.89。

图3-a，3-b为密码子优化前后重组hK1基因在哺乳动物细胞CHO表达宿主中最优密码子频率分布区域图。

其中图3-a表示hK1天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞CHO系统中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：hK1天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为2%；图3-b表示优化后的本发明的重组hK1密码子在哺乳动物细胞CHO系统中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的重组hK1密码子序列低利用率密码子出现为0。

图4-a，4-b为密码子优化前后重组hK1基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中平均GC碱基含量分布区域图。

其中，图4-a表示hK1天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞CHO表达系统中平均GC碱基含量为：56.29%；图4-b表示优化后的本发明的重组hK1密码子在哺乳动物细胞CHO表达系统中平均GC碱基含量为：55.73%。

图5-a，5-b为密码子优化前后重组hK1mRNA的二级结构预测图。

图5-a hK1天然基因mRNA的二级结构预测图，图5-b为密码子优化后的本发明的重组hK1mRNA的二级结构预测图。

图6-a，6-b为密码子优化后重组hK1不同表达质粒构建过程图。

图6-a为重组hK1密码子优化后表达质粒pCMV13-opt-hK1构建过程图；图6-b为重组hK1 密码子优化后表达质粒pCHO1.0-opt-hK1构建过程图。

图7-a，7-b为筛选抗生素对CHO宿主细胞工作曲线。

图7-a为G418对CHO-K1宿主细胞工作曲线，图7-b为嘌呤霉素对CHO-S宿主细胞工作曲线。

图8-a，图8-b含有重组hK1基因的哺乳动物CHO单克隆宿主细胞中稳定表达上清培养液免疫印迹图。

其中，图8-a为含有优化后重组hK1基因的CHO-K1单克隆宿主细胞株稳定表达上清培养液免疫印迹图。泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker（SM1811，购于Fermentas），泳道2-5为含有优化后重组hK1基因的不同CHO-K1单克隆宿主细胞表达上清培养液。

图8-b为含有优化后重组hK1基因的CHO-S单克隆宿主细胞株稳定表达上清培养液免疫印迹图。泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker，泳道2-5为含有优化后重组hK1基因的不同CHO-S单克隆宿主细胞表达上清培养液。

图9CHO-S单克隆细胞株稳定表达上清培养液免疫印迹图。

其中，泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker，泳道2为含有优化后重组hK1基因的CHO-S单克隆宿主细胞制备重组hK1蛋白第0天的上清培养液，泳道3为含有优化后重组hK1基因的CHO-S单克隆宿主细胞制备重组hK1蛋白第3天的上清培养液，泳道4为含有优化后重组hK1基因的CHO-S单克隆宿主细胞制备重组hK1蛋白第5天的上清培养液，泳道5为含有优化后重组hK1基因的CHO-S单克隆宿主细胞制备重组hK1蛋白第7天的上清培养液，泳道6为含有优化后重组hK1基因的CHO-S单克隆宿主细胞制备重组hK1蛋白第9天的上清培养液，泳道7为含有优化后重组hK1基因的CHO-S单克隆宿主细胞制备重组hK1蛋白第11天的上清培养液，泳道8为含有优化后重组hK1基因的CHO-S单克隆宿主细胞制备重组hK1蛋白第13天的上清培养液。

图10为重组hK1培养液经AKTA^TM avant150系统离子交换洗脱峰色谱图。

图11为重组hK1经AKTA^TM avant150系统疏水层析洗脱峰色谱图。

图12为重组hK1经过纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图。

其中，图12-a为高分子量的重组hK1经过AKTA^TM avant150系统纯化后，SDS-PAGE凝胶电泳图，其中，泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker，泳道2-3为纯化后的高分子量重组hK1蛋白。图12-b为低分子量的重组hK1经过AKTA^TM avant150系统纯化后，SDS-PAGE凝胶电泳图，其中，泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker，泳道2-3为纯化后的低分子量重组hK1蛋白。

图13为重组hK1间接ELISA标准曲线图。

图14-a，14-b为重组hK1间接ELISA方法不同孔间显著性差异图和回收率结果图

其中，图14-a为重组hK1间接ELISA不同孔间显著性差异图，P值=0.5874>0.05，说明不同孔间无显著差异；图14-b为重组hK1回收率结果图，结果显示，每次测定结果回收率均在100～120%之间。

图15含有优化后重组hK1基因CHO-S宿主细胞不同时间表达hK1表达量结果图。

图16-a，16-b为苯乙内酰硫氨基酸(PTH-AA)混合标准品和重组hK1蛋白N端分析色谱图谱。

其中，图16-a为苯乙内酰硫氨基酸(PTH-AA)混合标准品（163-12271，购于Wako）色谱图，图16-b为高分子量和低分子重组hK1蛋白N端分析色谱图谱，结果显示，两种分子量的蛋白N端氨基酸残基均为Ile-Val-Gly-Gly-Trp，说明二者N端氨基酸序列一致，在表达过程中信号肽均完全切除。

图17-a，17-b，17-c为MALDI标准品以及重组hK1蛋白相对分子质量测试质谱图。

其中，图17-a为MALDI标准品（ProteoMassTM Peptide&Protein MALDI-MS Calibration Kit，MSCAL1，购于Sigma-Aldrich）质谱图，图17-b为相对分子量较高的重组hK1蛋白质谱图，其相对分子质量大小为32460.5Da。图17-c为相对分子量较低的重组hK1蛋白质谱图，其相对分子质量大小为31175.1Da。

图18为等电聚焦（IEF）标准品及重组hK1等点聚焦电泳图。

其中，泳道1为pI从4.45-9.6等电聚焦标准品（161-0310，购于Bio-Rad）；泳道2为的重组hK1蛋白。结果显示，重组hK1蛋白在pI标准蛋白4.00附近。

图19为重组hK1蛋白的去糖基化分析SDS-PAGE凝胶电泳图。

其中，泳道1为相对分子质量较大的重组hK1蛋白，泳道2为相对分子质量较小的重组hK1蛋白；泳道3为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker；泳道4为N-glycosidase F（11365185001，购于Roche）和O-glycosidase（11347101001，Roche）糖苷酶对相对分子质量较大的重组hK1蛋白去糖基化，泳道5为为N-glycosidase F和O-glycosidase糖苷酶对相对分子质量较小的重组hK1蛋白去糖基化。

图20-a，20-b为重组猪激肽释放酶以及重组hK1蛋白酶动力学活性测定图。

其中，图20-a为阳性对照猪激肽释放酶酶动力学活性测定图，图20-b为不同相对分子质量的重组hK1酶动力学活性测定图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1重组hK1基因优化设计

1.密码子优化

综合GenBank中已公开的人激肽释放酶-1序列（Homo sapiens kallikrein1）的cDNA序列信息以及已经上市的产品人激肽释放酶-1的氨基酸序列，确定以cDNA序列(GenBank登录号：BC005313)（未经密码子优化的基因，原始基因）和已公开的人激肽释放酶1（Homo sapiens kallikrein）的氨基酸序列(GenBank登录号：AAA59455.1)对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组hK1基因，如SEQ ID No：1所示。

下面是对重组hK1进行密码子优化，优化前后各参数对比如下：

1.密码子适应指数(CAI)

由图2-a可知，密码子没有优化前，通过计算，重组hK1基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中密码子适应指数（CAI）为0.84。由图2-b可知，通过密码子优化后，使得重组hK1基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中CAI指数为0.89。通常CAI=1时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高重组hK1基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中的表达水平。

2.最优密码子使用频率（FOP）

由图3-a可知，基于哺乳动物CHO表达载体，密码子没有优化前，hK1基因序列的低利用率密码子（本发明中将利用率低于30%的密码子统称为低利用率密码子）出现百分比为2%。这条未进行优化的基因采用串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，通过密码子优化后，重组hK1基因在哺乳动物CHO系统中出现低利用率密码子的频率为0。

3.GC碱基含量（GC curve）

GC含量理想分布区域为30%-70%，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的hK1基因的GC碱基平均含量分布区域图对比可知，由图4-a中显示hK1基因中在优化前GC碱基平均含量为56.29%，由图4-b中显示出优化后去除60bp在30%-70%区域外出现的GC含量峰值，最终得到优化后重组hK1的GC碱基平均含量为55.73%。4.调控作用元件

调控作用元件	优化前	优化后
			Splice(GGTAAG)	0	0
Splice(GGTGAT)	1	0

[0093]

PolyA(AATAAA)	0	0
			PolyA(AAAAAA)	0	0
Destabilizing(ATTTA)	1	0
			PolyT(TTTTTT)	0	0
PolyA(AAAAAAA)	0	0

5.去除重复序列

6mRNA的二级结构预测图

在DNA转录成mRNA后，由于mRNA是单链线性分子，通过自身回折使得互补的碱基对相遇，通过氢键结合而成的发卡结构(Hairpin)。5’发卡结构可以在翻译起始阶段起调控作用。但是如果发卡结构很长，解链所需的能量很高，就有可能影响到翻译。所以需要表达的序列应该尽量避免长而且能量高的发卡结构。通过密码子优化后，由图5-a、图5-b重组hK1密码子优化前后mRNA的二级结构预测图可知，优化后的5’发卡结构和解链所需的能量合理。

实施例2：重组hK1基因在哺乳动物细胞中表达载体构建

1.重组hK1基因在贴壁哺乳动物细胞CHO-K1中表达载体构建

将优化后的重组hK1（如SEQ ID NO：1）直接融合优化后的褐家鼠Anionic trypsin-1蛋白的信号肽全基因（如SEQ ID No：3所示）合成的片段，构建到pUC57质粒（由南京金斯瑞科技有限公司提供）中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-opt-hK1质粒。以pUC57-opt-hK1质粒为模板，上游引物P1引入HindIII和下游引物P2引入BamHI酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物P1:CCCAAGCTTGCCACCATGTCCG

下游引物P2:CGCGGATCCTCAACTGTTTTCAGCAAT

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP（N0447S，购于New England Biolabs）加1μL，所用DNA聚合酶为Q5High-Fidelity DNAPolymerase（M0491S，购于New England Biolabs），2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃10s、55℃20s、72℃30，25个循环后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小一致。将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒（DP214，购于北京天根生化）纯化。纯化后，用Hind III(R0104S，购于New England Biolabs)和BamH I（R0136S，购于New England Biolabs）双酶切，用T4连接酶（M0202S，购于New England Biolabs）连接到p3XFLAG-CMV-13质粒（E7783-20UG，购于Sigma-Aldrich）中，转化到DH5α感受态细胞（CB101，购于北京天根生化）中，在含有氨苄青霉素（0339-100G，购于Amresco）的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到重组人激肽原酶hK1一种形式的表达质粒，记为pCMV13-opt-hK1，见图6-a。

2.重组hK1基因在悬浮哺乳动物细胞CHO-S中表达载体构建

以pUC57-opt-hK1质粒为模板，上游引物P3引入AvrII和下游引物P4引入BstZ171酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物P3:CATGCCTAGGGCCACCATGTCCGCTCTGCT

下游引物P4:GGGCGTATACTCAACTGTTTTCAGCAATGGT

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶为Q5High-Fidelity DNA Polymerase，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃10s、55℃20s、72℃30s，25个循环后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小一致。将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后，用AvrII(R0104S，购于New England Biolabs)和BstZ171（R0136S，购于New England Biolabs），用T4连接酶连接到pCHO1.0质粒（A1369601，购于Invitrogen）中，转化到Top10感受态细胞（CB104，购于北京天根生化）中，在含有卡那霉素（0408-100G，购于Amresco）的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到重组hK1一种形式的表达质粒，记为pCHO1.0-opt-hK1，见图6-b。

实施例3：含有优化后重组hK1基因CHO宿主细胞制备

1.含有优化后重组hK1基因CHO-K1贴壁宿主细胞制备

分别在24孔板中铺入适量的CHO-K1（CCL-61，购于ATCC）细胞，再依次加入不同浓度G418(E859-5G，购于Amresco)的含有5%FBS(FSP500，购于吉泰生物)的DMEM/F12（MD207-050，购于Merck）培养基。2周后，MTT（0793-5G，购于Amresco）方法确定G418工作浓度在400-800ug/mL之间，本申请G418工作浓度为600μg/mL，见图7-a。

将测序正确的pCMV13-opt-hK1质粒电转染到CHO-K1细胞中后，加入含有浓度为600μg/mL的G418培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱培养。2周后显微镜下观察出现多个细胞簇。通过有限稀释法和实施例6中间接ELISA方法高通量筛选单克隆细胞株，蛋白免疫印迹鉴定高表达细胞株，见图8-a，即获得含有优化后重组hK1基因CHO-K1宿主单克隆细胞株。

2.含有优化后重组hK1基因CHO-S悬浮宿主细胞制备

分别在24孔板中加入适量的CHO-S（A1369601，购于Invitrogen）细胞，再依次加入含不同浓度嘌呤霉素的CD FortiCHO（A1148301，购于Invitrogen）培养基。2周后，MTT方法确定嘌呤霉素工作浓度在5-10ug/mL之间，本申请嘌呤霉素工作浓度起始为10μg/mL，图7-b。

将测序正确的pCHO1.0-opt-hK1质粒通过NruI（R0192S，购于Invitrogen）线性化，电转染到CHO-S细胞中后，分别加入嘌呤霉素和MTX进行筛选，一周后计算细胞活率，当细胞活率大于30%以上转移到摇床中，37℃，8%CO₂，130rpm培养，并通过不断增加嘌呤霉素和MTX浓度来加压筛选直到通过表达量评价。通过有限稀释法和实施例6中ELISA方法高通量检测筛选单克隆细胞株，蛋白免疫印迹鉴定高表达细胞株，见图8-b，为含有优化后重组hK1基因的CHO-S宿主单克隆细胞株。

实施例4：含有优化后重组hK1基因CHO宿主细胞扩大培养

1.含有优化后重组hK1基因CHO-K1微载体扩大培养

将含有表达重组hK1的单克隆细胞株CHO-K1接入含有5%FBS的DMEM/F12培养基中，37℃，5%CO₂培养箱内进行培养。取对数生长期的细胞接入双侧壁细胞悬浮培养瓶中进行扩大培养，细胞接种密度为1×10⁵/mL，微载体浓度为5g/L（17-0448-02，购于GE healthcare），培养基为含有5%FBS的DMEM/F12，转速为45rpm。当细胞在微载体上的汇合度达到90%时，更换无血清培养基进行培养。一周后收集含有重组人激肽释放酶的培养基。

2.含有优化后重组hK1基因CHO-S悬浮扩大培养

将含有表达重组hK1的单克隆细胞株CHO-S接种于CD FortCD培养基中，37℃，8%CO₂，130rpm摇床中培养。当细胞密度达到5×10⁶/mL后，每隔一天流加2g/L的葡萄糖并取样，检测细胞的活率和密度，直到细胞的活率低于70%时，收集含有重组人激肽释放酶的培养基。随着葡萄糖流加，不同时间重组hK1上清培养液免疫印迹图见图9。

实施例5：重组hK1蛋白的纯化

1.培养液预处理

收集含有实施例4步骤1中含有重组hK1的培养液，12000rpm，4℃，高速离心，去除细胞碎片，超滤浓缩，并过滤0.20μm的膜，去除病毒。

2.阴离子交换

运用全自动智能蛋白纯化系统（AKTA avant150，GE healcare）UNICORN6.1操作软件中DOE方法优化对预处理获得的重组hK1培养液进行载量和纯度优化，首先用20mmol/L，pH=7.5的磷酸缓冲液平衡柱子直至基线平衡，然后将预处理后的上清经过Q sepharose HP （17-1014-03，购于GE healthcare）介质从培养基中捕获重组hK1，接着用20mmol/L磷酸二氢钠，1.0mol/L NaCl，pH=7.5洗脱缓冲液等度洗脱柱子，收集各个洗脱峰，分离杂蛋白和重组hK1蛋白，进一步去除部分病毒和残留宿主细胞DNA，洗脱峰色谱图见图10。

3.疏水层析

步骤2中收集到的含有重组hK1蛋白的洗脱峰中用（NH₄）₂SO₄调至电导率>130ms/cm，再经过phenyl sepharose（17-0973-03，购于GE healthcare）介质，用20mmol/L，pH=7.5的磷酸缓冲液梯度洗脱收集各个洗脱峰，就可以分离糖基化修饰程度不一致的重组hK1蛋白，洗脱峰色谱图见图11。

4.亲和纯化

最后可以再用Benzamidine FF（17-5144-01，购于GE healthcare）介质对上一步收集到的分子量不同的重组hK1进行纯化。SDS-PAGE凝胶电泳分析纯度并对符合要求部分进行过0.20μm膜，进一步去除残留病毒和宿主细胞DNA，如图12-a和图12-b为不同分子量的重组hK1蛋白，即为重组hK1原液。

根据电泳结果，通过上述过滤和纯化步骤，不仅可以去除病毒和宿主DNA，而且可以将重组hK1蛋白纯化，也可以将不同糖基化修饰的两种分子量的重组hK1蛋白完全分离。

实施例6：重组hK1间接ELISA方法建立

1一抗和二抗稀释倍数优化

将实施例5中获得的重组hK1蛋白用pH=7.0的PBS缓冲液稀释到一定浓度，以每孔100μL用量将上述梯度溶液包被于酶标板中，4℃过夜。第二天弃去板中包被溶液，用洗涤缓冲液（PBST）洗涤3次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体，以每孔100μL加入含2.5％脱脂奶粉（LP0031，购于OXOID）的封闭液，于37℃封闭2h。弃去封闭液，于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。加入经稀释的待测蛋白第一抗体（Anti-Kallikrein1-Kallikrein loop，ab28289，购于abcam），孵育后洗板加入经稀释的酶标记的第二抗体（Anti-Rabbit IgG–Peroxidase antibody produced in goat，A0545-1mL，购于Sigma-Aldrich），最终添加荧光底物Amplex UltraRed Reagent（A36006，购于Invitrogen）和3%双氧水（10011218，购于国药）反应15分钟后，于激发波长530nm，发射波长590nm，读数。优化第一抗体（Anti-Kallikrein1-Kallikrein loop，ab28289，购于abcam）稀释倍数和第二抗体（Anti-Rabbit IgG–Peroxidase antibody produced in goat，A0545-1mL，购于Sigma-Aldrich）稀释倍数，最终确定第一抗体稀释比例为1：3000，第二抗体稀释比例为1：75000。

2.重组hK1间接ELISA标准曲线

将实施例5中获得重组hK1蛋白用pH=7.0的PBS缓冲液稀释到浓度分别为2500ug/mL，1250g/mL，625ng/mL，312.5ng/mL，156.3ng/mL，78.1ng/mL，39ng/mL，19.5ng/mL，以每孔100μL用量将上述梯度溶液包被于酶标板中，4℃过夜。第二天弃去板中包被溶液，用洗涤缓冲液（PBST）洗涤3次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体，以每孔100μL加入含2.5％脱脂奶粉的封闭液，于37℃封闭2h。弃去封闭液，于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。一次加入一抗稀释比例为1:3000和二抗稀释比例为1:75000孵育2h，最终添加荧光底物和3%双氧水反应15分钟后于激发波长530nm，发射波长590nm，读数，获得重组hK1的间接ELISA标准曲线，y＝210.7x-933，R值为0.9983（结果见图13）；拟合浓度范围为20～2500ng/mL。

3.方法准确性及回收率的测定

将实施例5中获得重组hK1蛋白到稀释到PBS溶液液中，使其在PBS中的终质量浓度为100，1000ng/mL，各取100μL进行ELISA实验。以板内误差及板间误差来表示该方法的精确度。板内测定为同一酶标板上同一样本若干孔的荧光读数值，板间测定为不同酶标板上几次测定的荧光读数值，测定结果无显著差异(P值=0.5874≥0.05)，见图14-a。同时以没有加入重组hK1蛋白的PBS作为对照。测定时每个样品质量浓度设定3个重复，并重复3次实验。然后进行测定荧光信号值，代入标准回归方程，计算重组hK1蛋白的含量，回收率在100～120%之间，见图14-b。

4.样品浓度测定

将实施例4中获得的含有优化后重组hK1基因CHO-S宿主细胞表达的重组hK1上清液，包被酶标板，孵育、洗板、封闭后，加入第一抗体，孵育后洗板加入第二抗体，再次孵育后洗板加入荧光底物和3%双氧水反应一段15分钟后，测得荧光值；最后与步骤2中获得的标准曲线比较，得到重组hK1蛋白在摇瓶中表达的含量。本发明的含有经优化过的重组hK1基因的CHO-S宿主细胞在摇瓶培养规模中制备重组hK1蛋白的表达量就可达200mg/L以上，见图15。根据合理推算可以确定放大发酵后可超过1g/L，远高于现有技术中的表达量，可应用于实际工业化生产。

实施例7：重组hK1表征性质分析

1.重组hK1蛋白N端测定

蛋白质多肽类药物分子N端序列的测定是医药工业质量控制的重要环节之一。本试验主要采用基于经典的Edman降解法的N端序列分析，利用岛津全自动蛋白质多肽测序仪（PPSQ-33A，SHIMADZU）对实施例5纯化后收集得到的相对分子质量不同的重组hK1的N端序列进行分析，结果由图16-b所示，N端氨基酸残基均为Ile-Val-Gly-Gly-Trp，这表明哺乳动物CHO在表达的重组hK1蛋白时，信号肽剪切完全，N端序列与天然序列完全一致，没有出现N端不均一现象，两种重组hK1的分子量差异是由糖基化修饰不同引起的。

2.重组hK1蛋白的相对分子量测定

蛋白质多肽类药物分子的相对分子质量测定是医药工业质量控制的重要环节之一。本试验通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（4800Plus MALDI TOF/TOF，AB SCIEX）对实施例5纯化后收集到的相对分子质量偏高和偏低的重组hK1蛋白相对分子质量进行分析，结果见图17-b和17-c，相对分子质量偏高的重组hK1蛋白相对分子质量大小为32460.5Da，相对分子质量偏低的重组hK1蛋白相对分子质量大小为31175.1Da。

3.重组hK1蛋白的等电点测定

蛋白质多肽类药物分子的等电点测定是医药工业质量控制的重要环节之一。本试验的通过多功能平板等电聚焦系统（MultiphorⅡ，GE Healthcare）对重组hK1蛋白进行分析，结果见图15，相对分子质量偏高和偏低的重组hK1蛋白在pI标准蛋白4.00附近，这表明哺乳动物CHO表达的相对分子质量偏高和偏低的重组hK1蛋白等电点没有明显区别，pI均约为4.00（图18）。

4.重组hK1蛋白的去糖基化分析

通过对实施例5相对分子质量分析，重组hK1蛋白相对分子质量分别为32460.5Da和31175.1Da。用N-glycosidase F和O-glycosidase对这两种重组hK1蛋白进行去糖基化，SDS-PAGE凝胶电泳分析，图19显示去糖基化后，分子量较低的重组hK1蛋白与分子量较高的重组hK1分子量大小相当。

5重组hK1蛋白的比活力测定

5.1荧光底物比活力测定

将荧光底物Z-Phe-Arg-MCA（C9521，购于sigma-Aldrich）溶于DMSO（V900090，购于sigma-Aldrich）中，再用50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，10mmol/L CaCl2，pH=8.0配成的反应缓冲液稀释至0.2mM后加入25μL至酶标板中，最后将含有hK1蛋白的样品分别加入25μL于已加入底物的酶标板中，2复孔。振荡混匀后，设置激发波长为380nm，发射波长460nm，循环读板。以荧光信号值为纵坐标，读板时间为横坐标，斜率为荧光信号值和读板时间的比值，算出各个孔的斜率，以购于千红制药的标准品猪激肽释放酶纯品（NO.3712030700）测得的酶活制作标准曲线（见图20-a）。结果显示（图20-b）实施例5获得的不同相对分子质量的重组hK1蛋白比活力大于为1500IU/mg，说明不同糖修饰的高分子量、低分子量重组hK1蛋白的体外生物活性没有差别。

5.2发色底物比活力测定

用实施例5步骤2中反应缓冲液将标准品猪激肽释放酶稀释5个浓度梯度10IU/mL，5IU/mL，2.5IU/mL，1.25IU/mL，0.625IU/mL，底物为D-Val-Leu-Arg p-nitroanilide（购于sigma-Aldrich），使用时用反应缓冲液稀释至0.2mmol/L。样品用反应缓冲液稀释适当倍数，于96孔板中先每孔加稀释好的底物80μL，然后立即加入稀释好的标准品80μL及各样品，SynergyH1GEN酶标仪（购自BioTek）37℃，405nm处进行吸光度检测，1min检测一次，连续检测15min。实验结果显示，实施例5获得的不同相对分子质量的重组hK1蛋白比活力均为1600IU/mg，与步骤5.1中检测结果完全一致。进一步说明不同糖修饰的高分子量、低分子量重组hK1蛋白的体外生物活性没有差别。

综上所述，经CHO表达的分子质量不同的重组hK1蛋白，虽然糖基化修饰略有不同而导致分子量略有差异，但是二者在蛋白质氨基酸序列、等电点、空间结构及生物活性等性质方面没有差异。

Claims

1.一种重组人激肽释放酶1的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的编码基因，其特征在于，在所述编码基因之前加有分泌信号肽，所述分泌信号肽的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种含有如权利要求1或2所述的编码基因的载体，所述的载体为pcDNA3.1(+)，p3×FLAG-CMV13或pCHO1.0，优选为pCHO1.0。

4.一种包含有如权利要求3所述的载体的CHO细胞株，所述细胞株为CHO-K1或CHO-S细胞株，优选为CHO-S细胞株。

5.一种重组人激肽释放酶1蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：

A.构建含有如权利要求3所述的载体；

B.将步骤A的载体线性化后转入如权利要求4所述的CHO宿主细胞中，并在合适的条件下扩大培养；

C.回收纯化蛋白质。

6.如权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述扩大培养具体包含如下步骤：

A.将CHO细胞宿主接入培养基中，置于培养箱内进行培养；

B.取对数生长期的细胞接入含有3-5g/L微载体的细胞悬浮培养瓶中进行扩大培养，细胞接种数为1～5×10⁵/mL，培养基为含有5～10%FBS的DMEM/F12，转速为45～130rpm，置于培养箱内搅拌培养；

C.当细胞于微载体汇合度大于90%以上，换无血清培养基进行培养；

7.如权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述扩大培养具体包含如下步骤：

A.将单克隆细胞株CHO-S接种于CD FortCD培养基培养；

B.当细胞密度达到5×10⁶/mL后，每隔一天流加2g/L的葡萄糖；

8.一种人激肽释放酶1蛋白纯化工艺，所述纯化工艺如下：

A.首先对收集到的如权利要求6或7所述的培养基进行离心收集，浓缩滤0.2μm滤膜，去除病毒和宿主残留DNA。

B.接着用阴离子Q柱从经过预处理步骤A中的培养基捕获重组人激肽释放酶1，并进一步去除病毒和宿主残留DNA等。

C.然后用疏水phenyl柱对上一步收集到的糖基化修饰程度不同的重组hK1进进行分离。

9.一种测定人激肽释放酶1蛋白浓度的方法，所述方法具体包括如下：

A.取已知浓度的人激肽释放酶1蛋白质的标准品获得系列浓度的标准溶液，取所述标准溶液包被酶标板，孵育、洗板、封闭；

B.加入经稀释的人激肽释放酶1的第一抗体，孵育后洗板加入经稀释的酶标记的第二抗体，再次孵育后洗板加入所述酶的荧光底物和双氧水，反应一段时间后，测得荧光值，获得标准曲线；

C.取待测人激肽释放酶1蛋白质获得待测溶液，包被酶标板，孵育、洗板、封闭后，加入所述第一抗体，孵育后洗板加入第二抗体，再次孵育后洗板加入所述酶的荧光底物和双氧水，反应一段时间后，测得荧光值，与所述标准曲线比较，获得所述蛋白质的浓度。

10.如权利要求9所述的蛋白浓度检测方法在高表达人激肽释放酶1单克隆细胞株筛选中的应用。