JP7316662B2 - 操作されたイミンレダクターゼ、ならびにケトン化合物およびアミン化合物の還元的アミノ化のための方法 - Google Patents
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配列表の正式な写しは、EFS-Webを介してASCIIフォーマットテキストファイル(ファイル名「CX2-151USP1_ST25.txt」、作成日2016年8月26日およびサイズ511キロバイト)として本明細書と同時に提出される。EFS-Webを介して提出された配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる。
既存の抗生物質に対して耐性の細菌株の蔓延は、新たな抗菌剤の開発の必要性を強調している。複数の作用機序を標的とするように製剤化された抗生物質カクテルがますます普及している。細菌は、β-ラクタマーゼで化合物を加水分解することによって、β-ラクタム抗生物質の中和において非常に効率的になった。レレバクタム(relebactam)は、抗生物質がその標的に作用することを可能にする酵素を無効化するβ-ラクタマーゼインヒビターである。レレバクタムの化学合成は多段階プロセスであり、その1つは、ベンジルオキシアミンの立体選択的付加を必要とする。この化学工程は低収率であるので、酵素の使用が魅力的な代替手段になる。
123/124/169/171/173/213/235、123/124/169/212/213/235、123/169/171/173/212/213/235、123/169/171/173/213/235、123/169/173/175/213/235、123/169/173/212/213、123/169/175、123/169/175/212/235、123/169/212/213、123/173/175/212/213/235、123/212/213/235、123/212/235、123/169/171/173/175/212/213、123/169/173、123/169/212/213/235、123/213、124/169、124/169/173/175/212/213、124/169/173/212/213、124/169/173/212/213/235、124/169/175/212/213/235、124/169/212/213/235、124/169/213/235、124/175/212/213/235、124/212/213/235、134/169/176/178/211/214、134/169/176/178/211、134/169/176/178/211/217、134/169/176/211/215/217/234、134/169/176/211、134/169/178/211/214/217、134/169/211/214/217、134/169/211/217、134/176/211/214、134/176/211/215、134/211/214、169/171/173/213/235、169/173/175/213/235、169/175/212/213/235、169/176/178/211/214、169/176/178/211/214/217、169/176/178/211/217、169/176/178、169/176/178/211/214/217、169/176/211/214、169/176/211/214/215/234、169/176/211/214/217、169/176/211/217、169/176/214/215/217、169/178/217、169/178/234、169/211/214/215、169/211/217、169/212/213、169/212/235、169/212/213/235、169/235、171/173/212/213/235、173/175/213、175/213/235、175/235、176/178/211/215/217、176/178/211/217、176/211/214、176/214/217、178/211/214、178/211/217、178/215、211/234、212/213/235および213/235から選択される少なくとも2つの置換を含み、前記位置が、配列番号270を参照して付番されている、操作されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、123G/124G/169N/171V/173H/213V/235K、123G/124G/169N/212V/213V/235K、123G/169N/171V/173H/213V/235K、123G/169N/171V/173I/212C/213V/235K、123G/169N/173H/175H/213V/235K、123G/169N/173I/212G/213T、123G/169N/175G、123G/169N/175G/212C/235K、123G/169N/212G/213V、123G/173H/175H/212C/213V/235K、123G/212C/213V/235K、123G/212G/235K、123G/169N/171V/173H/175H/212X/213V、123G/169N/173I、123G/169N/212G/213V/235K、123G/213T、124G/169N、124A/169N/173I/175H/212G/213V、124G/169N/173I/212C/213V、124G/169N/173I/212G/213V、124G/169N/173I/212V/213V/235K、124G/169N/175G/212C/213V/235K、124G/169N/212G/213V/235K、124G/169N/212V/213V/235K、124G/175G/212V/213V/235K、124G/169N/213V/235K、124G/212C/213V/235K、124G/212G/213V/235K、134R/169N/176S/178I/211L/214M、134R/169N/176S/178I/211W、134R/169N/176S/178M/211L/217L、134R/169N/176S/211L/215M/217I/234L、134R/169N/176S/211W、134R/169N/178M/211W/214M/217I、134R/169N/211W/214M/217L、134R/169N/211W/217L、134R/176S/211W/214M、134R/176S/211W/215M、134R/211W/214M、169N/171V/173I/213V/235K、169N/173I/175H/213V/235K、169N/175G/212C/213V/235K、169N/M175H/E212G/A213V/A235K、169N/176S/178I/211L/214M、169N/176S/178I/211W/214M/217L、169N/176S/178I/211W/217L、169N/176S/178M、169N/176S/178M/211W/214M/217I、169N/176S/211W/214M、169N/176S/211W/214M/215L/234L、169N/176S/211W/217I、169N/176S/211W/217L、169N/176S/214M/215M/217I、169N/176S/211L/214M/217I、169N/178I/217I、169N/178M/234L、169N/211W/214M/215L、169N/211W/217I、169N/212C/235K、169N/212C/213V/235K、169N/212G/213V、169N/212V/213V/235K、169N/235K、171V/173I/212G/213V/235K、173I/175H/213V、175H/213P/235K、175H/235K、176S/178I/211W/215L/217L、176S/178I/211W/217I、176S/211L/214M、176S/214M/217L、178M/211L/214M、178M/211W/217L、178I/215M、211W/234L、212G/213V/235K、212V/213V/235K、213T/235K、および213V/235Kから選択される少なくとも1つの置換セットを含み、前記位置は、配列番号270を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、T123G/I124G/A169N/Y171V/A173H/A213V/A235K、T123G/I124G/A169N/E212V/A213V/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173H/A213V/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173I/E212C/A213V/A235K、T123G/A169N/A173H/M175H/A213V/A235K、T123G/A169N/A173I/E212G/A213T、T123G/A169N/M175G、T123G/A169N/M175G/E212C/A235K、T123G/A169N/E212G/A213V、T123G/A173H/M175H/E212C/A213V/A235K、T123G/E212C/A213V/A235K、T123G/E212G/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173H/M175H/E212X/A213V、T123G/A169N/A173I、T123G/A169N/E212G/A213V/A235K、T123G/A213T、I124G/A169N、I124A/A169N/A173I/M175H/E212G/A213V、I124G/A169N/A173I/E212C/A213V、I124G/A169N/A173I/E212G/A213V、I124G/A169N/A173I/E212V/A213V/A235K、I124G/A169N/M175G/E212C/A213V/A235K、I124G/A169N/E212G/A213V/A235K、I124G/A169N/E212V/A213V/A235K、I124G/M175G/E212V/A213V/A235K、I124G/A169N/A213V/A235K、I124G/E212C/A213V/A235K、I124G/E212G/A213V/A235K、T134R/A169N/L176S/V178I/I211L/V214M、T134R/A169N/L176S/V178I/I211W、T134R/A169N/L176S/V178M/I211L/W217L、T134R/A169N/L176S/I211L/T215M/W217I/D234L、T134R/A169N/L176S/I211W、T134R/A169N/V178M/I211W/V214M/W217I、T134R/A169N/I211W/V214M/W217L、T134R/A169N/I211W/W217L、T134R/L176S/I211W/V214M、134R/L176S/I211W/T215M、T134R/I211W/V214M、A169N/Y171V/A173I/A213V/A235K、
A169N/A173I/M175H/A213V/A235K、A169N/M175G/E212C/A213V/A235K、A169N/M175H/E212G/A213V/A235K、A169N/L176S/V178I/I211L/V214M、A169N/L176S/V178I/I211W/V214M/W217L、A169N/L176S/V178I/I211W/W217L、A169N/L176S/V178M、A169N/L176S/V178M/I211W/V214M/W217I、A169N/L176S/I211W/V214M、A169N/L176S/I211W/V214M/T215L/D234L、A169N/L176S/I211W/W217I、A169N/L176S/I211W/W217L、A169N/L176S/V214M/T215M/W217I、A169N/L176S/I211L/V214M/W217I、A169N/V178I/W217I、A169N/V178M/D234L、A169N/I211W/V214M/T215L、A169N/I211W/W217I、A169N/E212C/A235K、A169N/E212C/A213V/A235K、A169N/E212G/A213V、A169N/E212V/A213V/A235K、A169N/A235K、Y171V/A173I/E212G/A213V/A235K、A173I/M175H/A213V、M175H/A213P/A235K、M175H/A235K、L176S/V178I/I211W/T215L/W217L、L176S/V178I/I211W/W217I、L176S/I211L/V214M、L176S/V214M/W217L、V178M/I211L/V214M、V178M/I211W/W217L、V178I/T215M、I211W/D234L、E212G/A213V/A235K、E212V/A213V/A235K、A213T/A235K、およびA213V/A235Kから選択される少なくとも1つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号270を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号76~配列番号232に記載されている任意の偶数番号の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
632G/633G/640A/643T/644T/645G、507C/526T/527C/534G/633A/640A/645T/649C/650T/651A/702T、507C/526T/527C/534G/633A/640A/645T/649C/650T/651A/702T、507C/526T/532A/534T/644T/645G/702Tおよび631T/632G/633G/645T/700C/701Tから選択される置換/置換セットの少なくとも1つを含み、前記位置は、配列番号269を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下のA367G/C368G/C369T/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/A523G/T524G/G525C/G634T/A635G/A636C/G639T/G703A/C704A/C705G、C369G/A370G/T371G/T372C/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/A370G/T371G/T372C/A507C/T513C/519C/A523G/T524G/G525C/A635T/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T511G/A512T/G517A/C518T/A519T/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T513C/G517A/C518T/A519T/A523C/T524A/G525C/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/A523G/T524G/G525C/G634T/A635G/A636C/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/A635T/C638T/G703A/C704A/C705G、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534G/A631C/C633A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631C/C633A/G640A/C645T/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631C/C633A/C644T/C645G/T649A/G650T/G651A/G700C/A701T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/G532A/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/C702T、C401G/C402G/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/C644T/C645G/C702T、C401G/C402G/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534G/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631C/C633A/G640A/C645T/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631C/C633A/G640A/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/A643T/C644T/C645G/G700C/A701T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534T/C633A/G640A/C644T/C645G/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/G532A/C534G/C633A/C645T/G700C/A701T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/G532A/C534T/C645T/T649A/G650T/G651A、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/A643T/C644T/C645G/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/A507C/C526T/G532A/C534G/A631C/C633A/G640A/C645T、C402G/A507C/C526T/G532A/C534G/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/C526T/T527C/C534T/A631C/C633A/G640A/C645T/C702T、G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、G505A/C506A/A507C/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/A643T/C644T/C645G、A507C/C526T/T527C/C534G/C633A/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、A507C/C526T/G532A/C534T/C644T/C645G/C702T、およびA631T/T632G/C633G/C645T/G700C/A701Tから選択される置換/置換セットの少なくとも1つを含み、前記位置は、配列番号269を参照して付番されている。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
配列番号2の参照配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、57/211、87/175、103/212、122、123、124/178、124、132、134、169、171、173、175、176、178/242、178、211、212、213、214、215、217、234および235から選択される1つまたはそれを超える位置に、少なくとも1つの置換を含み、前記位置が、配列番号2を参照して付番されている、操作されたポリペプチド。
(項目2)
57T/211L、87S/175G、103H/212C、122E、123G、124A/178I、124G、132H/R、134R、169N/S、171W、173H/I、175G/H、176S、178I/242Y、178M、211L/W、212C/G/V、213P/R/T/V、214M、215L/M、217I/L、234Lおよび235Kから選択される少なくとも1つの置換を含み、前記位置が、配列番号2を参照して付番されている、項目1に記載の操作されたポリペプチド。
(項目3)
A57T/I211L、P87S/M175G、R103H/E212C、L122E、T123G、I124A/V178I、I124G、E132H/R、T134R、A169N/S、Y171W、A173H/I、M175G/H、L176S、V178I/A242Y、V178M、I211L/W、E212C/G/V、A213P/R/T/V、V214M、T215L/M、W217I/L、D234LおよびA235Kから選択される少なくとも1つの置換を含み、前記位置が、配列番号2を参照して付番されている、項目1に記載の操作されたポリペプチド。
(項目4)
配列番号4~配列番号74に記載されている任意の偶数番号の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目1に記載の操作されたポリペプチド。
(項目5)
配列番号270の参照配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、置換セット:
123/124/169/171/173/213/235、123/124/169/212/213/235、123/169/171/173/212/213/235、123/169/171/173/213/235、123/169/173/175/213/235、123/169/173/212/213、123/169/175、123/169/175/212/235、123/169/212/213、123/173/175/212/213/235、123/212/213/235、123/212/235、123/169/171/173/175/212/213、123/169/173、123/169/212/213/235、123/213、124/169、124/169/173/175/212/213、124/169/173/212/213、124/169/173/212/213/235、124/169/175/212/213/235、124/169/212/213/235、124/169/213/235、124/175/212/213/235、124/212/213/235、134/169/176/178/211/214、134/169/176/178/211、134/169/176/178/211/217、134/169/176/211/215/217/234、134/169/176/211、134/169/178/211/214/217、134/169/211/214/217、134/169/211/217、134/176/211/214、134/176/211/215、134/211/214、169/171/173/213/235、169/173/175/213/235、169/175/212/213/235、169/176/178/211/214、169/176/178/211/214/217、169/176/178/211/217、169/176/178、169/176/178/211/214/217、169/176/211/214、169/176/211/214/215/234、169/176/211/214/217、169/176/211/217、169/176/214/215/217、169/178/217、169/178/234、169/211/214/215、169/211/217、169/212/213、169/212/235、169/212/213/235、169/235、171/173/212/213/235、173/175/213、175/213/235、175/235、176/178/211/215/217、176/178/211/217、176/211/214、176/214/217、178/211/214、178/211/217、178/215、211/234、212/213/235および213/235から選択される少なくとも2つの置換を含み、前記位置が、配列番号270を参照して付番されている、操作されたポリペプチド。
(項目6)
123G/124G/169N/171V/173H/213V/235K、123G/124G/169N/212V/213V/235K、123G/169N/171V/173H/213V/235K、123G/169N/171V/173I/212C/213V/235K、123G/169N/173H/175H/213V/235K、123G/169N/173I/212G/213T、123G/169N/175G、123G/169N/175G/212C/235K、123G/169N/212G/213V、123G/173H/175H/212C/213V/235K、123G/212C/213V/235K、123G/212G/235K、123G/169N/171V/173H/175H/212X/213V、123G/169N/173I、123G/169N/212G/213V/235K、123G/213T、124G/169N、124A/169N/173I/175H/212G/213V、124G/169N/173I/212C/213V、124G/169N/173I/212G/213V、124G/169N/173I/212V/213V/235K、124G/169N/175G/212C/213V/235K、124G/169N/212G/213V/235K、124G/169N/212V/213V/235K、124G/175G/212V/213V/235K、124G/169N/213V/235K、124G/212C/213V/235K、124G/212G/213V/235K、134R/169N/176S/178I/211L/214M、134R/169N/176S/178I/211W、134R/169N/176S/178M/211L/217L、134R/169N/176S/211L/215M/217I/234L、134R/169N/176S/211W、134R/169N/178M/211W/214M/217I、134R/169N/211W/214M/217L、134R/169N/211W/217L、134R/176S/211W/214M、134R/176S/211W/215M、134R/211W/214M、169N/171V/173I/213V/235K、169N/173I/175H/213V/235K、169N/175G/212C/213V/235K、169N/M175H/E212G/A213V/A235K 169N/176S/178I/211L/214M、169N/176S/178I/211W/214M/217L、169N/176S/178I/211W/217L 169N/176S/178M、169N/176S/178M/211W/214M/217I、169N/176S/211W/214M、169N/176S/211W/214M/215L/234L、169N/176S/211W/217I、169N/176S/211W/217L、169N/176S/214M/215M/217I、169N/176S/211L/214M/217I、169N/178I/217I、169N/178M/234L、169N/211W/214M/215L、169N/211W/217I、169N/212C/235K、169N/212C/213V/235K、169N/212G/213V、169N/212V/213V/235K、169N/235K、171V/173I/212G/213V/235K、173I/175H/213V、175H/213P/235K、175H/235K、176S/178I/211W/215L/217L、176S/178I/211W/217I、176S/211L/214M、176S/214M/217L、178M/211L/214M、178M/211W/217L、178I/215M、211W/234L、212G/213V/235K、212V/213V/235K、213T/235Kおよび213V/235Kから選択される少なくとも1つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号270を参照して付番されている、項目5に記載の操作されたポリペプチド。
(項目7)
T123G/I124G/A169N/Y171V/A173H/A213V/A235K、T123G/I124G/A169N/E212V/A213V/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173H/A213V/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173I/E212C/A213V/A235K、T123G/A169N/A173H/M175H/A213V/A235K、T123G/A169N/A173I/E212G/A213T、T123G/A169N/M175G、T123G/A169N/M175G/E212C/A235K、T123G/A169N/E212G/A213V、T123G/A173H/M175H/E212C/A213V/A235K、T123G/E212C/A213V/A235K、T123G/E212G/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173H/M175H/E212X/A213V、T123G/A169N/A173I、T123G/A169N/E212G/A213V/A235K、T123G/A213T、I124G/A169N、I124A/A169N/A173I/M175H/E212G/A213V、I124G/A169N/A173I/E212C/A213V、I124G/A169N/A173I/E212G/A213V、I124G/A169N/A173I/E212V/A213V/A235K、I124G/A169N/M175G/E212C/A213V/A235K、I124G/A169N/E212G/A213V/A235K、I124G/A169N/E212V/A213V/A235K、I124G/M175G/E212V/A213V/A235K、I124G/A169N/A213V/A235K、I124G/E212C/A213V/A235K、I124G/E212G/A213V/A235K、T134R/A169N/L176S/V178I/I211L/V214M、T134R/A169N/L176S/V178I/I211W、T134R/A169N/L176S/V178M/I211L/W217L、T134R/A169N/L176S/I211L/T215M/W217I/D234L、T134R/A169N/L176S/I211W、T134R/A169N/V178M/I211W/V214M/W217I、T134R/A169N/I211W/V214M/W217L、T134R/A169N/I211W/W217L、T134R/L176S/I211W/V214M、134R/L176S/I211W/T215M、T134R/I211W/V214M、A169N/Y171V/A173I/A213V/A235K、A169N/A173I/M175H/A213V/A235K、A169N/M175G/E212C/A213V/A235K、A169N/M175H/E212G/A213V/A235K、A169N/L176S/V178I/I211L/V214M、A169N/L176S/V178I/I211W/V214M/W217L、A169N/L176S/V178I/I211W/W217L、A169N/L176S/V178M、A169N/L176S/V178M/I211W/V214M/W217I、A169N/L176S/I211W/V214M、A169N/L176S/I211W/V214M/T215L/D234L、A169N/L176S/I211W/W217I、A169N/L176S/I211W/W217L、A169N/L176S/V214M/T215M/W217I、A169N/L176S/I211L/V214M/W217I、A169N/V178I/W217I、A169N/V178M/D234L、A169N/I211W/V214M/T215L、A169N/I211W/W217I、A169N/E212C/A235K、A169N/E212C/A213V/A235K、A169N/E212G/A213V、A169N/E212V/A213V/A235K、A169N/A235K、Y171V/A173I/E212G/A213V/A235K、A173I/M175H/A213V、M175H/A213P/A235K、M175H/A235K、L176S/V178I/I211W/T215L/W217L、L176S/V178I/I211W/W217I、L176S/I211L/V214M、L176S/V214M/W217L、V178M/I211L/V214M、V178M/I211W/W217L、V178I/T215M、I211W/D234L、E212G/A213V/A235K、E212V/A213V/A235K、A213T/A235KおよびA213V/A235Kから選択される少なくとも1つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号270を参照して付番されている、項目5に記載の操作されたポリペプチド。
(項目8)
配列番号76~配列番号232に記載されている任意の偶数番号の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目5に記載の操作されたポリペプチド。
(項目9)
配列番号229の参照配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、45、127、130、134、174、206、209、212、216、223、227および279から選択される1つまたはそれを超える位置に、少なくとも1つの置換を含み、前記位置が、配列番号229を参照して付番されている、操作されたポリペプチド。
(項目10)
45I、127R、130R、134L/R、174M、206L、209K/S、212H/K/R、216N/R/S、223N、227Vおよび279Vから選択される少なくとも1つの置換を含み、前記位置が、配列番号229を参照して付番されている、項目9に記載の操作されたポリペプチド。
(項目11)
V45I、G127R、T130R、T134L/R、A174M、M206L、Q209K/S、E212H/K/R、G216N/R/S、D223N、A227VおよびD279Vから選択される少なくとも1つの置換を含み、前記位置が、配列番号229を参照して付番されている、項目9に記載の操作されたポリペプチド。
(項目12)
配列番号234~配列番号270に記載されている任意の偶数番号の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目9に記載の操作されたポリペプチド。
(項目13)
項目1~12のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたポリペプチドをコードする、操作されたポリヌクレオチド。
(項目14)
配列番号3~配列番号267に記載されている奇数番号の配列を含む、操作されたポリヌクレオチド。
(項目15)
操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置12/15/18/21/27、169/631/633、259/523/524/525、308/634/635/636、364/365/366、367/368/369、370/371、370/371/372/532、394/396、394/395/396、401/402、505/506/507、512/513、517/518/519、523/524/525、526/527/528、532/534、532/724/725、631/633、631/632/633、634/635/636、635/636、637/638、637/639、637/639、638/639、640、643/644/645、644/645、649/650/651、700/701/702および703/704/705に置換を含み、前記位置が、配列番号1を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチド。
(項目16)
以下の12A/15T/18G/21C/27A、169A/631C/633T、259T/523G/524G/525T、308A/634T/635G/636T、364G/365A/366A、367G/368G/369T、370G/371G、370G/371C/372A/532A、394C/396T、394A/395G/396G、401G/402G、505A/506A/507T、505A/506G/507T、512G/513G、517A/518T/519T、517C/518A/519T、523C/524A/525T、523G/524G/525T、526A/527G/528T、532A/534G、532A/724T/725A、631C/633T、631T/632G/633G、634T/635G/636T、635G/636T、635T/636T、637A/638G、637A/639A、637C/639A、638T/639T、640A、643T/644T/645G、644T/645G、649A/650T/651T、649C/650T/651T、700T/701T/702Gおよび703A/704A/705Aから選択される置換/置換セットの少なくとも1つを含み、前記位置が、配列番号1を参照して付番されている、項目15に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
(項目17)
以下のC12A/C15T/A18G/T21C/T27A、G169A/A631C/C633T、C259T/A523G/T524G/G525T、G308A/G634T/A635G/A636T、C364G/T365A/G366A、A367G/C368G/C369T、A370G/T371G、A370G/T371C/T372A/G532A、G394C/A396T、G394A/A395G/A396G、C401G/C402G、G505A/C506A/A507T、G505A/C506G/A507T、A512G/T513G、G517A/C518T/A519T、G517C/C518A/A519T、A523C/T524A/G525T、A523G/T524G/G525T、C526A/T527G/G528T、G532A/C534G、G532A/G724T/C725A、A631C/C633T、A631T/T632G/C633G、G634T/A635G/A636T、A635G/A636T、A635T/A636T、G637A/C638G、G637A/G639A、G637C/G639A、C638T/G639T、G640A、A643T/C644T/C645G、C644T/C645G、T649A/G650T/G651T、T649C/G650T/G651T、G700T/A701T/C702GおよびG703A/C704A/C705Aから選択される置換/置換セットの少なくとも1つを含み、前記位置が、配列番号1を参照して付番されている、項目15に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
(項目18)
操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置367/368/369/505/506/507/513/519/523/524/525/634/635/636/639/703/704/705、369/370/371/372/505/506/507/513/519/638/703/704/705、369/370/371/372/507/513/519/523/524/525/635/638/703/704/705、369/505/506/507/511/512/517/518/519/638/703/704/705、369/505/506/507/513/517/518/519/523/524/525/638/703/704/705、369/505/506/507/513/519/523/524/525/634/635/636/638/703/704/705、369/505/506/507/513/519/635/638/703/704/705、401/402/505/506/507/526/527/532/534/631/632/633/645/702、401/402/505/506/507/526/527/532/534/631/633/640/645/702、401/402/505/506/507/526/527/532/534/631/633/645/649/650/651/702、401/402/505/506/507/526/527/534/631/632/633/645/702、401/402/505/506/507/526/527/534/631/633/644/645/649/650/651/700/701、401/402/505/506/507/526/532/534/631/632/633/640/645/649/650/651/702、401/402/505/506/507/526/534/631/632/633/640/645/649/650/651/702、401/402/505/506/507/526/534/631/632/633/645/649/650/651/702、401/402/507/526/527/534/631/632/633/640/645/702、401/402/507/526/527/534/631/632/633/644/645/702、401/402/526/534/631/632/633/640/645/702、402/505/506/507/526/527/532/534/631/632/633/640/645/649/650/651/702、402/505/506/507/526/527/532/534/702、402/505/506/507/526/527/532/534/631/633/640/645/702、402/505/506/507/526/527/532/534/631/632/633/640/645/649/650/651/702、402/505/506/507/526/527/534/631/633/640/645/649/650/651/702、402/505/506/507/526/527/534/631/632/633/640/643/644/645/700/701、402/505/506/507/526/527/534/631/632/633/640/645/702、402/505/506/507/526/527/534/631/632/633/645/649/650/651/702、402/505/506/507/526/527/534/631/632/633/645/649/650/651/702、402/505/506/507/526/527/534/633/640/644/645/649/650/651/702、402/505/506/507/526/532/534/633/645/700/701、402/505/506/507/526/532/534/645/649/650/651、402/505/506/507/526/534/631/632/633/645/649/650/651/702、402/507/526/527/532/534/631/632/633/643/644/645/649/650/651/702、402/507/526/527/532/534/631/632/633/645/649/650/651/702、402/507/526/532/534/631/633/640/645、402/507/526/532/534/631/632/633/645/649/650/651/702、402/526/527/534/631/633/640/645/702、505/506/507/526/527/532/534/631/632/633/640/645/649/650/651/702、505/506/507/526/527/532/534/631/632/633/645/649/650/651/702、505/506/507/526/534/631/632/633/640/643/644/645、507/526/527/534/633/640/645/649/650/651/702、507/526/532/534/644/645/702、および631/632/633/645/700/701に置換を含み、前記位置が、配列番号269を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチド。
(項目19)
以下の367G/368G/369T/505A/506A/507T/513C/519C/523G/524G/525C/634T/635G/636C/639T/703A/704A/705G、369G/370G/371G/372C/505A/506A/507T/513C/519C/638T/703A/704A/705G、369G/370G/371G/372C/507C/513C/519C/523G/524G/525C/635T/638T/703A/704A/705G、369G/505A/506A/507T/511G/512T/517A/518T/519T/638T/703A/704A/705G、369G/505A/506A/507T/513C/517A/518T/519T/523C/524A/525C/638T/703A/704A/705G、369G/505A/506A/507T/513C/519C/523G/524G/525C/634T/635G/636C/638T/703A/704A/705G、369G/505A/506A/507T/513C/519C/635T/638T/703A/704A/705G、401G/402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534G/631C/633A/645T/649C/650T/651A/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631C/633A/640A/645T/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/645T/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/527C/534G/631C/633A/644T/645G/649A/650T/651A/700C/701T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/527C/534T/631T/632G/633G/645T/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/532A/534G/631T/632G/633G/640A/645T/649A/650T/651A/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/534G/631T/632G/633G/640A/645T/649C/650T/651A/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/534T/631T/632G/633G/645T/649C/650T/651A/702T、401G/402G/507C/526T/527C/534G/631T/632G/633G/640A/645T/702T、401G/402G/507C/526T/527C/534G/631T/632G/633G/644T/645G/702T、401G/402G/526T/534G/631T/632G/633G/640A/645T/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/640A/645T/649C/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534G/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631C/633A/640A/645T/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/640A/645T/649C/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534G/631C/633A/640A/645T/649A/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534G/631T/632G/633G/640A/643T/644T/645G/700C/701T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534G/631T/632G/633G/640A/645T/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534G/631T/632G/633G/645T/649C/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534T/631T/632G/633G/645T/649A/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534T/633A/640A/644T/645G/649A/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/532A/534G/633A/645T/700C/701T、402G/505A/506A/507C/526T/532A/534T/645T/649A/650T/651A、402G/505A/506A/507C/526T/534G/631T/632G/633G/645T/649A/650T/651A/702T、402G/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/643T/644T/645G/649C/650T/651A/702T、402G/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/645T/649A/650T/651A/702T、402G/507C/526T/532A/534G/631C/633A/640A/645T、402G/507C/526T/532A/534G/631T/632G/633G/645T/649C/650T/651A/702T、402G/526T/527C/534T/631C/633A/640A/645T/702T、505A/506A/507C/526T/527C/532A/534G/631T/632G/633G/640A/645T/649A/650T/651A/702T、505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/645T/649C/650T/651A/702T、505A/506A/507C/526T/534G/631T/632G/633G/640A/643T/644T/645G、507C/526T/527C/534G/633A/640A/645T/649C/650T/651A/702T、507C/526T/527C/534G/633A/640A/645T/649C/650T/651A/702T、507C/526T/532A/534T/644T/645G/702T、および631T/632G/633G/645T/700C/701Tから選択される置換/置換セットの少なくとも1つを含み、前記位置が、配列番号269を参照して付番されている、項目18に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
(項目20)
以下のA367G/C368G/C369T/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/A523G/T524G/G525C/G634T/A635G/A636C/G639T/G703A/C704A/C705G、C369G/A370G/T371G/T372C/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/A370G/T371G/T372C/A507C/T513C/519C/A523G/T524G/G525C/A635T/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T511G/A512T/G517A/C518T/A519T/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T513C/G517A/C518T/A519T/A523C/T524A/G525C/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/A523G/T524G/G525C/G634T/A635G/A636C/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/A635T/C638T/G703A/C704A/C705G、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534G/A631C/C633A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631C/C633A/G640A/C645T/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631C/C633A/C644T/C645G/T649A/G650T/G651A/G700C/A701T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/G532A/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/C702T、C401G/C402G/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/C644T/C645G/C702T、C401G/C402G/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534G/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631C/C633A/G640A/C645T/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631C/C633A/G640A/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/A643T/C644T/C645G/G700C/A701T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534T/C633A/G640A/C644T/C645G/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/G532A/C534G/C633A/C645T/G700C/A701T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/G532A/C534T/C645T/T649A/G650T/G651A、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/A643T/C644T/C645G/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/A507C/C526T/G532A/C534G/A631C/C633A/G640A/C645T、C402G/A507C/C526T/G532A/C534G/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/C526T/T527C/C534T/A631C/C633A/G640A/C645T/C702T、G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、G505A/C506A/A507C/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/A643T/C644T/C645G、A507C/C526T/T527C/C534G/C633A/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、A507C/C526T/G532A/C534T/C644T/C645G/C702T、およびA631T/T632G/C633G/C645T/G700C/A701Tから選択される置換/置換セットの少なくとも1つを含み、前記位置が、配列番号269を参照して付番されている、項目18に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
(項目21)
操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置133、379/381、388/389/390、400/401/402、401/402、520/521/522、616/618、625、625/626/627、634、634/635/636、634/636、646、646/647、646、667、680/681および836/837に置換を含み、前記位置が、配列番号229を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチド。
(項目22)
以下の133A、379A/381G、388C/389G/390T、400C/401T/402T、401G/402G、520A/521T/522G、616C/618T、625A、625A/626G/627T、634A、634A/635G/636G、634C/636T、646A、646A/647A、646C、667A、680T/681T、および836T/837Tから選択される置換/置換セットの少なくとも1つを含み、前記位置が、配列番号229を参照して付番されている、項目21に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
(項目23)
以下のG133A、G379A/C381G、A388C/C389G/C390T、A400C/C401T/C402T、C401G/C402G、G520A/C521T/A522G、A616C/G618T、C625A、C625A/A626G/A627T、G634A、G634A/A635G/A636G、G634C/A636T、G646A、G646A/G647A、G646C、G667A、C680T/C681T、およびA836T/C837Tから選択される置換/置換セットの少なくとも1つを含み、前記位置が、配列番号229を参照して付番されている、項目21に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
(項目24)
項目13~23のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(項目25)
少なくとも1つの調節配列をさらに含む、項目24に記載のベクター。
(項目26)
項目24および/または25に記載のベクターを含む、宿主細胞。
(項目27)
項目1~12のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたポリペプチドを生成する、項目26に記載の宿主細胞。
(項目28)
操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドを生成する方法であって、操作されたポリヌクレオチドが発現され、前記操作されたポリペプチドが生成されるような条件下で、項目26または27に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
(項目29)
前記操作されたポリペプチドを回収する工程をさらに含む、項目28に記載の方法。
遺伝的にコードされたアミノ酸のために使用した略語は慣習的な略語であり、これらを以下に示す。
本発明に関して、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、他で具体的に定義しないかぎり、当業者によって一般的に理解される意味を有するであろう。したがって、以下の用語は以下の意味を有することを意図する。
オキシム中間体の形成は、IREDの出発基質を生成するための効率的な方法であり、次いで、IREDは、高い立体選択性でこの化合物を還元して、95%超のエナンチオマー過剰率を有する生成物を生成する(スキーム1に示されている)。このアプローチの課題は、所望の基質と反応する酵素を同定し、酵素の効率を増加させる変異を同定することである。
本発明は、イミンレダクターゼ活性を有するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリペプチドを調製する方法、および前記ポリペプチドを使用するための方法を提供する。説明がポリペプチドに関する場合、それは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを説明し得ると理解すべきである。
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を調節する1つまたはそれを超える異種制御配列に作動可能に連結してポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製することができる。操作されたイミンレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するイミンレダクターゼポリペプチドを発現させる。
123G/124G/169N/171V/173H/213V/235K、123G/124G/169N/212V/213V/235K、123G/169N/171V/173H/213V/235K、123G/169N/171V/173I/212C/213V/235K、123G/169N/173H/175H/213V/235K、123G/169N/173I/212G/213T、123G/169N/175G、123G/169N/175G/212C/235K、123G/169N/212G/213V、123G/173H/175H/212C/213V/235K、123G/212C/213V/235K、123G/212G/235K、123G/169N/171V/173H/175H/212X/213V、123G/169N/173I、123G/169N/212G/213V/235K、123G/213T、124G/169N、124A/169N/173I/175H/212G/213V、124G/169N/173I/212C/213V、124G/169N/173I/212G/213V、124G/169N/173I/212V/213V/235K、124G/169N/175G/212C/213V/235K、124G/169N/212G/213V/235K、124G/169N/212V/213V/235K、124G/175G/212V/213V/235K、124G/169N/213V/235K、124G/212C/213V/235K、124G/212G/213V/235K、134R/169N/176S/178I/211L/214M、134R/169N/176S/178I/211W、134R/169N/176S/178M/211L/217L、134R/169N/176S/211L/215M/217I/234L、134R/169N/176S/211W、134R/169N/178M/211W/214M/217I、134R/169N/211W/214M/217L、134R/169N/211W/217L、134R/176S/211W/214M、134R/176S/211W/215M、134R/211W/214M、169N/171V/173I/213V/235K、169N/173I/175H/213V/235K、169N/175G/212C/213V/235K、169N/M175H/E212G/A213V/A235K 169N/176S/178I/211L/214M、169N/176S/178I/211W/214M/217L、169N/176S/178I/211W/217L 169N/176S/178M、169N/176S/178M/211W/214M/217I、169N/176S/211W/214M、169N/176S/211W/214M/215L/234L、169N/176S/211W/217I、169N/176S/211W/217L、169N/176S/214M/215M/217I、169N/176S/211L/214M/217I、169N/178I/217I、169N/178M/234L、169N/211W/214M/215L、169N/211W/217I、169N/212C/235K、169N/212C/213V/235K、169N/212G/213V、169N/212V/213V/235K、169N/235K、171V/173I/212G/213V/235K、173I/175H/213V、175H/213P/235K、175H/235K、176S/178I/211W/215L/217L、176S/178I/211W/217I、176S/211L/214M、176S/214M/217L、178M/211L/214M、178M/211W/217L、178I/215M、211W/234L、212G/213V/235K、212V/213V/235K、213T/235Kおよび213V/235Kから選択される、配列番号270と比較して1つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成すること;ならびに(b)前記ポリヌクレオチドによってコードされるイミンレダクターゼポリペプチドを発現させることを含む。
T123G/I124G/A169N/Y171V/A173H/A213V/A235K、T123G/I124G/A169N/E212V/A213V/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173H/A213V/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173I/E212C/A213V/A235K、T123G/A169N/A173H/M175H/A213V/A235K、T123G/A169N/A173I/E212G/A213T、T123G/A169N/M175G、T123G/A169N/M175G/E212C/A235K、T123G/A169N/E212G/A213V、T123G/A173H/M175H/E212C/A213V/A235K、T123G/E212C/A213V/A235K、T123G/E212G/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173H/M175H/E212X/A213V、T123G/A169N/A173I、¥ T123G/A169N/E212G/A213V/A235K、T123G/A213T、I124G/A169N、I124A/A169N/A173I/M175H/E212G/A213V、I124G/A169N/A173I/E212C/A213V、I124G/A169N/A173I/E212G/A213V、I124G/A169N/A173I/E212V/A213V/A235K、I124G/A169N/M175G/E212C/A213V/A235K、I124G/A169N/E212G/A213V/A235K、I124G/A169N/E212V/A213V/A235K、I124G/M175G/E212V/A213V/A235K、I124G/A169N/A213V/A235K、I124G/E212C/A213V/A235K、I124G/E212G/A213V/A235K、T134R/A169N/L176S/V178I/I211L/V214M、T134R/A169N/L176S/V178I/I211W、T134R/A169N/L176S/V178M/I211L/W217L、T134R/A169N/L176S/I211L/T215M/W217I/D234L、T134R/A169N/L176S/I211W、T134R/A169N/V178M/I211W/V214M/W217I、T134R/A169N/I211W/V214M/W217L、T134R/A169N/I211W/W217L、T134R/L176S/I211W/V214M、134R/L176S/I211W/T215M、T134R/I211W/V214M、A169N/Y171V/A173I/A213V/A235K、A169N/A173I/M175H/A213V/A235K、A169N/M175G/E212C/A213V/A235K、A169N/M175H/E212G/A213V/A235K、A169N/L176S/V178I/I211L/V214M、A169N/L176S/V178I/I211W/V214M/W217L、A169N/L176S/V178I/I211W/W217L、A169N/L176S/V178M、A169N/L176S/V178M/I211W/V214M/W217I、A169N/L176S/I211W/V214M、A169N/L176S/I211W/V214M/T215L/D234L、A169N/L176S/I211W/W217I、A169N/L176S/I211W/W217L、A169N/L176S/V214M/T215M/W217I、A169N/L176S/I211L/V214M/W217I、A169N/V178I/W217I、A169N/V178M/D234L、A169N/I211W/V214M/T215L、A169N/I211W/W217I、A169N/E212C/A235K、A169N/E212C/A213V/A235K、A169N/E212G/A213V、A169N/E212V/A213V/A235K、A169N/A235K、Y171V/A173I/E212G/A213V/A235K、A173I/M175H/A213V、M175H/A213P/A235K、M175H/A235K、L176S/V178I/I211W/T215L/W217L、L176S/V178I/I211W/W217I、L176S/I211L/V214M、L176S/V214M/W217L、V178M/I211L/V214M、V178M/I211W/W217L、V178I/T215M、I211W/D234L、E212G/A213V/A235K、E212V/A213V/A235K、A213T/A235KおよびA213V/A235Kから選択される、配列番号270と比較して1つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のイミンレダクターゼは、適切な基質をその生成物に変換するためのプロセスにおいて用途を見出す。
以下の実施例(達成された実験および結果が含まれる)を、例示のみを目的として提供し、本実施例は、本発明を制限すると解釈されない。
イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドの生成
遺伝子合成および最適化
大腸菌における発現のために、Pseudonocardia spinosispora由来の野生型イミンレダクターゼをコードするポリヌクレオチド配列(配列番号1)を、コドン最適化し、そして合成した(配列番号2)。配列番号2の合成遺伝子をpCK110900ベクター系(例えば、米国特許出願公開第2006/0195947号(これは、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)を参照のこと)にクローニングし、続いて、lacプロモーターの制御下で大腸菌W3110fhuAにおいて発現させた。
96ウェルフォーマットにおいて、単一コロニーを選択し、1%グルコースおよび30μg/mL CAMを含有する180μLのLB中、30℃、200rpm、湿度85%で成長させた。一晩成長させた後、20μLの成長培養物を、30μg/mLクロラムフェニコール(CAM)を含む380μLのTBを含有するディープウェルプレートに移した。各バリアントを2連で成長させて、活性決定のために十分な標的酵素を生成した。培養物を30℃、250rpm、湿度85%で成長させた。培養物の光学密度(OD600)が0.6~0.8に達したら、1mMの最終濃度までIPTGを添加することによって、イミンレダクターゼ遺伝子の発現を誘導した。誘導後、成長を18~20時間継続した。成長後、2連の培養物をプールし、4℃、4000rpmで10分間遠心分離することによって細胞を回収し、培地を破棄した。使用の準備ができるまで、細胞ペレットを-80℃で保存した。反応を行う前に、細胞ペレットを、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含む100mM HEPES、pH8を含有する250μLの溶解緩衝液に再懸濁した。マイクロタイタープレートシェーカー上、室温で2時間にわたり中速度で振盪して、プレートを撹拌した。次いで、プレートを4℃、4000rpmで20分間遠心分離し、下記HTPアッセイ反応において清澄化上清を使用した。
振盪フラスコ手順を使用して、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの振盪フラスコ粉末(SFP)(これは、二次スクリーニングアッセイおよび/または本明細書中に記載の生体触媒プロセスにおける使用に有用である)を生成し得る。酵素の振盪フラスコ粉末(SFP)調製は、HTPアッセイにおいて使用される細胞溶解物と比較して、操作された酵素のより精製された調製物(例えば、総タンパク質の最大30%)を提供し、より濃縮された酵素溶液の使用も可能にする。培養を開始するために、目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有する大腸菌の単一コロニーを、30μg/mL CAMおよび1%グルコースを含む50mLのLBに接種した。30℃のインキュベーター中で、250rpmで振盪しながら、培養物を一晩(少なくとも16時間)成長させた。一晩成長させた後、培養物のOD600を測定した。1L振盪フラスコ中で、成長培養物を、30μg/mL CAMを含む250mLのTBに希釈して、0.2の最終OD600とした。OD600が0.6~0.8に達するまで、250mLの培養物を30℃、250rpmで成長させた。1mMの最終濃度までIPTGを添加することによって、イミンレダクターゼ遺伝子の発現を誘導し、成長をさらに18~20時間継続した。培養物を、予め秤量された遠心分離ボトルに移すことによって、細胞を回収し、次いで、4℃、4000rpmで20分間遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、30mLの冷50mMリン酸カリウム、pH8緩衝液で洗浄し、4℃、4000rpmで20分間再遠心分離した。上清を破棄し、残りの細胞ペレットを秤量した。溶解前に、細胞を-80℃で少なくとも2時間凍結維持した。いくつかの実施形態では、使用の準備ができるまで、細胞を-80℃で保存する。溶解のために、細胞ペレット1g当たり6mLの冷50mMリン酸カリウム、pH8.0に細胞ペレットを再懸濁した。MICROFLUIDIZER(登録商標)-M110L高圧ホモジナイザー(Microfluidics)を使用して、再懸濁した細胞を溶解した。4℃、10,000rpmで60分間遠心分離することによって、細胞残屑を除去した。清澄化溶解物を収集し、-80℃で凍結し、次いで、当該分野で公知の標準的な方法を使用して凍結乾燥した。凍結清澄化溶解物の凍結乾燥は、粗製の操作されたポリペプチドを含む乾燥振盪フラスコ粉末を提供する。
化合物[2]の調製における改良された安定性およびイミンレダクターゼ活性のための、配列番号2由来の操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
配列番号2のイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドを使用して、表2-2のさらなる操作されたポリペプチドバリアントを生成した。当該分野で公知の十分に確立された技術(例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを生成した。実施例1に記載されているように、HTPにおいて、遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成し、可溶性溶解物を生成した。化合物[2]生成に対する活性について、各バリアントを試験した。
化合物[2]の分割のためのLC-MS分析。
化合物[2]の生成における改良された発現およびイミンレダクターゼ活性のための、配列番号2由来の操作されたポリヌクレオチドの進化およびスクリーニング
配列番号2のイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドを使用して、表3-1のさらなる操作されたポリヌクレオチドを生成した。当該分野で公知の十分に確立された技術(例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを生成した。実施例1に記載されているように、HTPにおいて、遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成し、可溶性溶解物を生成した。化合物[2]生成に対する活性について、各バリアントを試験した。
化合物[2]の生成のための配列番号269に対する改良
実施例2および3に記載されているように、バリアントをスクリーニングした後、配列番号269のポリヌクレオチド配列を親酵素として選択した。当該分野で公知の十分に確立された技術(例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを生成した。実施例1に記載されているように、HTPにおいて、各遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成し、可溶性溶解物を生成した。
化合物[2]の生成における、配列番号229によってコードされるポリペプチドに対する改良
実施例3に記載されているように、バリアントをスクリーニングした後、配列番号229のポリヌクレオチド配列を親配列として選択した。当該分野で公知のように十分に確立された技術(例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを生成した。実施例1に記載されているのと同様の方法を使用してHTPにおいて、各遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成した。配列番号229によってコードされるポリペプチドは、以前の親酵素と比較して有意に高い生成物をもたらしたので、各バリアントの400μLの単一培養物のみを成長させた。実施例1に記載されているのと同じ方法を使用して、溶解を行った。
Claims (23)
- 配列番号2の参照配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、57T/211L、87S/175G、103H/212C、122E、123G、124A/178I、124G、132H/R、134R、169N/S、171W、173H/I、175G/H、176S、178I/242Y、178M、211L/W、212C/G/V、213P/R/T/V、214M、215L/M、217I/L、234Lおよび235Kから選択される1つの置換または置換セットを含み、前記位置が、配列番号2を参照して付番されており、前記操作されたポリペプチドが、配列番号2の参照ポリペプチドのイミンレダクターゼ活性と比べて、少なくとも1.2倍以上の、基質から生成物へと変換するためのイミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリペプチド。
- A57T/I211L、P87S/M175G、R103H/E212C、L122E、T123G、I124A/V178I、I124G、E132H/R、T134R、A169N/S、Y171W、A173H/I、M175G/H、L176S、V178I/A242Y、V178M、I211L/W、E212C/G/V、A213P/R/T/V、V214M、T215L/M、W217I/L、D234LおよびA235Kから選択される1つの置換または置換セットを含み、前記位置が、配列番号2を参照して付番されている、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号4~配列番号74に記載されている任意の偶数番号の配列いずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号270の参照配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって:
123G/124G/169N/171V/173H/213V/235K、123G/124G/169N/212V/213V/235K、123G/169N/171V/173H/213V/235K、123G/169N/171V/173I/212C/213V/235K、123G/169N/173H/175H/213V/235K、123G/169N/173I/212G/213T、123G/169N/175G、123G/169N/175G/212C/235K、123G/169N/212G/213V、123G/173H/175H/212C/213V/235K、123G/212C/213V/235K、123G/212G/235K、123G/169N/171V/173H/175H/212X/213V、123G/169N/173I、123G/169N/212G/213V/235K、123G/213T、124G/169N、124A/169N/173I/175H/212G/213V、124G/169N/173I/212C/213V、124G/169N/173I/212G/213V、124G/169N/173I/212V/213V/235K、124G/169N/175G/212C/213V/235K、124G/169N/212G/213V/235K、124G/169N/212V/213V/235K、124G/175G/212V/213V/235K、124G/169N/213V/235K、124G/212C/213V/235K、124G/212G/213V/235K、134R/169N/176S/178I/211L/214M、134R/169N/176S/178I/211W、134R/169N/176S/178M/211L/217L、134R/169N/176S/211L/215M/217I/234L、134R/169N/176S/211W、134R/169N/178M/211W/214M/217I、134R/169N/211W/214M/217L、134R/169N/211W/217L、134R/176S/211W/214M、134R/176S/211W/215M、134R/211W/214M、169N/171V/173I/213V/235K、169N/173I/175H/213V/235K、169N/175G/212C/213V/235K、169N/M175H/E212G/A213V/A235K、169N/176S/178I/211L/214M、169N/176S/178I/211W/214M/217L、169N/176S/178I/211W/217L、169N/176S/178M、169N/176S/178M/211W/214M/217I、169N/176S/211W/214M、169N/176S/211W/214M/215L/234L、169N/176S/211W/217I、169N/176S/211W/217L、169N/176S/214M/215M/217I、169N/176S/211L/214M/217I、169N/178I/217I、169N/178M/234L、169N/211W/214M/215L、169N/211W/217I、169N/212C/235K、169N/212C/213V/235K、169N/212G/213V、169N/212V/213V/235K、169N/235K、171V/173I/212G/213V/235K、173I/175H/213V、175H/213P/235K、175H/235K、176S/178I/211W/215L/217L、176S/178I/211W/217I、176S/211L/214M、176S/214M/217L、178M/211L/214M、178M/211W/217L、178I/215M、211W/234L、212G/213V/235K、212V/213V/235K、213T/235Kおよび213V/235Kから選択される1つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号270を参照して付番されており、前記操作されたポリペプチドが、配列番号270の参照ポリペプチドのイミンレダクターゼ活性と比べて、少なくとも1.2倍以上の、基質から生成物へと変換するためのイミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリペプチド。 - T123G/I124G/A169N/Y171V/A173H/A213V/A235K、T123G/I124G/A169N/E212V/A213V/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173H/A213V/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173I/E212C/A213V/A235K、T123G/A169N/A173H/M175H/A213V/A235K、T123G/A169N/A173I/E212G/A213T、T123G/A169N/M175G、T123G/A169N/M175G/E212C/A235K、T123G/A169N/E212G/A213V、T123G/A173H/M175H/E212C/A213V/A235K、T123G/E212C/A213V/A235K、T123G/E212G/A235K、T123G/A169N/Y171V/A173H/M175H/E212X/A213V、T123G/A169N/A173I、T123G/A169N/E212G/A213V/A235K、T123G/A213T、I124G/A169N、I124A/A169N/A173I/M175H/E212G/A213V、I124G/A169N/A173I/E212C/A213V、I124G/A169N/A173I/E212G/A213V、I124G/A169N/A173I/E212V/A213V/A235K、I124G/A169N/M175G/E212C/A213V/A235K、I124G/A169N/E212G/A213V/A235K、I124G/A169N/E212V/A213V/A235K、I124G/M175G/E212V/A213V/A235K、I124G/A169N/A213V/A235K、I124G/E212C/A213V/A235K、I124G/E212G/A213V/A235K、T134R/A169N/L176S/V178I/I211L/V214M、T134R/A169N/L176S/V178I/I211W、T134R/A169N/L176S/V178M/I211L/W217L、T134R/A169N/L176S/I211L/T215M/W217I/D234L、T134R/A169N/L176S/I211W、T134R/A169N/V178M/I211W/V214M/W217I、T134R/A169N/I211W/V214M/W217L、T134R/A169N/I211W/W217L、T134R/L176S/I211W/V214M、134R/L176S/I211W/T215M、T134R/I211W/V214M、A169N/Y171V/A173I/A213V/A235K、A169N/A173I/M175H/A213V/A235K、A169N/M175G/E212C/A213V/A235K、A169N/M175H/E212G/A213V/A235K、A169N/L176S/V178I/I211L/V214M、A169N/L176S/V178I/I211W/V214M/W217L、A169N/L176S/V178I/I211W/W217L、A169N/L176S/V178M、A169N/L176S/V178M/I211W/V214M/W217I、A169N/L176S/I211W/V214M、A169N/L176S/I211W/V214M/T215L/D234L、A169N/L176S/I211W/W217I、A169N/L176S/I211W/W217L、A169N/L176S/V214M/T215M/W217I、A169N/L176S/I211L/V214M/W217I、A169N/V178I/W217I、A169N/V178M/D234L、A169N/I211W/V214M/T215L、A169N/I211W/W217I、A169N/E212C/A235K、A169N/E212C/A213V/A235K、A169N/E212G/A213V、A169N/E212V/A213V/A235K、A169N/A235K、Y171V/A173I/E212G/A213V/A235K、A173I/M175H/A213V、M175H/A213P/A235K、M175H/A235K、L176S/V178I/I211W/T215L/W217L、L176S/V178I/I211W/W217I、L176S/I211L/V214M、L176S/V214M/W217L、V178M/I211L/V214M、V178M/I211W/W217L、V178I/T215M、I211W/D234L、E212G/A213V/A235K、E212V/A213V/A235K、A213T/A235KおよびA213V/A235Kから選択される1つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号270を参照して付番されている、請求項4に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号76~配列番号232に記載されている任意の偶数番号の配列いずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号230の参照配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、45I、127R、130R、134L/R、174M、206L、209K/S、212H/K/R、216N/R/S、223N、227Vおよび279Vから選択される1つの置換を含み、前記位置が、配列番号230を参照して付番されており、前記操作されたポリペプチドが、配列番号230の参照ポリペプチドのイミンレダクターゼ活性と比べて、少なくとも1.2倍以上の、基質から生成物へと変換するためのイミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリペプチド。
- V45I、G127R、T130R、T134L/R、A174M、M206L、Q209K/S、E212H/K/R、G216N/R/S、D223N、A227VおよびD279Vから選択される1つの置換を含み、前記位置が、配列番号230を参照して付番されている、請求項7に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号234~配列番号268に記載されている任意の偶数番号の配列いずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の操作されたポリペプチド。
- 請求項1~9のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたポリペプチドをコードする、操作されたポリヌクレオチド。
- 配列番号3~配列番号267に記載されている奇数番号の配列いずれか1つからなる、操作されたポリヌクレオチド。
- 操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、前記操作されたポリヌクレオチドが、配列番号1の参照配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ、位置12A/15T/18G/21C/27A、169A/631C/633T、259T/523G/524G/525T、308A/634T/635G/636T、364G/365A/366A、367G/368G/369T、370G/371G、370G/371C/372A/532A、394C/396T、394A/395G/396G、401G/402G、505A/506A/507T、505A/506G/507T、512G/513G、517A/518T/519T、517C/518A/519T、523C/524A/525T、523G/524G/525T、526A/527G/528T、532A/534G、532A/724T/725A、631C/633T、631T/632G/633G、634T/635G/636T、635G/636T、635T/636T、637A/638G、637A/639A、637C/639A、638T/639T、640A、643T/644T/645G、644T/645G、649A/650T/651T、649C/650T/651T、700T/701T/702Gおよび703A/704A/705Aから選択される1つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号1を参照して付番されており、コードされる前記操作されたポリペプチドが、配列番号1のポリヌクレオチド配列によってコードされる参照ポリペプチドのイミンレダクターゼ活性と比べて、少なくとも1.2倍以上の、基質から生成物へと変換するためのイミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリヌクレオチド。
- 以下のC12A/C15T/A18G/T21C/T27A、G169A/A631C/C633T、C259T/A523G/T524G/G525T、G308A/G634T/A635G/A636T、C364G/T365A/G366A、A367G/C368G/C369T、A370G/T371G、A370G/T371C/T372A/G532A、G394C/A396T、G394A/A395G/A396G、C401G/C402G、G505A/C506A/A507T、G505A/C506G/A507T、A512G/T513G、G517A/C518T/A519T、G517C/C518A/A519T、A523C/T524A/G525T、A523G/T524G/G525T、C526A/T527G/G528T、G532A/C534G、G532A/G724T/C725A、A631C/C633T、A631T/T632G/C633G、G634T/A635G/A636T、A635G/A636T、A635T/A636T、G637A/C638G、G637A/G639A、G637C/G639A、C638T/G639T、G640A、A643T/C644T/C645G、C644T/C645G、T649A/G650T/G651T、T649C/G650T/G651T、G700T/A701T/C702GおよびG703A/C704A/C705Aから選択される1つの置換または置換セットを含み、前記位置が、配列番号1を参照して付番されている、請求項12に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
- 操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、前記操作されたポリヌクレオチドが、配列番号269の参照配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ、367G/368G/369T/505A/506A/507T/513C/519C/523G/524G/525C/634T/635G/636C/639T/703A/704A/705G、369G/370G/371G/372C/505A/506A/507T/513C/519C/638T/703A/704A/705G、369G/370G/371G/372C/507C/513C/519C/523G/524G/525C/635T/638T/703A/704A/705G、369G/505A/506A/507T/511G/512T/517A/518T/519T/638T/703A/704A/705G、369G/505A/506A/507T/513C/517A/518T/519T/523C/524A/525C/638T/703A/704A/705G、369G/505A/506A/507T/513C/519C/523G/524G/525C/634T/635G/636C/638T/703A/704A/705G、369G/505A/506A/507T/513C/519C/635T/638T/703A/704A/705G、401G/402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534G/631C/633A/645T/649C/650T/651A/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631C/633A/640A/645T/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/645T/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/527C/534G/631C/633A/644T/645G/649A/650T/651A/700C/701T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/527C/534T/631T/632G/633G/645T/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/532A/534G/631T/632G/633G/640A/645T/649A/650T/651A/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/534G/631T/632G/633G/640A/645T/649C/650T/651A/702T、401G/402G/505A/506A/507C/526T/534T/631T/632G/633G/645T/649C/650T/651A/702T、401G/402G/507C/526T/527C/534G/631T/632G/633G/640A/645T/702T、401G/402G/507C/526T/527C/534G/631T/632G/633G/644T/645G/702T、401G/402G/526T/534G/631T/632G/633G/640A/645T/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/640A/645T/649C/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534G/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631C/633A/640A/645T/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/640A/645T/649C/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534G/631C/633A/640A/645T/649A/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534G/631T/632G/633G/640A/643T/644T/645G/700C/701T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534G/631T/632G/633G/640A/645T/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534G/631T/632G/633G/645T/649C/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534T/631T/632G/633G/645T/649A/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/527C/534T/633A/640A/644T/645G/649A/650T/651A/702T、402G/505A/506A/507C/526T/532A/534G/633A/645T/700C/701T、402G/505A/506A/507C/526T/532A/534T/645T/649A/650T/651A、402G/505A/506A/507C/526T/534G/631T/632G/633G/645T/649A/650T/651A/702T、402G/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/643T/644T/645G/649C/650T/651A/702T、402G/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/645T/649A/650T/651A/702T、402G/507C/526T/532A/534G/631C/633A/640A/645T、402G/507C/526T/532A/534G/631T/632G/633G/645T/649C/650T/651A/702T、402G/526T/527C/534T/631C/633A/640A/645T/702T、505A/506A/507C/526T/527C/532A/534G/631T/632G/633G/640A/645T/649A/650T/651A/702T、505A/506A/507C/526T/527C/532A/534T/631T/632G/633G/645T/649C/650T/651A/702T、505A/506A/507C/526T/534G/631T/632G/633G/640A/643T/644T/645G、507C/526T/527C/534G/633A/640A/645T/649C/650T/651A/702T、507C/526T/527C/534G/633A/640A/645T/649C/650T/651A/702T、507C/526T/532A/534T/644T/645G/702T、および631T/632G/633G/645T/700C/701Tから選択される1つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号269を参照して付番されており、コードされる前記操作されたポリペプチドが、配列番号269のポリヌクレオチド配列によってコードされる参照ポリペプチドのイミンレダクターゼ活性と比べて、少なくとも1.2倍以上の、基質から生成物へと変換するためのイミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリヌクレオチド。
- A367G/C368G/C369T/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/A523G/T524G/G525C/G634T/A635G/A636C/G639T/G703A/C704A/C705G、C369G/A370G/T371G/T372C/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/A370G/T371G/T372C/A507C/T513C/519C/A523G/T524G/G525C/A635T/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T511G/A512T/G517A/C518T/A519T/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T513C/G517A/C518T/A519T/A523C/T524A/G525C/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/A523G/T524G/G525C/G634T/A635G/A636C/C638T/G703A/C704A/C705G、C369G/G505A/C506A/A507T/T513C/A519C/A635T/C638T/G703A/C704A/C705G、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534G/A631C/C633A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631C/C633A/G640A/C645T/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631C/C633A/C644T/C645G/T649A/G650T/G651A/G700C/A701T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/G532A/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C401G/C402G/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/C702T、C401G/C402G/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/C644T/C645G/C702T、C401G/C402G/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534G/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631C/C633A/G640A/C645T/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631C/C633A/G640A/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/A643T/C644T/C645G/G700C/A701T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534G/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/C534T/C633A/G640A/C644T/C645G/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/G532A/C534G/C633A/C645T/G700C/A701T、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/G532A/C534T/C645T/T649A/G650T/G651A、C402G/G505A/C506A/A507C/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/A643T/C644T/C645G/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、C402G/A507C/C526T/G532A/C534G/A631C/C633A/G640A/C645T、C402G/A507C/C526T/G532A/C534G/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、C402G/C526T/T527C/C534T/A631C/C633A/G640A/C645T/C702T、G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/C645T/T649A/G650T/G651A/C702T、G505A/C506A/A507C/C526T/T527C/G532A/C534T/A631T/T632G/C633G/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、G505A/C506A/A507C/C526T/C534G/A631T/T632G/C633G/G640A/A643T/C644T/C645G、A507C/C526T/T527C/C534G/C633A/G640A/C645T/T649C/G650T/G651A/C702T、A507C/C526T/G532A/C534T/C644T/C645G/C702T、およびA631T/T632G/C633G/C645T/G700C/A701Tから選択される1つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号269を参照して付番されている、請求項14に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
- 操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、前記操作されたポリヌクレオチドが、配列番号229の参照配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ、133A、379A/381G、388C/389G/390T、400C/401T/402T、401G/402G、520A/521T/522G、616C/618T、625A、625A/626G/627T、634A、634A/635G/636G、634C/636T、646A、646A/647A、646C、667A、680T/681Tおよび836T/837Tから選択される1つの置換または置換セットを含み、前記位置が、配列番号229を参照して付番されており、コードされる前記操作されたポリペプチドが、配列番号229のポリヌクレオチド配列によってコードされる参照ポリペプチドのイミンレダクターゼ活性と比べて、少なくとも1.2倍以上の、基質から生成物へと変換するためのイミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリヌクレオチド。
- 以下のG133A、G379A/C381G、A388C/C389G/C390T、A400C/C401T/C402T、C401G/C402G、G520A/C521T/A522G、A616C/G618T、C625A、C625A/A626G/A627T、G634A、G634A/A635G/A636G、G634C/A636T、G646A、G646A/G647A、G646C、G667A、C680T/C681T、およびA836T/C837Tから選択される置換/置換セットの1つを含み、前記位置が、配列番号229を参照して付番されている、請求項16に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
- 請求項10~17のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 少なくとも1つの調節配列をさらに含む、請求項18に記載のベクター。
- 請求項18および/または19に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1~9のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたポリペプチドを生成する、請求項20に記載の宿主細胞。
- 操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドを生成する方法であって、前記操作されたポリヌクレオチドが発現され、前記操作されたポリペプチドが生成されるような条件下で、請求項20または21に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
- 前記操作されたポリペプチドを回収する工程をさらに含む、請求項22に記載の方法。
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