JP2019526252A - 操作されたイミンレダクターゼ、ならびにケトン化合物およびアミン化合物の還元的アミノ化のための方法 - Google Patents

操作されたイミンレダクターゼ、ならびにケトン化合物およびアミン化合物の還元的アミノ化のための方法 Download PDF

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Abstract

本出願は、イミンまたはオキシムレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチド、上記操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、上記操作されたポリペプチドを発現することができる宿主細胞、ならびに広範なケトンアミン基質化合物と共にこれらの操作されたポリペプチドを使用して、第２級および第３級アミン生成物化合物を調製する方法を提供する。一局面では、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドが提供され、５７／２１１、８７／１７５、１０３／２１２、１２２、１２３、１２４／１７８、１２４、１３２、１３４、１６９、１７１、１７３、１７５、１７６、１７８／２４２、１７８、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１７などから選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換を含み、上記位置が、配列番号２を参照して付番されている。

Description

本出願は、２０１６年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／３８０，１６５号の優先権を主張し、その全体がすべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、第２級アミンの生成に有用なイミンおよび／またはオキシムレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチド、ならびにこれらの操作されたポリペプチドを利用する組成物および方法を提供する。
配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
配列表の正式な写しは、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットテキストファイル（ファイル名「ＣＸ２−１５１ＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１６年８月２６日およびサイズ５１１キロバイト）として本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる。
キラル第２級アミンは、製薬産業における重要な構成要素である。しかしながら、このクラスのキラルアミン化合物を生成することが公知の生体触媒経路は、ごくわずかである。既存の化学的方法は、キラルホウ素試薬、遷移金属に基づく還元的方法、またはイミンの全体的還元のために多段階合成を必要とする保護基戦略を使用する。
安定な環状アミンの生体触媒合成に関するいくつかの報告が文献にある。イミンレダクターゼまたは「ＩＲＥＤ」は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＦ３５８７およびＧＦ３５４６から精製および特徴付けられ、２−メチル−１−ピロリンを立体選択的に還元することが示された（Ｍｉｔｓｕｋｕｒａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７５：１７７８−１７８２［２０１１）］；Ｈｕｂｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｃａｔ．Ｃｈｅｍ．，６：２２４８−２２５２［２０１４］を参照のこと）。アルキル基による非環式アミンおよびアミノ酸への還元もまた、ネイティブなイミンレダクターゼを使用して示されている（Ｇａｎｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍ．，１１０：１２６−１３２［２０１４］）。工業規模でアミンを生成するための出発酵素としてのＩＲＥＤの使用は、最高の活性を有する適切なバリアントの同定に依存する。
既存の抗生物質に対して耐性の細菌株の蔓延は、新たな抗菌剤の開発の必要性を強調している。複数の作用機序を標的とするように製剤化された抗生物質カクテルがますます普及している。細菌は、β−ラクタマーゼで化合物を加水分解することによって、β−ラクタム抗生物質の中和において非常に効率的になった。レレバクタム（ｒｅｌｅｂａｃｔａｍ）は、抗生物質がその標的に作用することを可能にする酵素を無効化するβ−ラクタマーゼインヒビターである。レレバクタムの化学合成は多段階プロセスであり、その１つは、ベンジルオキシアミンの立体選択的付加を必要とする。この化学工程は低収率であるので、酵素の使用が魅力的な代替手段になる。
Ｍｉｔｓｕｋｕｒａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１１）７５：１７７８〜１７８２ ；Ｈｕｂｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｃａｔ．Ｃｈｅｍ．（２０１４）６：２２４８〜２２５２ Ｇａｎｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍ．，１１０：１２６−１３２［２０１４］
本発明は、新規生体触媒、およびイミン基質の直接的還元によるキラル第２級アミンの合成に使用するための関連方法を提供する。本開示の生体触媒は、配列番号２のアミノ酸配列を有するイミンレダクターゼまたは「ＩＲＥＤ」をコードする、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｉｎｏｓｉｓｐｏｒａ由来の野生型遺伝子の操作されたポリペプチドバリアントである。これらの操作されたポリペプチドは、第２級アミンへのイミンの変換を触媒することができる。
本発明は、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、５７／２１１、８７／１７５、１０３／２１２、１２２、１２３、１２４／１７８、１２４、１３２、１３４、１６９、１７１、１７３、１７５、１７６、１７８／２４２、１７８、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１７、２３４および２３５から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換を含み、前記位置が、配列番号２を参照して付番されている、操作されたポリペプチドを提供する。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、５７Ｔ／２１１Ｌ、８７Ｓ／１７５Ｇ、１０３Ｈ／２１２Ｃ、１２２Ｅ、１２３Ｇ、１２４Ａ／１７８Ｉ、１２４Ｇ、１３２Ｈ／Ｒ、１３４Ｒ、１６９Ｎ／Ｓ、１７１Ｗ、１７３Ｈ／Ｉ、１７５Ｇ／Ｈ、１７６Ｓ、１７８Ｉ／２４２Ｙ、１７８Ｍ、２１１Ｌ／Ｗ、２１２Ｃ／Ｇ／Ｖ、２１３Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｖ、２１４Ｍ、２１５Ｌ／Ｍ、２１７Ｉ／Ｌ、２３４Ｌおよび２３５Ｋから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号２を参照して付番されている。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ａ５７Ｔ／Ｉ２１１Ｌ、Ｐ８７Ｓ／Ｍ１７５Ｇ、Ｒ１０３Ｈ／Ｅ２１２Ｃ、Ｌ１２２Ｅ、Ｔ１２３Ｇ、Ｉ１２４Ａ／Ｖ１７８Ｉ、Ｉ１２４Ｇ、Ｅ１３２Ｈ／Ｒ、Ｔ１３４Ｒ、Ａ１６９Ｎ／Ｓ、Ｙ１７１Ｗ、Ａ１７３Ｈ／Ｉ、Ｍ１７５Ｇ／Ｈ、Ｌ１７６Ｓ、Ｖ１７８Ｉ／Ａ２４２Ｙ、Ｖ１７８Ｍ、Ｉ２１１Ｌ／Ｗ、Ｅ２１２Ｃ／Ｇ／Ｖ、Ａ２１３Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｖ、Ｖ２１４Ｍ、Ｔ２１５Ｌ／Ｍ、Ｗ２１７Ｉ／Ｌ、Ｄ２３４ＬおよびＡ２３５Ｋから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号２を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号４〜配列番号７４に記載されている任意の偶数番号の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、配列番号２７０の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、置換セット：
１２３／１２４／１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１２３／１２４／１６９／２１２／２１３／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／２１２／２１３／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１２３／１６９／１７３／１７５／２１３／２３５、１２３／１６９／１７３／２１２／２１３、１２３／１６９／１７５、１２３／１６９／１７５／２１２／２３５、１２３／１６９／２１２／２１３、１２３／１７３／１７５／２１２／２１３／２３５、１２３／２１２／２１３／２３５、１２３／２１２／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／１７５／２１２／２１３、１２３／１６９／１７３、１２３／１６９／２１２／２１３／２３５、１２３／２１３、１２４／１６９、１２４／１６９／１７３／１７５／２１２／２１３、１２４／１６９／１７３／２１２／２１３、１２４／１６９／１７３／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／１７５／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／２１３／２３５、１２４／１７５／２１２／２１３／２３５、１２４／２１２／２１３／２３５、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１／２１４、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１／２１７、１３４／１６９／１７６／２１１／２１５／２１７／２３４、１３４／１６９／１７６／２１１、１３４／１６９／１７８／２１１／２１４／２１７、１３４／１６９／２１１／２１４／２１７、１３４／１６９／２１１／２１７、１３４／１７６／２１１／２１４、１３４／１７６／２１１／２１５、１３４／２１１／２１４、１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１６９／１７３／１７５／２１３／２３５、１６９／１７５／２１２／２１３／２３５、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／１７８／２１１／２１７、１６９／１７６／１７８、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／２１１／２１４、１６９／１７６／２１１／２１４／２１５／２３４、１６９／１７６／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／２１１／２１７、１６９／１７６／２１４／２１５／２１７、１６９／１７８／２１７、１６９／１７８／２３４、１６９／２１１／２１４／２１５、１６９／２１１／２１７、１６９／２１２／２１３、１６９／２１２／２３５、１６９／２１２／２１３／２３５、１６９／２３５、１７１／１７３／２１２／２１３／２３５、１７３／１７５／２１３、１７５／２１３／２３５、１７５／２３５、１７６／１７８／２１１／２１５／２１７、１７６／１７８／２１１／２１７、１７６／２１１／２１４、１７６／２１４／２１７、１７８／２１１／２１４、１７８／２１１／２１７、１７８／２１５、２１１／２３４、２１２／２１３／２３５および２１３／２３５から選択される少なくとも２つの置換を含み、前記位置が、配列番号２７０を参照して付番されている、操作されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、１２３Ｇ／１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｔ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２３Ｇ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１２Ｇ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１２Ｘ／２１３Ｖ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１３Ｔ、１２４Ｇ／１６９Ｎ、１２４Ａ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｃ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１７５Ｇ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ／２１１Ｌ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１５Ｍ／２１７Ｉ／２３４Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１３４Ｒ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１５Ｍ、１３４Ｒ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１５Ｌ／２３４Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１４Ｍ／２１５Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７８Ｉ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７８Ｍ／２３４Ｌ、１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１５Ｌ、１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／２１２Ｃ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２３５Ｋ、１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１３Ｖ、１７５Ｈ／２１３Ｐ／２３５Ｋ、１７５Ｈ／２３５Ｋ、１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１５Ｌ／２１７Ｌ、１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１７６Ｓ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１７８Ｍ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１７８Ｉ／２１５Ｍ、２１１Ｗ／２３４Ｌ、２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、２１３Ｔ／２３５Ｋ、および２１３Ｖ／２３５Ｋから選択される少なくとも１つの置換セットを含み、前記位置は、配列番号２７０を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｔ１２３Ｇ／Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｔ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｘ／Ａ２１３Ｖ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ２１３Ｔ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ、Ｉ１２４Ａ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｌ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｔ２１５Ｍ／Ｗ２１７Ｉ／Ｄ２３４Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、１３４Ｒ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｔ２１５Ｍ、Ｔ１３４Ｒ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、
Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｌ／Ｄ２３４Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｉ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｍ／Ｄ２３４Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ａ２３５Ｋ、Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ、Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｐ／Ａ２３５Ｋ、Ｍ１７５Ｈ／Ａ２３５Ｋ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｔ２１５Ｌ／Ｗ２１７Ｌ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ｖ１７８Ｉ／Ｔ２１５Ｍ、Ｉ２１１Ｗ／Ｄ２３４Ｌ、Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ２１３Ｔ／Ａ２３５Ｋ、およびＡ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋから選択される少なくとも１つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号２７０を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号７６〜配列番号２３２に記載されている任意の偶数番号の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明はさらに、配列番号２２９の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、４５、１２７、１３０、１３４、１７４、２０６、２０９、２１２、２１６、２２３、２２７および２７９から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換を含み、前記位置が、配列番号２２９を参照して付番されている、操作されたポリペプチドを提供する。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、４５Ｉ、１２７Ｒ、１３０Ｒ、１３４Ｌ／Ｒ、１７４Ｍ、２０６Ｌ、２０９Ｋ／Ｓ、２１２Ｈ／Ｋ／Ｒ、２１６Ｎ／Ｒ／Ｓ、２２３Ｎ、２２７Ｖおよび２７９Ｖから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号２２９を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｖ４５Ｉ、Ｇ１２７Ｒ、Ｔ１３０Ｒ、Ｔ１３４Ｌ／Ｒ、Ａ１７４Ｍ、Ｍ２０６Ｌ、Ｑ２０９Ｋ／Ｓ、Ｅ２１２Ｈ／Ｋ／Ｒ、Ｇ２１６Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｄ２２３Ｎ、Ａ２２７ＶおよびＤ２７９Ｖから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号２２９を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号２３４〜配列番号２７０に記載されている任意の偶数番号の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、上記段落に記載されている少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号３〜配列番号２６７に記載されている任意の奇数番号の配列を含む。
本発明はさらに、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置１２／１５／１８／２１／２７、１６９／６３１／６３３、２５９／５２３／５２４／５２５、３０８／６３４／６３５／６３６、３６４／３６５／３６６、３６７／３６８／３６９、３７０／３７１、３７０／３７１／３７２／５３２、３９４／３９６、３９４／３９５／３９６、４０１／４０２、５０５／５０６／５０７、５１２／５１３、５１７／５１８／５１９、５２３／５２４／５２５、５２６／５２７／５２８、５３２／５３４、５３２／７２４／７２５、６３１／６３３、６３１／６３２／６３３、６３４／６３５／６３６、６３５／６３６、６３７／６３８、６３７／６３９、６３７／６３９、６３８／６３９、６４０、６４３／６４４／６４５、６４４／６４５、６４９／６５０／６５１、７００／７０１／７０２および７０３／７０４／７０５に置換を含み、前記位置が、配列番号１を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下の１２Ａ／１５Ｔ／１８Ｇ／２１Ｃ／２７Ａ、１６９Ａ／６３１Ｃ／６３３Ｔ、２５９Ｔ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｔ、３０８Ａ／６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｔ、３６４Ｇ／３６５Ａ／３６６Ａ、３６７Ｇ／３６８Ｇ／３６９Ｔ、３７０Ｇ／３７１Ｇ、３７０Ｇ／３７１Ｃ／３７２Ａ／５３２Ａ、３９４Ｃ／３９６Ｔ、３９４Ａ／３９５Ｇ／３９６Ｇ、４０１Ｇ／４０２Ｇ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ、５０５Ａ／５０６Ｇ／５０７Ｔ、５１２Ｇ／５１３Ｇ、５１７Ａ／５１８Ｔ／５１９Ｔ、５１７Ｃ／５１８Ａ／５１９Ｔ、５２３Ｃ／５２４Ａ／５２５Ｔ、５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｔ、５２６Ａ／５２７Ｇ／５２８Ｔ、５３２Ａ／５３４Ｇ、５３２Ａ／７２４Ｔ／７２５Ａ、６３１Ｃ／６３３Ｔ、６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ、６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｔ、６３５Ｇ／６３６Ｔ、６３５Ｔ／６３６Ｔ、６３７Ａ／６３８Ｇ、６３７Ａ／６３９Ａ、６３７Ｃ／６３９Ａ、６３８Ｔ／６３９Ｔ、６４０Ａ、６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ、６４４Ｔ／６４５Ｇ、６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ｔ、６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ｔ、７００Ｔ／７０１Ｔ／７０２Ｇおよび７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ａから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号１を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下のＣ１２Ａ／Ｃ１５Ｔ／Ａ１８Ｇ／Ｔ２１Ｃ／Ｔ２７Ａ、Ｇ１６９Ａ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ｔ、Ｃ２５９Ｔ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｔ、Ｇ３０８Ａ／Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｔ、Ｃ３６４Ｇ／Ｔ３６５Ａ／Ｇ３６６Ａ、Ａ３６７Ｇ／Ｃ３６８Ｇ／Ｃ３６９Ｔ、Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｇ、Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｃ／Ｔ３７２Ａ／Ｇ５３２Ａ、Ｇ３９４Ｃ／Ａ３９６Ｔ、Ｇ３９４Ａ／Ａ３９５Ｇ／Ａ３９６Ｇ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ｇ／Ａ５０７Ｔ、Ａ５１２Ｇ／Ｔ５１３Ｇ、Ｇ５１７Ａ／Ｃ５１８Ｔ／Ａ５１９Ｔ、Ｇ５１７Ｃ／Ｃ５１８Ａ／Ａ５１９Ｔ、Ａ５２３Ｃ／Ｔ５２４Ａ／Ｇ５２５Ｔ、Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｔ、Ｃ５２６Ａ／Ｔ５２７Ｇ／Ｇ５２８Ｔ、Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ、Ｇ５３２Ａ／Ｇ７２４Ｔ／Ｃ７２５Ａ、Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ｔ、Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ、Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｔ、Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｔ、Ａ６３５Ｔ／Ａ６３６Ｔ、Ｇ６３７Ａ／Ｃ６３８Ｇ、Ｇ６３７Ａ／Ｇ６３９Ａ、Ｇ６３７Ｃ／Ｇ６３９Ａ、Ｃ６３８Ｔ／Ｇ６３９Ｔ、Ｇ６４０Ａ、Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ、Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ、Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ｔ、Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ｔ、Ｇ７００Ｔ／Ａ７０１Ｔ／Ｃ７０２ＧおよびＧ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ａから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号１を参照して付番されている。
本発明はまた、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置３６７／３６８／３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／５２３／５２４／５２５／６３４／６３５／６３６／６３９／７０３／７０４／７０５、３６９／３７０／３７１／３７２／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／３７０／３７１／３７２／５０７／５１３／５１９／５２３／５２４／５２５／６３５／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１１／５１２／５１７／５１８／５１９／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１７／５１８／５１９／５２３／５２４／５２５／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／５２３／５２４／５２５／６３４／６３５／６３６／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／６３５／６３８／７０３／７０４／７０５、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３３／６４４／６４５／６４９／６５０／６５１／７００／７０１、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／７０２、４０１／４０２／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４４／６４５／７０２、４０１／４０２／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４３／６４４／６４５／７００／７０１、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３３／６４０／６４４／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３２／５３４／６３３／６４５／７００／７０１、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３２／５３４／６４５／６４９／６５０／６５１、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４３／６４４／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０７／５２６／５３２／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５、４０２／５０７／５２６／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５２６／５２７／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／７０２、５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４３／６４４／６４５、５０７／５２６／５２７／５３４／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、５０７／５２６／５３２／５３４／６４４／６４５／７０２および６３１／６３２／６３３／６４５／７００／７０１に置換を含み、前記位置が、配列番号２６９を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下の３６７Ｇ／３６８Ｇ／３６９Ｔ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｃ／６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｃ／６３９Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／３７０Ｇ／３７１Ｇ／３７２Ｃ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／３７０Ｇ／３７１Ｇ／３７２Ｃ／５０７Ｃ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｃ／６３５Ｔ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１１Ｇ／５１２Ｔ／５１７Ａ／５１８Ｔ／５１９Ｔ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１７Ａ／５１８Ｔ／５１９Ｔ／５２３Ｃ／５２４Ａ／５２５Ｃ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｃ／６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｃ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／６３５Ｔ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７００Ｃ／７０１Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｇ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／７００Ｃ／７０１Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３３Ａ／６４５Ｔ／７００Ｃ／７０１Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／

６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ、５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／７０２Ｔおよび６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／７００Ｃ／７０１Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号２６９を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下のＡ３６７Ｇ／Ｃ３６８Ｇ／Ｃ３６９Ｔ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｃ／Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｃ／Ｇ６３９Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｇ／Ｔ３７２Ｃ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｇ／Ｔ３７２Ｃ／Ａ５０７Ｃ／Ｔ５１３Ｃ／５１９Ｃ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｃ／Ａ６３５Ｔ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１１Ｇ／Ａ５１２Ｔ／Ｇ５１７Ａ／Ｃ５１８Ｔ／Ａ５１９Ｔ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ｇ５１７Ａ／Ｃ５１８Ｔ／Ａ５１９Ｔ／Ａ５２３Ｃ／Ｔ５２４Ａ／Ｇ５２５Ｃ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｃ／Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｃ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ａ６３５Ｔ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ｃ６３３Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ、Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｃ７０２Ｔ、およびＡ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号２６９を参照して付番されている。
本発明はまた、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置１３３、３７９／３８１、３８８／３８９／３９０、４００／４０１／４０２、４０１／４０２、５２０／５２１／５２２、６１６／６１８、６２５、６２５／６２６／６２７、６３４、６３４／６３５／６３６、６３４／６３６、６４６、６４６／６４７、６４６、６６７、６８０／６８１および８３６／８３７に置換を含み、前記位置が、配列番号２２９を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下の１３３Ａ、３７９Ａ／３８１Ｇ、３８８Ｃ／３８９Ｇ／３９０Ｔ、４００Ｃ／４０１Ｔ／４０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ、５２０Ａ／５２１Ｔ／５２２Ｇ、６１６Ｃ／６１８Ｔ、６２５Ａ、６２５Ａ／６２６Ｇ／６２７Ｔ、６３４Ａ、６３４Ａ／６３５Ｇ／６３６Ｇ、６３４Ｃ／６３６Ｔ、６４６Ａ、６４６Ａ／６４７Ａ、６４６Ｃ、６６７Ａ、６８０Ｔ／６８１Ｔおよび８３６Ｔ／８３７Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号２２９を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリヌクレオチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下のＧ１３３Ａ、Ｇ３７９Ａ／Ｃ３８１Ｇ、Ａ３８８Ｃ／Ｃ３８９Ｇ／Ｃ３９０Ｔ、Ａ４００Ｃ／Ｃ４０１Ｔ／Ｃ４０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ、Ｇ５２０Ａ／Ｃ５２１Ｔ／Ａ５２２Ｇ、Ａ６１６Ｃ／Ｇ６１８Ｔ、Ｃ６２５Ａ、Ｃ６２５Ａ／Ａ６２６Ｇ／Ａ６２７Ｔ、Ｇ６３４Ａ、Ｇ６３４Ａ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｇ、Ｇ６３４Ｃ／Ａ６３６Ｔ、Ｇ６４６Ａ、Ｇ６４６Ａ／Ｇ６４７Ａ、Ｇ６４６Ｃ、Ｇ６６７Ａ、Ｃ６８０Ｔ／Ｃ６８１ＴおよびＡ８３６Ｔ／Ｃ８３７Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号２２９を参照して付番されている。
本発明はさらに、上記の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの調節配列をさらに含む。
本発明はまた、本明細書中で提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書中で提供される少なくとも１つの操作されたポリペプチドを生成する。
本発明はさらに、操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドを生成する方法であって、上記操作されたポリヌクレオチドが発現され、上記操作されたポリペプチドが生成されるような条件下で、本明細書中で提供される宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、操作されたポリペプチドを回収する工程をさらに含む。
別段の定義がない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、一般に、本発明に属する当業者が一般的に理解している意味と同じ意味を有する。一般に、本明細書中で使用した命名法ならびに下記の細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学、および核酸化学の実験手順は、当該分野で周知であり、且つ一般的に使用されている。かかる技術は周知であり、当業者に周知の多数のテキストおよび参考文献に記載されている。標準的な技術またはその修正形態を、化学合成および化学分析のために使用する。前出および下記の本明細書中で言及した全ての特許、特許出願、論文、および刊行物は、本明細書中で参考として明確に援用される。
本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な任意の適切な方法および材料が本発明の実施で使用されるが、いくつかの方法および材料を本明細書中に記載する。記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬は、当業者が使用する状況に応じて変動し得るので、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。したがって、直後に定義した用語は、本発明全体を参照することによってより完全に説明される。
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は例示および説明のみを目的とし、本発明を制限しないと理解すべきである。本明細書中で使用した節の表題は、単に構成上の目的のためだけであり、記載の主題を制限すると解釈されない。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。したがって、本明細書中に開示のあらゆる数値範囲は、より狭い数値範囲が全て本明細書中に明示されているかのように、より広い数値範囲に含まれるあらゆるかかるより狭い数値範囲を含むことが意図される。本明細書中に開示のあらゆる最大（または最小）の数値の限度が、より低い（またはより高い）数値の限度が本明細書中に明示されているかのように、あらゆるかかるより低い（またはより高い）数値の限度を含むことも意図される。
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という表記には１つを超えるポリペプチドが含まれる。同様に、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、相互に交換可能であり、本発明を制限することを意図しない。
種々の実施形態の説明で用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例では、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語を使用して実施形態を代わりに説明することができると理解すべきである。種々の実施形態の説明で用語「任意選択的な（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意選択的に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」を使用する場合、その後に記載する事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、この記載には事象または状況が起こる場合および起こらない例が含まれるとさらに理解すべきである。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は例示および説明のみを目的とし、本開示を制限しないと理解すべきである。本明細書中で使用した節の表題は、単に構成上の目的のためだけであり、記載の主題を制限すると解釈されない。
略語：
遺伝的にコードされたアミノ酸のために使用した略語は慣習的な略語であり、これらを以下に示す。
三文字略語を使用する場合、「Ｌ」または「Ｄ」が明確に前置されないか、略語を使用した文脈から明確で無い限り、アミノ酸は、α−炭素（Ｃα）についてＬ型またはＤ型の立体配置のいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」がα−炭素についての立体配置を特定しないでアラニンを示すのに対して、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニンをそれぞれ示す。
一文字略語を使用する場合、大文字はα−炭素についてＬ−立体配置のアミノ酸を示し、小文字はα−炭素についてＤ−立体配置のアミノ酸を示す。例えば、「Ａ」はＬ−アラニンを示し、「ａ」はＤ−アラニンを示す。ポリペプチド配列を一連の一文字略語または三文字略語（またはその混合）として示す場合、配列を、慣習にしたがってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で示す。
遺伝的にコードするヌクレオシドのために使用される略語は慣習的な略語であり、以下に示す：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。特に記載しないかぎり、省略したヌクレオチドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドを、個別または凝集体に基づいてリボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると特定することができる。核酸配列を一連の一文字略語として示す場合、配列を、慣習にしたがって５’から３’への方向で示し、リン酸塩は示さない。
定義：
本発明に関して、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、他で具体的に定義しないかぎり、当業者によって一般的に理解される意味を有するであろう。したがって、以下の用語は以下の意味を有することを意図する。
「ＥＣ」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法をいう。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づいた酵素についての数値による分類システムである。
「ＡＴＣＣ」は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をいい、その生物所蔵物は遺伝子および株を含む。
「ＮＣＢＩ」は、米国国立生物学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および同センターが提供する配列データベースをいう。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）と無関係にアミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために本明細書中で互換的に使用される。Ｄ−およびＬ−アミノ酸ならびにＤ−およびＬ−アミノ酸の混合物、ならびにＤ−およびＬ−アミノ酸を含むポリマー、ならびにＤ−およびＬ−アミノ酸の混合物が本定義の範囲内に含まれる。
「アミノ酸」は、本明細書中で、アミノ酸の一般的に知られている三文字表記またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨されている一文字表記によって言及される。クレオチドを、同様に、その一般的に許容されている一文字コードによって言及し得る。
本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、相互に共有結合した２つまたはそれを超えるヌクレオシドをいう。ポリヌクレオチドを、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）から完全に構成することができ、２’デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）またはリボヌクレオシドおよび２’デオキシリボヌクレオチドの混合物から完全に構成することができる。典型的にはヌクレオシドが標準的なホスホジエステル結合を介して相互に連結する一方で、ポリヌクレオチドは、１つまたはそれを超える非標準的な連結を含み得る。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であり得るか、一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは典型的には天然に存在するコードヌクレオベース（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）から構成される一方で、ポリヌクレオチドは１つまたはそれを超える改変および／または合成ヌクレオベース（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる改変または合成ヌクレオベースは、アミノ酸配列をコードするヌクレオベースである。
「オピンデヒドロゲナーゼ活性」は、本明細書中で使用する場合、２−ケト酸（例えば、ピルベート）のカルボニル基および中性Ｌ−アミノ酸（例えば、Ｌ−ノルバリン）のアミノ基が第２級アミンジカルボキシラート化合物（例えば、Ｎ−［１−（Ｒ）−（カルボキシ）エチル］−（Ｓ）−ノルバリンなど）に変換される酵素活性をいう。
本明細書中で使用する場合、「イミン」は、窒素−炭素二重結合を含有する有機化合物または官能基であって、窒素が水素または有機基に結合している有機化合物または官能基をいう。
「イミンレダクターゼ活性」は、本明細書中で使用する場合、スキーム１に示されているように、ケトンまたはアルデヒドのカルボニル基および第１級アミンまたは第２級アミンのアミノ基（ここで、カルボニル基およびアミノ基は個別の化合物上または同一化合物上に存在し得る）を補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で第２級アミン生成物化合物または第３級アミン生成物化合物に変換する酵素活性をいう。
「イミンレダクターゼ」または「ＩＲＥＤ」は、本明細書中で使用する場合、イミンレダクターゼ活性を有する酵素をいう。イミンレダクターゼは、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｉｎｏｓｉｓｐｏｒａ由来の野生型イミンレダクターゼから誘導された操作されたポリペプチドに制限されないが、他のイミンレダクターゼ酵素から誘導された操作されたポリペプチドを含む、イミンレダクターゼ活性を有する他の酵素が含まれ得ると理解すべきである。本明細書中で使用するイミンレダクターゼには、天然に存在する（野生型）イミンレダクターゼおよび人の操作によって生成された天然に存在しない操作されたポリペプチドが含まれる。
本明細書中で使用する場合、「オキシム」は、一般式Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＮＯＲ３（式中、Ｒ１は有機側鎖であり、Ｒ２およびＲ３は水素または別の有機基であり得る）を有するイミンをいう。
本明細書中で使用する場合、「オキシムレダクターゼ活性」は、オキシム部分中の窒素と炭素との間の二重結合を単結合に還元する酵素活性をいう。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の一部をいう。
「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見出される形態をいう。例えば、天然に存在するかまたは野生型のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然供給源から単離することができ、且つ人の操作によって意図的に改変されていない生物中に存在する配列である。
本明細書中で使用する場合、「組換え」、「操作された」および「天然に存在しない」は、細胞、核酸、またはポリペプチドに関して使用する場合、材料、すなわち、他の点では天然に存在しないと考えられる様式で改変された材料の天然または未変性の形態に対応する材料をいう。いくつかの実施形態では、細胞、核酸、またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸、またはポリペプチドと同一であるが、合成材料および／または組換え技術を使用した操作によって産生または誘導されている。非限定的な例には、とりわけ、細胞の未変性（非組換え）形態内に見出されない遺伝子を発現するか、他の方法で異なるレベルで発現される未変性遺伝子を発現する組換え細胞が含まれる。
「配列同一性の百分率」および「相同性百分率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、ポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の比較をいうために本明細書中で互換的に使用され、比較ウィンドウにわたる２つの最適にアラインメントした配列の比較によって決定し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列部分またはポリペプチド配列部分は、２配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較した場合に付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることによって百分率を計算することができる。あるいは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じるか、核酸塩基またはアミノ酸残基をギャップを使用してアラインメントした位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることによって百分率を計算することができる。当業者は、２つの配列をアラインメントするために利用可能な確立されたアルゴリズムが多数存在すると認識する。比較のための配列の最適アラインメントを、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０］）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４［１９８８］）の類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実行（例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または当該分野で公知のように目視検査によって行うことができる。％配列同一性および配列類似性の決定に適切なアルゴリズムの例には、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３８９−３４０２［１９７７］を参照のこと）に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムが含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイトから公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードとアラインメントした場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか満たすクエリー配列中の長さＷのショートワードの同定による高スコア配列対（ＨＳＰ）の第１の同定を含む。Ｔを、隣接ワードスコア閾値という（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらのワードヒットを含むより長いＨＳＰを見出すための検索開始のためのシードとして働く。次いで、ワードヒットを、累積アラインメントスコアを増加させることができるかぎり、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアを、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（一致する残基対のための報酬スコア；常に０超）およびＮ（ミスマッチ残基のためのペナルティスコア；常に０未満）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコア行列を使用して、累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたはそれを超える負スコアの残基アラインメントの蓄積によって累積スコアが０またはそれ未満に進行した場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５［１９８９］を参照のこと）を使用する。例示的な配列アラインメントおよび％配列同一性の決定には、提供されたデフォルトパラメータを使用したＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴプログラムまたはＧＡＰプログラムを使用することができる。
「参照配列」は、配列比較の基本として使用される定義された配列をいう。参照配列は、より大きな配列のサブセット（例えば、全長の遺伝子配列またはポリペプチド配列のセグメント）であり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それぞれ、（１）２配列間で類似する配列（すなわち、完全配列の一部）を含むことができ、（２）２配列間で異なる配列をさらに含むことができるので、２つ（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較を、典型的には、配列が類似する局所領域を同定および比較するための「比較ウィンドウ」にわたる２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の比較によって行う。いくつかの実施形態では、「参照配列」は一次アミノ酸配列に基づくことができ、ここで、参照配列は一次配列中に１つまたはそれを超える変化を有し得る配列である。例えば、「Ｘ１４に対応する残基にバリンを有する配列番号４に基づく参照配列」またはＸ１４Ｖは、配列番号４中のＸ１４の対応する残基（チロシンである）がバリンに変更された参照配列をいう。
「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチドの位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントをいい、ここで、ある配列を少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ中の配列の一部が２配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加や欠失を含まない）と比較した場合に２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは、２０個の連続残基よりも長いことが可能であり、任意選択的に、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウィンドウが含まれる。
本明細書中で使用する場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基の位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には、少なくとも３０〜５０残基のウィンドウにわたって参照配列と比較した場合に、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％同一性、および少なくとも８９〜９５％配列同一性、またはより通常には少なくとも９９％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列をいい、ここで、配列同一性の百分率を、比較ウィンドウにわたって合計で２０％またはそれ未満の参照配列が付加または欠失した配列との参照配列の比較によって計算する。ポリペプチドに適用したいくつかの特定の実施形態では、用語「実質的な同一性」は、２つのポリペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを使用したプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントした場合、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも８９％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性、またはそれを超える配列同一性（例えば、９９％配列同一性）を共有することを意味する。いくつかの実施形態では、比較されている配列において同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
「〜に対応する」、「〜に関する」および「〜に関連する」は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の付番の文脈で使用する場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合に指定した参照配列の残基の付番をいう。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基の位置を、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の番号の位置によるよりもむしろ参照配列に関して指定する。例えば、所与のアミノ酸配列（操作されたイミンレダクターゼのアミノ酸配列など）を、２配列間の残基の一致を最適にするためのギャップの導入によって参照配列とアラインメントすることができる。これらの場合、ギャップが存在するにもかかわらず、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列中の残基を、アラインメントした参照配列に関して付番する。
「アミノ酸の相違」または「残基の相違」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比較したポリペプチド配列の位置のアミノ酸残基の変化をいう。アミノ酸の相違の位置を、一般に、本明細書中で「Ｘｎ」といい、ここで、ｎは残基の相違に基づいた参照配列中の対応する位置をいう。例えば、「配列番号２と比較した場合の位置Ｘ２５の残基の相違」は、配列番号２の位置２５に対応するポリペプチドの位置でのアミノ酸残基の変化をいう。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが位置２５にバリンを有する場合、「配列番号２と比較した場合の位置Ｘ２５の残基の相違」は、配列番号２の位置２５に対応するポリペプチドの位置でのバリン以外の任意の残基のアミノ酸置換をいう。本明細書中のほとんどの例では、ある位置での具体的なアミノ酸残基の相違を「ＸｎＹ」として示し、ここで、「Ｘｎ」は上記の対応する位置を指定し、「Ｙ」は操作されたポリペプチド中に見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中の残基と異なる残基）の一文字識別子である。いくつかの実施形態では、１つを超えるアミノ酸が指定した残基の位置に存在することができる（すなわち、別のアミノ酸をＸｎＹ／Ｚ（式中、ＹおよびＺは代わりとなるアミノ酸残基を示す）の形態で列挙することができる）。いくつかの場合では（例えば、表２−２、３−１、４−１および５−１中）、本発明はまた、従来の表示法「ＡｎＢ」で示す具体的なアミノ酸の相違を提供し、ここで、Ａは参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は参照配列中の残基の位置の番号であり、Ｂは操作されたポリペプチド配列中の残基置換の一文字識別子である。さらに、いくつかの場合では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比較して１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の相違を含むことができ、この相違は、参照配列と比較した場合に変化した特定の位置のリストによって示される。いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
本明細書中で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、ある残基の類似の側鎖を有する異なる残基との置換をいい、したがって、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸の同一または類似と定義されたアミノ酸クラス内のアミノ酸との置換を含む。制限されない例として、それぞれ、脂肪族側鎖を有するあるアミノ酸を、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）と置換し；ヒドロキシル側鎖を有するあるアミノ酸を、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）と置換し；芳香族側鎖を有するあるアミノ酸を、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）と置換し；塩基性側鎖を有するあるアミノ酸を、塩基性（ｂａｓｉｓ）側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）と置換し；酸性側鎖を有するあるアミノ酸を、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換し；ならびに／またはある疎水性または親水性のアミノ酸を、別の疎水性または親水性のアミノ酸と置換する。例示的な保存的置換を以下の表１に示す。
「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の有意に特性が異なる側鎖を有するアミノ酸との置換をいう。非保存的置換は、定義した群内よりもむしろ群間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換領域中のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンのプロリンへの置換）、（ｂ）電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を及ぼす。制限されない例として、例示的な非保存的置換は、塩基性アミノ酸または脂肪族アミノ酸に置換された酸性アミノ酸；小アミノ酸に置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸に置換された親水性アミノ酸であり得る。
「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたはそれを超えるアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変をいう。欠失は、操作されたイミンレダクターゼ酵素の酵素活性を保持し、そして／またはその改良された特性を保持しながら、参照酵素を構成する１またはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸、全アミノ酸数の１０％まで、または全アミノ酸数の２０％までを除去することができる。欠失は、ポリペプチドの内部および／または末端部が対象であり得る。種々の実施形態では、欠失は、連続的なセグメントを含むことができるか、不連続であり得る。
「挿入」は、参照ポリペプチド由来の１つまたはそれを超えるアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変をいう。いくつかの実施形態では、改良された操作されたイミンレダクターゼ酵素は、イミンレダクターゼ活性を有する天然に存在するポリペプチドへの１つまたはそれを超えるアミノ酸の挿入および他の改良されたイミンレダクターゼポリペプチドへの１つまたはそれを超えるアミノ酸の挿入を含む。ポリペプチドの内部またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に挿入することができる。本明細書中で使用する場合、挿入には、当該分野で公知の融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続セグメントであり得るか、天然に存在するポリペプチド中で１つまたはそれを超えるアミノ酸によって分離され得る。
本明細書中で使用する場合、「フラグメント」は、アミノ末端の欠失および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残存するアミノ酸配列が配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドをいう。フラグメントは、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、またはそれを超えるアミノ酸長、ならびに全長イミンレダクターゼポリペプチド（例えば、配列番号２のポリペプチド）または配列番号４〜２７０の偶数番号の配列で提供される操作されたイミンレダクターゼの７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および９９％までであり得る。
「単離されたポリペプチド」は、ポリペプチドに天然に付随している他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドをいう。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されているポリペプチドを含む。操作されたイミンレダクターゼ酵素は、細胞内に存在することができるか、細胞培地中に存在することができるか、種々の形態（溶解物または単離された調製物など）で調製することができる。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が主に存在する種である（すなわち、モル基準または重量基準で、組成物中の任意の他の個別の高分子種よりも豊富に存在する）組成物をいい、一般に、モルまたは重量％で存在する高分子種の少なくとも約５０％を対象種が構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なイミンレダクターゼ組成物は、モルまたは重量％で組成物に存在する全高分子種の約６０％またはそれを超えて、約７０％またはそれを超えて、約８０％またはそれを超えて、約９０％またはそれを超えて、約９５％またはそれを超えて、および約９８％またはそれを超えて構成するであろう。いくつかの実施形態では、対象種を、本質的に均一（すなわち、従来の検出方法によって組成物中の夾雑種を検出できない）まで精製し、ここで、組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。溶媒種、小分子（５００ダルトン未満）、および元素イオン種は、高分子種と見なさない。いくつかの実施形態では、単離された操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「立体選択的な」は、化学反応または酵素反応における一方の立体異性体の他方の立体異性体を超える形成の優先度をいう。立体選択性は、一方の立体異性体の形成が他方よりも有利である場合は部分的であり得、一方の立体異性体のみが形成される場合は完全であり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性を、エナンチオ選択性（両方の合計中の一方のエナンチオマーの分率（典型的には、百分率として報告される））という。あるいは、それは、式［主なエナンチオマー−少数のエナンチオマー］／［主なエナンチオマー＋少数のエナンチオマー］にしたがってエナンチオマーから計算したエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）（典型的には百分率として）として当該分野で一般に報告されている。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性をジアステレオ選択性（２つのジアステレオマーの混合物のうちの一方のジアステレオマーの分率（典型的には、百分率として報告される））といい、あるいは、ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として一般に報告されている。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の種類である。
「高度に立体選択的な」は、１つの基質または複数の基質（例えば、基質化合物（１ｅ）および（２ｂ））を対応するアミン生成物（例えば、化合物（３ｉ））に少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で変換することができる化学反応または酵素反応をいう。
本明細書中で使用する場合、「改良された酵素特性」は、酵素の少なくとも１つの改良された特性をいう。いくつかの実施形態では、本発明は、参照イミンレダクターゼポリペプチドおよび／または野生型イミンレダクターゼポリペプチドおよび／または別の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドと比較して、任意の酵素特性の改良を示す操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを提供する。本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドについて、一般にイミンレダクターゼが由来する野生型酵素と比較するが、いくつかの実施形態では、参照酵素は、別の改良された操作されたイミンレダクターゼであり得る。したがって、「改良」のレベルは、野生型および操作されたイミンレダクターゼを含む種々のイミンレダクターゼポリペプチド間で決定および比較され得る。改良された特性には、酵素活性（基質変換％で示すことができる）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性プロファイル、補因子要件、インヒビターに対する不応性（例えば、基質阻害または生成物阻害）、立体特異性、および／または立体選択性（エナンチオ選択性が含まれる）などの特性が含まれるが、これらに限定されない。
「増加した酵素活性」は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの改良された特性をいい、これを、参照イミンレダクターゼ酵素と比較した場合の比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の生成物への変換％（例えば、特定の量のイミンレダクターゼを使用した特定の時間内での出発量の基質の生成物への変換％）の増加によって示すことができる。例示的な酵素活性の決定方法を、実施例に示す。酵素活性に関する任意の特性（その変化によって酵素活性が増加し得るＫｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素の特性が含まれる）が影響を受け得る。酵素活性の改良は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．２倍から、イミンレダクターゼポリペプチドが由来する天然に存在するかまたは別の操作されたイミンレダクターゼよりも酵素活性が２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍またはそれを超えるまでであり得る。イミンレダクターゼ活性を、標準的なアッセイのうちのいずれか１つ（基質、補因子、または生成物の特性の変化のモニタリングなど）によって測定することができる。いくつかの実施形態では、生成物の生成量を、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって測定することができる。本明細書中にさらに詳述するように、酵素活性を、定義された酵素の調製物、設定された条件下での定義されたアッセイ、および１つまたはそれを超える定義された基質を使用して比較する。一般に、溶解物を比較する場合、宿主細胞によって生成される酵素の量および溶解物に存在する酵素の量の変動を最小にするために同一の発現系および同一の宿主細胞も使用してアッセイされる細胞の数およびタンパク質の量を決定する。
「変換」は、対応する生成物への基質の酵素変換をいう。「変換％」は、特定の条件下で一定時間内に生成物に変換される基質の百分率をいう。したがって、イミンレダクターゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」を、生成物への基質の「変換％」として示すことができる。
「熱安定性」は、同じ高温に曝露された野生型酵素と比較して一定期間（例えば、０．５〜２４時間）高温（例えば、４０〜８０℃）への曝露後に類似の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するイミンレダクターゼポリペプチドをいう。
「溶媒安定性」は、同じ濃度の同じ溶媒に曝露された野生型酵素と比較して一定期間（例えば、０．５〜２４時間）種々の濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）への曝露後に類似の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するイミンレダクターゼポリペプチドをいう。
「熱安定性かつ溶媒安定性」は、熱安定性および溶媒安定性の両方を示すイミンレダクターゼポリペプチドをいう。
用語「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、本明細書中で、核酸ハイブリッドが安定な条件をいう。当業者に公知のように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値を、公知の融点の予測方法を使用して計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１６８：７６１−７７７［１９８９］；Ｂｏｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：１３９０［１９６２］；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：８８９３−８８９７［１９８６］；Ｆｒｅｉｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７［１９８６］；Ｋｉｅｒｚｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５：７８４０−７８４６［１９８６］；Ｒｙｃｈｌｉｋら、１９９０，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：６４０９−６４１２［１９９０］（ｅｒｒａｔｕｍ，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：６９８［１９９１］）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）；Ｓｕｇｇｓら、１９８１，ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、Ｂｒｏｗｎら（編）ｐｐ． ６８３−６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ［１９８１］；およびＷｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ．，Ｂｉｏｌ．，２６：２２７−２５９［１９９１］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示のポリペプチドをコードし、定義した条件下で（中程度にストリンジェントな条件または高ストリンジェントな条件など）、本発明の操作されたイミンレダクターゼ酵素をコードする配列の相補物とハイブリッド形成する。
「ハイブリッド形成ストリンジェンシー」は、核酸のハイブリッド形成における洗浄条件などのハイブリッド形成条件をいう。一般に、ハイブリッド形成反応を、低い方のストリンジェンシーの条件下で実施後、多様であるが高い方のストリンジェンシーで洗浄する。用語「中程度のストリンジェントなハイブリッド形成」は、標的−ＤＮＡが標的ＤＮＡに対して約６０％同一、好ましくは約７５％同一、約８５％同一、標的−ポリヌクレオチドに対して約９０％を超える同一性で相補核酸に結合可能な条件をいう。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃での５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでのハイブリッド形成後、４２℃での０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリッド形成」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定した熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満低い温度の条件をいう。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８Ｍ ＮａＣｌにて安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみがハイブリッド形成することが可能な条件をいう（すなわち、ハイブリッドが６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定ではない場合、本明細書中で意図するように、高ストリンジェンシー条件下で安定でないであろう）。高ストリンジェンシー条件を、例えば、４２℃の５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ後、６５℃で０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件でのハイブリッド形成によって提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣでのハイブリッド形成および６５℃の０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣの洗浄に等価な条件でのハイブリッド形成である。他の高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件および中程度にストリンジェントな条件は、上記で引用した文献に記載されている。
「異種」ポリヌクレオチドは、実験技術によって宿主細胞に導入された任意のポリヌクレオチドをいい、宿主細胞から取り出され、実験操作に供され、次いで、宿主細胞に再導入されたポリヌクレオチドが含まれる。
「コドン最適化された」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、コードされたタンパク質が目的の生物中で効率的に発現されるように特定の生物中で優先的に使用されるコドンへの変化をいう。ほとんどのアミノ酸がいくつかのコドンによって示されるという点で遺伝暗号が縮重している（「同義語」または「同義」コドンと称される）にもかかわらず、特定の生物によるコドン使用頻度が非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度バイアスは、所与の遺伝子、共通の機能または起源となる祖先の遺伝子、低コピー数タンパク質に対する高発現タンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して高い可能性がある。いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物からの最適な生成のためにコドン最適化することができる。
本明細書中で使用する場合、「好ましいコドン、最適なコドン、高コドン使用頻度バイアスコドン」は、同一アミノ酸をコードする他のコドンよりもタンパク質コード領域中でより高い頻度で使用されるコドンを互換的にいう。好ましいコドンを、単一の遺伝子、共通の機能または起源の遺伝子組、高発現遺伝子におけるコドン使用頻度、全生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはその組み合わせに関して決定することができる。遺伝子発現レベルに伴って頻度が増加するコドンは、典型的には、発現に最適なコドンである。特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的な同義語コドン使用頻度）およびコドン優先度（例えば、クラスタ分析またはコレスポンデンス分析（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用した多変量解析が含まれる）ならびに遺伝子中で使用された有効コドン数を決定するための種々の方法が公知である（例えば、ＧＣＧ ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．，１４：３７２−７３［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２２４３７−４６［１９９４］；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇｅｎｅ ８７：２３−２９［１９９０］を参照のこと）。コドン使用頻度表は、多くの異なる生物について利用可能である（例えば、Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：２１１１−２１１８［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２９２［２０００］；Ｄｕｒｅｔら、上記；Ｈｅｎａｕｔ ａｎｄ Ｄａｎｃｈｉｎ，ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、（ｅｄｓ．），ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６［１９９６］を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらのデータセットは、発現したタンパク質をコードすることが実際に公知の核酸配列（例えば、完全タンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の推定コード領域を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．［２００１］；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：２５９−２８１［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１３：２６３−２７０［１９９７］を参照のこと）。
「調節配列」は、本明細書中で、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要であるかまたは有利な全ての成分を含むと定義する。各調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然のものであり得るか外来のものであり得る。かかる調節配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。最小限でも、調節配列は、プロモーター、転写停止シグナル、および翻訳停止シグナルを含む。調節配列に、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と調節配列とのライゲーションを容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーを提供することができる。
「作動可能に連結された」は、本明細書中で、調節配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または制御するように目的のポリヌクレオチドに関連する位置に調節配列が適切に（すなわち、機能的関係において）配置された構成と定義する。
「プロモーター配列」は、目的のポリヌクレオチド（コード配列など）の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列をいう。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、最適な宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく（変異プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが含まれる）、宿主細胞と同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
「適切な反応条件」は、本発明のイミンレダクターゼポリペプチドが基質化合物を生成物化合物に変換することができる（例えば、化合物（１）への化合物（２）の変換）生体触媒反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒の範囲など）をいう。例示的な「適切な反応条件」を、本発明中に示し、実施例で例示する。
「補因子再生系」または「補因子リサイクル系」は、補因子の酸化型を還元する（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ）反応に関与する一連の反応物をいう。ケトン基質のイミンレダクターゼ触媒還元的アミノ化によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元型で再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の供給源であり、補因子の酸化型を還元することができる化学量論的還元剤を含む。補因子再生系は、触媒（例えば、還元剤による補因子の酸化型の還元を触媒する酵素触媒）をさらに含むことができる。それぞれＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載の方法で使用することができる。
「ギ酸デヒドロゲナーゼ」および「ＦＤＨ」は、それぞれ二酸化炭素およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへのホルマートおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の変換を触媒するＮＡＤ＋依存性酵素またはＮＡＤＰ＋依存性酵素をいうために本明細書中で互換的に使用される。
「化合物負荷」、「酵素負荷」、または「補因子負荷」などにおける「負荷」は、反応開始時の反応混合物中の成分の濃度または量をいう。
生体触媒媒介プロセスの文脈における「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子をいう。例えば、本明細書中に開示の還元的アミノ化プロセスで使用されるイミンレダクターゼ生体触媒では、式（Ｉ）のケトン（またはアルデヒド）基質（シクロヘキサノンなど）および式（ＩＩ）のアミン基質（ブチルアミンなど）が存在する。
生体触媒媒介プロセスの文脈中の「生成物」は、生体触媒の作用に起因する化合物または分子をいう。例えば、本明細書中に開示のプロセスで使用されるイミンレダクターゼ生体触媒の例示的な生成物は、第２級アミン化合物または第３級アミン化合物（式（ＩＩＩ）の化合物など）である。
「アルキル」は、１〜１８個の炭素原子（両端の数を含む）、より好ましくは１〜８個の炭素原子（両端の数を含む）、最も好ましくは１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）の直鎖状または分枝状のいずれかの飽和炭化水素基をいう。特定の数の炭素原子を有するアルキルを丸括弧内に示し、例えば、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは１〜６個の炭素原子のアルキルをいう。
「アルケニル」は、２〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の炭化水素基であって、少なくとも１つの二重結合を含有するが、任意選択的に１つを超える二重結合を含有する直鎖状または分枝状のいずれかの炭化水素基をいう。
「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の炭化水素基であって、少なくとも１つの三重結合を含有するが、任意選択的に１つを超える三重結合を含有し、さらに任意選択的に１つまたはそれを超える二重結合部分を含有する直鎖状または分枝状のいずれかの炭化水素基をいう。
「アルキレン」は、１〜１８個の炭素原子（両端の数を含む）、より好ましくは１〜８個の炭素原子（両端の数を含む）、最も好ましくは１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、任意選択的に１個またはそれを超える適切な置換基で置換された直鎖状または分枝状の２価の炭化水素ラジカルをいう。例示的な「アルキレン」には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンなどが含まれるが、これらに限定されない。
「アルケニレン」は、２〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）および１つまたはそれを超える炭素−炭素二重結合、より好ましくは２〜８個の炭素原子（両端の数を含む）、最も好ましくは２〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、任意選択的に１個またはそれを超える適切な置換基で置換された直鎖状または分枝状の二価炭化水素ラジカルをいう。
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」はそれぞれ、１個またはそれを超える炭素原子がそれぞれ独立して、同じまたは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基で置き換えられた本明細書中で定義されるアルキル、アルケニルおよびアルキニルをいう。炭素原子を置き換え得るヘテロ原子および／またはヘテロ原子基には、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｏ−、−ＮＲγ−、−ＰＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）ＮＲγ−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲγ−など（それらの組み合わせを含む）が挙げられるが、これらに限定されず、各Ｒγは、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される。
「アリール」は、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する６〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の不飽和芳香族炭素環式基をいう。例示的なアリールには、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが含まれる。
「アリールアルキル」は、アリールで置換されたアルキル（すなわち、アリール−アルキル基）であって、好ましくはアルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、アリール部分中に６〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）を有するアルキルをいう。かかるアリールアルキル基は、ベンジル、フェネチルなどによって例示される。
「アリールオキシ」は、−ＯＲλ基（式中、Ｒλは、任意選択的に置換されていてもよいアリール基である）をいう。
「シクロアルキル」は、１〜３個のアルキル基に任意選択的に置換することができる単環または複数の縮合環を有する３〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の環状アルキル基をいう。例示的なシクロアルキル基には、単環構造（シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、１−メチルシクロプロピル、２−メチルシクロペンチル、および２−メチルシクロオクチルなど）または多環構造（アダマンチルなどの架橋環系が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
「シクロアルキルアルキル」は、好ましくは、アルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、シクロアルキル部分中に３〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）を有する、シクロアルキルで置換されたアルキル（すなわち、シクロアルキル−アルキル基）をいう。かかるシクロアルキルアルキル基は、シクロプロピルメチルおよびシクロヘキシルエチルなどによって例示される。
「アミノ」は、基−ＮＨ２をいう。置換アミノは、基−ＮＨＲη、ＮＲηＲη、およびＮＲηＲηＲη（式中、各Ｒηは、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから独立して選択される）をいう。典型的なアミノ基には、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル−オキシ−スルファミノなどが含まれるが、これらに限定されない。
「アミノアルキル」は、水素原子の１個またはそれよりも多くが、置換アミノ基を含む１個またはそれを超えるアミノ基で置き換えられたアルキル基をいう。
「アミノカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２をいう。置換アミノカルボニルは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲηＲη（式中、アミノ基ＮＲηＲηは、本明細書中で定義されるとおりである）をいう。
「オキシ」は、エーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成するために種々の置換基を有し得る二価基−Ｏ−をいう。
「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は、基−ＯＲζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換されたアルキル基を含むアルキル基である）をいうために本明細書中で互換的に使用される。
「カルボキシ」は、−ＣＯＯＨをいう。
「カルボニル」は、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む異なるカルボニル基を形成するために種々の置換基を有し得る−Ｃ（Ｏ）−をいう。
「カルボキシアルキル」は、水素原子の１個またはそれよりも多くが１個またはそれを超えるカルボキシ基で置き換えられたアルキルをいう。
「アミノカルボニルアルキル」は、本明細書中で定義されるアミノカルボニル基で置換されたアルキルをいう。
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードをいう。
「ハロアルキル」は、水素原子の１個またはそれよりも多くがハロゲンで置き換えられたアルキル基をいう。したがって、用語「ハロアルキル」は、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキルなど、ペルハロアルキルまでを含むことを意味する。例えば、表現「（Ｃ１−Ｃ２）ハロアルキル」は、１−フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、１−フルオロエチル、１，１−ジフルオロエチル、１，２−ジフルオロエチル、１，１，１トリフルオロエチル、ペルフルオロエチルなどを含む。
「ヒドロキシ」は、−ＯＨをいう。
「ヒドロキシアルキル」は、水素原子の１個またはそれよりも多くが１個またはそれを超えるヒドロキシ基で置き換えられたアルキル基をいう。
「チオール」または「スルファニル」は、−ＳＨをいう。置換チオールまたはスルファニルは、−Ｓ−Ｒη（式中、Ｒηは、アルキル、アリールまたは他の適切な置換基である）をいう。
「アルキルチオ」は、−ＳＲζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換されていてもよいアルキルである）をいう。典型的なアルキルチオ基には、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオなどが含まれるが、これらに限定されない。
「アルキルチオアルキル」は、アルキルチオ基−ＳＲζで置換されたアルキル（式中、Ｒζは、任意選択的に置換されていてもよいアルキルである）をいう。
「スルホニル」は、−ＳＯ２−をいう。置換スルホニルは、−ＳＯ２−Ｒη（式中、Ｒηは、アルキル、アリールまたは他の適切な置換基である）をいう。
「アルキルスルホニル」は、−ＳＯ２−Ｒζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換されていてもよいアルキルである）をいう。典型的なアルキルスルホニル基には、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニルなどが含まれるが、これらに限定されない。
「アルキルスルホニルアルキル」は、アルキルスルホニル基−ＳＯ２−Ｒζで置換されたアルキル（式中、Ｒζは、任意選択的に置換されていてもよいアルキルである）をいう。
「ヘテロアリール」は、環内に１〜１０個の炭素原子（両端の数を含む）および１〜４個の酸素、窒素、および硫黄から選択されるヘテロ原子（両端の数を含む）を含む芳香族複素環基をいう。かかるヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有することができる。
「ヘテロアリールアルキル」は、好ましくは、アルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、ヘテロアリール部分中に５〜１２個の環原子（両端の数を含む）を有する、ヘテロアリールで置換されたアルキル（すなわち、ヘテロアリール−アルキル基）をいう。かかるヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルなどによって例示される。
「ヘテロ環」、「複素環」、および、互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、単環または複数の縮合環、環内に２〜１０個の炭素環原子（両端の数を含む）および１〜４個の窒素、硫黄、または酸素から選択されるヘテロ環原子（両端の数を含む）を有する飽和または不飽和の基をいう。かかる複素環基は、単環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフラン、またはキヌクリジニル）を有することができる。ヘテロ環の例には、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、およびインドリンなどが含まれるが、これらに限定されない。
「ヘテロシクロアルキルアルキル」は、好ましくは、アルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、ヘテロシクロアルキル部分中に３〜１２個の環原子（両端の数を含む）を有する、ヘテロシクロアルキルで置換されたアルキル（すなわち、ヘテロシクロアルキル−アルキル基）をいう。
「員環」は、任意の環状構造を含むことを意味する。用語「員」の前の数字は、環を構成する骨格原子の数を示す。したがって、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピラン、およびチオピランは６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フラン、およびチオフェンは５員環である。
本明細書中で使用する場合、「縮合二環」は、各環内に５〜８個の原子を有する、非置換または置換の炭素環および／または複素環部分の両方をいい、環は２個の共通の原子を有する。
前述の化学基に関して本明細書中で使用する場合、「任意選択的に置換された」は、水素によって占められる化学基の位置を、（特に指定がない限り）炭素、酸素、窒素、または硫黄によって例示されるが、これらに限定されない別の原子、またはヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（ａｍｉｄｏｘｉｍｏ）、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、ヘテロ環、（ヘテロ環）オキシ、および（ヘテロ環）アルキルによって例示されるが、これらに限定されない化学基で置換することができ；ここで、好ましいヘテロ原子が酸素、窒素、および硫黄であることを意味する。さらに、開放原子価がこれらの置換化学基上に存在する場合、開放原子価をアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、および／またはヘテロ環基でさらに置換することができ、これらの開放原子価が炭素上に存在する場合、開放原子価を、ハロゲンならびに酸素、窒素、または硫黄に結合した置換基によってさらに置換することができ、複数のかかる開放原子価が存在する場合、結合の直接形成または新規のヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素、または硫黄への結合の形成のいずれかによってこれらの基を接合させて環を形成することができる。水素の置換基への置き換えによって本発明の分子が許容できない不安定性を導入せず、かつ他の点で化学的に妥当であるという条件で、上記置換を実施することができることがさらに意図される。当業者は、任意選択的に置換されたと記載の任意の化学基に関して、立体的に実用的および／または合成的に実行可能な化学基のみが含まれることを意味すると理解するであろう。本明細書中で使用する場合、「任意選択的に置換された」は、化学基の用語または一連の用語におけるその後の全修飾語句をいう。例えば、用語「任意選択的に置換されたアリールアルキル」では、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分を置換しても置換しなくてもよく、一連の用語「任意選択的に置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール」について、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、およびヘテロアリール基を、他の基から独立して、置換しても置換しなくてもよい。
オキシム中間体形成および第２級アミンへのイミンの変換
オキシム中間体の形成は、ＩＲＥＤの出発基質を生成するための効率的な方法であり、次いで、ＩＲＥＤは、高い立体選択性でこの化合物を還元して、９５％超のエナンチオマー過剰率を有する生成物を生成する（スキーム１に示されている）。このアプローチの課題は、所望の基質と反応する酵素を同定し、酵素の効率を増加させる変異を同定することである。
本発明は、新規生体触媒、およびイミン基質の直接的還元によるキラル第２級アミンの合成にそれらを使用するための関連方法を提供する。本開示の生体触媒は、配列番号２のアミノ酸配列を有するイミンレダクターゼまたは「ＩＲＥＤ」をコードする、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｉｎｏｓｉｓｐｏｒａ由来の野生型遺伝子の操作されたポリペプチドバリアントである。これらの操作されたポリペプチドは、第２級アミンへのイミンの変換を触媒することができる。ＩＲＥＤの一般的なイミンレダクターゼ活性は、以下のスキーム２で例証される。
本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、広範囲の基質を許容し得る。したがって、スキーム２の生体触媒反応では、基質のＲ１基は、水素原子または任意選択的に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールアルコキシ、ヒドロキシアルキル、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノ、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルから選択され；基質のＲ２およびＲ３基は、水素原子ならびに任意選択的に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルから独立して選択され、ただし、Ｒ２およびＲ３の両方が水素であり得ない。任意選択的に、基質のＲ１基とＲ２およびＲ３基のいずれかが連結して、３員〜１０員環を形成し得る。同様に、基質のＲ２およびＲ３基は連結して、３員〜１０員環を形成し得る。
本明細書中にさらに記載されるように、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは立体選択性を示すので、スキーム２のイミンレダクターゼ反応を使用して、単一の生体触媒反応において生成物の１つ、２つまたはそれを超えるキラル中心を確立し得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２のアミノ酸参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、前記参照アミノ配列と比較して１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の相違をさらに含み、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性は、スキーム２の活性である。
操作されたイミンレダクターゼポリペプチド
本発明は、イミンレダクターゼ活性を有するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリペプチドを調製する方法、および前記ポリペプチドを使用するための方法を提供する。説明がポリペプチドに関する場合、それは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを説明し得ると理解すべきである。
操作されたポリペプチドの上記改良された特性が所望の反応を行う適切な反応条件は、以下および実施例にさらに記載されているように、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、補基質、緩衝液、溶媒、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、ならびに／または固体支持体上に固定化されたポリペプチドを用いる条件に関して決定され得る。
いくつかの実施形態では、特に化合物［２］への化合物［１］の変換において、改良された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、表２−２に示されている残基位置に、配列番号２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、特に化合物［２］への化合物［１］の変換において、改良された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、表３−１に示されている残基位置に、配列番号２７０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、特に化合物［２］への化合物［１］の変換において、改良された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、表４−１に示されている残基位置に、配列番号２３０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の例示的な天然に存在しない（または操作された）ポリペプチドの構造および機能の情報は、化合物［２］への化合物［１］の変換に基づいており、その結果は、以下の表２−２、３−１、４−１および５−１に示されており、実施例にさらに記載されている。これらの表における奇数番号の配列識別子（すなわち、配列番号）は、これらの表における偶数番号の配列番号によって提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をいう。例示的な配列は、本発明に付随する電子配列表ファイル（これは、参照により本明細書中に組み入れられる）に提供されている。示されているように、アミノ酸残基の相違は、配列番号２、２３０および２７０の参照配列との比較に基づく。
大腸菌における発現のために、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｉｎｏｓｉｓｐｏｒａイミンレダクターゼの天然に存在するアミノ酸配列（配列番号１）をコドン最適化および合成した（ポリペプチド配列は、配列番号２に提供されている）。
配列番号２、２３０または２７０の参照ポリペプチドと比較した各操作されたポリペプチドの活性を、本明細書中の実施例に記載されている基質の変換として決定した。いくつかの実施形態では、二次スクリーニングとして振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を使用して、操作されたイミンレダクターゼの特性を評価し、その結果は実施例に提供されている。いくつかの実施形態では、ＳＦＰ形態は、操作されたポリペプチドのより精製された粉末調製物を提供し、総タンパク質の最大約３０％の操作されたポリペプチドを含有し得る。
いくつかの実施形態では、特異的酵素特性は、本明細書中に示されている残基位置に、配列番号２、２３０および２７０と比較した残基の相違に関連する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド発現に影響を与える残基の相違は、操作されたイミンレダクターゼの発現を増加させるために使用され得る。
本明細書中で提供されるガイドラインを考慮して、配列番号４〜２７０の偶数番号の配列を含む例示的な操作されたポリペプチドはいずれも、例えば、表２−２、３−１、４−１および５−１の他のポリペプチドに由来する種々のアミノ酸の相違と、本明細書中に記載の他の残基位置との新たな組み合わせを組み込む後続ラウンドの進化によって他の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを合成するための出発アミノ酸配列としての用途を見出すことがさらに意図される。さらなる改良は、より初期のラウンドの進化で不変のまま維持されている残基位置に、アミノ酸の相違を含めることによって生成され得る。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列と、５７／２１１、８７／１７５、１０３／２１２、１２２、１２３、１２４／１７８、１２４、１３２、１３４、１６９、１７１、１７３、１７５、１７６、１７８／２４２、１７８、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１７、２３４および２３５から選択される残基位置に、配列番号２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列と、５７Ｔ／２１１Ｌ、８７Ｓ／１７５Ｇ、１０３Ｈ／２１２Ｃ、１２２Ｅ、１２３Ｇ、１２４Ａ／１７８Ｉ、１２４Ｇ、１３２Ｈ／Ｒ、１３４Ｒ、１６９Ｎ／Ｓ、１７１Ｗ、１７３Ｈ／Ｉ、１７５Ｇ／Ｈ、１７６Ｓ、１７８Ｉ／２４２Ｙ、１７８Ｍ、２１１Ｌ／Ｗ、２１２Ｃ／Ｇ／Ｖ、２１３Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｖ、２１４Ｍ、２１５Ｌ／Ｍ、２１７Ｉ／Ｌ、２３４Ｌおよび２３５Ｋから選択される、配列番号２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列と、Ａ５７Ｔ／Ｉ２１１Ｌ、Ｐ８７Ｓ／Ｍ１７５Ｇ、Ｒ１０３Ｈ／Ｅ２１２Ｃ、Ｌ１２２Ｅ、Ｔ１２３Ｇ、Ｉ１２４Ａ／Ｖ１７８Ｉ、Ｉ１２４Ｇ、Ｅ１３２Ｈ／Ｒ、Ｔ１３４Ｒ、Ａ１６９Ｎ／Ｓ、Ｙ１７１Ｗ、Ａ１７３Ｈ／Ｉ、Ｍ１７５Ｇ／Ｈ、Ｌ１７６Ｓ、Ｖ１７８Ｉ／Ａ２４２Ｙ、Ｖ１７８Ｍ、Ｉ２１１Ｌ／Ｗ、Ｅ２１２Ｃ／Ｇ／Ｖ、Ａ２１３Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｖ、Ｖ２１４Ｍ、Ｔ２１５Ｌ／Ｍ、Ｗ２１７Ｉ／Ｌ、Ｄ２３４ＬおよびＡ２３５Ｋから選択される残基位置に、配列番号２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２７０の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列と、１２３／１２４／１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１２３／１２４／１６９／２１２／２１３／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／２１２／２１３／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１２３／１６９／１７３／１７５／２１３／２３５、１２３／１６９／１７３／２１２／２１３、１２３／１６９／１７５、１２３／１６９／１７５／２１２／２３５、１２３／１６９／２１２／２１３、１２３／１７３／１７５／２１２／２１３／２３５、１２３／２１２／２１３／２３５、１２３／２１２／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／１７５／２１２／２１３、１２３／１６９／１７３、１２３／１６９／２１２／２１３／２３５、１２３／２１３、１２４／１６９、１２４／１６９／１７３／１７５／２１２／２１３、１２４／１６９／１７３／２１２／２１３、１２４／１６９／１７３／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／１７５／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／２１３／２３５、１２４／１７５／２１２／２１３／２３５、１２４／２１２／２１３／２３５、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１／２１４、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１／２１７、１３４／１６９／１７６／２１１／２１５／２１７／２３４、１３４／１６９／１７６／２１１、１３４／１６９／１７８／２１１／２１４／２１７、１３４／１６９／２１１／２１４／２１７、１３４／１６９／２１１／２１７、１３４／１７６／２１１／２１４、１３４／１７６／２１１／２１５、１３４／２１１／２１４、１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１６９／１７３／１７５／２１３／２３５、１６９／１７５／２１２／２１３／２３５、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／１７８／２１１／２１７、１６９／１７６／１７８、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／２１１／２１４、１６９／１７６／２１１／２１４／２１５／２３４、１６９／１７６／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／２１１／２１７、１６９／１７６／２１４／２１５／２１７、１６９／１７８／２１７、１６９／１７８／２３４、１６９／２１１／２１４／２１５、１６９／２１１／２１７、１６９／２１２／２１３、１６９／２１２／２３５、１６９／２１２／２１３／２３５、１６９／２３５、１７１／１７３／２１２／２１３／２３５、１７３／１７５／２１３、１７５／２１３／２３５、１７５／２３５、１７６／１７８／２１１／２１５／２１７、１７６／１７８／２１１／２１７、１７６／２１１／２１４、１７６／２１４／２１７、１７８／２１１／２１４、１７８／２１１／２１７、１７８／２１５、２１１／２３４、２１２／２１３／２３５および２１３／２３５から選択される、配列番号２７０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２７０の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列と、１２３Ｇ／１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｔ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２３Ｇ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１２Ｇ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１２Ｘ／２１３Ｖ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１３Ｔ、１２４Ｇ／１６９Ｎ、１２４Ａ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｃ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１７５Ｇ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ／２１１Ｌ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１５Ｍ／２１７Ｉ／２３４Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１３４Ｒ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１５Ｍ、１３４Ｒ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ １６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１７Ｌ １６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１５Ｌ／２３４Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１４Ｍ／２１５Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７８Ｉ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７８Ｍ／２３４Ｌ、１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１５Ｌ、１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／２１２Ｃ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２３５Ｋ、１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１３Ｖ、１７５Ｈ／２１３Ｐ／２３５Ｋ、１７５Ｈ／２３５Ｋ、１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１５Ｌ／２１７Ｌ、１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１７６Ｓ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１７８Ｍ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１７８Ｉ／２１５Ｍ、２１１Ｗ／２３４Ｌ、２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、２１３Ｔ／２３５Ｋ、および２１３Ｖ／２３５Ｋから選択される、配列番号２７０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２７０の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列と、Ｔ１２３Ｇ／Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｔ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｘ／Ａ２１３Ｖ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ２１３Ｔ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ、Ｉ１２４Ａ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｌ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｔ２１５Ｍ／Ｗ２１７Ｉ／Ｄ２３４Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、１３４Ｒ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｔ２１５Ｍ、Ｔ１３４Ｒ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｌ／Ｄ２３４Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｉ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｍ／Ｄ２３４Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ａ２３５Ｋ、Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ、Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｐ／Ａ２３５Ｋ、Ｍ１７５Ｈ／Ａ２３５Ｋ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｔ２１５Ｌ／Ｗ２１７Ｌ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ｖ１７８Ｉ／Ｔ２１５Ｍ、Ｉ２１１Ｗ／Ｄ２３４Ｌ、Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ２１３Ｔ／Ａ２３５ＫおよびＡ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋから選択される、配列番号２７０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２７０の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列と、４５、１２７、１３０、１３４、１７４、２０６、２０９、２１２、２１６、２２３、２２７および２７９から選択される、配列番号２３０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２３０の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列と、４５Ｉ、１２７Ｒ、１３０Ｒ、１３４Ｌ／Ｒ、１７４Ｍ、２０６Ｌ、２０９Ｋ／Ｓ、２１２Ｈ／Ｋ／Ｒ、２１６Ｎ／Ｒ／Ｓ、２２３Ｎ、２２７Ｖおよび２７９Ｖから選択される、配列番号２３０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２３０の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列と、Ｖ４５Ｉ、Ｇ１２７Ｒ、Ｔ１３０Ｒ、Ｔ１３４Ｌ／Ｒ、Ａ１７４Ｍ、Ｍ２０６Ｌ、Ｑ２０９Ｋ／Ｓ、Ｅ２１２Ｈ／Ｋ／Ｒ、Ｇ２１６Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｄ２２３Ｎ、Ａ２２７ＶおよびＤ２７９Ｖから選択される、配列番号２３０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４〜７４の偶数番号の配列を含む。
いくつかの実施形態では、活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２７０の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号７６〜２３２の偶数番号の配列を含む。
いくつかの実施形態では、活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２３０の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２３４〜２７０の偶数番号の配列を含む。
当業者が認識するように、いくつかの実施形態では、選択された上記の残基の相違の１つまたは組み合わせを、コア特徴として操作されたイミンレダクターゼ中に一定に維持し（例えば、維持し）、他の残基の位置のさらなる残基の相違を配列に組み込むことにより特性が改良されたさらなる操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを生成することができる。したがって、上記の残基の相違の１つまたはサブセットを含む任意の操作されたイミンレダクターゼについて、本発明が、残基の相違の１つまたはサブセット、さらに、本明細書中に開示の他の残基の位置に１つまたはそれを超える残基の相違を含む他の操作されたイミンレダクターゼを意図すると理解すべきである。
上記のように、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドはまた、基質（例えば、化合物［１］）を生成物（例えば、化合物［２］）に変換することができる。いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、２３０または２７０の参照ポリペプチドの活性と比較して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれを超える活性で、基質を生成物に変換することができる。
いくつかの実施形態では、配列番号２、２３０および／または２７０と比較して少なくとも２倍の活性で基質化合物を生成物化合物に変換することができる操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、配列番号４〜２７０の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼは、配列番号２、２３０および／または２７０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違であって、細菌宿主細胞において、特に大腸菌において、操作されたイミンレダクターゼ活性の発現を増加させる残基の相違を含むアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、改良された特性を有する操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列から選択される配列を含むアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列の１つと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列と、実施例で提供されているように、配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列のいずれか１つに存在する配列番号２、２３０および／または２７０と比較したアミノ酸残基の相違とを含む。
上記で詳述されている残基位置に加えて、本明細書中に開示の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドはいずれも、他の残基位置（すなわち、本明細書中に含まれるもの以外の残基位置）に、配列番号２、２３０および／または２７０と比較した他の残基の相違をさらに含み得る。これらの他の残基位置における残基の相違は、生成物への基質の変換を行うポリペプチドの能力に悪影響を与えずに、アミノ酸配列のさらなるバリエーションを提供し得る。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列から選択される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのいずれか１つに存在するアミノ酸残基の相違に加えて、前記配列は、他のアミノ酸残基位置に、配列番号２、２２９および／または２７０と比較した１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０個の残基の相違をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基の相違の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個の残基位置であり得る。いくつかの実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基の相違の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の残基位置であり得る。これらの他の位置における残基の相違は、保存的変化または非保存的変化であり得る。いくつかの実施形態では、残基の相違は、配列番号２、２２９および／または２７０の天然に存在するイミンレダクターゼポリペプチドと比較して、保存的置換および非保存的置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、操作されたイミンレダクターゼの機能的活性および／または改良された特性を保持する、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのいずれかのフラグメントを含む操作されたポリペプチドを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、適切な反応条件下で基質を生成物に変換することができるポリペプチドフラグメントであって、本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチド、例えば配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列から選択される例示的な操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含むポリペプチドフラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチド配列、例えば配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列の例示的な操作されたポリペプチドのいずれか１つにおいて欠失を含むアミノ酸配列を有し得る。
したがって、本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの各実施形態およびあらゆる実施形態のために、アミノ酸配列は、イミンレダクターゼポリペプチドの１つまたはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、３またはそれを超えるアミノ酸、４またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸、総アミノ酸数の１０％まで、総アミノ酸数の２０％まで、または総アミノ酸数の３０％までの欠失を含むことができ、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼの関連する機能活性および／または改良された特性が維持される。いくつかの実施形態では、欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、欠失数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基数であり得る。いくつかの実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチド（配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列の例示的な操作されたポリペプチドなど）のうちのいずれか１つと比較した場合に挿入を含むアミノ酸配列を有することができる。したがって、本発明のイミンレダクターゼポリペプチドのそれぞれおよび全ての実施形態について、挿入は、１つまたはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、３またはそれを超えるアミノ酸、４またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、２０またはそれを超えるアミノ酸、３０またはそれを超えるアミノ酸、４０またはそれを超えるアミノ酸、または５０またはそれを超えるアミノ酸を含むことができ、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼの関連する機能活性および／または改良された特性が維持される。挿入は、イミンレダクターゼポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端または内部に存在し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書中の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列から選択される配列、および任意選択で、１つまたは複数の（例えば、最大３、４、５、または最大１０の）アミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を含むアミノ酸配列を有することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列数は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
上記実施形態では、操作されたポリペプチドのための適切な反応条件は、表２−２、３−１、４−１および／または５−１に提供されており、本明細書中の実施例に記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが他のポリペプチド（制限されない例として、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属への結合のためのＨｉｓタグ）、および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）など）に融合した融合ポリペプチドである。したがって、本明細書中に記載の操作されたポリペプチドを、他のポリペプチドに融合するか融合せずに使用することができる。
本明細書中に記載のポリペプチドが遺伝的にコードされたアミノ酸に制限されないと理解すべきである。遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書中に記載のポリペプチドは、その全体または一部が、天然に存在し、そして／または合成によるコードされないアミノ酸から構成され得る。本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができる一定の一般的に認められる非コードアミノ酸には、以下が含まれるが、これらに限定されない：遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ−ステレオマー；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アントリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（３−ａｍｉｎｏ−５−ｐｈｅｎｙｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈｏｍｏｇｌｕｔａｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペント−（２または３）−エン−４ カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＧｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）。本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができるさらなるコードされないアミノ酸は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｆａｓｍａｎ，ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ｐｐ．３−７０［１９８９］、および引用文献（その全てが本明細書中で参照によって組み込まれる）に記載の種々のアミノ酸を参照のこと）。これらのアミノ酸は、Ｌ立体配置またはＤ立体配置のいずれかであり得る。
当業者は、側鎖保護基を保有するアミノ酸または残基が本明細書中に記載のポリペプチドを構成することもできると認識するであろう。この場合に芳香族カテゴリーに属するかかる保護されたアミノ酸の非限定的な例には、以下が含まれるが、これらに限定されない（カッコ内に保護基を列挙する）：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）、およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）。
本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができるコンフォメーションが拘束された非コードアミノ酸には、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ−立体配置）；１−アミノシクロペント−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、例えば、実質的に精製された酵素としての単離された調製物、酵素をコードする遺伝子を使用して形質転換されたホールセル、ならびに／またはかかる細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物などの種々の形態であり得る。酵素は、以下でさらに考察するように、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、沈殿形態、または粗ペースト形態であり得る。
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドを、固体支持体（膜、樹脂、固体キャリア、または他の固相材料など）上に提供し得る。固体支持体は、有機ポリマー（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなど）、ならびにそのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体は、ガラス、シリカ、孔制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属（金または白金など）などの無機固体支持体でもあり得る。固体支持体の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または面の形態であり得る。面は、平面、実質的平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であってよく、膨潤性または非膨潤性であり得る。固体支持体を、ウェル、窪み、または他の容器、管の形態、特徴、または位置で構成することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを、このポリペプチドが配列番号２、２３０および／または２７０の参照のポリペプチドと比較した場合に改良された活性、および／または他の改良された特性を保持するように固体支持体上に固定することができる。かかる実施形態では、固定されたポリペプチドは、基質化合物の生成物への生体触媒変換を容易にすることができ、反応完了後に容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定されたビーズの保持による）、次いで、その後の反応で再利用またはリサイクルされる。かかる酵素の固定化プロセスによりさらに効率が上がり、経費が抑えられる。したがって、本発明のイミンレダクターゼポリペプチドの任意の使用方法を、固体支持体に結合または固定された同一のイミンレダクターゼポリペプチドを使用して実施することができることがさらに意図される。
酵素の固定方法は、当該分野で周知である。操作されたポリペプチドを、非共有結合または共有結合することができる。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素の種々のコンジュゲーションおよび固定方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｙｉら，Ｐｒｏｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４２（５）：８９５−８９８［２００７］；Ｍａｒｔｉｎら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７６（４）：８４３−８５１［２００７］；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６３：３９−４４［２０１０］；Ｔｒｕｐｐｏら，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍ［２００８］；Ｍａｔｅｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１８（３）：６２９−３４［２００２］；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｉｅｍｅｙｅｒ（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ［２００４］（それぞれの開示は、本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。本発明の操作されたイミンレダクターゼの固定に有用な固体支持体には、エポキシド官能基を有するポリメタクリラート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリラート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリラートを含むビーズまたは樹脂が含まれるが、これらに限定されない。本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの固定に有用な固体支持体の例には、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ、およびＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）（以下の異なるタイプのＳＥＰＡＢＥＡＤが含まれる：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９、およびＥＸＥ１２０）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のポリペプチドを、キットの形態で提供される。キット中の酵素は、個別に存在し得るか、複数の酵素として存在し得る。キットは、酵素反応を行うための試薬、酵素活性を評価するための基質、および生成物を検出するための試薬をさらに含むことができる。キットはまた、試薬用ディスペンサーおよびキットの使用説明書を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、異なるアドレス可能位置に複数の異なるイミンレダクターゼポリペプチドを含むアレイを含み、異なるポリペプチドが、それぞれが少なくとも１つの異なる改良された酵素の特性を有する参照配列の異なるバリアントである。いくつかの実施形態では、固体支持体上に固定した複数のポリペプチドは、ロボットによる試薬送達のためにアドレス可能であるか、検出方法および／または検出装置によってアレイの種々の位置に構成される。アレイを使用して、ポリペプチドによる変換について種々の基質化合物を試験することができる。複数の操作されたポリペプチドを含むかかるアレイおよびその使用方法は当該分野で公知である（例えば、ＷＯ２００９／００８９０８Ａ２号を参照のこと）。
操作されたイミンレダクターゼをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を調節する１つまたはそれを超える異種制御配列に作動可能に連結してポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製することができる。操作されたイミンレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するイミンレダクターゼポリペプチドを発現させる。
当業者に明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性および種々のアミノ酸に対応するコドンの知識は、対象のポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドの記載を提供する。同じアミノ酸が代替的または同義的コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重は、その全てが改良されたイミンレダクターゼ酵素をコードする極めて多数の核酸を作製することを可能にする。したがって、特定のアミノ酸配列の知識を有することにより、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させないように１つまたはそれを超えるコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製し得る。これに関して、本発明は、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって、本明細書中に記載のポリペプチドをコードするようにされ得るそれぞれのおよびあらゆるバリエーションのポリヌクレオチドを具体的に意図しており、全てのかかるバリエーションは、表２−２、３−１、４−１および５−１に示されており、配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列として配列表（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されているアミノ酸配列を含む本明細書中に記載の任意のポリペプチドについて具体的に開示されているとみなされるべきである。
種々の実施形態では、タンパク質が生成される宿主細胞に適合するようにコドンを選択することが好ましい。例えば、細菌中で遺伝子を発現するために細菌中で使用される好ましいコドンを使用し；酵母中での発現のために酵母中で使用される好ましいコドンを使用し；哺乳動物細胞中での発現のために哺乳動物中で使用される好ましいコドンを使用する。いくつかの実施形態では、天然の配列が好ましいコドンを含み、好ましいコドンの使用が全てのアミノ酸残基に必要でないかもしれないので、全てのコドンがイミンレダクターゼのコドン使用頻度を最適化するために置換される必要はない。したがって、イミンレダクターゼ酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える位置で好ましいコドンを含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、２３０および／または２７０によって表されている天然に存在するイミンレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列をコードするコドン最適化核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を含む核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３〜２６９の範囲内の奇数番号の配列におけるコドン最適化核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を含む核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３〜２６９の範囲内の奇数番号の配列のコドン最適化配列は、コードされる野生型イミンレダクターゼの発現を増強し、基質を生成物に変換することができる酵素の調製物を提供する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェントな条件下で、配列番号３〜２６９の奇数番号の配列から選択される参照配列またはその相補物とハイブリダイズすることができ、イミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、上記のように、ポリヌクレオチドは、配列番号２、２３０および／または２７０と比較して改良された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号２、２３０および／または２７０から選択される参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２、２３０および／または２７０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含み、前記配列は、配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列から選択される。いくつかの実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号４〜２７０の範囲内の偶数番号の配列から選択される。いくつかの実施形態では、参照アミノ酸配列は配列番号２であるが、いくつかの他の実施形態では、参照配列は配列番号２３０であり、さらにいくつかの他の実施形態では、参照配列は配列番号２７０である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、２３０および／または２７０と比較して改良された特性で基質を生成物に変換することができるイミンレダクターゼポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号２、２３０および／または２７０の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３〜２６９の範囲内の奇数番号の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェントな条件下で、配列番号３〜２６９の範囲内の奇数番号の配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補物とハイブリダイズすることができ、本明細書中に記載の改良された特性の１つまたはそれよりも多くを有するイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むイミンレダクターゼポリペプチドであって、５７／２１１、８７／１７５、１０３／２１２、１２２、１２３、１２４／１７８、１２４、１３２、１３４、１６９、１７１、１７３、１７５、１７６、１７８／２４２、１７８、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１７、２３４および２３５から選択される残基位置に、配列番号２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含むアミノ酸配列を有するイミンレダクターゼポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェントな条件下で、配列番号３〜２６９の範囲内の奇数番号の配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補物とハイブリダイズすることができ、本明細書中に記載の改良された特性の１つまたはそれよりも多くを有するイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号２７０と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むイミンレダクターゼポリペプチドであって、１２３／１２４／１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１２３／１２４／１６９／２１２／２１３／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／２１２／２１３／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１２３／１６９／１７３／１７５／２１３／２３５、１２３／１６９／１７３／２１２／２１３、１２３／１６９／１７５、１２３／１６９／１７５／２１２／２３５、１２３／１６９／２１２／２１３、１２３／１７３／１７５／２１２／２１３／２３５、１２３／２１２／２１３／２３５、１２３／２１２／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／１７５／２１２／２１３、１２３／１６９／１７３、１２３／１６９／２１２／２１３／２３５、１２３／２１３、１２４／１６９、１２４／１６９／１７３／１７５／２１２／２１３、１２４／１６９／１７３／２１２／２１３、１２４／１６９／１７３／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／１７５／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／２１３／２３５、１２４／１７５／２１２／２１３／２３５、１２４／２１２／２１３／２３５、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１／２１４、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１／２１７、１３４／１６９／１７６／２１１／２１５／２１７／２３４、１３４／１６９／１７６／２１１、１３４／１６９／１７８／２１１／２１４／２１７、１３４／１６９／２１１／２１４／２１７、１３４／１６９／２１１／２１７、１３４／１７６／２１１／２１４、１３４／１７６／２１１／２１５、１３４／２１１／２１４、１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１６９／１７３／１７５／２１３／２３５、１６９／１７５／２１２／２１３／２３５、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／１７８／２１１／２１７、１６９／１７６／１７８、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／２１１／２１４、１６９／１７６／２１１／２１４／２１５／２３４、１６９／１７６／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／２１１／２１７、１６９／１７６／２１４／２１５／２１７、１６９／１７８／２１７、１６９／１７８／２３４、１６９／２１１／２１４／２１５、１６９／２１１／２１７、１６９／２１２／２１３、１６９／２１２／２３５、１６９／２１２／２１３／２３５、１６９／２３５、１７１／１７３／２１２／２１３／２３５、１７３／１７５／２１３、１７５／２１３／２３５、１７５／２３５、１７６／１７８／２１１／２１５／２１７、１７６／１７８／２１１／２１７、１７６／２１１／２１４、１７６／２１４／２１７、１７８／２１１／２１４、１７８／２１１／２１７、１７８／２１５、２１１／２３４、２１２／２１３／２３５、および２１３／２３５から選択される残基位置に、配列番号２７０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含むアミノ酸配列を有するイミンレダクターゼポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、改良された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号２２９と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列と、４５、１２７、１３０、１３４、１７４、２０６、２０９、２１２、２１６、２２３、２２７および２７９から選択される残基位置に、配列番号２２９と比較して１つまたはそれを超える残基の相違とを含む操作されたポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、改良された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号２、２３０および／または２７０と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号３〜２６９から選択される。
いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、改良された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号３〜７３から選択される。
いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、改良された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号２７０と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号７５〜２３１から選択される。
いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、改良された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号２２９と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号２３３〜２６８から選択される。
本発明はまた、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置１２／１５／１８／２１／２７、１６９／６３１／６３３、２５９／５２３／５２４／５２５、３０８／６３４／６３５／６３６、３６４／３６５／３６６、３６７／３６８／３６９、３７０／３７１、３７０／３７１／３７２／５３２、３９４／３９６、３９４／３９５／３９６、４０１／４０２、５０５／５０６／５０７、５１２／５１３、５１７／５１８／５１９、５２３／５２４／５２５、５２６／５２７／５２８、５３２／５３４、５３２／７２４／７２５、６３１／６３３、６３１／６３２／６３３、６３４／６３５／６３６、６３５／６３６、６３７／６３８、６３７／６３９、６３７／６３９、６３８／６３９、６４０、６４３／６４４／６４５、６４４／６４５、６４９／６５０／６５１、７００／７０１／７０２および７０３／７０４／７０５に置換を含み、前記位置が、配列番号１を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下の１２Ａ／１５Ｔ／１８Ｇ／２１Ｃ／２７Ａ、１６９Ａ／６３１Ｃ／６３３Ｔ、２５９Ｔ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｔ、３０８Ａ／６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｔ、３６４Ｇ／３６５Ａ／３６６Ａ、３６７Ｇ／３６８Ｇ／３６９Ｔ、３７０Ｇ／３７１Ｇ、３７０Ｇ／３７１Ｃ／３７２Ａ／５３２Ａ、３９４Ｃ／３９６Ｔ、３９４Ａ／３９５Ｇ／３９６Ｇ、４０１Ｇ／４０２Ｇ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ、５０５Ａ／５０６Ｇ／５０７Ｔ、５１２Ｇ／５１３Ｇ、５１７Ａ／５１８Ｔ／５１９Ｔ、５１７Ｃ／５１８Ａ／５１９Ｔ、５２３Ｃ／５２４Ａ／５２５Ｔ、５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｔ、５２６Ａ／５２７Ｇ／５２８Ｔ、５３２Ａ／５３４Ｇ、５３２Ａ／７２４Ｔ／７２５Ａ、６３１Ｃ／６３３Ｔ、６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ、６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｔ、６３５Ｇ／６３６Ｔ、６３５Ｔ／６３６Ｔ、６３７Ａ／６３８Ｇ、６３７Ａ／６３９Ａ、６３７Ｃ／６３９Ａ、６３８Ｔ／６３９Ｔ、６４０Ａ、６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ、６４４Ｔ／６４５Ｇ、６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ｔ、６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ｔ、７００Ｔ／７０１Ｔ／７０２Ｇ、および７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ａから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号１を参照して付番されている。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下のＣ１２Ａ／Ｃ１５Ｔ／Ａ１８Ｇ／Ｔ２１Ｃ／Ｔ２７Ａ、Ｇ１６９Ａ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ｔ、Ｃ２５９Ｔ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｔ、Ｇ３０８Ａ／Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｔ、Ｃ３６４Ｇ／Ｔ３６５Ａ／Ｇ３６６Ａ、Ａ３６７Ｇ／Ｃ３６８Ｇ／Ｃ３６９Ｔ、Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｇ、Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｃ／Ｔ３７２Ａ／Ｇ５３２Ａ、Ｇ３９４Ｃ／Ａ３９６Ｔ、Ｇ３９４Ａ／Ａ３９５Ｇ／Ａ３９６Ｇ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ｇ／Ａ５０７Ｔ、Ａ５１２Ｇ／Ｔ５１３Ｇ、Ｇ５１７Ａ／Ｃ５１８Ｔ／Ａ５１９Ｔ、Ｇ５１７Ｃ／Ｃ５１８Ａ／Ａ５１９Ｔ、Ａ５２３Ｃ／Ｔ５２４Ａ／Ｇ５２５Ｔ、Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｔ、Ｃ５２６Ａ／Ｔ５２７Ｇ／Ｇ５２８Ｔ、Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ、Ｇ５３２Ａ／Ｇ７２４Ｔ／Ｃ７２５Ａ、Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ｔ、Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ、Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｔ、Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｔ、Ａ６３５Ｔ／Ａ６３６Ｔ、Ｇ６３７Ａ／Ｃ６３８Ｇ、Ｇ６３７Ａ／Ｇ６３９Ａ、Ｇ６３７Ｃ／Ｇ６３９Ａ、Ｃ６３８Ｔ／Ｇ６３９Ｔ、Ｇ６４０Ａ、Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ、Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ、Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ｔ、Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ｔ、Ｇ７００Ｔ／Ａ７０１Ｔ／Ｃ７０２ＧおよびＧ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ａから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号１を参照して付番されている。
本発明はまた、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置３６７／３６８／３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／５２３／５２４／５２５／６３４／６３５／６３６／６３９／７０３／７０４／７０５、３６９／３７０／３７１／３７２／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／３７０／３７１／３７２／５０７／５１３／５１９／５２３／５２４／５２５／６３５／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１１／５１２／５１７／５１８／５１９／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１７／５１８／５１９／５２３／５２４／５２５／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／５２３／５２４／５２５／６３４／６３５／６３６／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／６３５／６３８／７０３／７０４／７０５、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３３／６４４／６４５／６４９／６５０／６５１／７００／７０１、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／７０２、４０１／４０２／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４４／６４５／７０２、４０１／４０２／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４３／６４４／６４５／７００／７０１、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３３／６４０／６４４／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３２／５３４／６３３／６４５／７００／７０１、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３２／５３４／６４５／６４９／６５０／６５１、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４３／６４４／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０７／５２６／５３２／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５、４０２／５０７／５２６／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５２６／５２７／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／７０２、５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４３／６４４／６４５、５０７／５２６／５２７／５３４／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、５０７／５２６／５３２／５３４／６４４／６４５／７０２および６３１／６３２／６３３／６４５／７００／７０１に置換を含み、前記位置が、配列番号２６９を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下の３６７Ｇ／３６８Ｇ／３６９Ｔ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｃ／６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｃ／６３９Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／３７０Ｇ／３７１Ｇ／３７２Ｃ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／３７０Ｇ／３７１Ｇ／３７２Ｃ／５０７Ｃ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｃ／６３５Ｔ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１１Ｇ／５１２Ｔ／５１７Ａ／５１８Ｔ／５１９Ｔ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１７Ａ／５１８Ｔ／５１９Ｔ／５２３Ｃ／５２４Ａ／５２５Ｃ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｃ／６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｃ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／６３５Ｔ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７００Ｃ／７０１Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｇ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／７００Ｃ／７０１Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３３Ａ／６４５Ｔ／７００Ｃ／７０１Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ、５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／７０２Ｔ、および６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／７００Ｃ／７０１Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号２６９を参照して付番されている。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下のＡ３６７Ｇ／Ｃ３６８Ｇ／Ｃ３６９Ｔ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｃ／Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｃ／Ｇ６３９Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｇ／Ｔ３７２Ｃ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｇ／Ｔ３７２Ｃ／Ａ５０７Ｃ／Ｔ５１３Ｃ／５１９Ｃ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｃ／Ａ６３５Ｔ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１１Ｇ／Ａ５１２Ｔ／Ｇ５１７Ａ／Ｃ５１８Ｔ／Ａ５１９Ｔ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ｇ５１７Ａ／Ｃ５１８Ｔ／Ａ５１９Ｔ／Ａ５２３Ｃ／Ｔ５２４Ａ／Ｇ５２５Ｃ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｃ／Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｃ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ａ６３５Ｔ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ｃ６３３Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ、Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｃ７０２Ｔ、およびＡ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号２６９を参照して付番されている。
本発明はまた、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置１３３、３７９／３８１、３８８／３８９／３９０、４００／４０１／４０２、４０１／４０２、５２０／５２１／５２２、６１６／６１８、６２５、６２５／６２６／６２７、６３４、６３４／６３５／６３６、６３４／６３６、６４６、６４６／６４７、６４６、６６７、６８０／６８１および８３６／８３７に置換を含み、前記位置が、配列番号２２９を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼをコードする操作されたポリヌクレオチドは、１３３Ａ、３７９Ａ／３８１Ｇ、３８８Ｃ／３８９Ｇ／３９０Ｔ、４００Ｃ／４０１Ｔ／４０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ、５２０Ａ／５２１Ｔ／５２２Ｇ、６１６Ｃ／６１８Ｔ、６２５Ａ、６２５Ａ／６２６Ｇ／６２７Ｔ、６３４Ａ、６３４Ａ／６３５Ｇ／６３６Ｇ、６３４Ｃ／６３６Ｔ、６４６Ａ、６４６Ａ／６４７Ａ、６４６Ｃ、６６７Ａ、６８０Ｔ／６８１Ｔおよび８３６Ｔ／８３７Ｔ、前記位置は、配列番号２２９を参照して付番されている。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドは、以下のＧ１３３Ａ、Ｇ３７９Ａ／Ｃ３８１Ｇ、Ａ３８８Ｃ／Ｃ３８９Ｇ／Ｃ３９０Ｔ、Ａ４００Ｃ／Ｃ４０１Ｔ／Ｃ４０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ、Ｇ５２０Ａ／Ｃ５２１Ｔ／Ａ５２２Ｇ、Ａ６１６Ｃ／Ｇ６１８Ｔ、Ｃ６２５Ａ、Ｃ６２５Ａ／Ａ６２６Ｇ／Ａ６２７Ｔ、Ｇ６３４Ａ、Ｇ６３４Ａ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｇ、Ｇ６３４Ｃ／Ａ６３６Ｔ、Ｇ６４６Ａ、Ｇ６４６Ａ／Ｇ６４７Ａ、Ｇ６４６Ｃ、Ｇ６６７Ａ、Ｃ６８０Ｔ／Ｃ６８１ＴおよびＡ８３６Ｔ／Ｃ８３７Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置は、配列番号２２９を参照して付番されている。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現させる種々の方法で操作する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を制御するための１つまたはそれを超える調節配列が存在する発現ベクターとして提供する。発現ベクターに応じて単離されたポリヌクレオチドをベクターへの挿入前に操作することが望ましいか必要かもしれない。組換えＤＮＡ法を利用したポリヌクレオチドおよび核酸配列の改変技術は、当該分野で周知である。
いくつかの実施形態では、調節配列には、他の配列の中でも、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれる。当該技術分野で公知のように、適切なプロモーターを、使用する宿主細胞に基づいて選択することができる。細菌宿主細胞のために、本出願の核酸構築物の転写の指示に適切なプロモーターには、これらに限定されないが、大腸菌ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１［１９７８］を参照のこと）から得たプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５［１９８３］を参照のこと）が含まれる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ９６／００７８７号を参照のこと）の遺伝子から得たプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、その変異プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが含まれる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８［１９９２］を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、調節配列は、適切な転写終結配列（転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列）である。終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞で機能する任意のターミネーターを、本発明で有用である。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのα−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロム Ｃ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら，前出を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、調節配列は、適切なリーダー配列（宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞で機能する任意のリーダー配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得る。酵母宿主細胞に適切なリーダーは、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが挙げられる。調節配列はまた、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写時に転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）であり得る。最適な宿主細胞で機能する任意のポリアデニル化配列を、本発明で使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列として、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ α−グルコシダーゼの遺伝子に由来するものが挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、当該分野で公知である（例えば、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．，１５：５９８３−５９９０［１９９５］を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向づけるシグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと共に翻訳読み枠中に天然に連結したシグナルペプチドコード領域を固有に含むことができる。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含むことができる。発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に方向づける任意のシグナルペプチドコード領域は、本明細書で提供される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの発現に有用である。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域が挙げられる。さらなるシグナルペプチドは、当該分野で公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７：１０９−１３７［１９９３］を参照のこと）。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとして、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来するものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。得られたポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」またはいくつかの場合「酵素原」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって活性な成熟ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子由来のものが挙げられる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６号を参照のこと）。シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端に隣接し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端に隣接する。
いくつかの実施形態では、制御配列も使用される。これらの配列は、宿主細胞の成長に関連するポリペプチドの発現の制御を促進する。制御系の例は、化学的刺激または物理的刺激（制御化合物の存在が含まれる）に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにする制御系である。原核生物宿主細胞では、適切な制御配列には、これらに限定されないが、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐのオペレーター系が含まれる。酵母宿主細胞では、適切な制御系には、これらに限定されないが、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が含まれる。糸状菌では、適切な制御配列には、これらに限定されないが、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが含まれる。
本発明はまた、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および導入される宿主のタイプに応じて１つまたはそれを超える発現制御領域（プロモーターおよびターミネーターなど）、複製起点などを含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、上記の種々の核酸および調節配列を共に組み合わせて組換え発現ベクターを産生し、この組換え発現ベクターは、１つまたはそれを超える都合の良い制限部位を含み、この制限部位は、かかる部位でのバリアントイミンレダクターゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換が可能である。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列または該ポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を発現に適切なベクター内に挿入することによって発現する。発現ベクターの作製では、コード配列が発現に適切な調節配列と作動可能に連結されるようにコード配列をベクター中に配置する。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができ、且つバリアントイミンレダクターゼポリヌクレオチド配列を発現することができる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターを導入すべき宿主細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは、線状プラスミドまたは閉じた環状プラスミドであり得る。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり、その複製は染色体複製、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体から独立している）である。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含むことができる。いくつかの代替的な実施形態では、、ベクターは、宿主細胞に導入された場合にゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。さらに、単一のベクターまたはプラスミドまたは宿主細胞のゲノムに導入されるべきＤＮＡの全てを共に含む２つまたはそれを超えるベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンを使用することができる。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、形質転換した細胞を容易に選択することができる１つまたはそれを超える選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、その生成物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属耐性、および栄養素要求体に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌選択マーカーの例として、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、あるいは、抗生物質耐性（アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンへの耐性など）を付与するマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞に適切なマーカーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が含まれるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞で用いる選択マーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにその等価物が含まれるが、これらに限定されない。別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、このポリヌクレオチドが宿主細胞中で操作されたイミンレダクターゼ酵素の発現のための１つまたはそれを超える調節配列に作動可能に連結されている、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされたポリペプチドの発現で用いる宿主細胞は、当該分野で周知であり、細菌細胞（大腸菌細胞、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞など）；真菌細胞（酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞［ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８］）など）；昆虫細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞など）；動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞など）；および植物細胞が含まれるが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）である。
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを生成する方法であって、ポリペプチドの発現に適切な条件下で操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書中に記載のように、イミンレダクターゼポリペプチドを単離および／または精製する工程をさらに含む。
上記宿主細胞の適切な培養培地および成長条件は当該分野で周知である。イミンレダクターゼポリヌクレオチド発現のためのポリヌクレオチドを、当該分野で公知の種々の方法によって細胞に導入することができる。技術には、とりわけ、エレクトロポレーション、遺伝子銃粒子衝突、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が含まれる。
本明細書中に開示の特性を有する操作されたイミンレダクターゼを、天然に存在するか操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当該分野で公知であり、且つ本明細書中に記載の変異誘発法および／または定向進化法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）に供することによって得ることができる。例示的な定向進化技術は、変異誘発および／またはＤＮＡシャフリングである（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５号；ＷＯ９７／００７８号；ＷＯ９７／３５９６６号；ＷＯ９８／２７２３０号；ＷＯ００／４２６５１号；ＷＯ０１／７５７６７号、および米国特許第６，５３７，７４６号を参照のこと）。使用することができる他の定向進化手順には、とりわけ、付着伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Ｚｈａｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：２５８−２６１［１９９８］を参照のこと）、変異誘発ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，３：Ｓ１３６−Ｓ１４０［１９９４］を参照のこと）、およびカセット式変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：３５２５−３５２９［１９９６］を参照のこと）が含まれる。
例えば、変異誘発法および定向進化法を、発現、スクリーニング、およびアッセイが可能なバリアントライブラリーを生成するために、ポリヌクレオチドに容易に適用することができる。変異誘発法および定向進化法は当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８３０，７２１号、同第６，１３２，９７０号、同第６，４２０，１７５号、同第６，２７７，６３８号、同第６，３６５，４０８号、同第６，６０２，９８６号、同第７，２８８，３７５号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２９７，０５３号、同第６，５７６，４６７号、同第６，４４４，４６８号、同第５，８１１２３８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２９１，２４２号、同第６，９９５，０１７号、同第６，３９５，５４７号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５０６，６０３号、同第６，４１３，７７４号、同第６，５７３，０９８号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３７２，４９７号、同第７，８６８，１３８号、同第５，８３４，２５２号、同第５，９２８，９０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，０９６，５４８号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３５８，７４２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，３３５，１６０号、同第６，６５３，０７２号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３１９，７１３号、同第６，６１３，５１４号、同第６，４５５，２５３号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，４０６，８５５号、同第６，９４６，２９６号、同第７，５３４，５６４号、同第７，７７６，５９８号、同第５，８３７，４５８号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３０９，８８３号、同第７，１０５，２９７号、同第７，７９５，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，２５１，６７４号、同第６，７１６，６３１号、同第６，５２８，３１１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３７９，９６４号、同第７，１４８，０５４号、同第７，６２９，１７０号、同第７，６２０，５００号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３５８，７４０号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４３６，６７５号、同第６，９６１，６６４号、同第６，５３７，７４６号、同第７，４３０，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４７９，６５２号、同第６，３１９，７１４号、同第６，５２１，４５３号、同第６，３６８，８６１号、同第７，４２１，３４７号、同第７，０５８，５１５号、同第７，０２４，３１２号、同第７，６２０，５０２号、同第７，８５３，４１０号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９０４，２４９号、同第８，３８３，３４６号、同第８，５０４，４９８号、同第８，７６８，８７１号、同第８，７６２，０６６号、同第８，８４９，５７５号および全ての関連非米国対応出願；Ｌｉｎｇら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４：１５７−７８［１９９７］；Ｄａｌｅら、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，５７：３６９−７４［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．，１９：４２３−４６２［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３−１２０１［１９８５］； Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，２３７：１−７［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７ ［１９８４］； Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３１５−３２３［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、 Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．，３：２８４−２９０［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：２５９−２６４［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：４３６−４３８［１９９７］；Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４５０４−４５０９［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３１５−３１９［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１［１９９４］；ＷＯ ９５／２２６２５；ＷＯ ９７／００７８；ＷＯ ９７／３５９６６；ＷＯ ９８／２７２３０；ＷＯ ００／４２６５１；ＷＯ ０１／７５７６７；ＷＯ ２００９／１５２３３６、ＷＯ ２００９／１０２９０１、ＷＯ ２００９／１０２８９９、ＷＯ ２０１１／０３５１０５、ＷＯ ２０１３／１３８３３９、ＷＯ ２０１３／００３２９０、ＷＯ ２０１４／１２０８１９、ＷＯ ２０１４／１２０８２１、ＷＯ ２０１５／０１３４３１５、およびＷＯ ２０１５／０４８５７３を参照のこと（その全てが、本明細書中で参照によって組み込まれる））。
いくつかの実施形態では、変異誘発処理後に得られた酵素クローンを、酵素を規定の温度（または広範な基質にわたる酵素活性の試験などの他のアッセイ条件）に供し、熱処理または他のアッセイ条件後の酵素活性の残存量を測定することによってスクリーニングする。次に、イミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むクローンを配列決定してヌクレオチド配列の変化（存在する場合）を同定し、これを使用して宿主細胞中で酵素を発現させる。発現ライブラリー由来の酵素活性の測定を、当該技術分野において公知の任意の適切な方法（例えば、標準的な生化学技術（ＨＰＬＣ分析など））を使用して行うことができる。
いくつかの実施形態では、変異誘発処理後に得られたクローンを、１つまたはそれを超える望ましい改良された酵素特性（例えば、改良された位置選択性）を有する操作されたイミンレダクターゼについてスクリーニングすることができる。発現ライブラリー由来の酵素活性の測定を、標準的な生化学技術（ＨＰＬＣ分析および／または生成物の誘導体化（分離前または分離後）（例えば、ダンシルクロリドまたはＯＰＡを使用（例えば、Ｙａｅｇａｋｉら、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ３５６（１）：１６３−７０［１９８６］を参照のこと）など）を使用して行うことができる。
操作されたポリペプチドの配列が既知の場合、酵素をコードするポリヌクレオチドを、公知の合成方法にしたがった標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、約１００塩基までのフラグメントを、個別に合成し、次いで、接合して（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）法、またはポリメラーゼ媒介法による）、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、イミンレダクターゼの一部をコードするポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを、自動化合成法で典型的に実施されるように、当該技術分野で知られる通りに（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−６９［１９８１］の古典的なホスホルアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．，３：８０１−０５［１９８４］によって記載される方法）を使用した化学合成によって調製することができる。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを、（例えば、自動ＤＮＡ合成機で）合成し、精製し、アニーリングし、適切なベクター中にライゲーションし、クローニングする。さらに、本質的に任意の核酸を、種々の販売者のうちのいずれかから得ることができる。いくつかの実施形態では、さらなるバリエーションを、欠失、挿入、および／または置換を含むオリゴヌクレオチドを合成し、種々の順序でオリゴヌクレオチドを組み合わせて特性が改良された操作されたイミンレダクターゼを作製することによって作製することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４〜７４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、５７／２１１、８７／１７５、１０３／２１２、１２２、１２３、１２４／１７８、１２４、１３２、１３４、１６９、１７１、１７３、１７５、１７６、１７８／２４２、１７８、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１７、２３４および２３５から選択される残基位置に、配列番号２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成すること；ならびに（ｂ）前記ポリヌクレオチドによってコードされるイミンレダクターゼポリペプチドを発現させることを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４〜７４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、５７Ｔ／２１１Ｌ、８７Ｓ／１７５Ｇ、１０３Ｈ／２１２Ｃ、１２２Ｅ、１２３Ｇ、１２４Ａ／１７８Ｉ、１２４Ｇ、１３２Ｈ／Ｒ、１３４Ｒ、１６９Ｎ／Ｓ、１７１Ｗ、１７３Ｈ／Ｉ、１７５Ｇ／Ｈ、１７６Ｓ、１７８Ｉ／２４２Ｙ、１７８Ｍ、２１１Ｌ／Ｗ、２１２Ｃ／Ｇ／Ｖ、２１３Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｖ、２１４Ｍ、２１５Ｌ／Ｍ、２１７Ｉ／Ｌ、２３４Ｌおよび２３５Ｋから選択される、配列番号２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４〜７４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ａ５７Ｔ／Ｉ２１１Ｌ、Ｐ８７Ｓ／Ｍ１７５Ｇ、Ｒ１０３Ｈ／Ｅ２１２Ｃ、Ｌ１２２Ｅ、Ｔ１２３Ｇ、Ｉ１２４Ａ／Ｖ１７８Ｉ、Ｉ１２４Ｇ、Ｅ１３２Ｈ／Ｒ、Ｔ１３４Ｒ、Ａ１６９Ｎ／Ｓ、Ｙ１７１Ｗ、Ａ１７３Ｈ／Ｉ、Ｍ１７５Ｇ／Ｈ、Ｌ１７６Ｓ、Ｖ１７８Ｉ／Ａ２４２Ｙ、Ｖ１７８Ｍ、Ｉ２１１Ｌ／Ｗ、Ｅ２１２Ｃ／Ｇ／Ｖ、Ａ２１３Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｖ、Ｖ２１４Ｍ、Ｔ２１５Ｌ／Ｍ、Ｗ２１７Ｉ／Ｌ、Ｄ２３４ＬおよびＡ２３５Ｋから選択される、配列番号２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号７６〜２３２の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、１２３／１２４／１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１２３／１２４／１６９／２１２／２１３／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／２１２／２１３／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１２３／１６９／１７３／１７５／２１３／２３５、１２３／１６９／１７３／２１２／２１３、１２３／１６９／１７５、１２３／１６９／１７５／２１２／２３５、１２３／１６９／２１２／２１３、１２３／１７３／１７５／２１２／２１３／２３５、１２３／２１２／２１３／２３５、１２３／２１２／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／１７５／２１２／２１３、１２３／１６９／１７３、１２３／１６９／２１２／２１３／２３５、１２３／２１３、１２４／１６９、１２４／１６９／１７３／１７５／２１２／２１３、１２４／１６９／１７３／２１２／２１３、１２４／１６９／１７３／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／１７５／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／２１３／２３５、１２４／１７５／２１２／２１３／２３５、１２４／２１２／２１３／２３５、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１／２１４、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１／２１７、１３４／１６９／１７６／２１１／２１５／２１７／２３４、１３４／１６９／１７６／２１１、１３４／１６９／１７８／２１１／２１４／２１７、１３４／１６９／２１１／２１４／２１７、１３４／１６９／２１１／２１７、１３４／１７６／２１１／２１４、１３４／１７６／２１１／２１５、１３４／２１１／２１４、１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１６９／１７３／１７５／２１３／２３５、１６９／１７５／２１２／２１３／２３５、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／１７８／２１１／２１７、１６９／１７６／１７８、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／２１１／２１４、１６９／１７６／２１１／２１４／２１５／２３４、１６９／１７６／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／２１１／２１７、１６９／１７６／２１４／２１５／２１７、１６９／１７８／２１７、１６９／１７８／２３４、１６９／２１１／２１４／２１５、１６９／２１１／２１７、１６９／２１２／２１３、１６９／２１２／２３５、１６９／２１２／２１３／２３５、１６９／２３５、１７１／１７３／２１２／２１３／２３５、１７３／１７５／２１３、１７５／２１３／２３５、１７５／２３５、１７６／１７８／２１１／２１５／２１７、１７６／１７８／２１１／２１７、１７６／２１１／２１４、１７６／２１４／２１７、１７８／２１１／２１４、１７８／２１１／２１７、１７８／２１５、２１１／２３４、２１２／２１３／２３５および２１３／２３５から選択される残基位置に、配列番号２７０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号７６〜２３２の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
１２３Ｇ／１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｔ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２３Ｇ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１２Ｇ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１２Ｘ／２１３Ｖ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１３Ｔ、１２４Ｇ／１６９Ｎ、１２４Ａ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｃ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１７５Ｇ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ／２１１Ｌ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１５Ｍ／２１７Ｉ／２３４Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１３４Ｒ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１５Ｍ、１３４Ｒ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ １６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１７Ｌ １６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１５Ｌ／２３４Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１４Ｍ／２１５Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７８Ｉ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７８Ｍ／２３４Ｌ、１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１５Ｌ、１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／２１２Ｃ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２３５Ｋ、１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１３Ｖ、１７５Ｈ／２１３Ｐ／２３５Ｋ、１７５Ｈ／２３５Ｋ、１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１５Ｌ／２１７Ｌ、１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１７６Ｓ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１７８Ｍ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１７８Ｉ／２１５Ｍ、２１１Ｗ／２３４Ｌ、２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、２１３Ｔ／２３５Ｋおよび２１３Ｖ／２３５Ｋから選択される、配列番号２７０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成すること；ならびに（ｂ）前記ポリヌクレオチドによってコードされるイミンレダクターゼポリペプチドを発現させることを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号７６〜２３２の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
Ｔ１２３Ｇ／Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｔ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｘ／Ａ２１３Ｖ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ、￥ Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ２１３Ｔ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ、Ｉ１２４Ａ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｌ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｔ２１５Ｍ／Ｗ２１７Ｉ／Ｄ２３４Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、１３４Ｒ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｔ２１５Ｍ、Ｔ１３４Ｒ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｌ／Ｄ２３４Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｉ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｍ／Ｄ２３４Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ａ２３５Ｋ、Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ、Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｐ／Ａ２３５Ｋ、Ｍ１７５Ｈ／Ａ２３５Ｋ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｔ２１５Ｌ／Ｗ２１７Ｌ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ｖ１７８Ｉ／Ｔ２１５Ｍ、Ｉ２１１Ｗ／Ｄ２３４Ｌ、Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ２１３Ｔ／Ａ２３５ＫおよびＡ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋから選択される、配列番号２７０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号２３４〜２６８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、４５、１２７、１３０、１３４、１７４、２０６、２０９、２１２、２１６、２２３、２２７および２７９から選択される残基位置に、配列番号２３０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号２３４〜２６８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、４５Ｉ、１２７Ｒ、１３０Ｒ、１３４Ｌ／Ｒ、１７４Ｍ、２０６Ｌ、２０９Ｋ／Ｓ、２１２Ｈ／Ｋ／Ｒ、２１６Ｎ／Ｒ／Ｓ、２２３Ｎ、２２７Ｖおよび２７９Ｖから選択される、配列番号２３０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成すること；ならびに（ｂ）前記ポリヌクレオチドによってコードされるイミンレダクターゼポリペプチドを発現させることを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号２３４〜２６８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ｖ４５Ｉ、Ｇ１２７Ｒ、Ｔ１３０Ｒ、Ｔ１３４Ｌ／Ｒ、Ａ１７４Ｍ、Ｍ２０６Ｌ、Ｑ２０９Ｋ／Ｓ、Ｅ２１２Ｈ／Ｋ／Ｒ、Ｇ２１６Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｄ２２３Ｎ、Ａ２２７ＶおよびＤ２７９Ｖから選択される、配列番号２３０と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することを含む。
前記方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、任意選択的に、１個または複数（例えば、最大３個、４個、５個または最大１０個）のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する操作されたイミンレダクターゼをコードする。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞で発現された任意の操作されたイミンレダクターゼ酵素は、タンパク質精製のための周知の技術（とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心、およびクロマトグラフィが含まれる）のうちの任意の１つまたは複数を使用して細胞および／または培養培地から回収することができる。大腸菌などの細菌の溶解および高効率のタンパク質抽出に適切な溶液は、市販されている（例えば、ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＢＴＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）。
イミンレダクターゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィ技術には、とりわけ、逆相クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、およびアフィニティクロマトグラフィが含まれる。特定の酵素の精製条件は、その一部が、正味荷電、疎水性、親水性、分子量、分子の形状などの要因に依存し、その条件は当業者に明らかであろう。
いくつかの実施形態では、親和性技術を使用して、改良されたイミンレダクターゼ酵素を単離することができる。アフィニティクロマトグラフィ精製のために、イミンレダクターゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体生成のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが含まれるが、これらに限定されない）を、イミンレダクターゼポリペプチドまたはそのフラグメントを使用した注射によって免疫化することができる。イミンレダクターゼポリペプチドまたはフラグメントを、側鎖官能基または側鎖官能基に取り付けたリンカーによって適切なキャリア（ＢＳＡなど）に取り付けることができる。いくつかの実施形態では、親和性精製は、イミンレダクターゼによって結合した特異的リガンドまたは色素アフィニティカラム（例えば、欧州特許第０６４１８６２号；およびＳｔｅｌｌｗａｇｅｎ，“Ｄｙｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，”Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｔ ９．２−９．２．１６［２００１］を参照のこと）を使用することができる。
操作されたイミンレダクターゼ酵素を使用する方法
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のイミンレダクターゼは、適切な基質をその生成物に変換するためのプロセスにおいて用途を見出す。
本明細書に提供されるおよび実施例に例示の実施形態では、プロセスで使用することができる種々の範囲の適切な反応条件には、基質負荷、共基質負荷、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、ポリペプチド負荷、および反応時間に伴う条件が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼを使用した基質化合物の生成物化合物への生体触媒変換プロセスの実施のためのさらに適切な反応条件を、本明細書中に提供したガイダンスを考慮して、日常的な実験（濃度、ｐＨ、温度、および溶媒条件の実験反応条件下での目的の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドと基質化合物との接触、ならびに生成物化合物の検出が含まれるが、これらに限定されない）によって容易に最適化することができる。
反応混合物中の基質化合物は、例えば、所望の量の生成物化合物、酵素活性に対する基質濃度の効果、反応条件下における酵素の安定性、および生成物への基質の変換％を考慮して変動させ得る。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５〜約２５ｇ／Ｌ、１〜約２５ｇ／Ｌ、５〜約２５ｇ／Ｌ、約１０〜約２５ｇ／Ｌまたは２０〜約２５ｇ／Ｌの基質化合物負荷を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌまたは少なくとも約３０ｇ／Ｌまたはそれを超える基質化合物負荷を含む。
本明細書中に記載のイミンレダクターゼ媒介プロセスの実施では、操作されたポリペプチドを、精製酵素、部分精製酵素、酵素をコードする遺伝子で形質転換したホールセルの形態で、かかる細胞の細胞抽出物および／または溶解物として、および／または固体支持体上に固定した酵素として反応混合物に添加することができる。操作されたイミンレダクターゼ酵素をコードする遺伝子で形質転換したホールセルまたはその細胞抽出物、溶解物、および単離された酵素を、種々の異なる形態（固体（例えば、凍結乾燥形態、および噴霧乾燥形態など）または半固体（例えば、粗ペースト）が含まれる）で使用することができる。細胞抽出物または細胞溶解物を、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、または熱処理など、およびその後の凍結乾燥前の脱塩手順（例えば、限外濾過および透析など）によって部分精製することができる。任意の酵素調製物（ホールセル調製物が含まれる）を、公知の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドなど）を使用した架橋または固相（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃなど）への固定によって安定化することができる。
操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子を、宿主細胞に個別に形質転換するか、同一宿主細胞に共に形質転換することができる。例えば、いくつかの実施形態では、一方の宿主細胞組を、一方の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換することができ、他方の組を他方の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換することができる。両方の形質転換された細胞の組を、ホールセルの形態またはホールセル由来の溶解物もしくは抽出物の形態にて反応混合物中で共に利用することができる。他の実施形態では、宿主細胞を、複数の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換することができる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドを、分泌されたポリペプチドの形態で発現することができ、分泌されたポリペプチドを含む培養培地を、イミンレダクターゼ反応のために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの改良された活性および／または位置選択性および／または立体選択性により、より低い濃度の操作されたポリペプチドを使用してより高い変換百分率を得ることができるプロセスが得られる。プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、７５％（ｗ／ｗ）、１００％（ｗ／ｗ）、またはそれを超える量の基質化合物負荷の操作されたポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、約０．０１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ；約０．０５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約１ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約２ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ；約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ；約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ；約０．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ；または約０．１ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌで存在する。いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼポリペプチドは、約０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌで存在する。
反応の過程の間、反応混合物のｐＨは変化し得る。反応混合物のｐＨは、所望のｐＨにおいて、または所望のｐＨ範囲内において維持され得る。反応の過程の前および／またはその間、これは、酸または塩基の添加によって行われ得る。あるいは、ｐＨは、緩衝液を使用することによって制御され得る。したがって、いくつかの実施形態では、反応条件は、緩衝液を含む。所望のｐＨ範囲を維持するための適切な緩衝液は当該分野で公知であり、例として、ホウ酸塩、リン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、酢酸塩、トリエタノールアミンおよび２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、反応条件は、緩衝液が存在しない適切な溶媒として水を含む。
プロセスの実施形態では、反応条件は、適切なｐＨを含む。望ましいｐＨまたは望ましいｐＨ範囲を、酸または塩基、適切な緩衝液の使用、または緩衝化と酸もしくは塩基の添加との組み合わせによって維持することができる。反応混合物のｐＨを、一連の反応前および／または反応中に調節することができる。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、ｐＨが約４〜約１０、約５〜約１０、約５〜約９、約６〜約９、約６〜約８の溶液を含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、ｐＨが約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０の溶液を含む。
本明細書中のプロセスの実施形態では、例えば、より高い温度での反応速度の増加および反応期間中の酵素活性を考慮して、反応条件に適切な温度を使用する。したがって、いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃〜約６０℃、約１０℃〜約５５℃、約１５℃〜約６０℃、約２０℃〜約６０℃、約２０℃〜約５５℃、約２５℃〜約５５℃、または約３０℃〜約５０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、または６０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度を、一連の反応を通して特定の温度に維持することができる。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度を、一連の反応中の温度プロフィールに対して調整することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のプロセスを、溶媒中で行う。適切な溶媒には、水、水性緩衝液、有機溶媒、ポリマー溶媒、および／または共溶媒系（一般に、水性溶媒、有機溶媒、および／またはポリマー溶媒を含む）が含まれる。水性溶媒（水または水性共溶媒系）を、ｐＨ緩衝化しても緩衝化しなくてもよい。いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを使用するプロセスを、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、およびトルエンなど）、イオン性溶媒または極性溶媒（例えば、１−エチル−４−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボラート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボラート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、グリセロール、およびポリエチレングリコールなど）を含む水性共溶媒系中で行うことができる。いくつかの実施形態では、共溶媒は、極性溶媒（ポリオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または低級アルコールなど）であり得る。水性共溶媒系の非水性共溶媒成分は、水性成分と混和性を示して単一の液相を得ることができるか、水性成分と部分的混和性または不混和性を示して２種の液相を得ることができる。例示的な水性共溶媒系は、水ならびに有機溶媒、極性溶媒、およびポリオール溶媒から選択される１つまたはそれを超える共溶媒を含むことができる。一般に、水性共溶媒系の共溶媒成分を、反応条件下でイミンレダクターゼ酵素を不利に不活化しないように選択する。適切な共溶媒系を、酵素活性アッセイ（本明細書中に記載のアッセイなど）を利用した候補溶媒系における目的の定義した基質を使用した指定の操作されたイミンレダクターゼ酵素の酵素活性の測定によって容易に同定することができる。
プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、水性共溶媒を含み、この共溶媒は、約１％〜約５０％（ｖ／ｖ）、約１〜約４０％（ｖ／ｖ）、約２％〜約４０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約３０％（ｖ／ｖ）、約１０％〜約３０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約２０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む。プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）、約２０％（ｖ／ｖ）、約２５％（ｖ／ｖ）、約３０％（ｖ／ｖ）、約３５％（ｖ／ｖ）、約４０％（ｖ／ｖ）、約４５％（ｖ／ｖ）、または約５０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む水性共溶媒を含むことができる。
いくつかの実施形態では、反応条件は、反応の安定化または増強のための界面活性剤を含む。界面活性剤は、非イオン性、陽イオン性、陰イオン性、および両親媒性の界面活性剤を含むことができる。例示的な界面活性剤には、制限されない例として、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、ＴＲＩＴＯＮＴＭ Ｘ−１００、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ステアリルアミン、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、オレイルアミド硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｌｅｙｌａｍｉｄｏｓｕｌｆａｔｅ）、ポリオキシエチレン−ソルビタンモノステアラート、ヘキサデシルジメチルアミンなどが含まれる。反応を安定化または増強することができる任意の界面活性剤を使用することができる。反応における界面活性剤の使用濃度は、一般に、０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、特に１〜２０ｍｇ／ｍｌであり得る。
いくつかの実施形態では、反応条件には、反応溶液を混合またはスパージングする場合などに反応溶液中の起泡を軽減または防止するのを補助する消泡剤を含める。消泡剤には、非極性油（例えば、鉱物、シリコーンなど）、極性油（例えば、脂肪酸、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルファートなど）、および疎水性消泡剤（例えば、処理済みシリカ、ポリプロピレンなど）が含まれ、これらのうちのいくつかは界面活性剤としても機能する。例示的な消泡剤には、Ｙ−３０（登録商標）（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ポリ−グリコールコポリマー、オキシ／エトキシル化アルコール、およびポリジメチルシロキサンが含まれる。いくつかの実施形態では、消泡剤は、約０．００１％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、または約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２％（ｖ／ｖ）で存在し得る。いくつかの実施形態では、消泡剤は、反応を促進することが望ましい場合、約０．００１％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、または約５％（ｖ／ｖ）、またはそれを超えて存在し得る。
イミンレダクターゼ反応で使用される反応物の量は、一般に、望ましい生成物の量、同時にイミンレダクターゼ基質の使用量に応じて変化するであろう。当業者は、所望の生成レベルおよび生成規模に合わせてこれらの量を変化させる方法を容易に理解するであろう。
いくつかの実施形態では、反応物の添加順序は重要ではない。反応物は、溶媒（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）に同時に一緒に添加され得るか、またはあるいは反応物の一部は別々に添加され得、一部は異なる時点で一緒に添加され得る。例えば、補因子、補基質および基質は、溶媒に最初に添加され得る。
固体反応物（例えば、酵素、塩など）を、種々の異なる形態（粉末（例えば、凍結乾燥粉末および噴霧乾燥粉末など）、溶液、乳濁液、および懸濁液などが含まれる）で反応物に提供することができる。反応物を、当業者に公知の方法および装置を使用して容易に凍結乾燥または噴霧乾燥させることができる。例えば、タンパク質溶液を、少量ずつ等分して−８０℃で凍結し、次いで、予め冷却した凍結乾燥室に添加し、その後に真空を適用することができる
水性共溶媒系を使用する場合の混合効率を改良するために、イミンレダクターゼおよび共基質を水相に最初に添加し、混合することができる。イミンレダクターゼ基質を添加し、混合し、その後に有機相または基質は有機相に溶解されて、混合されてもよい。あるいは、イミンレダクターゼ基質を、有機相に予め混合後、水相に添加することができる。
一般に、生成物への基質のさらなる変換が反応時間によって有意に変化しなくなる（例えば、基質の１０％未満が変換されるか、または基質の５％未満が変換される）まで、本発明のプロセスを進行させる。いくつかの実施形態では、生成物への基質の完全またはほぼ完全な変換があるまで、反応を進行させる。生成物への基質の変換は、誘導体化を伴ってまたは伴わずに、基質および／または生成物を検出することによって、公知の方法を使用してモニタリングされ得る。適切な分析方法には、ガスクロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、ＭＳなどが含まれる。
プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌまたはそれを超える基質負荷を含み、本方法により、約２４時間またはそれ未満、約１２時間またはそれ未満、約６時間またはそれ未満、または約４時間またはそれ未満で少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれを超えて基質化合物が生成物化合物に変換される。
本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、適切な反応条件下のプロセスにおいて使用される場合、望ましくない生成物よりも少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるジアステレオマー過剰率で、過剰な所望の生成物をもたらす。
操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを使用して基質化合物を生成物化合物に変換するためのプロセスのいくつかのさらなる実施形態では、適切な反応条件は、反応溶液（次いで、これをポリペプチドと接触させる）への初期基質負荷を含み得る。次いで、この反応溶液に、少なくとも約１ｇ／Ｌ／時、少なくとも約２ｇ／Ｌ／時、少なくとも約４ｇ／Ｌ／時、少なくとも約６ｇ／Ｌ／時またはそれを超える速度で時間をわたり連続添加またはバッチ添加として、さらなる基質化合物をさらに補充する。したがって、これらの適切な反応条件にしたがって、ポリペプチドは、少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌの初期基質負荷を有する溶液に添加される。次いで、このポリペプチド添加の後、少なくとも約３０ｇ／Ｌまたはそれを超えるはるかに高い最終基質負荷が達成されるまで、約２ｇ／Ｌ／時、４ｇ／Ｌ／時または６ｇ／Ｌ／時の速度でさらなる基質を溶液に連続添加する。したがって、前記プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌの初期基質負荷を有する溶液にポリペプチドを添加し、続いて、少なくとも約３０ｇ／Ｌまたはそれを超える最終基質負荷が達成されるまで、約２ｇ／Ｌ／時、４ｇ／Ｌ／時または６ｇ／Ｌ／時の速度でさらなる基質を溶液に添加することを含む。この基質補充反応条件は、基質の少なくとも約５％、２５％、５０％、７５％、９０％またはそれを超える変換という生成物への基質の高い変換率を維持しながら、より高い基質負荷を達成することを可能にする。
いくつかの実施形態では、反応条件を補足するために、さらなる反応成分またはさらなる技術を実施した。これらは、酵素の安定化またはその不活化の阻害、生成物阻害の軽減、所望の生成物の形成への反応平衡のシフトのための手段を講じることを含み得る。
さらなる実施形態では、基質化合物の生成物化合物への変換のための上記の任意のプロセスは、以下：生成物化合物の抽出；単離；精製；および結晶化から選択される１つまたはそれを超える工程をさらに含むことができる。上で開示のプロセスによって生成された生体触媒反応混合物からの生成物の抽出、単離、精製、および／または結晶化のための方法、技術、およびプロトコールは、当業者に公知であり、および／または日常的な実験によって評価される。さらに、例示的な方法を、以下の実施例に示す。
本発明の種々の特徴および実施形態を、以下の代表例で例示しており、これは、例示を意図し、本発明の制限を意図しない。
実験
以下の実施例（達成された実験および結果が含まれる）を、例示のみを目的として提供し、本実施例は、本発明を制限すると解釈されない。
以下の実施例では、以下の略語を適用する：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（ユニット）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド／平方インチ）；℃（摂氏）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｂｒｏｔｈ）；ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ；１２ｇ／Ｌバクトトリプトン、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）；ＨＥＰＥＳ（ＨＥＰＥＳ両性イオン緩衝液；４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジンエタンスルホン酸）；ＳＦＰ（振盪フラスコ粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；大腸菌Ｗ３１１０（一般に使用される研究用大腸菌株，Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴから利用可能）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）；ＦＩＯＰＣ（ポジティブコントロールに対する改良の倍数）；マイクロフルイディクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，ＭＡ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）；およびＧｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ（Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。
実施例１
イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドの生成
遺伝子合成および最適化
大腸菌における発現のために、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｉｎｏｓｉｓｐｏｒａ由来の野生型イミンレダクターゼをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１）を、コドン最適化し、そして合成した（配列番号２）。配列番号２の合成遺伝子をｐＣＫ１１０９００ベクター系（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号（これは、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）にクローニングし、続いて、ｌａｃプロモーターの制御下で大腸菌Ｗ３１１０ｆｈｕＡにおいて発現させた。
ハイスループット（ＨＴＰ）成長、発現および溶解物調製：
９６ウェルフォーマットにおいて、単一コロニーを選択し、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭを含有する１８０μＬのＬＢ中、３０℃、２００ｒｐｍ、湿度８５％で成長させた。一晩成長させた後、２０μＬの成長培養物を、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含む３８０μＬのＴＢを含有するディープウェルプレートに移した。各バリアントを２連で成長させて、活性決定のために十分な標的酵素を生成した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍ、湿度８５％で成長させた。培養物の光学密度（ＯＤ６００）が０．６〜０．８に達したら、１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによって、イミンレダクターゼ遺伝子の発現を誘導した。誘導後、成長を１８〜２０時間継続した。成長後、２連の培養物をプールし、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって細胞を回収し、培地を破棄した。使用の準備ができるまで、細胞ペレットを−８０℃で保存した。反応を行う前に、細胞ペレットを、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／Ｌ ＰＭＢＳを含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８を含有する２５０μＬの溶解緩衝液に再懸濁した。マイクロタイタープレートシェーカー上、室温で２時間にわたり中速度で振盪して、プレートを撹拌した。次いで、プレートを４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、下記ＨＴＰアッセイ反応において清澄化上清を使用した。
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）の生成
振盪フラスコ手順を使用して、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）（これは、二次スクリーニングアッセイおよび／または本明細書中に記載の生体触媒プロセスにおける使用に有用である）を生成し得る。酵素の振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）調製は、ＨＴＰアッセイにおいて使用される細胞溶解物と比較して、操作された酵素のより精製された調製物（例えば、総タンパク質の最大３０％）を提供し、より濃縮された酵素溶液の使用も可能にする。培養を開始するために、目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有する大腸菌の単一コロニーを、３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭおよび１％グルコースを含む５０ｍＬのＬＢに接種した。３０℃のインキュベーター中で、２５０ｒｐｍで振盪しながら、培養物を一晩（少なくとも１６時間）成長させた。一晩成長させた後、培養物のＯＤ６００を測定した。１Ｌ振盪フラスコ中で、成長培養物を、３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭを含む２５０ｍＬのＴＢに希釈して、０．２の最終ＯＤ６００とした。ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで、２５０ｍＬの培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで成長させた。１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによって、イミンレダクターゼ遺伝子の発現を誘導し、成長をさらに１８〜２０時間継続した。培養物を、予め秤量された遠心分離ボトルに移すことによって、細胞を回収し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、３０ｍＬの冷５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８緩衝液で洗浄し、４℃、４０００ｒｐｍで２０分間再遠心分離した。上清を破棄し、残りの細胞ペレットを秤量した。溶解前に、細胞を−８０℃で少なくとも２時間凍結維持した。いくつかの実施形態では、使用の準備ができるまで、細胞を−８０℃で保存する。溶解のために、細胞ペレット１ｇ当たり６ｍＬの冷５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０に細胞ペレットを再懸濁した。ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）−Ｍ１１０Ｌ高圧ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して、再懸濁した細胞を溶解した。４℃、１０，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離することによって、細胞残屑を除去した。清澄化溶解物を収集し、−８０℃で凍結し、次いで、当該分野で公知の標準的な方法を使用して凍結乾燥した。凍結清澄化溶解物の凍結乾燥は、粗製の操作されたポリペプチドを含む乾燥振盪フラスコ粉末を提供する。
実施例２
化合物［２］の調製における改良された安定性およびイミンレダクターゼ活性のための、配列番号２由来の操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
配列番号２のイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドを使用して、表２−２のさらなる操作されたポリペプチドバリアントを生成した。当該分野で公知の十分に確立された技術（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを生成した。実施例１に記載されているように、ＨＴＰにおいて、遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成し、可溶性溶解物を生成した。化合物［２］生成に対する活性について、各バリアントを試験した。
９６ウェルフォーマット中、８５％ＨＴＰ溶解物、１６ｍＭオキシム、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、１０％ＤＭＳＯ、１ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５、３ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋および１００ｍＭグルコースを含む総容量１００μＬ／ウェルで、酵素アッセイを行った。以下のものを各ウェルに添加することによって、反応を実施した：（ｉ）１０μＬのＧＤＨ補因子リサイクリングプレミックス（プレミックスは、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８中、１Ｍグルコース、３０ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋、１０ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５を含有する）；（ｉｉ）８５μＬのＨＴＰ清澄化溶解物（実施例１に記載されているように調製したもの）；および（ｉｉｉ）１０μＬのＤＭＳＯ中１６０ｍＭオキシムストック溶液。反応プレートをヒートシールし、３０℃、４００ｒｐｍで２４時間振盪した。０．１％ギ酸を含む１００μＬのＣＨ３ＣＮを添加することによって、反応をクエンチした。次いで、マイクロタイタープレートシェーカー中で、サンプルを室温で振盪し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＬＣ／ＭＳ分析の前に、クエンチしたサンプルを、０．１％ギ酸を含むＣＨ３ＣＮでさらに５倍希釈した。ＬＣ／ＭＳ ４０００ ＱＴＲＡＰの実行パラメータは、以下の表２−１に記載されている。
化合物［２］の分割のためのＬＣ−ＭＳ分析。
ＭＲＭトランジション：４３３．３／３７７を使用してＭＲＭモードでＬＣ−ＭＳによって、実施例２に記載されているように調製したＨＴＰアッセイ混合物を、化合物［２］の形成について分析した。さらなる関連ＬＣ−ＭＳ機器パラメータおよび条件は、以下に示されているとおりであった。
配列番号２によって生成された化合物［２］のピーク面積に対する、バリアントによって生成された化合物［２］のピーク面積として、配列番号２と比較した活性を計算した。表２−２に列挙されているＩＲＥＤバリアントは、出発ポリペプチド（すなわち、配列番号２）と比較して改良されたイミンレダクターゼ活性を有する。有益な変異を決定し、次のラウンドの進化のための主鎖として、最も改良されたバリアントの１つを選択した。
実施例３
化合物［２］の生成における改良された発現およびイミンレダクターゼ活性のための、配列番号２由来の操作されたポリヌクレオチドの進化およびスクリーニング
配列番号２のイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドを使用して、表３−１のさらなる操作されたポリヌクレオチドを生成した。当該分野で公知の十分に確立された技術（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを生成した。実施例１に記載されているように、ＨＴＰにおいて、遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成し、可溶性溶解物を生成した。化合物［２］生成に対する活性について、各バリアントを試験した。
９６ウェルフォーマット中、８５％ＨＴＰ溶解物、１６ｍＭオキシム、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、１０％ＤＭＳＯ、１ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５、３ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋および１００ｍＭグルコースを含む総容量１００μＬ／ウェルで、酵素アッセイを行った。以下のものを各ウェルに添加することによって、反応を実施した：（ｉ）１０μＬのＧＤＨ補因子リサイクリングプレミックス（プレミックスは、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８中、１Ｍグルコース、３０ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋、１０ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５を含有する）；（ｉｉ）８５μＬのＨＴＰ清澄化溶解物（実施例１に記載されているように調製したもの）；および（ｉｉｉ）１０μＬのＤＭＳＯ中１６０ｍＭオキシムストック溶液。反応プレートをヒートシールし、３０℃、４００ｒｐｍで２４時間振盪した。０．１％ギ酸を含む１００μＬのＣＨ３ＣＮを添加することによって、反応をクエンチした。次いで、マイクロタイタープレートシェーカー中で、サンプルを室温で振盪し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＬＣ／ＭＳ分析の前に、クエンチしたサンプルを、０．１％ギ酸を含むＣＨ３ＣＮでさらに５倍希釈した。ＬＣ／ＭＳ ４０００ ＱＴＲＡＰの実行パラメータは、表２−１に記載されている。
実施例４
化合物［２］の生成のための配列番号２６９に対する改良
実施例２および３に記載されているように、バリアントをスクリーニングした後、配列番号２６９のポリヌクレオチド配列を親酵素として選択した。当該分野で公知の十分に確立された技術（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを生成した。実施例１に記載されているように、ＨＴＰにおいて、各遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成し、可溶性溶解物を生成した。
９６ウェルフォーマット中、８５％ＨＴＰ溶解物、１６ｍＭオキシム、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、１０％ＤＭＳＯ、１ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５、３ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋および１００ｍＭグルコースを含む総容量１００μＬ／ウェルで、酵素アッセイを行った。以下のものを各ウェルに添加することによって、反応を実施した：（ｉ）１０μＬのＧＤＨ補因子リサイクリングプレミックス（プレミックスは、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８中、１Ｍグルコース、３０ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋、１０ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５を含有する）／（ｉｉ）８５μＬのＨＴＰ清澄化溶解物（上記のように調製したもの）／および（ｉｉｉ）１０μＬのＤＭＳＯ中１６０ｍＭオキシムストック溶液。反応プレートをヒートシールし、３０℃、４００ｒｐｍで２４時間振盪した。０．１％ギ酸を含む１００μＬのＣＨ３ＣＮを添加することによって、反応をクエンチした。次いで、マイクロタイタープレートシェーカー中で、サンプルを室温で振盪し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＬＣ／ＭＳ分析の前に、クエンチしたサンプルを、０．１％ギ酸を含むＣＨ３ＣＮでさらに５倍希釈した。ＬＣ／ＭＳ ４０００ ＱＴＲＡＰの実行パラメータは、表２−１に記載されている。
配列番号２７０の化合物［２］のピーク面積に対する、バリアントによって生成された化合物［２］のピーク面積として、配列番号２６９によってコードされる酵素（すなわち、配列番号２７０）と比較した活性を計算した。表４−１に列挙されているポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して改良されたイミンレダクターゼ活性を有する。有益な変異を同定し、次のラウンドの進化のための親として、最も改良されたバリアントの１つを選択した。
実施例５
化合物［２］の生成における、配列番号２２９によってコードされるポリペプチドに対する改良
実施例３に記載されているように、バリアントをスクリーニングした後、配列番号２２９のポリヌクレオチド配列を親配列として選択した。当該分野で公知のように十分に確立された技術（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを生成した。実施例１に記載されているのと同様の方法を使用してＨＴＰにおいて、各遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成した。配列番号２２９によってコードされるポリペプチドは、以前の親酵素と比較して有意に高い生成物をもたらしたので、各バリアントの４００μＬの単一培養物のみを成長させた。実施例１に記載されているのと同じ方法を使用して、溶解を行った。
９６ウェルフォーマット中、２０％ＨＴＰ溶解物、１６ｍＭオキシム、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、１０％ＤＭＳＯ、１ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５、３ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋および１００ｍＭグルコースを含む総容量１００μＬ／ウェルで、酵素アッセイを行った。以下のものを各ウェルに添加することによって、反応を実施した：（ｉ）７０μＬのＧＤＨ補因子リサイクリングプレミックス（プレミックスは、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８中、０．１４３Ｍグルコース、４．２８ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ＋、１．４３ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５を含有する）／（ｉｉ）２０μＬのＨＴＰ清澄化溶解物（上記のように調製したもの）／および（ｉｉｉ）１０μＬのＤＭＳＯ中１６０ｍＭオキシムストック溶液。反応プレートをヒートシールし、３０℃、４００ｒｐｍで２４時間振盪した。０．１％ギ酸を含む１００μＬのＣＨ３ＣＮを添加することによって、反応をクエンチした。次いで、マイクロタイタープレートシェーカー中で、サンプルを室温で振盪し、次いで、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＬＣ／ＭＳ分析の前に、クエンチしたサンプルを、０．１％ギ酸を含むＣＨ３ＣＮでさらに１０倍希釈した。ＬＣ／ＭＳ ４０００ ＱＴＲＡＰの実行パラメータは、実施例２に記載されている。
配列番号２２９によってコードされるポリペプチドの生成物ピーク面積に対する、バリアントによって生成された生成物ピーク面積として、配列番号２２９によってコードされるポリペプチドと比較した活性を計算した。表５−１のＩＲＥＤバリアントは、出発ポリペプチドと比較して改良されたイミンレダクターゼ活性を有する。
本出願で引用される刊行物、特許、特許出願および他の文書は全て、個々の各刊行物、特許、特許出願または他の文書が参照により組み込まれることが個々に示されているのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
種々の特定の実施形態を例証および説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに種々の変更を行い得ることが認識されよう。

Claims (29)

  1. 配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、５７／２１１、８７／１７５、１０３／２１２、１２２、１２３、１２４／１７８、１２４、１３２、１３４、１６９、１７１、１７３、１７５、１７６、１７８／２４２、１７８、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１７、２３４および２３５から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換を含み、前記位置が、配列番号２を参照して付番されている、操作されたポリペプチド。
  2. ５７Ｔ／２１１Ｌ、８７Ｓ／１７５Ｇ、１０３Ｈ／２１２Ｃ、１２２Ｅ、１２３Ｇ、１２４Ａ／１７８Ｉ、１２４Ｇ、１３２Ｈ／Ｒ、１３４Ｒ、１６９Ｎ／Ｓ、１７１Ｗ、１７３Ｈ／Ｉ、１７５Ｇ／Ｈ、１７６Ｓ、１７８Ｉ／２４２Ｙ、１７８Ｍ、２１１Ｌ／Ｗ、２１２Ｃ／Ｇ／Ｖ、２１３Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｖ、２１４Ｍ、２１５Ｌ／Ｍ、２１７Ｉ／Ｌ、２３４Ｌおよび２３５Ｋから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置が、配列番号２を参照して付番されている、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  3. Ａ５７Ｔ／Ｉ２１１Ｌ、Ｐ８７Ｓ／Ｍ１７５Ｇ、Ｒ１０３Ｈ／Ｅ２１２Ｃ、Ｌ１２２Ｅ、Ｔ１２３Ｇ、Ｉ１２４Ａ／Ｖ１７８Ｉ、Ｉ１２４Ｇ、Ｅ１３２Ｈ／Ｒ、Ｔ１３４Ｒ、Ａ１６９Ｎ／Ｓ、Ｙ１７１Ｗ、Ａ１７３Ｈ／Ｉ、Ｍ１７５Ｇ／Ｈ、Ｌ１７６Ｓ、Ｖ１７８Ｉ／Ａ２４２Ｙ、Ｖ１７８Ｍ、Ｉ２１１Ｌ／Ｗ、Ｅ２１２Ｃ／Ｇ／Ｖ、Ａ２１３Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｖ、Ｖ２１４Ｍ、Ｔ２１５Ｌ／Ｍ、Ｗ２１７Ｉ／Ｌ、Ｄ２３４ＬおよびＡ２３５Ｋから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置が、配列番号２を参照して付番されている、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  4. 配列番号４〜配列番号７４に記載されている任意の偶数番号の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  5. 配列番号２７０の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、置換セット：
    １２３／１２４／１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１２３／１２４／１６９／２１２／２１３／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／２１２／２１３／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１２３／１６９／１７３／１７５／２１３／２３５、１２３／１６９／１７３／２１２／２１３、１２３／１６９／１７５、１２３／１６９／１７５／２１２／２３５、１２３／１６９／２１２／２１３、１２３／１７３／１７５／２１２／２１３／２３５、１２３／２１２／２１３／２３５、１２３／２１２／２３５、１２３／１６９／１７１／１７３／１７５／２１２／２１３、１２３／１６９／１７３、１２３／１６９／２１２／２１３／２３５、１２３／２１３、１２４／１６９、１２４／１６９／１７３／１７５／２１２／２１３、１２４／１６９／１７３／２１２／２１３、１２４／１６９／１７３／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／１７５／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／２１２／２１３／２３５、１２４／１６９／２１３／２３５、１２４／１７５／２１２／２１３／２３５、１２４／２１２／２１３／２３５、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１／２１４、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１、１３４／１６９／１７６／１７８／２１１／２１７、１３４／１６９／１７６／２１１／２１５／２１７／２３４、１３４／１６９／１７６／２１１、１３４／１６９／１７８／２１１／２１４／２１７、１３４／１６９／２１１／２１４／２１７、１３４／１６９／２１１／２１７、１３４／１７６／２１１／２１４、１３４／１７６／２１１／２１５、１３４／２１１／２１４、１６９／１７１／１７３／２１３／２３５、１６９／１７３／１７５／２１３／２３５、１６９／１７５／２１２／２１３／２３５、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／１７８／２１１／２１７、１６９／１７６／１７８、１６９／１７６／１７８／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／２１１／２１４、１６９／１７６／２１１／２１４／２１５／２３４、１６９／１７６／２１１／２１４／２１７、１６９／１７６／２１１／２１７、１６９／１７６／２１４／２１５／２１７、１６９／１７８／２１７、１６９／１７８／２３４、１６９／２１１／２１４／２１５、１６９／２１１／２１７、１６９／２１２／２１３、１６９／２１２／２３５、１６９／２１２／２１３／２３５、１６９／２３５、１７１／１７３／２１２／２１３／２３５、１７３／１７５／２１３、１７５／２１３／２３５、１７５／２３５、１７６／１７８／２１１／２１５／２１７、１７６／１７８／２１１／２１７、１７６／２１１／２１４、１７６／２１４／２１７、１７８／２１１／２１４、１７８／２１１／２１７、１７８／２１５、２１１／２３４、２１２／２１３／２３５および２１３／２３５から選択される少なくとも２つの置換を含み、前記位置が、配列番号２７０を参照して付番されている、操作されたポリペプチド。
  6. １２３Ｇ／１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｔ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２３Ｇ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１２Ｇ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｈ／１７５Ｈ／２１２Ｘ／２１３Ｖ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ、１２３Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２３Ｇ／２１３Ｔ、１２４Ｇ／１６９Ｎ、１２４Ａ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｃ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７３Ｉ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１７５Ｇ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／１６９Ｎ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１２４Ｇ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ／２１１Ｌ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１５Ｍ／２１７Ｉ／２３４Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１３４Ｒ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１３４Ｒ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１５Ｍ、１３４Ｒ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／１７５Ｇ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ １６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１７Ｌ １６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１５Ｌ／２３４Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１４Ｍ／２１５Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１４Ｍ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７８Ｉ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／１７８Ｍ／２３４Ｌ、１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１４Ｍ／２１５Ｌ、１６９Ｎ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１６９Ｎ／２１２Ｃ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２１２Ｃ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２１２Ｇ／２１３Ｖ、１６９Ｎ／２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１６９Ｎ／２３５Ｋ、１７１Ｖ／１７３Ｉ／２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、１７３Ｉ／１７５Ｈ／２１３Ｖ、１７５Ｈ／２１３Ｐ／２３５Ｋ、１７５Ｈ／２３５Ｋ、１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１５Ｌ／２１７Ｌ、１７６Ｓ／１７８Ｉ／２１１Ｗ／２１７Ｉ、１７６Ｓ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１７６Ｓ／２１４Ｍ／２１７Ｌ、１７８Ｍ／２１１Ｌ／２１４Ｍ、１７８Ｍ／２１１Ｗ／２１７Ｌ、１７８Ｉ／２１５Ｍ、２１１Ｗ／２３４Ｌ、２１２Ｇ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、２１２Ｖ／２１３Ｖ／２３５Ｋ、２１３Ｔ／２３５Ｋおよび２１３Ｖ／２３５Ｋから選択される少なくとも１つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号２７０を参照して付番されている、請求項５に記載の操作されたポリペプチド。
  7. Ｔ１２３Ｇ／Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｔ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｈ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｘ／Ａ２１３Ｖ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１２３Ｇ／Ａ２１３Ｔ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ、Ｉ１２４Ａ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ａ１６９Ｎ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｉ１２４Ｇ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｌ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｔ２１５Ｍ／Ｗ２１７Ｉ／Ｄ２３４Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ｔ１３４Ｒ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、１３４Ｒ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｔ２１５Ｍ、Ｔ１３４Ｒ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｇ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｍ１７５Ｈ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｌ／Ｄ２３４Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｉ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｖ１７８Ｍ／Ｄ２３４Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｖ２１４Ｍ／Ｔ２１５Ｌ、Ａ１６９Ｎ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｃ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ、Ａ１６９Ｎ／Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１６９Ｎ／Ａ２３５Ｋ、Ｙ１７１Ｖ／Ａ１７３Ｉ／Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ１７３Ｉ／Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｖ、Ｍ１７５Ｈ／Ａ２１３Ｐ／Ａ２３５Ｋ、Ｍ１７５Ｈ／Ａ２３５Ｋ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｔ２１５Ｌ／Ｗ２１７Ｌ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ１７８Ｉ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｉ、Ｌ１７６Ｓ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｌ１７６Ｓ／Ｖ２１４Ｍ／Ｗ２１７Ｌ、Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｌ／Ｖ２１４Ｍ、Ｖ１７８Ｍ／Ｉ２１１Ｗ／Ｗ２１７Ｌ、Ｖ１７８Ｉ／Ｔ２１５Ｍ、Ｉ２１１Ｗ／Ｄ２３４Ｌ、Ｅ２１２Ｇ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ｅ２１２Ｖ／Ａ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋ、Ａ２１３Ｔ／Ａ２３５ＫおよびＡ２１３Ｖ／Ａ２３５Ｋから選択される少なくとも１つの置換セットを含み、前記位置が、配列番号２７０を参照して付番されている、請求項５に記載の操作されたポリペプチド。
  8. 配列番号７６〜配列番号２３２に記載されている任意の偶数番号の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の操作されたポリペプチド。
  9. 配列番号２２９の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、４５、１２７、１３０、１３４、１７４、２０６、２０９、２１２、２１６、２２３、２２７および２７９から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換を含み、前記位置が、配列番号２２９を参照して付番されている、操作されたポリペプチド。
  10. ４５Ｉ、１２７Ｒ、１３０Ｒ、１３４Ｌ／Ｒ、１７４Ｍ、２０６Ｌ、２０９Ｋ／Ｓ、２１２Ｈ／Ｋ／Ｒ、２１６Ｎ／Ｒ／Ｓ、２２３Ｎ、２２７Ｖおよび２７９Ｖから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置が、配列番号２２９を参照して付番されている、請求項９に記載の操作されたポリペプチド。
  11. Ｖ４５Ｉ、Ｇ１２７Ｒ、Ｔ１３０Ｒ、Ｔ１３４Ｌ／Ｒ、Ａ１７４Ｍ、Ｍ２０６Ｌ、Ｑ２０９Ｋ／Ｓ、Ｅ２１２Ｈ／Ｋ／Ｒ、Ｇ２１６Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｄ２２３Ｎ、Ａ２２７ＶおよびＤ２７９Ｖから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置が、配列番号２２９を参照して付番されている、請求項９に記載の操作されたポリペプチド。
  12. 配列番号２３４〜配列番号２７０に記載されている任意の偶数番号の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の操作されたポリペプチド。
  13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードする、操作されたポリヌクレオチド。
  14. 配列番号３〜配列番号２６７に記載されている奇数番号の配列を含む、操作されたポリヌクレオチド。
  15. 操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置１２／１５／１８／２１／２７、１６９／６３１／６３３、２５９／５２３／５２４／５２５、３０８／６３４／６３５／６３６、３６４／３６５／３６６、３６７／３６８／３６９、３７０／３７１、３７０／３７１／３７２／５３２、３９４／３９６、３９４／３９５／３９６、４０１／４０２、５０５／５０６／５０７、５１２／５１３、５１７／５１８／５１９、５２３／５２４／５２５、５２６／５２７／５２８、５３２／５３４、５３２／７２４／７２５、６３１／６３３、６３１／６３２／６３３、６３４／６３５／６３６、６３５／６３６、６３７／６３８、６３７／６３９、６３７／６３９、６３８／６３９、６４０、６４３／６４４／６４５、６４４／６４５、６４９／６５０／６５１、７００／７０１／７０２および７０３／７０４／７０５に置換を含み、前記位置が、配列番号１を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチド。
  16. 以下の１２Ａ／１５Ｔ／１８Ｇ／２１Ｃ／２７Ａ、１６９Ａ／６３１Ｃ／６３３Ｔ、２５９Ｔ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｔ、３０８Ａ／６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｔ、３６４Ｇ／３６５Ａ／３６６Ａ、３６７Ｇ／３６８Ｇ／３６９Ｔ、３７０Ｇ／３７１Ｇ、３７０Ｇ／３７１Ｃ／３７２Ａ／５３２Ａ、３９４Ｃ／３９６Ｔ、３９４Ａ／３９５Ｇ／３９６Ｇ、４０１Ｇ／４０２Ｇ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ、５０５Ａ／５０６Ｇ／５０７Ｔ、５１２Ｇ／５１３Ｇ、５１７Ａ／５１８Ｔ／５１９Ｔ、５１７Ｃ／５１８Ａ／５１９Ｔ、５２３Ｃ／５２４Ａ／５２５Ｔ、５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｔ、５２６Ａ／５２７Ｇ／５２８Ｔ、５３２Ａ／５３４Ｇ、５３２Ａ／７２４Ｔ／７２５Ａ、６３１Ｃ／６３３Ｔ、６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ、６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｔ、６３５Ｇ／６３６Ｔ、６３５Ｔ／６３６Ｔ、６３７Ａ／６３８Ｇ、６３７Ａ／６３９Ａ、６３７Ｃ／６３９Ａ、６３８Ｔ／６３９Ｔ、６４０Ａ、６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ、６４４Ｔ／６４５Ｇ、６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ｔ、６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ｔ、７００Ｔ／７０１Ｔ／７０２Ｇおよび７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ａから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置が、配列番号１を参照して付番されている、請求項１５に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
  17. 以下のＣ１２Ａ／Ｃ１５Ｔ／Ａ１８Ｇ／Ｔ２１Ｃ／Ｔ２７Ａ、Ｇ１６９Ａ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ｔ、Ｃ２５９Ｔ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｔ、Ｇ３０８Ａ／Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｔ、Ｃ３６４Ｇ／Ｔ３６５Ａ／Ｇ３６６Ａ、Ａ３６７Ｇ／Ｃ３６８Ｇ／Ｃ３６９Ｔ、Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｇ、Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｃ／Ｔ３７２Ａ／Ｇ５３２Ａ、Ｇ３９４Ｃ／Ａ３９６Ｔ、Ｇ３９４Ａ／Ａ３９５Ｇ／Ａ３９６Ｇ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ｇ／Ａ５０７Ｔ、Ａ５１２Ｇ／Ｔ５１３Ｇ、Ｇ５１７Ａ／Ｃ５１８Ｔ／Ａ５１９Ｔ、Ｇ５１７Ｃ／Ｃ５１８Ａ／Ａ５１９Ｔ、Ａ５２３Ｃ／Ｔ５２４Ａ／Ｇ５２５Ｔ、Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｔ、Ｃ５２６Ａ／Ｔ５２７Ｇ／Ｇ５２８Ｔ、Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ、Ｇ５３２Ａ／Ｇ７２４Ｔ／Ｃ７２５Ａ、Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ｔ、Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ、Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｔ、Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｔ、Ａ６３５Ｔ／Ａ６３６Ｔ、Ｇ６３７Ａ／Ｃ６３８Ｇ、Ｇ６３７Ａ／Ｇ６３９Ａ、Ｇ６３７Ｃ／Ｇ６３９Ａ、Ｃ６３８Ｔ／Ｇ６３９Ｔ、Ｇ６４０Ａ、Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ、Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ、Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ｔ、Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ｔ、Ｇ７００Ｔ／Ａ７０１Ｔ／Ｃ７０２ＧおよびＧ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ａから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置が、配列番号１を参照して付番されている、請求項１５に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
  18. 操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置３６７／３６８／３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／５２３／５２４／５２５／６３４／６３５／６３６／６３９／７０３／７０４／７０５、３６９／３７０／３７１／３７２／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／３７０／３７１／３７２／５０７／５１３／５１９／５２３／５２４／５２５／６３５／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１１／５１２／５１７／５１８／５１９／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１７／５１８／５１９／５２３／５２４／５２５／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／５２３／５２４／５２５／６３４／６３５／６３６／６３８／７０３／７０４／７０５、３６９／５０５／５０６／５０７／５１３／５１９／６３５／６３８／７０３／７０４／７０５、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３３／６４４／６４５／６４９／６５０／６５１／７００／７０１、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０１／４０２／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／７０２、４０１／４０２／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４４／６４５／７０２、４０１／４０２／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４３／６４４／６４５／７００／７０１、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３４／６３３／６４０／６４４／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３２／５３４／６３３／６４５／７００／７０１、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３２／５３４／６４５／６４９／６５０／６５１、４０２／５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４３／６４４／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５０７／５２６／５３２／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５、４０２／５０７／５２６／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、４０２／５２６／５２７／５３４／６３１／６３３／６４０／６４５／７０２、５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、５０５／５０６／５０７／５２６／５２７／５３２／５３４／６３１／６３２／６３３／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、５０５／５０６／５０７／５２６／５３４／６３１／６３２／６３３／６４０／６４３／６４４／６４５、５０７／５２６／５２７／５３４／６３３／６４０／６４５／６４９／６５０／６５１／７０２、５０７／５２６／５３２／５３４／６４４／６４５／７０２、および６３１／６３２／６３３／６４５／７００／７０１に置換を含み、前記位置が、配列番号２６９を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチド。
  19. 以下の３６７Ｇ／３６８Ｇ／３６９Ｔ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｃ／６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｃ／６３９Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／３７０Ｇ／３７１Ｇ／３７２Ｃ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／３７０Ｇ／３７１Ｇ／３７２Ｃ／５０７Ｃ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｃ／６３５Ｔ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１１Ｇ／５１２Ｔ／５１７Ａ／５１８Ｔ／５１９Ｔ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１７Ａ／５１８Ｔ／５１９Ｔ／５２３Ｃ／５２４Ａ／５２５Ｃ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／５２３Ｇ／５２４Ｇ／５２５Ｃ／６３４Ｔ／６３５Ｇ／６３６Ｃ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、３６９Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｔ／５１３Ｃ／５１９Ｃ／６３５Ｔ／６３８Ｔ／７０３Ａ／７０４Ａ／７０５Ｇ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７００Ｃ／７０１Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／７０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｇ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／７００Ｃ／７０１Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３３Ａ／６４５Ｔ／７００Ｃ／７０１Ｔ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ、４０２Ｇ／５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ、４０２Ｇ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、４０２Ｇ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｔ／６３１Ｃ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／７０２Ｔ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ａ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０５Ａ／５０６Ａ／５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３４Ｇ／６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４０Ａ／６４３Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ、５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０７Ｃ／５２６Ｔ／５２７Ｃ／５３４Ｇ／６３３Ａ／６４０Ａ／６４５Ｔ／６４９Ｃ／６５０Ｔ／６５１Ａ／７０２Ｔ、５０７Ｃ／５２６Ｔ／５３２Ａ／５３４Ｔ／６４４Ｔ／６４５Ｇ／７０２Ｔ、および６３１Ｔ／６３２Ｇ／６３３Ｇ／６４５Ｔ／７００Ｃ／７０１Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置が、配列番号２６９を参照して付番されている、請求項１８に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
  20. 以下のＡ３６７Ｇ／Ｃ３６８Ｇ／Ｃ３６９Ｔ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｃ／Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｃ／Ｇ６３９Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｇ／Ｔ３７２Ｃ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ａ３７０Ｇ／Ｔ３７１Ｇ／Ｔ３７２Ｃ／Ａ５０７Ｃ／Ｔ５１３Ｃ／５１９Ｃ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｃ／Ａ６３５Ｔ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１１Ｇ／Ａ５１２Ｔ／Ｇ５１７Ａ／Ｃ５１８Ｔ／Ａ５１９Ｔ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ｇ５１７Ａ／Ｃ５１８Ｔ／Ａ５１９Ｔ／Ａ５２３Ｃ／Ｔ５２４Ａ／Ｇ５２５Ｃ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ａ５２３Ｇ／Ｔ５２４Ｇ／Ｇ５２５Ｃ／Ｇ６３４Ｔ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｃ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ３６９Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｔ／Ｔ５１３Ｃ／Ａ５１９Ｃ／Ａ６３５Ｔ／Ｃ６３８Ｔ／Ｇ７０３Ａ／Ｃ７０４Ａ／Ｃ７０５Ｇ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ｃ６３３Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ、Ｃ４０２Ｇ／Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｃ４０２Ｇ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｃ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｃ７０２Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ａ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ｇ５０５Ａ／Ｃ５０６Ａ／Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｃ５３４Ｇ／Ａ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｇ６４０Ａ／Ａ６４３Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ、Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｔ５２７Ｃ／Ｃ５３４Ｇ／Ｃ６３３Ａ／Ｇ６４０Ａ／Ｃ６４５Ｔ／Ｔ６４９Ｃ／Ｇ６５０Ｔ／Ｇ６５１Ａ／Ｃ７０２Ｔ、Ａ５０７Ｃ／Ｃ５２６Ｔ／Ｇ５３２Ａ／Ｃ５３４Ｔ／Ｃ６４４Ｔ／Ｃ６４５Ｇ／Ｃ７０２Ｔ、およびＡ６３１Ｔ／Ｔ６３２Ｇ／Ｃ６３３Ｇ／Ｃ６４５Ｔ／Ｇ７００Ｃ／Ａ７０１Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置が、配列番号２６９を参照して付番されている、請求項１８に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
  21. 操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、位置１３３、３７９／３８１、３８８／３８９／３９０、４００／４０１／４０２、４０１／４０２、５２０／５２１／５２２、６１６／６１８、６２５、６２５／６２６／６２７、６３４、６３４／６３５／６３６、６３４／６３６、６４６、６４６／６４７、６４６、６６７、６８０／６８１および８３６／８３７に置換を含み、前記位置が、配列番号２２９を参照して付番されている、操作されたポリヌクレオチド。
  22. 以下の１３３Ａ、３７９Ａ／３８１Ｇ、３８８Ｃ／３８９Ｇ／３９０Ｔ、４００Ｃ／４０１Ｔ／４０２Ｔ、４０１Ｇ／４０２Ｇ、５２０Ａ／５２１Ｔ／５２２Ｇ、６１６Ｃ／６１８Ｔ、６２５Ａ、６２５Ａ／６２６Ｇ／６２７Ｔ、６３４Ａ、６３４Ａ／６３５Ｇ／６３６Ｇ、６３４Ｃ／６３６Ｔ、６４６Ａ、６４６Ａ／６４７Ａ、６４６Ｃ、６６７Ａ、６８０Ｔ／６８１Ｔ、および８３６Ｔ／８３７Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置が、配列番号２２９を参照して付番されている、請求項２１に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
  23. 以下のＧ１３３Ａ、Ｇ３７９Ａ／Ｃ３８１Ｇ、Ａ３８８Ｃ／Ｃ３８９Ｇ／Ｃ３９０Ｔ、Ａ４００Ｃ／Ｃ４０１Ｔ／Ｃ４０２Ｔ、Ｃ４０１Ｇ／Ｃ４０２Ｇ、Ｇ５２０Ａ／Ｃ５２１Ｔ／Ａ５２２Ｇ、Ａ６１６Ｃ／Ｇ６１８Ｔ、Ｃ６２５Ａ、Ｃ６２５Ａ／Ａ６２６Ｇ／Ａ６２７Ｔ、Ｇ６３４Ａ、Ｇ６３４Ａ／Ａ６３５Ｇ／Ａ６３６Ｇ、Ｇ６３４Ｃ／Ａ６３６Ｔ、Ｇ６４６Ａ、Ｇ６４６Ａ／Ｇ６４７Ａ、Ｇ６４６Ｃ、Ｇ６６７Ａ、Ｃ６８０Ｔ／Ｃ６８１Ｔ、およびＡ８３６Ｔ／Ｃ８３７Ｔから選択される置換／置換セットの少なくとも１つを含み、前記位置が、配列番号２２９を参照して付番されている、請求項２１に記載の操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
  24. 請求項１３〜２３のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  25. 少なくとも１つの調節配列をさらに含む、請求項２４に記載のベクター。
  26. 請求項２４および／または２５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  27. 請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたポリペプチドを生成する、請求項２６に記載の宿主細胞。
  28. 操作されたイミンまたはオキシムレダクターゼポリペプチドを生成する方法であって、操作されたポリヌクレオチドが発現され、前記操作されたポリペプチドが生成されるような条件下で、請求項２６または２７に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
  29. 前記操作されたポリペプチドを回収する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
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