JPH05222033A - 新規の活性化カルバメートの製造及び使用 - Google Patents
新規の活性化カルバメートの製造及び使用Info
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- JPH05222033A JPH05222033A JP4274884A JP27488492A JPH05222033A JP H05222033 A JPH05222033 A JP H05222033A JP 4274884 A JP4274884 A JP 4274884A JP 27488492 A JP27488492 A JP 27488492A JP H05222033 A JPH05222033 A JP H05222033A
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- C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/6818—Sequencing of polypeptides
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 下記式：
（式中、Ａｒ−ＮＨは複素環式芳香族アミンである）を
有する新規の複素環式カルバメート化合物。 【効果】 上記のカルバメートは、非常に少量の試料中
のフェムトモル量のアミン化合物の検出及び計量を可能
にし且つ分析の際に消費される試料の量を最少にするこ
とができる。
有する新規の複素環式カルバメート化合物。 【効果】 上記のカルバメートは、非常に少量の試料中
のフェムトモル量のアミン化合物の検出及び計量を可能
にし且つ分析の際に消費される試料の量を最少にするこ
とができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ある類の複素環式芳
香族カルバメート化合物並びに少量のアミン官能性化合
物を検出するためのそれらの使用に関する。
香族カルバメート化合物並びに少量のアミン官能性化合
物を検出するためのそれらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】複雑な生物学的試料中のアミノ酸、ペプ
チド及び他のアミン官能性化合物の濃度を測定すること
は生化学者、臨床化学者及び薬剤製造業者にとって相当
に関心があることである。この分析は、例えばピコモル
レベルでの２０種以上のアミノ酸の測定を必要とするこ
とがある。代表的な用途は、合成ペプチド中、ことによ
ると組換えＤＮＡ法によって合成されたものの中に存在
するアミノ酸の定性分析及び定量分析である。この用途
においては、分析者はμｇ以下の量の試料での作業を強
いられることも稀ではない。同様に、例えば新生児の血
液中のアミノ酸についての分析においては、非常に少量
の試料を取り扱うことが要求される。
チド及び他のアミン官能性化合物の濃度を測定すること
は生化学者、臨床化学者及び薬剤製造業者にとって相当
に関心があることである。この分析は、例えばピコモル
レベルでの２０種以上のアミノ酸の測定を必要とするこ
とがある。代表的な用途は、合成ペプチド中、ことによ
ると組換えＤＮＡ法によって合成されたものの中に存在
するアミノ酸の定性分析及び定量分析である。この用途
においては、分析者はμｇ以下の量の試料での作業を強
いられることも稀ではない。同様に、例えば新生児の血
液中のアミノ酸についての分析においては、非常に少量
の試料を取り扱うことが要求される。
【０００３】入手できる試料の潜在的な不足に適応する
ために試料の量を低減させ且つ非アミノ酸成分の存在下
での検出能力をもたらすためには、選択される分析方法
は非常に高度な感度及び検出選択性をもたらさなければ
ならない。化合物についての分析の感度及び選択性は、
その化合物がもたらす装置応答に依存する。代表的な検
出図式は、問題とする化合物の光の吸収若しくは放射
性、又は電気化学的反応性を伴う。
ために試料の量を低減させ且つ非アミノ酸成分の存在下
での検出能力をもたらすためには、選択される分析方法
は非常に高度な感度及び検出選択性をもたらさなければ
ならない。化合物についての分析の感度及び選択性は、
その化合物がもたらす装置応答に依存する。代表的な検
出図式は、問題とする化合物の光の吸収若しくは放射
性、又は電気化学的反応性を伴う。
【０００４】アミノ酸及び（又は）ペプチドの複雑な混
合物の定性及び定量分析は、２０種以上のアミノ酸を含
有し得る試料の分析を伴い、かかる試料においては多く
のアミノ酸の間の構造上の違いが微妙であり、例えばロ
イシンとバリンとの間の違いは脂肪族側鎖中のメチレン
基１個である。従って、それらを区別するためには高度
な選択性が必要である。代表的な混合物は、酸性側基を
持つアミノ酸、塩基性側基を持つアミノ酸及び中性側基
を持つアミノ酸を含有する。
合物の定性及び定量分析は、２０種以上のアミノ酸を含
有し得る試料の分析を伴い、かかる試料においては多く
のアミノ酸の間の構造上の違いが微妙であり、例えばロ
イシンとバリンとの間の違いは脂肪族側鎖中のメチレン
基１個である。従って、それらを区別するためには高度
な選択性が必要である。代表的な混合物は、酸性側基を
持つアミノ酸、塩基性側基を持つアミノ酸及び中性側基
を持つアミノ酸を含有する。
【０００５】ほとんどのアミノ酸の吸収、蛍光性及び電
気化学的応答は非常に弱い。分析の感度を増大させるた
めに通常用いられる方策は、問題とする化合物をその化
合物自体より良好な応答を示す誘導体に転化させること
である。誘導体化剤の選択は分析方法の開発における臨
界的な要素である。誘導体化剤は、誘導体化されたアミ
ノ酸の感度、収量及び安定性を増大させることによって
分析の最終的な感度及び精度に影響を及ぼす。
気化学的応答は非常に弱い。分析の感度を増大させるた
めに通常用いられる方策は、問題とする化合物をその化
合物自体より良好な応答を示す誘導体に転化させること
である。誘導体化剤の選択は分析方法の開発における臨
界的な要素である。誘導体化剤は、誘導体化されたアミ
ノ酸の感度、収量及び安定性を増大させることによって
分析の最終的な感度及び精度に影響を及ぼす。
【０００６】誘導体化法の有用性に重要な基準はいくつ
かある。分析操作は複雑な混合物中に存在する各成分に
ついての正確な定量（量を決定すること、量的に表わす
こと）をもたらさなければならない。これを達成するた
めには、問題とする化合物を互いに分離するだけではな
く、誘導体化操作によって生じる成分からも分離する必
要がある。第２級アミノ酸を含む全ての未誘導体化アミ
ノ酸を定量的に単一の生成物に転化させることが極めて
望ましく、このような転化が良好な定量を促進する。
かある。分析操作は複雑な混合物中に存在する各成分に
ついての正確な定量（量を決定すること、量的に表わす
こと）をもたらさなければならない。これを達成するた
めには、問題とする化合物を互いに分離するだけではな
く、誘導体化操作によって生じる成分からも分離する必
要がある。第２級アミノ酸を含む全ての未誘導体化アミ
ノ酸を定量的に単一の生成物に転化させることが極めて
望ましく、このような転化が良好な定量を促進する。
【０００７】検出選択性はアミノ酸誘導体についての別
の有利な特徴である。未誘導体化アミノ酸は全て低紫外
線（２００〜２２０ｎｍ）範囲において弱い吸収を持つ
が、しかし、かかる波長における検出は、試料混合物中
又はクロマトグラフィーの移動相中に存在する多くの化
合物による妨害を受けやすい。ほぼ２５４ｎｍで吸収が
ある試薬で誘導体化することによってある程度の選択性
がもたらされるが、しかし、生物学的試料中にしばしば
存在する有機芳香族化合物がこの波長において妨害する
ことがある。優れた検出選択性のためには、蛍光性、電
気化学的応答又は可視範囲の吸収による検出を可能にす
る試薬が望ましい。
の有利な特徴である。未誘導体化アミノ酸は全て低紫外
線（２００〜２２０ｎｍ）範囲において弱い吸収を持つ
が、しかし、かかる波長における検出は、試料混合物中
又はクロマトグラフィーの移動相中に存在する多くの化
合物による妨害を受けやすい。ほぼ２５４ｎｍで吸収が
ある試薬で誘導体化することによってある程度の選択性
がもたらされるが、しかし、生物学的試料中にしばしば
存在する有機芳香族化合物がこの波長において妨害する
ことがある。優れた検出選択性のためには、蛍光性、電
気化学的応答又は可視範囲の吸収による検出を可能にす
る試薬が望ましい。
【０００８】最後に、誘導体は有意に分解することなく
分離及び検出を可能にするのに充分に安定であることが
必要である。また、誘導体が非常に安定であれば、必要
な場合にある試料を別の試料を分析することなく再び分
析することができるという点でも好ましい。
分離及び検出を可能にするのに充分に安定であることが
必要である。また、誘導体が非常に安定であれば、必要
な場合にある試料を別の試料を分析することなく再び分
析することができるという点でも好ましい。
【０００９】過去において、高性能液体クロマトグラフ
ィー分離及び電気泳動分離によるアミノ酸の分析を可能
にするために多くの誘導体化方法が開発されてきた。こ
の目的のために通常用いられている方法として、次の４
つのものが挙げられる。 １）ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）／メルカプタン法 ＯＰＡ法は、約１００フェムトモル（ｆｍｏｌ）の程度
の代表的な検出可能レベルでアミノ酸を検出することが
できる。誘導体の生成は迅速である。しかしながら、こ
の方法の重大な難点は、付加物がかなり不安定であり、
検出工程の直前に製造しなければならないということで
ある。追加の問題点は、この試薬は第２級アミノ酸との
誘導体を形成しないということである。 ２）９−フルオレニルメチルクロルホルメート（ＦＭＯ
Ｃ法） ＦＭＯＣ法は、数百ｆｍｏｌの程度の最小検出可能レベ
ルを持つ安定な誘導体を提供する。しかしながら、ＦＭ
ＯＣ法には多くの欠点がある。遊離のトリプトファン及
びシスチンは容易には定量することができない。さら
に、この誘導体化用試薬はそれ自体蛍光性であるため
に、抽出工程によって反応混合物から除去しなければな
らない。また、この試薬をヒスチジンについて用いた場
合には多種の誘導体が生成するということも報告されて
いる。また、この試薬は腐蝕性があり且つ催涙物質であ
るので、取扱うのが危険である。 ３）フェニルイソチオシアネート法（ＰＩＴＣ） ＰＩＴＣ法は、迅速に生成する安定な誘導体を提供す
る。これは第１級アミン及び第２級アミンの両方並びに
シスチンに用いることができる。この方法は検出法とし
て吸収を用い、１ｐｍｏｌの最小検出限度を提供するこ
とができる。しかしながら、この誘導体は蛍光性ではな
く、検出は２５４ｎｍにおいて実施しなければならず、
これは良好な検出選択性をもたらさない。 ４）ダンシル（dansyl）クロリド法 ダンシルクロリド法は、約１．５ｐｍｏｌの程度の最小
検出可能性を持つ安定な誘導体を提供する。これは第２
級アミン及びシスチンを検出することができるが、しか
し多種の誘導体をもたらす。
ィー分離及び電気泳動分離によるアミノ酸の分析を可能
にするために多くの誘導体化方法が開発されてきた。こ
の目的のために通常用いられている方法として、次の４
つのものが挙げられる。 １）ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）／メルカプタン法 ＯＰＡ法は、約１００フェムトモル（ｆｍｏｌ）の程度
の代表的な検出可能レベルでアミノ酸を検出することが
できる。誘導体の生成は迅速である。しかしながら、こ
の方法の重大な難点は、付加物がかなり不安定であり、
検出工程の直前に製造しなければならないということで
ある。追加の問題点は、この試薬は第２級アミノ酸との
誘導体を形成しないということである。 ２）９−フルオレニルメチルクロルホルメート（ＦＭＯ
Ｃ法） ＦＭＯＣ法は、数百ｆｍｏｌの程度の最小検出可能レベ
ルを持つ安定な誘導体を提供する。しかしながら、ＦＭ
ＯＣ法には多くの欠点がある。遊離のトリプトファン及
びシスチンは容易には定量することができない。さら
に、この誘導体化用試薬はそれ自体蛍光性であるため
に、抽出工程によって反応混合物から除去しなければな
らない。また、この試薬をヒスチジンについて用いた場
合には多種の誘導体が生成するということも報告されて
いる。また、この試薬は腐蝕性があり且つ催涙物質であ
るので、取扱うのが危険である。 ３）フェニルイソチオシアネート法（ＰＩＴＣ） ＰＩＴＣ法は、迅速に生成する安定な誘導体を提供す
る。これは第１級アミン及び第２級アミンの両方並びに
シスチンに用いることができる。この方法は検出法とし
て吸収を用い、１ｐｍｏｌの最小検出限度を提供するこ
とができる。しかしながら、この誘導体は蛍光性ではな
く、検出は２５４ｎｍにおいて実施しなければならず、
これは良好な検出選択性をもたらさない。 ４）ダンシル（dansyl）クロリド法 ダンシルクロリド法は、約１．５ｐｍｏｌの程度の最小
検出可能性を持つ安定な誘導体を提供する。これは第２
級アミン及びシスチンを検出することができるが、しか
し多種の誘導体をもたらす。
【００１０】上記の方法に加えて、蛍光性のスクシンイ
ミドカルバメートがアミン、アミノ酸、ペプチド、ホス
フェート及び他の類の化合物用の誘導化剤として用いら
れている。化合物を蛍光性基で標識付けするためにスク
シンイミドカルバメート試薬を用いた場合、約１ｐｍｏ
ｌの検出限度を達成することができる。これらの試薬は
高性能液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィ
ー又は毛細管電気泳動のような近代的な分離技術と組合
せて用いられる｛ニムラら、「アナリティカル・ケミス
トリー（Analytical Chemistry）」第５８巻、第２３７
２〜２３７５頁（１９８６年）｝。スクシンイミジル活
性化カルバメートは、炭素環式芳香族アミンとジ−（Ｎ
−スクシンイミジル）カーボネートとを反応させること
によって製造される｛タケダら、「テトラヘドロン・レ
ターズ（Tetrahedron Letters ）」第２４巻、第４５６
９〜４５７２頁（１９８３年）｝。
ミドカルバメートがアミン、アミノ酸、ペプチド、ホス
フェート及び他の類の化合物用の誘導化剤として用いら
れている。化合物を蛍光性基で標識付けするためにスク
シンイミドカルバメート試薬を用いた場合、約１ｐｍｏ
ｌの検出限度を達成することができる。これらの試薬は
高性能液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィ
ー又は毛細管電気泳動のような近代的な分離技術と組合
せて用いられる｛ニムラら、「アナリティカル・ケミス
トリー（Analytical Chemistry）」第５８巻、第２３７
２〜２３７５頁（１９８６年）｝。スクシンイミジル活
性化カルバメートは、炭素環式芳香族アミンとジ−（Ｎ
−スクシンイミジル）カーボネートとを反応させること
によって製造される｛タケダら、「テトラヘドロン・レ
ターズ（Tetrahedron Letters ）」第２４巻、第４５６
９〜４５７２頁（１９８３年）｝。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】アミン官能性化合物、
特にアミノ酸及び蛋白質の存在を検出し且つその量を正
確に測定するための改良法が必要とされている。非常に
少量の試料中のピコモル以下の量のこれらの化合物の検
出を可能にし且つ分析の際に消費される試料の量を最少
にする方法が必要とされている。
特にアミノ酸及び蛋白質の存在を検出し且つその量を正
確に測定するための改良法が必要とされている。非常に
少量の試料中のピコモル以下の量のこれらの化合物の検
出を可能にし且つ分析の際に消費される試料の量を最少
にする方法が必要とされている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】発明の概要 本発明は、ある類の複素環式芳香族カルバメート化合物
並びに少量のアミン官能性化合物を検出するためのそれ
らの使用に関する。本発明のカルバメート化合物は、次
の一般式を有する：
並びに少量のアミン官能性化合物を検出するためのそれ
らの使用に関する。本発明のカルバメート化合物は、次
の一般式を有する：
【化５】 （ここで、Ａｒ−ＮＨは複素環式芳香族アミンであ
る）。複素環部分は、環構造中に窒素（Ｎ）、酸素
（Ｏ）、硫黄（Ｓ）及びそれらの組合せのような複素原
子を約１〜約４個含有する任意の芳香環構造（例えば環
中に約２５個までの炭素原子を含有するもの）｛多環式
環構造（例えば約５個までの環を持つもの）を含む｝で
あることができる。１個又は多数の複素原子が環構造の
外側に存在していてよく、かかる複素原子には、Ｎ、
Ｏ、Ｓ、ハロゲン（例えば弗素、塩素、臭素）及びそれ
らの組合せが含まれる。複素環部分はアルキル基（例え
ばメチル若しくはエチルのようなＣ1 〜Ｃ6 アルキ
ル）、アルコキシ基（例えばメトキシ若しくはエトキシ
基のようなＣ1 〜Ｃ6 アルコキシ）又は芳香族基（例え
ばフェニル基）のような非反応性電子供与基１個以上で
置換されていてよい。本発明のカルバメート化合物を生
成させるのに有用な複素環式芳香族アミンとしては、例
えば、アミノキノリン、置換アミノキノリン、アミノイ
ソキノリン、アミノクマリン、置換アミノクマリン、ア
ミノアクリジン又は置換アミノアクリジンが挙げられ
る。
る）。複素環部分は、環構造中に窒素（Ｎ）、酸素
（Ｏ）、硫黄（Ｓ）及びそれらの組合せのような複素原
子を約１〜約４個含有する任意の芳香環構造（例えば環
中に約２５個までの炭素原子を含有するもの）｛多環式
環構造（例えば約５個までの環を持つもの）を含む｝で
あることができる。１個又は多数の複素原子が環構造の
外側に存在していてよく、かかる複素原子には、Ｎ、
Ｏ、Ｓ、ハロゲン（例えば弗素、塩素、臭素）及びそれ
らの組合せが含まれる。複素環部分はアルキル基（例え
ばメチル若しくはエチルのようなＣ1 〜Ｃ6 アルキ
ル）、アルコキシ基（例えばメトキシ若しくはエトキシ
基のようなＣ1 〜Ｃ6 アルコキシ）又は芳香族基（例え
ばフェニル基）のような非反応性電子供与基１個以上で
置換されていてよい。本発明のカルバメート化合物を生
成させるのに有用な複素環式芳香族アミンとしては、例
えば、アミノキノリン、置換アミノキノリン、アミノイ
ソキノリン、アミノクマリン、置換アミノクマリン、ア
ミノアクリジン又は置換アミノアクリジンが挙げられ
る。
【００１３】本発明の複素環式芳香族カルバメートの製
造方法もまた本発明の主題の１つである。この方法は一
般的に、複素環式芳香族アミンとジ−（Ｎ−スクシンイ
ミジル）カーボネートとを複素環式芳香族カルバメート
化合物を生成させるのに適した条件下で反応させること
を含む。
造方法もまた本発明の主題の１つである。この方法は一
般的に、複素環式芳香族アミンとジ−（Ｎ−スクシンイ
ミジル）カーボネートとを複素環式芳香族カルバメート
化合物を生成させるのに適した条件下で反応させること
を含む。
【００１４】本発明の複素環式芳香族カルバメート化合
物は、アミン官能性分子を蛍光性基で標識付けするため
に該分子を誘導体化するのに有用である。複素環式芳香
族部分は本来的に蛍光性であり、アミン官能性化合物を
誘導体化して検出するのに用いることができ、得られる
誘導体は蛍光性であり、複素環式芳香族部分の高い蛍光
量子収率のために痕跡量レベルで容易に検出することが
できる。この方法は、非常に少量、例えばフェムトモル
範囲のアミノ酸、ペプチド、他のアミン官能性化合物又
はアミノ化炭水化物（複合炭水化物を含む）を検出して
計量するのに特に有用である。
物は、アミン官能性分子を蛍光性基で標識付けするため
に該分子を誘導体化するのに有用である。複素環式芳香
族部分は本来的に蛍光性であり、アミン官能性化合物を
誘導体化して検出するのに用いることができ、得られる
誘導体は蛍光性であり、複素環式芳香族部分の高い蛍光
量子収率のために痕跡量レベルで容易に検出することが
できる。この方法は、非常に少量、例えばフェムトモル
範囲のアミノ酸、ペプチド、他のアミン官能性化合物又
はアミノ化炭水化物（複合炭水化物を含む）を検出して
計量するのに特に有用である。
【００１５】複素環式芳香族カルバメート化合物を用い
た少量のアミノ酸の検出及び計量方法もまた、本発明の
主題の１つである。この方法においては、問題とするア
ミノ酸を複素環式芳香族カルバメート化合物の第１級又
は第２級アミノ基と反応させて蛍光性誘導体を生成させ
ることによって、問題とするアミノ酸が複素環式芳香族
カルバメート化合物によって誘導体化される。これらの
アミンの誘導体化は、じゃまな副生成物が生成すること
なく各アミノ酸について単一生成物を生じさせる。この
ことは、存在する成分の定量を簡単にする。
た少量のアミノ酸の検出及び計量方法もまた、本発明の
主題の１つである。この方法においては、問題とするア
ミノ酸を複素環式芳香族カルバメート化合物の第１級又
は第２級アミノ基と反応させて蛍光性誘導体を生成させ
ることによって、問題とするアミノ酸が複素環式芳香族
カルバメート化合物によって誘導体化される。これらの
アミンの誘導体化は、じゃまな副生成物が生成すること
なく各アミノ酸について単一生成物を生じさせる。この
ことは、存在する成分の定量を簡単にする。
【００１６】また、本発明の複素環式芳香族カルバメー
ト化合物を用いてペプチド／蛋白質を誘導体化して計量
することもできる。本発明の複素環式芳香族カルバメー
トによる誘導体化を用いたペプチドの検出方法もまた、
本発明の主題の１つである。この方法の代表的な用途に
おいては、蛋白質を酵素によって又は化学的に消化させ
てペプチドを生成させる。次いでこのペプチドをカルバ
メート化合物で誘導体化し、分析してペプチドマップを
得て、それによって蛋白質のプロフィールがもたらされ
る。
ト化合物を用いてペプチド／蛋白質を誘導体化して計量
することもできる。本発明の複素環式芳香族カルバメー
トによる誘導体化を用いたペプチドの検出方法もまた、
本発明の主題の１つである。この方法の代表的な用途に
おいては、蛋白質を酵素によって又は化学的に消化させ
てペプチドを生成させる。次いでこのペプチドをカルバ
メート化合物で誘導体化し、分析してペプチドマップを
得て、それによって蛋白質のプロフィールがもたらされ
る。
【００１７】本発明の複素環式芳香族カルバメート化合
物は、合成するのが容易であり且つ多くのアミン官能性
誘導体化剤より高い蛍光量子収率を示す。従って、多く
の通常の方法と比較して、微量のアミン化合物の検出に
ついてより大きい感度が達成される。この誘導体化プロ
セスは迅速であり且つ効率がよく、毒性の又は危険な副
生成物の取扱いを伴わない。この方法は、フェムトモル
量のアミンを検出して計量することを可能にする。本発
明の複素環式芳香族カルバメート化合物のいくつかは、
標識付け又は誘導体化したアミンの最大放射が、活性化
カルバメートを生成させるために用いられ且つ誘導体化
反応の通常の加水分解生成物でもある遊離の複素環式ア
ミンの最大放射とは有意に異なる波長にあるという追加
的な利点を提供する。従って、誘導体化生成物は出発物
質及び副生成物から区別され得る。
物は、合成するのが容易であり且つ多くのアミン官能性
誘導体化剤より高い蛍光量子収率を示す。従って、多く
の通常の方法と比較して、微量のアミン化合物の検出に
ついてより大きい感度が達成される。この誘導体化プロ
セスは迅速であり且つ効率がよく、毒性の又は危険な副
生成物の取扱いを伴わない。この方法は、フェムトモル
量のアミンを検出して計量することを可能にする。本発
明の複素環式芳香族カルバメート化合物のいくつかは、
標識付け又は誘導体化したアミンの最大放射が、活性化
カルバメートを生成させるために用いられ且つ誘導体化
反応の通常の加水分解生成物でもある遊離の複素環式ア
ミンの最大放射とは有意に異なる波長にあるという追加
的な利点を提供する。従って、誘導体化生成物は出発物
質及び副生成物から区別され得る。
【００１８】発明の具体的な説明 本発明は、アミンの分析及び精製に用いることができる
化学誘導体の生成に有用な複素環式芳香族カルバメート
試薬、並びに複素環式芳香族アミンからの該試薬の合成
に関する。これらは、迅速、安全且つ高収率の化学反応
によって高純度で（即ち蛍光性不純物なしに）製造され
る。本発明の芳香族複素環式カルバメートは、次の一般
式を有する：
化学誘導体の生成に有用な複素環式芳香族カルバメート
試薬、並びに複素環式芳香族アミンからの該試薬の合成
に関する。これらは、迅速、安全且つ高収率の化学反応
によって高純度で（即ち蛍光性不純物なしに）製造され
る。本発明の芳香族複素環式カルバメートは、次の一般
式を有する：
【化６】 （ここで、Ａｒ−ＮＨは複素環式芳香族アミンを表わ
す）。
す）。
【００１９】複素環式芳香族部分は、環構造中に窒素
（Ｎ）、酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ）及びそれらの組合せの
ような複素原子を約１〜約４個含有する任意の芳香環構
造（例えば環中に約２５個までの炭素原子を含有するも
の）｛多環式環構造（例えば約５個までの環を持つも
の）を含む｝であることができる。１個又は多数の複素
原子が環構造の外側に存在していてよく、かかる複素原
子には、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ハロゲン（例えば弗素、塩素及び
臭素）並びにそれらの組合せが含まれる。複素環部分は
アルキル（例えばメチル若しくはエチルのようなＣ1 〜
Ｃ6 アルキル）、アルコキシ（例えばメトキシ若しくは
エトキシ基のようなＣ1 〜Ｃ6 アルコキシ）又は芳香族
基（例えばフェニル）のような非反応性電子供与基で置
換されていてよい。本発明の活性化カルバメート化合物
を生成させるのに有用な複素環式芳香族アミンとして
は、例えば、アミノキノリン、置換アミノキノリン、ア
ミノイソキノリン、アミノクマリン、置換アミノクマリ
ン、アミノアクリジン又は置換アミノアクリジンが挙げ
られる。さらに、複素原子を１個より多く有する化合物
をカルバメート化合物の生成において用いることもでき
る。
（Ｎ）、酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ）及びそれらの組合せの
ような複素原子を約１〜約４個含有する任意の芳香環構
造（例えば環中に約２５個までの炭素原子を含有するも
の）｛多環式環構造（例えば約５個までの環を持つも
の）を含む｝であることができる。１個又は多数の複素
原子が環構造の外側に存在していてよく、かかる複素原
子には、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ハロゲン（例えば弗素、塩素及び
臭素）並びにそれらの組合せが含まれる。複素環部分は
アルキル（例えばメチル若しくはエチルのようなＣ1 〜
Ｃ6 アルキル）、アルコキシ（例えばメトキシ若しくは
エトキシ基のようなＣ1 〜Ｃ6 アルコキシ）又は芳香族
基（例えばフェニル）のような非反応性電子供与基で置
換されていてよい。本発明の活性化カルバメート化合物
を生成させるのに有用な複素環式芳香族アミンとして
は、例えば、アミノキノリン、置換アミノキノリン、ア
ミノイソキノリン、アミノクマリン、置換アミノクマリ
ン、アミノアクリジン又は置換アミノアクリジンが挙げ
られる。さらに、複素原子を１個より多く有する化合物
をカルバメート化合物の生成において用いることもでき
る。
【００２０】本発明の複素環式芳香族カルバメートは、
複素環式芳香族アミンとジ−（Ｎ−スクシンイミジル）
カーボネートとを反応させることによって製造される。
この反応は、下記の反応式（１）で示され、ここで、Ａ
ｒＮＨ2 は複素環式芳香族アミンを表わす。
複素環式芳香族アミンとジ−（Ｎ−スクシンイミジル）
カーボネートとを反応させることによって製造される。
この反応は、下記の反応式（１）で示され、ここで、Ａ
ｒＮＨ2 は複素環式芳香族アミンを表わす。
【化７】 この反応は一般的に、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳ
Ｏ、ＴＨＦ、アセトン、塩化メチレン、クロロホルム又
はジオキサンのような非プロトン系極性溶媒中で実施さ
れる。この溶媒中のアミンの溶液をカーボネートの撹拌
された溶液に所定の時間、好ましくは約０．５〜約４．
０時間かけて添加する。添加が完了した後に、完全な反
応を確実にするために、反応混合物を所定の時間（例え
ば約１〜２４時間）撹拌する。この反応は室温において
進行するが、しかし場合によっては、アミンの添加の間
及び（又は）その後に反応混合物を還流することによっ
て、収率の向上を達成することができる。
Ｏ、ＴＨＦ、アセトン、塩化メチレン、クロロホルム又
はジオキサンのような非プロトン系極性溶媒中で実施さ
れる。この溶媒中のアミンの溶液をカーボネートの撹拌
された溶液に所定の時間、好ましくは約０．５〜約４．
０時間かけて添加する。添加が完了した後に、完全な反
応を確実にするために、反応混合物を所定の時間（例え
ば約１〜２４時間）撹拌する。この反応は室温において
進行するが、しかし場合によっては、アミンの添加の間
及び（又は）その後に反応混合物を還流することによっ
て、収率の向上を達成することができる。
【００２１】本発明の新規の複素環式芳香族カルバメー
トには、以下の化合物が包含される：６−アミノキノリ
ル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、３
−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカ
ルバメート、５−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミジルカルバメート、５−アミノイソキノリル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、６−ア
ミノ−４−メチルキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミジルカルバメート、６−アミノ−２，４−ジメチルキ
ノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメー
ト、６−アミノ−２−フェニルキノリル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメート、６−アミノ−２−メ
トキシ−４−メチルキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミジルカルバメート、４−アミノキナルジン−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミジルカルバメート、９−アミノア
クリジン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメー
ト、２−アミノアクリジン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミジルカルバメート、ルミノール−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミジルカルバメート、イソルミノール−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミジルカルバメート、７−アミノ−４
−メチルクマリン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカ
ルバメート、７−アミノ−４−（トリフルオルメチル）
クマリン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメー
ト、４’−（アミノメチル）フルオレセイン−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミジルカルバメート、５−（アミノメ
チル）フルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジ
ルカルバメート、５−アミノエオシン−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメート、及びカスケードブルー
エチレンジアミン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカ
ルバメート。
トには、以下の化合物が包含される：６−アミノキノリ
ル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、３
−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカ
ルバメート、５−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミジルカルバメート、５−アミノイソキノリル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、６−ア
ミノ−４−メチルキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミジルカルバメート、６−アミノ−２，４−ジメチルキ
ノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメー
ト、６−アミノ−２−フェニルキノリル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメート、６−アミノ−２−メ
トキシ−４−メチルキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミジルカルバメート、４−アミノキナルジン−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミジルカルバメート、９−アミノア
クリジン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメー
ト、２−アミノアクリジン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミジルカルバメート、ルミノール−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミジルカルバメート、イソルミノール−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミジルカルバメート、７−アミノ−４
−メチルクマリン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカ
ルバメート、７−アミノ−４−（トリフルオルメチル）
クマリン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメー
ト、４’−（アミノメチル）フルオレセイン−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミジルカルバメート、５−（アミノメ
チル）フルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジ
ルカルバメート、５−アミノエオシン−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメート、及びカスケードブルー
エチレンジアミン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカ
ルバメート。
【００２２】本発明の方法の１つの具体例においては、
６−アミノキノリンをジ−（Ｎ−スクシンイミジル）カ
ーボネートと反応させて対応するカルバメートである６
−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカ
ルバメートを生成させた。この反応は、次の反応式
（２）で示される。
６−アミノキノリンをジ−（Ｎ−スクシンイミジル）カ
ーボネートと反応させて対応するカルバメートである６
−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカ
ルバメートを生成させた。この反応は、次の反応式
（２）で示される。
【化８】 この化合物の合成は、アミンをアセトニトリル中でカー
ボネートと反応させることによって実施した。アミンの
溶液をカーボネートの撹拌された溶液に添加した。添加
が完了した後に、完全な反応を確実にするために、反応
混合物を所定の時間撹拌した。
ボネートと反応させることによって実施した。アミンの
溶液をカーボネートの撹拌された溶液に添加した。添加
が完了した後に、完全な反応を確実にするために、反応
混合物を所定の時間撹拌した。
【００２３】別の具体例においては、複素環式芳香族ア
ミンからイソシアネート中間体の生成を介して本発明の
カルバメートを合成した。この反応は、危険で毒性のあ
る物質であるホスゲンの使用を必要とする。また、この
経路で生成させたカルバメートは蛍光を発する不純物を
含有することがある。
ミンからイソシアネート中間体の生成を介して本発明の
カルバメートを合成した。この反応は、危険で毒性のあ
る物質であるホスゲンの使用を必要とする。また、この
経路で生成させたカルバメートは蛍光を発する不純物を
含有することがある。
【００２４】本発明の複素環式芳香族カルバメート試薬
は、複雑な混合物中のアミンを誘導体化するために用い
ることができ、該アミンをピコモル以下のレベルで検出
することを可能にする。アミン誘導体の生成は簡単であ
り、この誘導体は、分析者が多くの試料中のアミンの濃
度を測定するのに充分に長い期間安定である。この方法
においては、本発明の複素環式芳香族カルバメート試薬
を用いて、アミンを蛍光性部分で標識付けする。誘導体
を生成させるために用いられる基本的反応を下記の反応
式（３）に示す。カルバメートは迅速にアミンと反応し
て誘導体を生成する。
は、複雑な混合物中のアミンを誘導体化するために用い
ることができ、該アミンをピコモル以下のレベルで検出
することを可能にする。アミン誘導体の生成は簡単であ
り、この誘導体は、分析者が多くの試料中のアミンの濃
度を測定するのに充分に長い期間安定である。この方法
においては、本発明の複素環式芳香族カルバメート試薬
を用いて、アミンを蛍光性部分で標識付けする。誘導体
を生成させるために用いられる基本的反応を下記の反応
式（３）に示す。カルバメートは迅速にアミンと反応し
て誘導体を生成する。
【化９】 この式中、Ｒ’ＮＨ2 は問題とするアミン化合物を表わ
す。
す。
【００２５】本発明の化合物は複素環式芳香族基を有
し、これは、他の誘導体化反応において標識として用い
られる炭素環式芳香族基より高い蛍光量子収率を示す
｛ニムラら、「アナリティカル・ケミストリー」第５８
巻、第２３７２頁（１９８６年）｝。この標識の蛍光量
子収率の増大は、標識付けされたアミンの感度の増大を
もたらす。本方法は、本発明以前には得られていなかっ
たこれら複素環式芳香族カルバメートの製造方法を提供
する。
し、これは、他の誘導体化反応において標識として用い
られる炭素環式芳香族基より高い蛍光量子収率を示す
｛ニムラら、「アナリティカル・ケミストリー」第５８
巻、第２３７２頁（１９８６年）｝。この標識の蛍光量
子収率の増大は、標識付けされたアミンの感度の増大を
もたらす。本方法は、本発明以前には得られていなかっ
たこれら複素環式芳香族カルバメートの製造方法を提供
する。
【００２６】本発明の複素環式芳香族カルバメートの中
のあるものについては、このカルバメートで誘導体化さ
れたアミン化合物の最大放射は、カルバメートを生成さ
せるために用いた遊離の複素環式アミンの最大放射とは
有意に異なる波長にある。例えば、遊離の６−アミノキ
ノリンは５５０ｎｍにおいて最大放射を有し、蛍光性部
分が蛋白質に結合した場合には最大放射は３７５ｎｍに
ある｛ブリネス（Brynes）、ベヴィラクァ（Bevilaqua
）及びグリーン（Green ）、「アナリティカル・バイ
オケミストリー（Analytical Biochemistry ）」第１１
６巻、第４０８頁（１９８１年）｝。
のあるものについては、このカルバメートで誘導体化さ
れたアミン化合物の最大放射は、カルバメートを生成さ
せるために用いた遊離の複素環式アミンの最大放射とは
有意に異なる波長にある。例えば、遊離の６−アミノキ
ノリンは５５０ｎｍにおいて最大放射を有し、蛍光性部
分が蛋白質に結合した場合には最大放射は３７５ｎｍに
ある｛ブリネス（Brynes）、ベヴィラクァ（Bevilaqua
）及びグリーン（Green ）、「アナリティカル・バイ
オケミストリー（Analytical Biochemistry ）」第１１
６巻、第４０８頁（１９８１年）｝。
【００２７】この波長シフトは、標識付けされたアミン
の蛍光検出について非常に重要な意味を持つ。例えば６
−アミノキノリン誘導体を用いて標識付けされたアミン
を検出するためには、モノクロメーターの放射を、例え
ば６−アミノキノリン誘導体化アミンが蛍光を発する３
９５ｎｍに設定する。この波長においては、遊離の６−
アミノキノリンからの蛍光がごく僅かである。観察され
る蛍光が優勢的に誘導体からのものであるので、バック
グラウンドノイズが除去又は低減され、より感度のよい
分析が得られる。
の蛍光検出について非常に重要な意味を持つ。例えば６
−アミノキノリン誘導体を用いて標識付けされたアミン
を検出するためには、モノクロメーターの放射を、例え
ば６−アミノキノリン誘導体化アミンが蛍光を発する３
９５ｎｍに設定する。この波長においては、遊離の６−
アミノキノリンからの蛍光がごく僅かである。観察され
る蛍光が優勢的に誘導体からのものであるので、バック
グラウンドノイズが除去又は低減され、より感度のよい
分析が得られる。
【００２８】これに対して、大抵の標識付け誘導体化剤
については、標識付けされたアミン、未反応誘導体化剤
及び誘導体化剤の加水分解生成物の放射特性が非常に類
似している。このことは、非常に重大な分析上の問題点
を引き起こし得る。何故ならば、蛍光を発し得る未反応
誘導体化剤及び（又は）誘導体化剤の加水分解生成物が
標識付けされたアミンの検出を妨害しないようにするこ
とが必要だからである。本発明のアミンの誘導体化方法
においては、未反応のカルバメート試薬が誘導体生成反
応の条件下で加水分解して遊離のアミンになる。従っ
て、例えば複素環式芳香族カルバメートを生成させるた
めに６−アミノキノリンを用いた場合には、その存在は
標識付けされたアミンの分析を妨害しない。
については、標識付けされたアミン、未反応誘導体化剤
及び誘導体化剤の加水分解生成物の放射特性が非常に類
似している。このことは、非常に重大な分析上の問題点
を引き起こし得る。何故ならば、蛍光を発し得る未反応
誘導体化剤及び（又は）誘導体化剤の加水分解生成物が
標識付けされたアミンの検出を妨害しないようにするこ
とが必要だからである。本発明のアミンの誘導体化方法
においては、未反応のカルバメート試薬が誘導体生成反
応の条件下で加水分解して遊離のアミンになる。従っ
て、例えば複素環式芳香族カルバメートを生成させるた
めに６−アミノキノリンを用いた場合には、その存在は
標識付けされたアミンの分析を妨害しない。
【００２９】この技術によるアミンの分析は、アミンの
最小検出限度の有意の向上をもたらす。本発明の複素環
式芳香族カルバメートを用いた代表的な実験において、
アミンについての最小検出限度は少なくとも１桁改善さ
れ、従って、６−アミノキノリン又は他の複素環式芳香
族アミンから生成されたカルバメートを用いることによ
って、１００フェムトモル（１ｆｍｏｌ＝１０-15 モ
ル）の限度の多くのアミンを検出することができる。カ
ルバメート試薬が非複素環式アミン、例えばナフチルア
ミンから生成されたものである場合、検出限度は０．１
５〜０．３ｎｇ｛１〜２ｐｍｏｌ（１ｐｍｏｌ＝１０
-12 モル）｝だった（ニムラらの前記の文献）。従っ
て、標識としての複素環式芳香族部分を使用することに
よって、少なくとも１桁追加の感度がもたらされる。従
って、分析に必要な試料の量は１桁少ない。
最小検出限度の有意の向上をもたらす。本発明の複素環
式芳香族カルバメートを用いた代表的な実験において、
アミンについての最小検出限度は少なくとも１桁改善さ
れ、従って、６−アミノキノリン又は他の複素環式芳香
族アミンから生成されたカルバメートを用いることによ
って、１００フェムトモル（１ｆｍｏｌ＝１０-15 モ
ル）の限度の多くのアミンを検出することができる。カ
ルバメート試薬が非複素環式アミン、例えばナフチルア
ミンから生成されたものである場合、検出限度は０．１
５〜０．３ｎｇ｛１〜２ｐｍｏｌ（１ｐｍｏｌ＝１０
-12 モル）｝だった（ニムラらの前記の文献）。従っ
て、標識としての複素環式芳香族部分を使用することに
よって、少なくとも１桁追加の感度がもたらされる。従
って、分析に必要な試料の量は１桁少ない。
【００３０】本発明のカルバメート試薬を用いて生成さ
れる誘導体化アミンは数分以内で生成され、溶液状で少
なくとも１４日間の期間安定である。この試薬は、複雑
な試料中のアミンを１００フェムトモルのレベルで検出
して計量することを可能にする。
れる誘導体化アミンは数分以内で生成され、溶液状で少
なくとも１４日間の期間安定である。この試薬は、複雑
な試料中のアミンを１００フェムトモルのレベルで検出
して計量することを可能にする。
【００３１】本発明の組成物及び方法は、アミノ酸を誘
導体化して検出するのに特に有用である。誘導体を生成
させるのに用いられる基本的反応を下記の反応式（４）
に示す。この式中、Ａｒは複素環式部分であり、Ｒ’は
アミノ酸の側鎖を表わす。
導体化して検出するのに特に有用である。誘導体を生成
させるのに用いられる基本的反応を下記の反応式（４）
に示す。この式中、Ａｒは複素環式部分であり、Ｒ’は
アミノ酸の側鎖を表わす。
【化１０】 この目的のためには、下記の複素環式芳香族カルバメー
ト試薬が好ましい：６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメート、３−アミノキノリル
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、５−
アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカル
バメート、５−アミノイソキノリル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミジルカルバメート、６−アミノ−４−メチル
キノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメー
ト、６−アミノ−２，４−ジメチルイソキノリル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、６−アミノ
−２−フェニルキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルカルバメート、６−アミノ−２−メトキシ−４−メ
チルキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバ
メート、４−アミノキナルジン−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミジルカルバメート、及び９−アミノアクリジン−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート。
ト試薬が好ましい：６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメート、３−アミノキノリル
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、５−
アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカル
バメート、５−アミノイソキノリル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミジルカルバメート、６−アミノ−４−メチル
キノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメー
ト、６−アミノ−２，４−ジメチルイソキノリル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、６−アミノ
−２−フェニルキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルカルバメート、６−アミノ−２−メトキシ−４−メ
チルキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバ
メート、４−アミノキナルジン−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミジルカルバメート、及び９−アミノアクリジン−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート。
【００３２】アミノ酸の分析についての一般的な方法
は、次の３つの密接に関連したプロセスから成る。 （１）試料中のアミノ酸の誘導体の生成 （２）アミノ酸誘導体の分離 及び （３）分離した誘導体の検出 第１の工程は一般的に、アミノ酸を含有する混合物と本
発明のカルバメート試薬の１種とを反応させることによ
って実施され、各アミノ酸について別個の化合物を得
る。これらの誘導体は蛍光信号をもたらし、これは分析
の検出段階で検出することができる。本発明の複素環式
化合物は、アミノ酸と迅速に反応して安定で蛍光性の高
い誘導体を生成するので、アミノ酸を誘導体化するのに
特に有用である。
は、次の３つの密接に関連したプロセスから成る。 （１）試料中のアミノ酸の誘導体の生成 （２）アミノ酸誘導体の分離 及び （３）分離した誘導体の検出 第１の工程は一般的に、アミノ酸を含有する混合物と本
発明のカルバメート試薬の１種とを反応させることによ
って実施され、各アミノ酸について別個の化合物を得
る。これらの誘導体は蛍光信号をもたらし、これは分析
の検出段階で検出することができる。本発明の複素環式
化合物は、アミノ酸と迅速に反応して安定で蛍光性の高
い誘導体を生成するので、アミノ酸を誘導体化するのに
特に有用である。
【００３３】分離工程は、誘導体の化学構造の違いに基
づく。誘導体化されたアミノ酸は、先駆体のアミノ酸の
化学構造が異なるのと同じ様式で、互いに異なる。これ
ら誘導体は、検出器の信号が各誘導体の濃度に正確に関
係づけられ得るように分離されなければならない。誘導
体化されたアミノ酸は、クロマトグラフィー、例えば高
性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は毛細管ゾ
ーン電気泳動（ＣＺＥ）によって分離して検出すること
ができる。ＨＰＬＣがこの目的に特に有用である。これ
らの技術は選択性があり且つ非常に少ない試料の量で用
いることができるので、この目的に非常に適している。
また、分離工程は、誘導体化の前にアミノ酸を分離する
ことによって実施することもできる。
づく。誘導体化されたアミノ酸は、先駆体のアミノ酸の
化学構造が異なるのと同じ様式で、互いに異なる。これ
ら誘導体は、検出器の信号が各誘導体の濃度に正確に関
係づけられ得るように分離されなければならない。誘導
体化されたアミノ酸は、クロマトグラフィー、例えば高
性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は毛細管ゾ
ーン電気泳動（ＣＺＥ）によって分離して検出すること
ができる。ＨＰＬＣがこの目的に特に有用である。これ
らの技術は選択性があり且つ非常に少ない試料の量で用
いることができるので、この目的に非常に適している。
また、分離工程は、誘導体化の前にアミノ酸を分離する
ことによって実施することもできる。
【００３４】検出工程は一般的に、吸収又は蛍光検出器
のいずれかを用いて実施される。工程（２）の後にクロ
マトグラフィーのカラムから各誘導体が溶出した時に、
光の吸収又は放射によってその存在及び量を検出する。
分析の感度は各アミノ酸からの信号の強度に依存する。
本発明のカルバメート化合物は、高い量子吸収を示し、
それによってフェムトモル量の検出を可能にする。図１
に、６−アミノキノリンを用いた誘導体の代表的なＨＰ
ＬＣ分離を示す。図２に、３−アミノキノリン、９−ア
ミノアクリジン及び７−アミノ−４−メチルクマリンを
用いた他の代表的な誘導体の分離を示す。
のいずれかを用いて実施される。工程（２）の後にクロ
マトグラフィーのカラムから各誘導体が溶出した時に、
光の吸収又は放射によってその存在及び量を検出する。
分析の感度は各アミノ酸からの信号の強度に依存する。
本発明のカルバメート化合物は、高い量子吸収を示し、
それによってフェムトモル量の検出を可能にする。図１
に、６−アミノキノリンを用いた誘導体の代表的なＨＰ
ＬＣ分離を示す。図２に、３−アミノキノリン、９−ア
ミノアクリジン及び７−アミノ−４−メチルクマリンを
用いた他の代表的な誘導体の分離を示す。
【００３５】本発明の方法の別の具体例においては、複
素環式芳香族カルバメート試薬を用いて、ペプチドを蛍
光性部分で標識付けする。基本反応は、前記の反応式
（４）に示したアミノ酸誘導体を生成させるために用い
るものと同じである。カルバメートは迅速にペプチドと
反応して誘導体を生成する。試薬がペプチドと反応した
時に、複素環式芳香族部分が、前記したように、最終的
に検出される化合物の一部となる。この技術によるペプ
チド及び（又は）蛋白質の分析は、ペプチドの最小検出
限度の有意の改善をもたらす。代表的な実験において、
ペプチドについての最小検出限度は１桁改善される。し
かして、前記の複素環式芳香族アミンから生成させたカ
ルバメート試薬を用いることによって、１００フェルト
モルの限度を検出することができる。
素環式芳香族カルバメート試薬を用いて、ペプチドを蛍
光性部分で標識付けする。基本反応は、前記の反応式
（４）に示したアミノ酸誘導体を生成させるために用い
るものと同じである。カルバメートは迅速にペプチドと
反応して誘導体を生成する。試薬がペプチドと反応した
時に、複素環式芳香族部分が、前記したように、最終的
に検出される化合物の一部となる。この技術によるペプ
チド及び（又は）蛋白質の分析は、ペプチドの最小検出
限度の有意の改善をもたらす。代表的な実験において、
ペプチドについての最小検出限度は１桁改善される。し
かして、前記の複素環式芳香族アミンから生成させたカ
ルバメート試薬を用いることによって、１００フェルト
モルの限度を検出することができる。
【００３６】本発明の複素環式芳香族カルバメートは、
ペプチド／蛋白質のマッピングに有用である。ペプチド
マッピングは、蛋白質の構造の特徴付けに用いられる有
力な技術である。この方法においては、蛋白質を酵素に
よって又は化学的に消化させて、アミノ酸より鎖が短い
ペプチドを生成させる。この開裂生成物は元の蛋白質と
正確に同じ序列でアミノ酸を含有する。蛋白質を開裂す
ることの利点は、研究がより容易であるより小さいセグ
メントを分析者に提供することである。蛋白質を開裂す
るためには、様々な酵素及び試薬を用いることができ、
それらはそれぞれ異なるペプチド集合体をもたらす。次
いで、これらの消化物を分析して、蛋白質の独特のプロ
フィールである『ペプチドマップ』を得る。ペプチドマ
ッピングデータを参照用クロマトグラムと比較して、問
題とする蛋白質を同定し、又は未知の蛋白質の構造決
定、例えば突然変異的な変種の決定を補助する。
ペプチド／蛋白質のマッピングに有用である。ペプチド
マッピングは、蛋白質の構造の特徴付けに用いられる有
力な技術である。この方法においては、蛋白質を酵素に
よって又は化学的に消化させて、アミノ酸より鎖が短い
ペプチドを生成させる。この開裂生成物は元の蛋白質と
正確に同じ序列でアミノ酸を含有する。蛋白質を開裂す
ることの利点は、研究がより容易であるより小さいセグ
メントを分析者に提供することである。蛋白質を開裂す
るためには、様々な酵素及び試薬を用いることができ、
それらはそれぞれ異なるペプチド集合体をもたらす。次
いで、これらの消化物を分析して、蛋白質の独特のプロ
フィールである『ペプチドマップ』を得る。ペプチドマ
ッピングデータを参照用クロマトグラムと比較して、問
題とする蛋白質を同定し、又は未知の蛋白質の構造決
定、例えば突然変異的な変種の決定を補助する。
【００３７】ペプチド消化を分析するためには、一般的
に逆相ＨＰＬＣが用いられる。ある種のペプチド消化に
おいては、２０〜１５０種の異なるペプチドがあること
があり、それらをそれぞれ分離して定量しなければなら
ない。多くの場合、入手できる試料は非常に少量であ
る。例えば、分析者は有機体から単離した蛋白質又は組
換えＤＮＡ技術によって合成した蛋白質の構造を決定し
ていることがある。代表的には、蛋白質消化はナノモル
量で研究される。多くの蛋白質の不足及び費用のため
に、できるだけ少量の試料を用いることが非常に望まし
い。
に逆相ＨＰＬＣが用いられる。ある種のペプチド消化に
おいては、２０〜１５０種の異なるペプチドがあること
があり、それらをそれぞれ分離して定量しなければなら
ない。多くの場合、入手できる試料は非常に少量であ
る。例えば、分析者は有機体から単離した蛋白質又は組
換えＤＮＡ技術によって合成した蛋白質の構造を決定し
ていることがある。代表的には、蛋白質消化はナノモル
量で研究される。多くの蛋白質の不足及び費用のため
に、できるだけ少量の試料を用いることが非常に望まし
い。
【００３８】蛋白質のマッピングの作業には一般的に吸
収検出が用いられる。この目的のためにしばしば用いら
れる検出法は、ａ）単一波長検出器を用いた２１０〜２
１５ｎｍにおける検出、及びｂ）フォトダイオード配列
（ＰＤＡ）検出器を用いた広域スペクトル検出の２つで
ある。第１の方法においては、全てのペプチドがその波
長において吸収があり、従って、使用者は、カラムから
溶出する全てのペプチドが検出されるのを確実にするこ
とができる。しかしながら、この技術の１つの難点は、
広範な化合物がこのスペクトル領域で吸収があるという
ことであり、観察される信号がペプチドからのものだけ
であることを確実にするためには、全ての試薬、溶離
剤、ガラス器具等が完全にきれいであるのを確実にする
ために極度の注意を払わなければならないということで
ある。第２の方法においては、ＰＤＡ検出器が特定の時
間間隔で溶離剤のスペクトルを収集する（例えば２００
〜３５０ｎｍの範囲のスペクトルが毎秒収集される）。
これは単一の波長より多くの情報をもたらし、しかし
て、同じ保持時間で溶出することがあるペプチドを区別
するのを助けることができる。
収検出が用いられる。この目的のためにしばしば用いら
れる検出法は、ａ）単一波長検出器を用いた２１０〜２
１５ｎｍにおける検出、及びｂ）フォトダイオード配列
（ＰＤＡ）検出器を用いた広域スペクトル検出の２つで
ある。第１の方法においては、全てのペプチドがその波
長において吸収があり、従って、使用者は、カラムから
溶出する全てのペプチドが検出されるのを確実にするこ
とができる。しかしながら、この技術の１つの難点は、
広範な化合物がこのスペクトル領域で吸収があるという
ことであり、観察される信号がペプチドからのものだけ
であることを確実にするためには、全ての試薬、溶離
剤、ガラス器具等が完全にきれいであるのを確実にする
ために極度の注意を払わなければならないということで
ある。第２の方法においては、ＰＤＡ検出器が特定の時
間間隔で溶離剤のスペクトルを収集する（例えば２００
〜３５０ｎｍの範囲のスペクトルが毎秒収集される）。
これは単一の波長より多くの情報をもたらし、しかし
て、同じ保持時間で溶出することがあるペプチドを区別
するのを助けることができる。
【００３９】ペプチドマッピングにはしばしば、消化さ
れた蛋白質中の痕跡量のペプチドの定性及び定量分析が
伴う。本発明の方法における複雑な混合物中のペプチド
の同定及び定量は、ａ）問題とするペプチドを元々の化
合物より強い吸収又は蛍光を示す複素環式芳香族カルバ
メートで標識付けし、ｂ）誘導体化された試料を分離
し、そしてｃ）誘導体化されたペプチドを吸収又は蛍光
技術によって検出することから成る３段階法によって果
たされる。誘導体の分離条件は大抵の場合、出発化合物
の分離とは著しく異なる。同様に、分離の有効性は検出
プロセスに重大な影響を持つ。本発明の複素環式芳香族
カルバメートを使用することによって、ナノグラム量の
蛋白質を用いる用途に採用できるマッピング法が提供さ
れる。さらに、本発明の方法は、組織、尿、血液及び唾
液のような生物学的試料中のペプチドを検出するための
既知の方法の感度を高めるための手段を提供する。
れた蛋白質中の痕跡量のペプチドの定性及び定量分析が
伴う。本発明の方法における複雑な混合物中のペプチド
の同定及び定量は、ａ）問題とするペプチドを元々の化
合物より強い吸収又は蛍光を示す複素環式芳香族カルバ
メートで標識付けし、ｂ）誘導体化された試料を分離
し、そしてｃ）誘導体化されたペプチドを吸収又は蛍光
技術によって検出することから成る３段階法によって果
たされる。誘導体の分離条件は大抵の場合、出発化合物
の分離とは著しく異なる。同様に、分離の有効性は検出
プロセスに重大な影響を持つ。本発明の複素環式芳香族
カルバメートを使用することによって、ナノグラム量の
蛋白質を用いる用途に採用できるマッピング法が提供さ
れる。さらに、本発明の方法は、組織、尿、血液及び唾
液のような生物学的試料中のペプチドを検出するための
既知の方法の感度を高めるための手段を提供する。
【００４０】
【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに例示す
る。
る。
【００４１】例１：６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメートの合成 次の手順に従って６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメートを合成した。アセトニト
リル｛ベイカー（Baker ）分析ＨＰＬＣ等級｝５００ミ
リリットルを蒸留して存在する水を共沸除去した。最初
の５０ミリリットルのアセトニトリルは廃棄した。アセ
トニトリル５０ミリリットル中に６−アミノキノリン
｛アルドリッチ・ケミカル（Aldrich Chemical）社｝
１．５ｇ（１０ミリモル）を溶解させ、滴下漏斗に入れ
た。ジ−（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート（ＤＳ
Ｃ）｛フルカ・ケミカル（Fluka Chemical）社｝３ｇ
（１２ミリモル）をアセトニトリル１００ミリリットル
中に溶解させ、撹拌しながら加熱還流した。この還流溶
液にアミノキノリン溶液を約３０分かけて滴下した。添
加が完了した後に、この溶液をさらに３０分間還流し、
次いで反応混合物からアセトニトリルを約３０ミリリッ
トル留去した。この溶液を放置冷却し、アミノキノリル
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートの種晶
を入れた。２４時間後にこの溶液をデカンテーション
し、結晶をろ過し、少量ずつ合計１００ミリリットルの
アセトニトリルで洗浄して、粗製生成物１．９５ｇを得
た（収率６６％）。母液は追加分の生成物をＤＳＣ、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド及び１，３−ジ−（６−ア
ミノキノリル）尿素と共に含有していた。この生成物
を、粗製物質を熱いアセトニトリル（生成物１ｇ当たり
に１００ミリリットル）中に溶解させ、この溶液を０．
５μｍのフィルターに通してろ過し、ろ液に６−アミノ
キノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメー
トの種晶を入れることによって再結晶した。生成物７２
４ｍｇが得られた（全体から見た収率２４％）。
シスクシンイミジルカルバメートの合成 次の手順に従って６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメートを合成した。アセトニト
リル｛ベイカー（Baker ）分析ＨＰＬＣ等級｝５００ミ
リリットルを蒸留して存在する水を共沸除去した。最初
の５０ミリリットルのアセトニトリルは廃棄した。アセ
トニトリル５０ミリリットル中に６−アミノキノリン
｛アルドリッチ・ケミカル（Aldrich Chemical）社｝
１．５ｇ（１０ミリモル）を溶解させ、滴下漏斗に入れ
た。ジ−（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート（ＤＳ
Ｃ）｛フルカ・ケミカル（Fluka Chemical）社｝３ｇ
（１２ミリモル）をアセトニトリル１００ミリリットル
中に溶解させ、撹拌しながら加熱還流した。この還流溶
液にアミノキノリン溶液を約３０分かけて滴下した。添
加が完了した後に、この溶液をさらに３０分間還流し、
次いで反応混合物からアセトニトリルを約３０ミリリッ
トル留去した。この溶液を放置冷却し、アミノキノリル
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートの種晶
を入れた。２４時間後にこの溶液をデカンテーション
し、結晶をろ過し、少量ずつ合計１００ミリリットルの
アセトニトリルで洗浄して、粗製生成物１．９５ｇを得
た（収率６６％）。母液は追加分の生成物をＤＳＣ、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド及び１，３−ジ−（６−ア
ミノキノリル）尿素と共に含有していた。この生成物
を、粗製物質を熱いアセトニトリル（生成物１ｇ当たり
に１００ミリリットル）中に溶解させ、この溶液を０．
５μｍのフィルターに通してろ過し、ろ液に６−アミノ
キノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメー
トの種晶を入れることによって再結晶した。生成物７２
４ｍｇが得られた（全体から見た収率２４％）。
【００４２】例２：３−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメートの合成 次のことを除いて例１に記載した手順に従って３−アミ
ノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメ
ートを合成した。６−アミノキノリンの代わりに３−ア
ミノキノリンを用い、アミン溶液をカーボネート溶液に
３時間かけて添加し、反応を室温において実施した。ア
ミンの添加が完了した後に、回転式蒸発器によってアセ
トニトリルを２０％除去した。得られた濃厚溶液を次い
で冷凍して固形生成物を沈殿させた。
シスクシンイミジルカルバメートの合成 次のことを除いて例１に記載した手順に従って３−アミ
ノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメ
ートを合成した。６−アミノキノリンの代わりに３−ア
ミノキノリンを用い、アミン溶液をカーボネート溶液に
３時間かけて添加し、反応を室温において実施した。ア
ミンの添加が完了した後に、回転式蒸発器によってアセ
トニトリルを２０％除去した。得られた濃厚溶液を次い
で冷凍して固形生成物を沈殿させた。
【００４３】例３：９−アミノアクリジン−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミジルカルバメートの合成 次のことを除いて例１に記載した手順に従って９−アミ
ノアクリジン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバ
メートを合成した。６−アミノキノリンの代わりに９−
アミノアクリジンを用いた。反応は還流温度において実
施した。アミン溶液をカーボネート溶液に２時間かけて
添加した。アミンの添加が完了した後に、回転式蒸発器
によってアセトニトリルを８０％除去した。得られた濃
厚溶液を冷凍機に入れ、固形生成物を沈殿させた。
キシスクシンイミジルカルバメートの合成 次のことを除いて例１に記載した手順に従って９−アミ
ノアクリジン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバ
メートを合成した。６−アミノキノリンの代わりに９−
アミノアクリジンを用いた。反応は還流温度において実
施した。アミン溶液をカーボネート溶液に２時間かけて
添加した。アミンの添加が完了した後に、回転式蒸発器
によってアセトニトリルを８０％除去した。得られた濃
厚溶液を冷凍機に入れ、固形生成物を沈殿させた。
【００４４】例４：７−アミノ−４−メチルクマリン−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートの合成 次のことを除いて例１に記載した手順に従って７−アミ
ノ−４−メチルクマリン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルカルバメートを合成した。６−アミノキノリンの代
わりに７−アミノ−４−メチルクマリンを用いた。反応
は室温において撹拌しながら実施した。アミン溶液は４
時間かけて添加した。アセトニトリルを用いて生成物の
分別再結晶を実施して、カルバメート生成物を精製し
た。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートの合成 次のことを除いて例１に記載した手順に従って７−アミ
ノ−４−メチルクマリン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルカルバメートを合成した。６−アミノキノリンの代
わりに７−アミノ−４−メチルクマリンを用いた。反応
は室温において撹拌しながら実施した。アミン溶液は４
時間かけて添加した。アセトニトリルを用いて生成物の
分別再結晶を実施して、カルバメート生成物を精製し
た。
【００４５】例５：複素環式芳香族カルバメートによる
アミンの誘導体化についての一般的手順 次の手順によって標準検量溶液を調製する。アミン標準
溶液（０．１ｎｍｏｌ／マイクロリットル）５マイクロ
リットルを調製し、硼酸塩緩衝液（硼酸塩０．２Ｍ、Ｅ
ＤＴＡ５ＭＭ）３５マイクロリットルを添加した。この
混合物に試薬溶液（ＨＰＬＣ等級アセトニトリル１ミリ
リットル中にカルバメート化合物３ｍｇ）１０マイクロ
リットルを添加した。得られた混合物を７０℃に５分間
加熱した。誘導体は次のようにして調製した。即ち、除
蛋白した試料に１０ＭＭ塩酸１０マイクロリットルを添
加し、撹拌した。この混合物に硼酸塩緩衝液３０マイク
ロリットルを添加し、次いでカルバメート試薬溶液１０
マイクロリットルを添加した。得られた混合物を７０℃
に５分間加熱した。反応は非常に迅速であり、ほとんど
即座に誘導体化生成物が生成する。しかしながら、定量
的にチロシンを単一の安定な誘導体に転化させるために
は、溶液を次いで５０〜７０℃に加熱する。周囲条件下
ではチロシンは第２の誘導体をも生成し、これはゆっく
り安定な形に転化する。
アミンの誘導体化についての一般的手順 次の手順によって標準検量溶液を調製する。アミン標準
溶液（０．１ｎｍｏｌ／マイクロリットル）５マイクロ
リットルを調製し、硼酸塩緩衝液（硼酸塩０．２Ｍ、Ｅ
ＤＴＡ５ＭＭ）３５マイクロリットルを添加した。この
混合物に試薬溶液（ＨＰＬＣ等級アセトニトリル１ミリ
リットル中にカルバメート化合物３ｍｇ）１０マイクロ
リットルを添加した。得られた混合物を７０℃に５分間
加熱した。誘導体は次のようにして調製した。即ち、除
蛋白した試料に１０ＭＭ塩酸１０マイクロリットルを添
加し、撹拌した。この混合物に硼酸塩緩衝液３０マイク
ロリットルを添加し、次いでカルバメート試薬溶液１０
マイクロリットルを添加した。得られた混合物を７０℃
に５分間加熱した。反応は非常に迅速であり、ほとんど
即座に誘導体化生成物が生成する。しかしながら、定量
的にチロシンを単一の安定な誘導体に転化させるために
は、溶液を次いで５０〜７０℃に加熱する。周囲条件下
ではチロシンは第２の誘導体をも生成し、これはゆっく
り安定な形に転化する。
【００４６】例６ 例５に記載したようにして調製したアミノ酸誘導体のＨ
ＰＬＣ分離を逆相カラムを用いて実施した。有機改質剤
による緩衝液系を用いた勾配溶出法を採用した。次の条
件を用いて、標識剤として６−アミノキノリル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミジルカルバメートを用いて１７種
のアミノ酸及びアンモニウムを含有する標準蛋白質加水
分解混合物を分離した。 ａ）カラム：アミノ酸加水分解物用にノヴァパック（No
vaPak ）（登録商標名）フェニル｛ミリポア（Millipor
e ）社のウォーターズ（Waters）事業部｝を充填したカ
ラム（１５ｃｍ×３．９ｍｍのカラム）を用いた。ウォ
ーターズＨＰＬＣ装置は、２個のＭ５１０ポンプ、Ｍ７
１２自動試料採取装置、Ｍ４４０吸収検出器、Ｍ４７０
蛍光検出器、カラム温度制御モジュール及びＭ８６０デ
ータシステムを含む。 ｂ）移動相： 移動相Ａ：６０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．３５） 移動相Ｂ：６０％アセトニトリル 勾配：３０分かけて直線勾配を用いて移動相Ｂ ０−２
０％ ｃ）温度：３５℃ 例５に記載したようにして調製した標準溶液５マイクロ
リットルを初めに注入し、次いで試料１０マイクロリッ
トルを注入した。活性化カルバメートから生成させたア
ミノ酸誘導体の蛍光検出を、２４５ｎｍにおける励起及
び３９５ｎｍにおける放射によって実施した。結果を図
１のＡに示す。また、ノヴァパックＣ１８カラム（３．
９ｍｍ×１５ｃｍ）を用いて同じ分離を実施した。移動
相Ａは酢酸ナトリウム１４０ＭＭ、トリエチルアミン１
７ＭＭ、ｐＨ４．９５とした。２５４ｎｍにおける紫外
線によって検出を実施した。この分離の結果を図１のＢ
に示す。
ＰＬＣ分離を逆相カラムを用いて実施した。有機改質剤
による緩衝液系を用いた勾配溶出法を採用した。次の条
件を用いて、標識剤として６−アミノキノリル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミジルカルバメートを用いて１７種
のアミノ酸及びアンモニウムを含有する標準蛋白質加水
分解混合物を分離した。 ａ）カラム：アミノ酸加水分解物用にノヴァパック（No
vaPak ）（登録商標名）フェニル｛ミリポア（Millipor
e ）社のウォーターズ（Waters）事業部｝を充填したカ
ラム（１５ｃｍ×３．９ｍｍのカラム）を用いた。ウォ
ーターズＨＰＬＣ装置は、２個のＭ５１０ポンプ、Ｍ７
１２自動試料採取装置、Ｍ４４０吸収検出器、Ｍ４７０
蛍光検出器、カラム温度制御モジュール及びＭ８６０デ
ータシステムを含む。 ｂ）移動相： 移動相Ａ：６０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．３５） 移動相Ｂ：６０％アセトニトリル 勾配：３０分かけて直線勾配を用いて移動相Ｂ ０−２
０％ ｃ）温度：３５℃ 例５に記載したようにして調製した標準溶液５マイクロ
リットルを初めに注入し、次いで試料１０マイクロリッ
トルを注入した。活性化カルバメートから生成させたア
ミノ酸誘導体の蛍光検出を、２４５ｎｍにおける励起及
び３９５ｎｍにおける放射によって実施した。結果を図
１のＡに示す。また、ノヴァパックＣ１８カラム（３．
９ｍｍ×１５ｃｍ）を用いて同じ分離を実施した。移動
相Ａは酢酸ナトリウム１４０ＭＭ、トリエチルアミン１
７ＭＭ、ｐＨ４．９５とした。２５４ｎｍにおける紫外
線によって検出を実施した。この分離の結果を図１のＢ
に示す。
【００４７】例７ また、本発明の方法によって製造したアミノ酸誘導体を
分離検出するために、毛細管電気泳動をも用いた。誘導
体の毛細管電気泳動分離は、次の条件を用い、ウォータ
ーズ、クァンタ（Quanta）４０００毛細管電気泳動シス
テムを用いて実施し、２５４ｎｍにおいて検出した｛１
０倍希釈した加水分解生成物（２５０マイクロモル／リ
ットル）｝。 ・分離溶液：０．０５Ｍ（ｐＨ９．５）水性硼酸ナトリ
ウム緩衝液／メタノール（９０：１０）及び０．０５Ｍ
ドデシル硫酸ナトリウム ・毛細管：長さ６０ｃｍ、内径５０μ、ポリイミドコー
ティングしたフューズドシリカ ・電圧：２０ｋＶ ２５４ｎｍにおいて吸収検出を用いた。結果を図３に示
す。
分離検出するために、毛細管電気泳動をも用いた。誘導
体の毛細管電気泳動分離は、次の条件を用い、ウォータ
ーズ、クァンタ（Quanta）４０００毛細管電気泳動シス
テムを用いて実施し、２５４ｎｍにおいて検出した｛１
０倍希釈した加水分解生成物（２５０マイクロモル／リ
ットル）｝。 ・分離溶液：０．０５Ｍ（ｐＨ９．５）水性硼酸ナトリ
ウム緩衝液／メタノール（９０：１０）及び０．０５Ｍ
ドデシル硫酸ナトリウム ・毛細管：長さ６０ｃｍ、内径５０μ、ポリイミドコー
ティングしたフューズドシリカ ・電圧：２０ｋＶ ２５４ｎｍにおいて吸収検出を用いた。結果を図３に示
す。
【００４８】当業者は、本明細書に記載された発明の特
定実施態様と同等の多くの実施態様を認識するか又はほ
んの日常的な実験を用いて突き止めるだろう。かかる同
等実施態様の例には、化学ルミネセンス又は電気化学的
応答を含む、蛍光性以外の手段による誘導体化化合物の
検出も含まれる。かかる同等実施態様は本発明に包含さ
れるべきものである。
定実施態様と同等の多くの実施態様を認識するか又はほ
んの日常的な実験を用いて突き止めるだろう。かかる同
等実施態様の例には、化学ルミネセンス又は電気化学的
応答を含む、蛍光性以外の手段による誘導体化化合物の
検出も含まれる。かかる同等実施態様は本発明に包含さ
れるべきものである。
【図１】標識剤として６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミジルカルバメートを用いたアミノ酸誘
導体のＨＰＬＣ分離のクロマトグラムである。
キシスクシンイミジルカルバメートを用いたアミノ酸誘
導体のＨＰＬＣ分離のクロマトグラムである。
【図２】３−アミノキノリン（Ａ）、９−アミノアクリ
ジン（Ｂ）又は７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｃ）
を用いたアミノ酸誘導体のＨＰＬＣ分離のクロマトグラ
ムである。
ジン（Ｂ）又は７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｃ）
を用いたアミノ酸誘導体のＨＰＬＣ分離のクロマトグラ
ムである。
【図３】アミノ酸誘導体の毛細管電気泳動分離から得た
クロマトグラムである。
クロマトグラムである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１２月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】例１：６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメートの合成 次の手順に従って６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメートを合成した。アセトニト
リル｛ベイカー（Ｂａｋｅｒ）分析ＨＰＬＣ等級｝５０
０ミリリットルを蒸留して存在する水を共沸除去した。
最初の５０ミリリットルのアセトニトリルは廃棄した。
アセトニトリル５０ミリリットル中に６−アミノキノリ
ン｛アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ）社｝１．５ｇ（１０ミリモル）を溶解さ
せ、滴下漏斗に入れた。ジ−（Ｎ−スクシンイミジル）
カーボネート（ＤＳＣ）｛フルカ・ケミカル（Ｆｌｕｋ
ａＣｈｅｍｉｃａｌ）社｝３ｇ（１２ミリモル）をアセ
トニトリル１００ミリリットル中に溶解させ、撹拌しな
がら加熱還流した。この還流溶液にアミノキノリン溶液
を約３０分かけて滴下した。添加が完了した後に、この
溶液をさらに３０分間還流し、次いで反応混合物からア
セトニトリルを約３０ミリリットル留去した。この溶液
を放置冷却し、アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミジルカルバメートの種晶を入れた。２４時間後に
この溶液をデカンテーションし、結晶をろ過し、少量ず
つ合計１００ミリリットルのアセトニトリルで洗浄し
て、粗製生成物１．９５ｇを得た（収率６６％）。母液
は追加分の生成物をＤＳＣ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド及び１，３−ジ−（６−アミノキノリル）尿素と共
に含有していた。この生成物を、粗製物質を熱いアセト
ニトリル（生成物１ｇ当たりに１００ミリリットル）中
に溶解させ、この溶液を０．５μｍのフィルターに通し
てろ過し、ろ液に６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメートの種晶を入れることによ
って再結晶した。生成物７２４ｍｇが得られた（全体か
ら見た収率２４％）。１ Ｈ−ＮＭＲスペクトル：（ＣＤ３ＣＮ中、ｐｐｍ） キノリルの３位置のＨ：７．４５ キノリルの７位置のＨ：７．７３ キノリルの８位置のＨ：８．００ キノリルの５位置のＨ：８．０６ キノリルの４位置のＨ：８．２２ キノリルの２位置のＨ：８．８０
シスクシンイミジルカルバメートの合成 次の手順に従って６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメートを合成した。アセトニト
リル｛ベイカー（Ｂａｋｅｒ）分析ＨＰＬＣ等級｝５０
０ミリリットルを蒸留して存在する水を共沸除去した。
最初の５０ミリリットルのアセトニトリルは廃棄した。
アセトニトリル５０ミリリットル中に６−アミノキノリ
ン｛アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ）社｝１．５ｇ（１０ミリモル）を溶解さ
せ、滴下漏斗に入れた。ジ−（Ｎ−スクシンイミジル）
カーボネート（ＤＳＣ）｛フルカ・ケミカル（Ｆｌｕｋ
ａＣｈｅｍｉｃａｌ）社｝３ｇ（１２ミリモル）をアセ
トニトリル１００ミリリットル中に溶解させ、撹拌しな
がら加熱還流した。この還流溶液にアミノキノリン溶液
を約３０分かけて滴下した。添加が完了した後に、この
溶液をさらに３０分間還流し、次いで反応混合物からア
セトニトリルを約３０ミリリットル留去した。この溶液
を放置冷却し、アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミジルカルバメートの種晶を入れた。２４時間後に
この溶液をデカンテーションし、結晶をろ過し、少量ず
つ合計１００ミリリットルのアセトニトリルで洗浄し
て、粗製生成物１．９５ｇを得た（収率６６％）。母液
は追加分の生成物をＤＳＣ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド及び１，３−ジ−（６−アミノキノリル）尿素と共
に含有していた。この生成物を、粗製物質を熱いアセト
ニトリル（生成物１ｇ当たりに１００ミリリットル）中
に溶解させ、この溶液を０．５μｍのフィルターに通し
てろ過し、ろ液に６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメートの種晶を入れることによ
って再結晶した。生成物７２４ｍｇが得られた（全体か
ら見た収率２４％）。１ Ｈ−ＮＭＲスペクトル：（ＣＤ３ＣＮ中、ｐｐｍ） キノリルの３位置のＨ：７．４５ キノリルの７位置のＨ：７．７３ キノリルの８位置のＨ：８．００ キノリルの５位置のＨ：８．０６ キノリルの４位置のＨ：８．２２ キノリルの２位置のＨ：８．８０
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】例２：３−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメートの合成 次のことを除いて例１に記載した手順に従って３−アミ
ノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメ
ートを合成した。６−アミノキノリンの代わりに３−ア
ミノキノリンを用い、アミン溶液をカーボネート溶液に
３時間かけて添加し、反応を室温において実施した。ア
ミンの添加が完了した後に、回転式蒸発器によってアセ
トニトリルを２０％除去した。得られた濃厚溶液を次い
で冷凍して固形生成物を沈殿させた。１ Ｈ−ＮＭＲスペクトル：（ＣＤ３ＣＮ中、ｐｐｍ） スクシンイミジル部分：２．６及び２．８ キノリルの７位置のＨ：７．６ キノリルの７位置のＨ：７．６ キノリルの６位置のＨ：７．７ キノリルの５位置のＨ：７．９ キノリルの８位置のＨ：８．０ キノリルの４位置のＨ：８．４ キノリルの２位置のＨ：８．８
シスクシンイミジルカルバメートの合成 次のことを除いて例１に記載した手順に従って３−アミ
ノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメ
ートを合成した。６−アミノキノリンの代わりに３−ア
ミノキノリンを用い、アミン溶液をカーボネート溶液に
３時間かけて添加し、反応を室温において実施した。ア
ミンの添加が完了した後に、回転式蒸発器によってアセ
トニトリルを２０％除去した。得られた濃厚溶液を次い
で冷凍して固形生成物を沈殿させた。１ Ｈ−ＮＭＲスペクトル：（ＣＤ３ＣＮ中、ｐｐｍ） スクシンイミジル部分：２．６及び２．８ キノリルの７位置のＨ：７．６ キノリルの７位置のＨ：７．６ キノリルの６位置のＨ：７．７ キノリルの５位置のＨ：７．９ キノリルの８位置のＨ：８．０ キノリルの４位置のＨ：８．４ キノリルの２位置のＨ：８．８
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】例４：７−アミノ−４−メチルクマリン−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートの合成 次のことを除いて例１に記載した手順に従って７−アミ
ノ−４−メチルクマリン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルカルバメートを合成した。６−アミノキノリンの代
わりに７−アミノ−４−メチルクマリンを用いた。反応
は室温において撹拌しながら実施した。アミン溶液は４
時間かけて添加した。アセトニトリルを用いて生成物の
分別再結晶を実施して、カルバメート生成物を精製し
た。１ Ｈ−ＮＭＲスペクトル：（ＣＤ３ＣＮ中、ｐｐｍ） ４−メチルクマリンの４位置のＭｅのＨ：２．４ スクシンイミジル部分：２．８ ４−メチルクマリンの３位置のＨ：６．２ ４−メチルクマリンの６位置のＨ：７．４ ４−メチルクマリンの５位置のＨ：７．５ ４−メチルクマリンの８位置のＨ：７．７
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートの合成 次のことを除いて例１に記載した手順に従って７−アミ
ノ−４−メチルクマリン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルカルバメートを合成した。６−アミノキノリンの代
わりに７−アミノ−４−メチルクマリンを用いた。反応
は室温において撹拌しながら実施した。アミン溶液は４
時間かけて添加した。アセトニトリルを用いて生成物の
分別再結晶を実施して、カルバメート生成物を精製し
た。１ Ｈ−ＮＭＲスペクトル：（ＣＤ３ＣＮ中、ｐｐｍ） ４−メチルクマリンの４位置のＭｅのＨ：２．４ スクシンイミジル部分：２．８ ４−メチルクマリンの３位置のＨ：６．２ ４−メチルクマリンの６位置のＨ：７．４ ４−メチルクマリンの５位置のＨ：７．５ ４−メチルクマリンの８位置のＨ：７．７
Claims (9)
- 【請求項１】 次式： 【化１】 （ここで、Ａｒ−ＮＨは複素環式芳香族アミンである）
を有する活性化複素環式カルバメート化合物を含む組成
物。 - 【請求項２】 複素環式芳香族アミンがアミノキノリ
ン、置換アミノキノリン、アミノクマリン、置換アミノ
クマリン、アミノアクリジン及び置換アミノアクリジン
より成る群から選択される、請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】 ａ）６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメート、 ｂ）３−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルカルバメート、 ｃ）５−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルカルバメート、 ｄ）５−アミノイソキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミジルカルバメート、 ｅ）６−アミノ−４−メチルキノリル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメート、 ｆ）６−アミノ−２，４−ジメチルキノリル−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミジルカルバメート、 ｇ）６−アミノ−２−フェニルキノリル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメート、 ｈ）６−アミノ−２−メトキシ−４−メチルキノリル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、 ｉ）４−アミノキナルジン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミジルカルバメート、 ｊ）９−アミノアクリジン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミジルカルバメート、 ｋ）２−アミノアクリドン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミジルカルバメート、 ｌ）ルミノール−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカル
バメート、 ｍ）イソルミノール−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル
カルバメート、 ｎ）７−アミノ−４−メチルクマリン−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメート、 ｏ）７−アミノ−４−（トリフルオルメチル）クマリン
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、 ｐ）４’−（アミノメチル）フルオレセイン−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミジルカルバメート、 ｑ）５−（アミノメチル）フルオレセイン−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミジルカルバメート、 ｒ）５−アミノエオシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルカルバメート、及び ｓ）カスケードブルーエチレンジアミン−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジルカルバメート より成る群から選択される請求項１記載の複素環式芳香
族カルバメートを含む組成物。 - 【請求項４】 ａ）複素環式アミンとジ−（Ｎ−スクシ
ンイミジル）カーボネートとを反応させる工程及び ｂ）上記ａ）において形成された組合せ物を複素環式カ
ルバメートを生成させるのに充分な条件下に保つ工程を
含む、複素環式芳香族カルバメートの製造方法。 - 【請求項５】 ａ）アミン官能性化合物と次式： 【化２】 （ここで、Ａｒ−ＮＨは複素環式芳香族アミンである）
を有する活性化複素環式カルバメートとを接触させる工
程及び ｂ）上記ａ）において形成された組合せ物をカルバメー
ト化合物とアミン化合物との反応を起こさせるのに充分
な条件下に保つ工程を含む、アミン官能性化合物の誘導
体化方法。 - 【請求項６】 ａ）アミノ酸と次式： 【化３】 （ここで、Ａｒ−ＮＨは複素環式芳香族アミンである）
を有する活性化複素環式カルバメートとを接触させる工
程及び ｂ）上記ａ）において形成された組合せ物をアミノ酸と
複素環式カルバメートとの反応を起こさせるのに充分な
条件下に保つ工程を含む、アミノ酸の誘導体化方法。 - 【請求項７】 ａ）ペプチド又は蛋白質と次式： 【化４】 （ここで、Ａｒ−ＮＨは複素環式芳香族アミンである）
を有する複素環式芳香族カルバメートとを接触させる工
程及び ｂ）上記ａ）において形成された組合せ物をペプチド又
は蛋白質と複素環式カルバメートとの反応を起こさせる
のに充分な条件下に保つ工程を含む、ペプチド又は蛋白
質の誘導体化方法。 - 【請求項８】 ａ）アミン官能性化合物を請求項１記載
の複素環式芳香族カルバメートで標識付けする工程及び ｂ）蛍光検出を用いてアミン官能性化合物を検出する工
程を含む、アミン官能性化合物の検出方法。 - 【請求項９】 ペプチドを請求項１記載の蛍光性の複素
環式芳香族カルバメートで標識付けすることを含む、ペ
プチドマッピング方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US762579 | 1991-09-19 | ||
| US07/762,579 US5296599A (en) | 1991-09-19 | 1991-09-19 | Activated carbamates compounds |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05222033A true JPH05222033A (ja) | 1993-08-31 |
| JP3128353B2 JP3128353B2 (ja) | 2001-01-29 |
Family
ID=25065471
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04274884A Expired - Lifetime JP3128353B2 (ja) | 1991-09-19 | 1992-09-21 | 新規の活性化カルバメートの製造及び使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5296599A (ja) |
| EP (1) | EP0533200B1 (ja) |
| JP (1) | JP3128353B2 (ja) |
| DE (1) | DE69232252T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2003069328A1 (fr) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede d'analyse aminofonctionnelle et reactif analytique |
| JP2005500406A (ja) * | 2001-06-04 | 2005-01-06 | アマシャム バイオサイエンス ユーケイ リミテッド | 標的材料の蛍光検出用標識としてのアクリドン誘導体 |
| JP2009513766A (ja) * | 2005-10-28 | 2009-04-02 | アイティーアイ スコットランド リミテッド | 新規な蛍光染料およびその使用 |
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1992
- 1992-09-18 EP EP92116027A patent/EP0533200B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-18 DE DE69232252T patent/DE69232252T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-21 JP JP04274884A patent/JP3128353B2/ja not_active Expired - Lifetime
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