JP2005500406A5

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Publication number: JP2005500406A5
Application number: JP2003502493A
Authority: JP
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2022-05-30

Claims

標的材料の標識及び寿命検出のための試薬の使用であって、上記色素が次式で表される色素である、使用。

［式中、Ｒ²及びＲ³基はＺ¹環構造に結合し、Ｒ⁴及びＲ⁵基はＺ²環構造に結合しており、
Ｚ¹及びＺ²は、独立して、単環系、２縮合環系又は３縮合環系芳香族又は複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子と適宜酸素、窒素及び硫黄から選択される２個以下の原子とから選択される５又は６個の原子を有しており、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、モノ−もしくはジ−ニトロ−置換ベンジル、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ₁−Ｃ₄アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、−Ｅ−Ｆ基及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択され、
Ｒ¹は、水素、モノ−もしくはジ−ニトロ−置換ベンジル、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル、−Ｅ−Ｆ基及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であるが、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個がスルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択される水溶性基であるか、及び／又はＲ¹が−（ＣＨ₂−）_nＹ基（ただし、Ｙ及びｎは上記で定義した通りである。）であることを条件とする。］
前記色素が蛍光色素であって、
Ｒ²及びＲ³がＺ¹環構造に結合し、Ｒ⁴及びＲ⁵がＺ²環構造に結合しており、Ｚ¹及びＺ²が前記で定義した通りであり、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵が、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ₁−Ｃ₄アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、−Ｅ−Ｆ基及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択され、
Ｒ¹が、水素、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル、−Ｅ−Ｆ基及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択され、
Ｅ、Ｆ、Ｙ及びｎが前記で定義した通りである、請求項１記載の使用。
前記蛍光色素が２〜３０ナノ秒の範囲の蛍光寿命を有する、請求項２記載の使用。
前記色素が非蛍光性又は実質的に非蛍光性色素であって、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｚ¹及びＺ²基が前記で定義した通りであり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個が少なくとも１個のニトロ基を含む、請求項１記載の使用。
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個が−Ｅ−Ｆ基であり、Ｅ及びＦが前記で定義した通りである、請求項１乃至請求項４記載の使用。
前記標的結合基Ｆが、標的材料の官能基と反応するための反応基、又は標的材料の反応基と反応するための官能基を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の使用。
前記反応基が、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトから選択される、請求項６記載の使用。
前記官能基が、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、リン酸基及びチオリン酸基から選択される、請求項６記載の使用。
スペーサー基Ｅが以下の基から選択される、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の使用。
−（ＣＨＲ’）_p−
−｛（ＣＨＲ’）_q−Ｏ−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
−｛（ＣＨＲ’）_q−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
−｛（ＣＨＲ’）_q−（ＣＨ＝ＣＨ）−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
−｛（ＣＨＲ’）_q−Ａｒ−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
−｛（ＣＨＲ’）_q−ＣＯ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
−｛（ＣＨＲ’）ｑ−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
［式中、Ｒ’は、水素、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル又はアリールであって、適宜スルホネートで置換されていてもよく、Ａｒは、適宜スルホネートで置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、ｓは１〜５である。］
標的生物材料の標識法であって、
ｉ）標的生物材料を含む液体に、次式の色素を加え、

［式中、Ｒ²及びＲ³基はＺ¹環構造に結合し、Ｒ⁴及びＲ⁵基はＺ²環構造に結合しており、Ｚ¹及びＺ²は前記で定義した通りであり、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個は−Ｅ−Ｆ基であり（Ｅ及びＦは前記で定義した通りである。）、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうちのいずれかが−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ₁−Ｃ₄アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択され、
Ｒ¹基が−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ¹基は水素、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択されるが、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個がスルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択される水溶性基であるか、及び／又はＲ¹が−（ＣＨ₂−）_nＹ基（ただし、Ｙ及びｎは前記で定義した通りである。）であることを条件とする。]
ii）標的を標識するのに適した条件下で色素と標的生物材料をインキュベーションする
工程を含む方法。
前記標的生物材料が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、リン酸及びチオリン酸基を含むか又は含むように誘導体化されているヌクレオチド、及び１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、リン酸及びチオリン酸基を含むか又は含むように誘導体化されているオキシ又はデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
試料中における被検体の検定方法であって、
ｉ）被検体の少なくとも一部分を特異的結合パートナーと結合させるのに適した条件下で被検体を被検体に特異的な結合パートナーと接触させることにより、複合体を形成させ、被検体及び特異的結合パートナーのうちの一方を次式の蛍光色素で標識し、

［式中、Ｒ²及びＲ³基はＺ¹環構造に結合し、Ｒ⁴及びＲ⁵基はＺ²環構造に結合しており、Ｚ¹及びＺ²は前記で定義した通りであり、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個は−Ｅ−Ｆ基であり（ただし、Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうちのいずれかが−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ₁−Ｃ₄アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択され、
Ｒ¹基が−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ¹基は水素、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択されるが、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個がスルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択される水溶性基であるか、及び／又はＲ¹が−（ＣＨ₂−）_nＹ基（ただし、Ｙ及びｎは上記で定義した通りである。）であることを条件とする。]
ii）標識複合体から放出された蛍光を測定し、及び
iii）放出された蛍光と試料中における被検体の存在又は量との相互関係を明らかにする
工程を含む方法。
前記被検体−特異的結合パートナーが、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質又は補因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
２種以上の異なる蛍光色素セットであって、当該色素セットの各色素が次式を有し、当該セットの各色素が、当該セットの残りの色素の寿命と比べて明確に異なる蛍光寿命を有する、セット。

［式中、Ｒ²及びＲ³基はＺ¹環構造に結合し、Ｒ⁴及びＲ⁵基はＺ²環構造に結合しており、Ｚ¹及びＺ²は前記で定義した通りであり、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個は−Ｅ−Ｆ基であり（ただし、Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうちのいずれかが−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ₁−Ｃ₄アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択され、
Ｒ¹基が−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ¹基は水素、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択されるが、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個がスルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択される水溶性基であるか、及び／又はＲ¹が−（ＣＨ₂−）_nＹ基（ただし、Ｙ及びｎは上記で定義した通りである。）であることを条件とする。］
４種の異なる色素を含み、セットの各色素が異なる蛍光寿命を有するものである、請求項１４記載のセット。
当該セットにおける蛍光色素の各々が、２〜３０ナノ秒の範囲の蛍光寿命を呈する、請求項１４又は請求項１５記載のセット。
上記２色素の蛍光放出寿命の差異が、寿命が短い方の色素の値の少なくとも１５％である、請求項１４乃至請求項１６のいずれか１項記載のセット。
次式で表される色素の蛍光を増加させる方法であって、少なくとも１個のニトロ基を−ＮＨＯＨ又は−ＮＨ₂に還元することを特徴とする方法。

［式中、基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｚ¹及びＺ²は、前記で定義した通りであるが、基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む。］
組成物におけるニトロレダクターゼ酵素活性の検出方法であって、
ｉ）ニトロレダクターゼ活性を高める条件下、組成物を次式で表される色素と混合し、

［式中、基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｚ¹及びＺ²は、前記で定義した通りであり、基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む。］
ii）ニトロレダクターゼ活性の量の尺度となる蛍光の増加を測定する
ことを含む方法。
ｉ）特異的結合対の第１成分を表面に結合させ、
ii）成分間の結合を促す条件下で、特異的結合対の第２成分であってニトロレダクターゼ酵素で標識された第２成分を加え、
iii）次式で表される色素を加え、

［式中、基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｚ¹及びＺ²は、前記で定義した通りであり、基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
iv）結合したニトロレダクターゼ活性の尺度として蛍光の増加を測定することにより、第１成分への第２成分の結合を検出する
ことを含む検定方法。
前記特異的結合対が、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／結合タンパク質からなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
ｉ）ニトロレダクターゼをコード化する配列に機能し得るように結合した発現制御配列を含む核酸分子でトランスフェクションした宿主細胞を、次式で表される色素と接触させ、

［式中、基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｚ¹及びＺ²は、前記で定義した通りであり、基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
ii）ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度として蛍光の増加を測定する
ことを含む検定方法。
遺伝子発現に対する効果を測定すべき試験剤の存在下で検定を実施する、請求項２２記載の方法。
次式で表される色素。

［式中、Ｒ²及びＲ³基はＺ¹環構造に結合し、Ｒ⁴及びＲ⁵基はＺ²環構造に結合しており、
Ｚ¹及びＺ²は、独立して、単環系、２縮合環系又は３縮合環系芳香族又は複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子と適宜酸素、窒素及び硫黄から選択される２個以下の原子とから選択される５又は６個の原子を有しており、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個は−Ｅ−Ｆ基であり（ただし、Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうちのいずれかが−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ₁−Ｃ₄アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択され、
Ｒ¹基が−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ¹基は水素、モノ−もしくはジ−ニトロ−置換ベンジル、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、アラルキル及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択され、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であるが、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵基のうち少なくとも１個がスルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ₂−）_nＹ基から選択される水溶性基であるか、及び／又はＲ¹が−（ＣＨ₂−）_nＹ基（ただし、Ｙ及びｎは上記で定義した通りである。）であることを条件とする。］
前記標的結合基Ｆが、
ｉ）カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトから選択される反応基、又は
ii）ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、リン酸及びチオリン酸基から選択される官能基
を含む、請求項２４記載の色素。
前記スペーサー基Ｅが以下の基から選択される、請求項２４又は請求項２５記載の色素。
−（ＣＨＲ’）_p−
−｛（ＣＨＲ’）_q−Ｏ−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
−｛（ＣＨＲ’）_q−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
−｛（ＣＨＲ’）_q−（ＣＨ＝ＣＨ）−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
−｛（ＣＨＲ’）_q−Ａｒ−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
−｛（ＣＨＲ’）_q−ＣＯ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
−｛（ＣＨＲ’）ｑ−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）_r｝_s−
［式中、Ｒ’は、水素、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル又はアリールであって、適宜スルホネートで置換されていてもよく、Ａｒは、適宜スルホネートで置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、ｓは１〜５である。］