CN114438122B

CN114438122B - 油菜类肉桂酰-CoA还原酶基因BnaCCR-LIKE在调控作物含油量中的应用

Info

Publication number: CN114438122B
Application number: CN202210079554.XA
Authority: CN
Inventors: 郭亮; 姚璇; 鲁少平; 夏烨凡; 章惠
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2023-11-24
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114438122A

Abstract

本发明公开了油菜类肉桂酰‑CoA还原酶基因BnaCCR‑LIKE在调控油菜含油量中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。本发明使用农杆菌介导的遗传转化方法将靶向所述类肉桂酰‑CoA还原酶基因BnaCCR‑LIKE的CRISPR/Cas9基因编辑载体转化到油菜的基因组中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得基因BnaCCR‑LIKE功能缺失的油菜品种。通过测定突变体材料的含油量、脂质组，发现BnaCCR‑LIKE基因负调控油菜含油量的积累，突变体材料含油量相比于野生型显著升高，且亚麻酸含量显著升高。该遗传资源在油菜高油育种中具有十分重要的应用。

Description

油菜类肉桂酰-CoA还原酶基因BnaCCR-LIKE在调控作物含油量中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种具有还原酶活性的油菜类肉桂酰-CoA还原酶基因BnaCCR-LIKE在调控作物含油量中的应用。

背景技术

油菜是我国分布最广、播种面积最大的油料作物，植物油用途较广，不仅是食用油的主要来源，而且可用于生产油漆、肥皂、润滑油以及生物柴油。我国是食用油消费大国，其中菜籽油占中国自产植物油41％以上，目前65％以上的食用油依赖进口。2017年中国进口油菜籽已占世界油菜总进口总量的40％左右。2020年我国进口食用油籽1.0614亿吨，同比增加1283万吨，是国内油籽油料总产量6564万吨的1.6倍，单纯依赖进口，难以满足中国不断增加的食用油需求因此，提高油菜的含油量有利于保障我国食用油的供给安全。

种子中油的积累是一个复杂的生物学过程，与多种生物学途径密切相关，受如光合作用、种子发育、物质转运、脂质合成、积累和降解。目前，在模式植物拟南芥中已报道超过700个与油脂积累相关的基因或者酶，而油菜的油脂代谢相关基因研究还较少。油菜的含油性状一直是油菜的育种目标之一，创建新型的高油材料质，扩宽了油菜的高油育种的种质资源。

本发明克隆了一个具有氧化还原酶活性的油菜类肉桂酰-CoA还原酶基因BnaCCR-LIKE，利用CRISPR Cas9技术创建BnaCCR-LIKE的突变体，获得的油菜突变体的种子含油量显著升高。本申请人的结果预示着BnaCCR-LIKE基因在调控油菜种子含油量中起着重要作用，它在创建油菜含油量新种质中具有相当的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一个具有还原酶活性的油菜类肉桂酰-CoA还原酶基因BnaCCR-LIKE在调控作物含油量中的应用，该基因编码具有氧化还原酶活性的类肉桂酰-CoA还原酶蛋白，在油菜A3，C7和C5染色体上各有一个拷贝，分别是BnaA03.CCR(BnaA03g50190D)，BnaC07.CCR(BnaC07g42660D)和BnaC05.CCR(BnaC05g26540D)该基因的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，由912bp，912bp和732bp组成；该基因编码的蛋白质序列分别如序列表SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示，分别编码303，303和243个氨基酸。可以采用PCR技术从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。

本发明在获得所述基因的突变体时，使用农杆菌介导的遗传转化方法将靶向类肉桂酰-CoA还原酶基因BnaCCR-LIKE的CRISPR/Cas9基因编辑载体转化到油菜的基因组中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得基因BnaCCR-LIKE功能缺失的油菜品种。

通过测定突变体材料的含油量、脂质组，发现BnaCCR-LIKE基因负调控油菜含油量的积累，突变体材料含油量相比于野生型显著升高，且亚麻酸(18：3)含量显著升高。该遗传资源在油菜高油育种中具有十分重要的应用。

附图说明

图1-图3：分别是获得的5个BnaCCR-LIKE突变体的的靶位点的编辑情况。sgRNA1和sgRNA2分别位于基因BnaA03.CCR-LIKE和BnaC07.CCR-LIKE的第三和第五个外显子区，而BnaC05.CCR-LIKE仅有sgRNA1位于该基因的第二个外显子区。CR21、CR43、CR44和CR46为BnaA03.CCR-LIKE，BnaC07.CCR-LIKE和BnaC05.CCR-LIKE均被编辑的三突，CR48为BnaA03.CCR-LIKE和BnaC07.CCR-LIKE被编辑的双突。

图4：是基因BnaCCR-LIKE在油菜的表型鉴定。(a)利用近红外分析油菜种子含油量。CR21、CR43、CR44和CR46为BnaA03.CCR-LIKE，BnaC07.CCR-LIKE和BnaC05.CCR-LIKE均被编辑的三突，CR48为BnaA03.CCR-LIKE和BnaC07.CCR-LIKE被编辑的双突，每个株系有3个不同单株，*表示在Student’s t test中P<0.05。(b)种子各种脂肪酸的测定。每个株系有3个不同单株，*表示在Student’s t test中P<0.05。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如工具书《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory,1989)中所述的条件，或者按照生产商提供的操作手册中建议的方法。

序列表说明：

序列表SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3是分离自甘蓝型油菜Westar的基因BnaA03.CCR-LIKE(BnaA03g50190D)，BnaC07.CCR-LIKE(BnaC07g42660D)和BnaC05.CCR-LIKE(BnaC05g26540D)的核苷酸序列，其序列长度分别912bp，912bp和732bp。

序列表SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6是分离自甘蓝型油菜基因Westar的基因BnaA03.CCR-LIKE(BnaA03g50190D)，BnaC07.CCR-LIKE(BnaC07g42660D)和BnaC05.CCR-LIKE(BnaC05g26540D)编码的蛋白质序列，分别编码303，303和243个氨基酸。

实施例1BnaCCR-LIKE-CRISPR载体的构建

利用中国农业大学生物学院陈其军团队的sgRNA-Cas9系统创建油菜BnaCCR-LIKE突变体。实验操作步骤如下：

(1)登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选靶点sgRNA1：AGAGGAGCTATCAATGTGGTGG和sgRNA2：TTTGATACCTATGCCACCGAGG，分别位于基因BnaA03.CCR-LIKE和BnaC07.CCR-LIKE的第三和第五个外显子区，而BnaC05.CCR-LIKE仅有sgRNA1位于该基因的第二个外显子区。因此sgRNA1可以同时靶向BnaA03.CCR-LIKE，BnaC07.CCR-LIKE和BnaC05.CCR-LIKE，而sgRNA2可以靶向BnaA03.CCR-LIKE和BnaC07.CCR-LIKE。

(2)设计引物

DT1-BsF:ATATATGGTCTCGATTGTTTGATACCTATGCCACCGGTT

DT1-F0:TGTTTGATACCTATGCCACCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

DT2-R0:AACCCACATTGATAGCTCCTCTCAATCTCTTAGTCGACTCTAC

DT2-BsR:ATTATTGGTCTCGAAACCCACATTGATAGCTCCTCTCAA

(3)PCR扩增：以稀释100倍的pCBC-DT1T2为模板进行四引物PCR扩增。DT1–BsF和DT2-BsR为正常引物浓度；DT1-F0和DT2-R0稀释20倍。扩增体系为：

PCR扩增程序：98℃总变性1min；98℃变性15sec，56℃退火25sec，72℃延伸25sec，34circles；72℃总延伸5min。

(4)纯化回收PCR产物，建立如下酶切-连接体系(restriction-ligation)：

反应条件：5hours at 37℃，5min at 50℃，10min at 80℃

(5)转化转化大肠杆菌DH5α：取5μL转化大肠杆菌感受态，Kan板筛选，阳性克隆PCR鉴定并测序。测序正确的载体即为BnaCCR-LIKE的CRISPR载体。

(6)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株GV3101，挑选阳性单克隆于-80℃冰箱保存。导入方法如下：

a.清洗电转杯：先用纯水洗，再用超纯水洗，倒掉，再用无水乙醇清洗(用1ml枪头吹打)，倒掉无水乙醇，置于超净台晾干；

b.取农杆菌感受态GV3101 20μl；

c.取构建正确的重组质粒0.8μl，加入到20μl感受态中，轻轻吸打混匀，避免产生气泡；

d.将洗好吹干的电转杯置于冰中预冷，再将上述混合液靠杯壁打入；

e.将电转仪调至1800V；

f.将电转杯从冰中取出，用吸水纸擦干净电转杯外壁；

g.将电转杯放入仪器，连续按两下“push”键，几秒钟之后听到“滴”的一声则成功；

h.电击成功后，向电转杯中加入400μl无抗LB，吸打几下，转移到无菌离心管中；

i.28℃活化2h左右，取100μl涂到含有双抗，用封口膜封好，倒置于28度培养箱培养2天，挑斑检测。

(5)农杆菌菌落检测

挑选菌落于双抗LB中，28℃培养2小时，取适量菌液进行PCR检测，保存阳性农杆菌菌液。

实施例2遗传转化实验

(1)油菜的遗传转化

对构建好的BnaCCR-LIKE-CRISPR载体进行油菜的遗传转化，使用农杆菌介导的遗传转化方式，本发明中用于油菜转化的受体为甘蓝型油菜Westar，具体操作流程详见参考文献：An efficient Agrobacterium-mediated transformation method usinghypocotyl as explants for Brassica napus.①将甘蓝型油菜品系‘Westar’种子经灭菌消毒播种于MS的培养盒中，在培养室中进行暗培养；②将构建好的表达CRISPR/Cas9基因编辑载体的农杆菌菌液在28℃摇床过夜培养，收集菌液，侵染下胚轴；③PCR鉴定获得的转化材料，并将其种植于实验田。

(2)CRISPR转化单株的鉴定

对获得的油菜CRISPR转化单株进行测序筛选油菜突变体。首先利用引物Cas9-570-F(5’-AGACCGTGAAGGTTGTGGAC-3’)和Cas9-570-R(5’-TAGTGATCTGCCGTGTCTC-G-3’)鉴定Cas9蛋白，对于Cas9蛋白阳性单株进行目的基因的特异扩增以及测序鉴定。目的基因的特异扩增的方法为：分别用引物CCR-A3-F(5’-cttggcgcaactaaaaat-3’)和CCR-A3-R(5’-ctataaccctttcttgtataagc-3’)特异扩增BnaA03.CCR-LIKE；CCR-C07-F(5’-cttggcgcaactataaag-3’)和CCR-C07-R(5’-ctatgaccctttaatttcttg-3’)特异扩增BnaC07.CCR-LIKE；CCR-C05-F(5’-cgtcttctgcctgttgg-3’)和CCR-C05-R(5’-cacttgtaagtgggaaaacg-3’)特异扩增BnaC05.CCR-LIKE，扩增方法如下：

PCR体系为：Easy taq polymerase 0.15μL,10mM dNTP 0.4μL,10×buffer 2μL,DNA模板2μL,F引物2μL,R引物2μL，补ddH₂O至20μL。PCR条件：94℃总变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，32circles；72℃总延伸5min。

对扩增的目的片段进行PCR产物测序，测序结果用DSDecode在线网站(http:// skl.scau.edu.cn/dsdecode/)分析靶位点的编辑情况。测序结果显示，获得了BnaCCR-LIKE被编辑的多个突变体独立株系(CR21、CR43、CR44、CR46和CR48)。其中CR21、CR43、CR44和CR46为BnaA03.CCR-LIKE，BnaC07.CCR-LIKE和BnaC05.CCR-LIKE均被编辑的三突，CR48为BnaA03.CCR-LIKE和BnaC07.CCR-LIKE被编辑的双突(图1-3)。

(4)转化所得植株的含油量相关表型分析

①采用近红外分析仪测定油菜种子含油量

利用近红外分析仪，对成熟期收获的油菜种子进行品质分析，获得种子含油量数据，测定仪器由华中农业大学国家油菜工程技术研究中心提供。

含油量结果显示，受体背景材料Westar的含油量是44.06±2.15，突变体材料CR21、CR43、CR44、CR46和CR48的含油量分别是48.26±1.11、48.02±1.10、47.54±0.39、46.90±0.59和46.80±1.19，不难看出，所有的突变体含油量相比于野生型都显著升高约2.2-4.2个百分点(图4a)。

②采用LC-MS/MS方法测定油菜种子脂质含量

利用6500plus Qtrap，对成熟期收获的油菜种子进行脂质提取与分析，结果显示，成熟种子中油酸(18：1)、亚油酸(18：2)、亚麻酸(18：3)为主要的脂肪酸分别占总脂肪酸的70％、15％、5％。与WT相比，所有的突变体中亚麻酸(18：3)含量均显著升高了1.5％-3％。而油酸(18：1)、亚油酸(18：2)的含量均没有显著性的变化(图4b)。

综上所述，基因BnaCCR-LIKE在调控油菜含油量中发挥重要的作用。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 油菜类肉桂酰-CoA还原酶基因BnaCCR-LIKE在调控作物含油量中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 912

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)

<400> 1

atggatcaag aaaagtctca ttcctgctgc tgcgttcttg atgcttccac ttatgtgggt 60

ttctggattc tcaagaagtt gcttagcaga ggatactctg ttcacgcagc tattcgtaaa 120

aacggagata gtgaaattga ggagacaatc cgagagatgg aagcaacaga ggagagatta 180

gttgtgtacg atgttgatgt gttggattat caaagcatac ttgtctctct caagacatgt 240

aacgctgtct tctgctgctt agatagccct gaaggatacg atgagaagga agtggatttg 300

gaggtgagag gagctatcaa tgtggtggaa gcatgtggaa gaacagagag catagagaag 360

attgtattct cttcttcttt aacagcttca atttggagag acaacattgg aactcagaag 420

gatgttgatg agaagtgttg gagtgatcaa gacttctgtc gcaacaaaaa gttgtggcac 480

gcattggcaa agatgttgtc cgagaaagca gcttgggcac tagccatgga ccgtaggctc 540

aacatggtct ctatcaatcc tggtcttatc gttggaccat cggttgcaca atataaccct 600

aggcccacca tgtcctacct caaaggagct gcacaaatgt atgagaatgg agtgttggcg 660

tacgtagacg ttaaattttt agcggatgtt catattagag catacgagga tgtttcagct 720

tgtggtcgat atttctgctt caaccaaatc gttaacacag aagaagaagc tctcaagctt 780

gtcgagagtt tgtctccttt gatacctatg ccaccgaggt atgagagtgt aatgcaagga 840

agcgaagttt acgaagaaag actgaggaac aataaattga gcaagctggt ggaagctggc 900

tctgcttgtt aa 912

<210> 2

<211> 912

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)

<400> 2

atggatcaag aaaagtctca ttcctgctgc tgcgttcttg atgcttccac ttatgtgggc 60

ttctggattc tcaagaagtt gcttagcaga ggatactctg ttcacgcagc tattcgtaaa 120

aacggagata gtgaaattga ggagacaatc cgagagatgg aagcaacaga ggagagatta 180

gttgtgtacg atgttgatgt gttggattat caaagcatac ttgtctctct caagacatgt 240

aacgctgtct tctgctgctt agatagccct gaaggatacg atgagaagga agtggatttg 300

gaggtgagag gagctatcaa tgtggtggaa gcatgtggaa gaacagagag catagagaag 360

attgtattct cttcttcttt aacagcttca atttggagag acaacattgg cactcagaag 420

gatgttgatg agaagtgttg gagtgatcaa gacttctgtc gcaacaaaaa gttgtggcac 480

gcattggcaa agatgttgtc cgagaaagca gcttgggcac tagccatgga ccgtaggctc 540

aacatggtct ctatcaatcc tggtcttatc gttggaccat cggttgcaca atataaccct 600

aggcccacca tgtcctacct caaaggagct gcacaaatgt atgagaatgg agtgttggcg 660

tacgtagacg ttaaattttt agcggatgtt catattagag catacgagga tgtttcagct 720

tgtggtcgat atttctgctt caaccaaatc gttaacacag aagaagaagc tctcaagctt 780

gtcgagagtt tgtctccttt gatacctatg ccaccgaggt atgagagtgt aatgcaagga 840

agcgaagttt acgaagaaag actgaggaac aataaattga gcaagctggt ggaagctggc 900

tctgcttgtt aa 912

<210> 3

<211> 732

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)

<400> 3

atggaagcaa cagaggagag attagttgtg tacgatgttg atgtgttgga ttatcaaagc 60

atacttgtct ctctcaagac atctaacgcc gtcttctgcc tgttggatag ccctgaagga 120

tacgatgaga aggaagtgga tttggaggtg agaggagcta tcaatgtggt ggaagcatgt 180

gaaagaacag agagcataga taagattgtg ttctcttctt cttctttaac agcttcaatt 240

ttgagagaca acattggaac tcagaaggat gttgatgaga agtgttggag tgatcaagac 300

ttctgtcgca acaaaaagtt tgcagaagga atggtagagt ttattggatt gcttgaggtg 360

gctgttaaga aaggtactaa cttagctatc agagacatga tgtcaagtga tgcttatgtt 420

gccttgaatc tagggaagca agtaactatt gttcataaac ttcaaaaaac tgttgtgaat 480

tgtaatttga acccggtatg gaatcaagaa ctcatgctgt ctgttcctga cagctatggt 540

cctgtaaaac tgcaagtgta tgattatgat acattctctg ctggtgacat aatgggagaa 600

gctcaacttg atatccagcc tctgataaca tctgcgatgg tgtttgggga tccagagatg 660

tttggggata tgcagattgg gaaatggcta aagttgcatg ataatccgcc aatagatgac 720

agcatcattt ga 732

<210> 4

<211> 303

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)

<400> 4

Met Asp Gln Glu Lys Ser His Ser Cys Cys Cys Val Leu Asp Ala Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Val Gly Phe Trp Ile Leu Lys Lys Leu Leu Ser Arg Gly Tyr

20 25 30

Ser Val His Ala Ala Ile Arg Lys Asn Gly Asp Ser Glu Ile Glu Glu

35 40 45

Thr Ile Arg Glu Met Glu Ala Thr Glu Glu Arg Leu Val Val Tyr Asp

50 55 60

Val Asp Val Leu Asp Tyr Gln Ser Ile Leu Val Ser Leu Lys Thr Cys

65 70 75 80

Asn Ala Val Phe Cys Cys Leu Asp Ser Pro Glu Gly Tyr Asp Glu Lys

85 90 95

Glu Val Asp Leu Glu Val Arg Gly Ala Ile Asn Val Val Glu Ala Cys

100 105 110

Gly Arg Thr Glu Ser Ile Glu Lys Ile Val Phe Ser Ser Ser Leu Thr

115 120 125

Ala Ser Ile Trp Arg Asp Asn Ile Gly Thr Gln Lys Asp Val Asp Glu

130 135 140

Lys Cys Trp Ser Asp Gln Asp Phe Cys Arg Asn Lys Lys Leu Trp His

145 150 155 160

Ala Leu Ala Lys Met Leu Ser Glu Lys Ala Ala Trp Ala Leu Ala Met

165 170 175

Asp Arg Arg Leu Asn Met Val Ser Ile Asn Pro Gly Leu Ile Val Gly

180 185 190

Pro Ser Val Ala Gln Tyr Asn Pro Arg Pro Thr Met Ser Tyr Leu Lys

195 200 205

Gly Ala Ala Gln Met Tyr Glu Asn Gly Val Leu Ala Tyr Val Asp Val

210 215 220

Lys Phe Leu Ala Asp Val His Ile Arg Ala Tyr Glu Asp Val Ser Ala

225 230 235 240

Cys Gly Arg Tyr Phe Cys Phe Asn Gln Ile Val Asn Thr Glu Glu Glu

245 250 255

Ala Leu Lys Leu Val Glu Ser Leu Ser Pro Leu Ile Pro Met Pro Pro

260 265 270

Arg Tyr Glu Ser Val Met Gln Gly Ser Glu Val Tyr Glu Glu Arg Leu

275 280 285

Arg Asn Asn Lys Leu Ser Lys Leu Val Glu Ala Gly Ser Ala Cys

290 295 300

<210> 5

<211> 303

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)

<400> 5

Met Asp Gln Glu Lys Ser His Ser Cys Cys Cys Val Leu Asp Ala Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Val Gly Phe Trp Ile Leu Lys Lys Leu Leu Ser Arg Gly Tyr

20 25 30

Ser Val His Ala Ala Ile Arg Lys Asn Gly Asp Ser Glu Ile Glu Glu

35 40 45

Thr Ile Arg Glu Met Glu Ala Thr Glu Glu Arg Leu Val Val Tyr Asp

50 55 60

Val Asp Val Leu Asp Tyr Gln Ser Ile Leu Val Ser Leu Lys Thr Cys

65 70 75 80

Asn Ala Val Phe Cys Cys Leu Asp Ser Pro Glu Gly Tyr Asp Glu Lys

85 90 95

Glu Val Asp Leu Glu Val Arg Gly Ala Ile Asn Val Val Glu Ala Cys

100 105 110

Gly Arg Thr Glu Ser Ile Glu Lys Ile Val Phe Ser Ser Ser Leu Thr

115 120 125

Ala Ser Ile Trp Arg Asp Asn Ile Gly Thr Gln Lys Asp Val Asp Glu

130 135 140

Lys Cys Trp Ser Asp Gln Asp Phe Cys Arg Asn Lys Lys Leu Trp His

145 150 155 160

Ala Leu Ala Lys Met Leu Ser Glu Lys Ala Ala Trp Ala Leu Ala Met

165 170 175

Asp Arg Arg Leu Asn Met Val Ser Ile Asn Pro Gly Leu Ile Val Gly

180 185 190

Pro Ser Val Ala Gln Tyr Asn Pro Arg Pro Thr Met Ser Tyr Leu Lys

195 200 205

Gly Ala Ala Gln Met Tyr Glu Asn Gly Val Leu Ala Tyr Val Asp Val

210 215 220

Lys Phe Leu Ala Asp Val His Ile Arg Ala Tyr Glu Asp Val Ser Ala

225 230 235 240

Cys Gly Arg Tyr Phe Cys Phe Asn Gln Ile Val Asn Thr Glu Glu Glu

245 250 255

Ala Leu Lys Leu Val Glu Ser Leu Ser Pro Leu Ile Pro Met Pro Pro

260 265 270

Arg Tyr Glu Ser Val Met Gln Gly Ser Glu Val Tyr Glu Glu Arg Leu

275 280 285

Arg Asn Asn Lys Leu Ser Lys Leu Val Glu Ala Gly Ser Ala Cys

290 295 300

<210> 6

<211> 243

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)

<400> 6

Met Glu Ala Thr Glu Glu Arg Leu Val Val Tyr Asp Val Asp Val Leu

1 5 10 15

Asp Tyr Gln Ser Ile Leu Val Ser Leu Lys Thr Ser Asn Ala Val Phe

20 25 30

Cys Leu Leu Asp Ser Pro Glu Gly Tyr Asp Glu Lys Glu Val Asp Leu

35 40 45

Glu Val Arg Gly Ala Ile Asn Val Val Glu Ala Cys Glu Arg Thr Glu

50 55 60

Ser Ile Asp Lys Ile Val Phe Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ala Ser Ile

65 70 75 80

Leu Arg Asp Asn Ile Gly Thr Gln Lys Asp Val Asp Glu Lys Cys Trp

85 90 95

Ser Asp Gln Asp Phe Cys Arg Asn Lys Lys Phe Ala Glu Gly Met Val

100 105 110

Glu Phe Ile Gly Leu Leu Glu Val Ala Val Lys Lys Gly Thr Asn Leu

115 120 125

Ala Ile Arg Asp Met Met Ser Ser Asp Ala Tyr Val Ala Leu Asn Leu

130 135 140

Gly Lys Gln Val Thr Ile Val His Lys Leu Gln Lys Thr Val Val Asn

145 150 155 160

Cys Asn Leu Asn Pro Val Trp Asn Gln Glu Leu Met Leu Ser Val Pro

165 170 175

Asp Ser Tyr Gly Pro Val Lys Leu Gln Val Tyr Asp Tyr Asp Thr Phe

180 185 190

Ser Ala Gly Asp Ile Met Gly Glu Ala Gln Leu Asp Ile Gln Pro Leu

195 200 205

Ile Thr Ser Ala Met Val Phe Gly Asp Pro Glu Met Phe Gly Asp Met

210 215 220

Gln Ile Gly Lys Trp Leu Lys Leu His Asp Asn Pro Pro Ile Asp Asp

225 230 235 240

Ser Ile Ile

Claims

1.油菜类肉桂酰-CoA还原酶基因在负调控油菜含油量中的应用，所述基因为：（1）核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的基因；或

（2）核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的基因。

2.油菜类肉桂酰-CoA还原酶蛋白在负调控油菜含油量中的应用，所述蛋白为：（1）氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的蛋白；或

（2）氨基酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的蛋白。

3.靶向权利要求1中所述的油菜类肉桂酰-CoA还原酶基因的CRISPR基因编辑载体在提高油菜含油量中的应用。

4.一种提高油菜含油量的方法，其特征在于：使用农杆菌介导的遗传转化方法将靶向权利要求1中所述类肉桂酰-CoA还原酶基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体转化到油菜的基因组中，利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术获得基因功能缺失的油菜品种。