CN107312785A

CN107312785A - OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用

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Publication number: CN107312785A
Application number: CN201710674530.8A
Authority: CN
Inventors: 钦鹏; 胡彬华; 李仕贵; 张国华; 陈微兰; 涂斌; 王玉平; 马炳田
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2017-11-03
Anticipated expiration: 2037-08-09
Also published as: CN107312785B

Abstract

本发明公开了OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用，属于水稻基因工程领域。本发明主要是通过CRISPR/Cas9系统对OsKTN80b基因进行基因编辑，获得OsKTN80b基因敲除的转基因植株，从中选择纯合突变体，最终获得株高降低的植株。本发明还公开了用于OsKTN80b基因敲除的2个靶点序列SG1或SG2，分别由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成。与野生型水稻相比，本发明OskTN80b基因敲除的转基因植株的株高降低了13.56％‑16.33％，其降低水稻株高的效果好；其次，本发明方法不受遗传背景限制，也不存在与不良性状连锁的问题。

Description

OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域，具体涉及OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的用途。

背景技术

20世纪60年代，矮秆水稻育种的成功，使水稻产量提高了20％-30％，被称为水稻育种的“绿色革命”。矮化育种不仅提高了水稻的抗倒伏能力，而且对于增加种植密度、改善水稻的综合性状都有重要的作用。目前，生产上应用的水稻矮杆基因主要是sd1，存在矮秆基因单一和遗传背景狭窄等缺点，很容易造成遗传上的脆弱性和局限性。此外，其他已知的矮杆和半矮杆基因大多对水稻农艺性状有负面影响，即含有这些矮秆基因的水稻品种农艺性状较差，在实际生产中很难应用，因而限制了水稻矮化育种的发展。

随着生物技术的发展，转基因技术为水稻的矮化育种提供了一种新的途径。目前，已克隆了20多个矮杆及相关基因，其中大部分矮杆基因参与赤霉素(GA)的合成、运输及信号转导途径，如sd1(Sasaki A等，Nature,2002,416(416):701-702；Monna L等，DNAResearch,2002,9(1):11；Wolfgang Spielmeyer等，Proceedings of the NationalAcademy of Science,2002,99(13):9043-9048)、D1(Fujisawa Y等，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,1999,96(13):7575-7580)、BC12/GDD1(Li J等，Plant Cell，2011,23(2):628-640)、OsSPY(Shimada A等，Plant Journal,2006,48(3):390-402)、D35(Itoh H等，Plant Molecular Biology,2004,54(4):533)、D18(Tong H等，Plant Cell,2014,26(11):4376)、EUI1(Zhu Y等，Plant Cell,2006,18(2):442-456)、GID1(Tanaka N等，Plant Cell&Environment，2006，29(4):619-631)和GID2(Sasaki A等，Science，2003，299(5614):1896-1898)等。这些矮杆基因中，除sd1以外，大多具有“一因多效”的遗传表型，矮化的同时伴随着不利的农艺性状，难以在实际生产中应用。

OsKTN80b是编码微管剪切酶蛋白的基因(Wan L等.Journal of IntegrativePlant Biology,2014,56(7):622-634)。

CRISPR/Cas9系统是一种准确、便捷、高效率的生物基因组编辑工具。该系统仅需要短的gRNA和核酸酶(Cas9)就可以进行特定的生物靶基因的编辑。目前，CRISPR/Cas9系统已在拟南芥、烟草、水稻、小麦、高粱、玉米等植物中实现了定点基因组编辑。

发明内容

本发明人在蜀恢498背景的EMS诱变突变体库中意外发现一种小粒突变体材料，通过全基因组重测序和MutMap定位分析，得到5个候选基因，包括编码微管剪切蛋白p80亚基OsKTN80b的LOC_Os04g58130基因；对候选基因OsKTN80b进行CRISPR/Cas9基因编辑敲除后，意外发现该基因在调控水稻株高方面的功能。本发明是在上述意外发现的基础上完成的，本发明目的在于提供OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的用途。

本发明另一目的在于提供用于敲除水稻OsKTN80b基因的靶点序列。

本发明第三目的在于提供上述靶点序列在降低水稻株高方面的用途。

本发明第四目的在于提供用于敲除水稻OsKTN80b基因的sgRNA。

本发明第五目的在于提供上述sgRNA在降低水稻株高方面的用途。

本发明第六目的在于提供通过敲除OsKTN80b基因降低水稻株高的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用。

所述的OsKTN80b基因由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成。

所述的OsKTN80b基因，其编码的蛋白质由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成。

所述的OsKTN80b基因，其基因组序列由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成。

本发明还提供了用于敲除水稻OsKTN80b基因的靶点序列，所述的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合；其中所述的SG1由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成；所述的SG2由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成；即

SG1：5’-CAGAAGGAACTCATGGGGA-3’(SEQ ID No.4)；

SG2：5’-TTGAATTGATTGGGTCTAC-3’(SEQ ID No.5)。

本发明还提供了上述靶点序列在降低水稻株高方面的应用。

上述应用中所述的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合。

本发明还提供了用于敲除水稻OsKTN80b基因的sgRNA，所述的sgRNA的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合。

上述sgRNA在降低水稻株高方面的应用。

本发明还提供了通过敲除水稻OsKTN80b基因降低水稻株高的方法，所述的敲除水稻OsKTN80b基因是通过CRISPR/Cas9系统实现的。

上述方法中所述的CRISPR/Cas9系统中，其sgRNA的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合，其中所述的SG1由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成；所述的SG2由SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列组成。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：(1)、与野生型水稻相比，本发明OskTN80b基因敲除的转基因植株的株高降低了13.56％-16.33％，其降低水稻株高的效果好，为水稻矮秆育种提供了一个新的途径。(2)、本发明方法不受遗传背景限制，也不存在与不良性状连锁的问题，通过基因工程方法可以将该基因应用到水稻矮化育种中，用以获得水稻理想株型，增加种植密度，提高水稻产量。(3)本发明OskTN80b基因为水稻株高遗传研究提供了很好的研究材料。

附图说明

图1为OsKTN80b基因CRISPR/Cas9敲除载体质粒电泳图；其中1为OsKTN80b基因第一个靶位点SG1的CRISPR/Cas9敲除载体；2为OskTN80b基因第二个靶位点SG2的CRISPR/Cas9敲除载体；M为Trans2k Plus DNA Marker。

图2为T0代转基因植株潮霉素检测电泳图谱；其中M为Marker，1-10为靶位点SG1的T0代植株,11-19代表靶位点SG2的T₀代植株。

图3为敲除植株包含靶位点一的PCR扩增测序的部分电泳图谱；其中M为Marker,1、2、3和4分别代表部分靶位点SG1敲除的植株。

图4为OsKTN80b基因靶位点SG1敲除突变体的测序比对结果及测序峰图谱(其中一种突变方式)。

图5为敲除植株包含靶位点SG2的PCR扩增测序的部分电泳图谱；其中M为Marker,1、2、3和4分别代表部分靶位点SG2敲除的植株。

图6为OsKTN80b基因靶位点SG2敲除突变体的测序比对结果及测序峰图谱(其中一种突变方式)。

图7为日本晴和OsKTN80b基因CRISPR/Cas9敲除的纯合突变的转基因水稻T1代植株照片；其中1为日本晴；2为Osktn80b-1CRISPR/Cas9编辑OsKTN80b基因靶位点SG1获得的纯合突变体植株；3为Osktn80b-2 CRISPR/Cas9编辑OsKTN80b基因靶位点SG2获得的纯合突变体植株。

图8为日本晴(WT)和Osktn80b-1和Osktn80b-2两个敲除突变体水稻植株的株高统计分析柱形图；其中1为日本晴；2为Osktn80b-1 CRISPR/Cas9编辑OsKTN80b基因靶位点SG1获得的纯合突变体；3为Osktn80b-2 CRISPR/Cas9编辑OsKTN80b基因靶位点SG2获得的纯合突变体。“**”表示根据TTEST统计学分析差异极显著(p≤0.01)。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的解释和说明。下述实施例中所述的方法如非特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1OsKTN80b CRISPR/Cas9敲除载体的构建

本发明人在蜀恢498背景的EMS诱变突变体库里筛选到一份粒小突变体材料，通过全基因组重测序和MutMap定位分析，得到5个候选基因，包括其中编码微管剪切蛋白p80亚基OsKTN80b的LOC_Os04g58130基因；对候选基因OsKTN80b进行CRISPR/Cas9基因编辑敲除，意外发现该基因在调控水稻植株表型方面的功能。

采用百格基因CRISPR/Cas载体构建试剂盒构建cas9敲除载体。

(1)靶点序列设计：在CRISPR/Cas9系统的sgRNA在线设计软件网站：http:// www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html输入OsKTN80b基因序列(见SEQ ID NO.1)，设计并生成gRNA的靶点序列SG1和SG2。识别序列选择19bp，该靶点序列分别为：

SG1：5’-CAGAAGGAACTCATGGGGA-3’(SEQ ID NO.4)，

SG2：5’-TTGAATTGATTGGGTCTAC-3’(SEQ ID NO.5)。

(2)分别将19bp的靶点序列SG1和SG2输入到百格生物技术在线网站：http:// www.biogle.cn/index/excrispr下面的对话框，

分别获得与试剂盒对应的携带接头的寡聚靶点接头分子Oligo1和Oligo2，以及Oligo3和Oligo4。

Oligo1:5’-TGTGTGCAGAAGGAACTCATGGGGA-3’(SEQ ID NO.6)，

Oligo2:5’-AAACTCCCCATGAGTTCCTTCTGCA-3’(SEQ ID NO.7)。

Oligo3:5’-TGTGTGTTGAATTGATTGGGTCTAC-3’(SEQ ID NO.8)，

Oligo4:5’-AAACGTAGACCCAATCAATTCAACA-3’(SEQ ID NO.9)。

Oligo1、Oligo2、Oligo3和Oligo4序列由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

按照百格基因CRISPR/Cas载体构建试剂盒的步骤操作：

(3)制备Oligo二聚体双链靶点接头。将合成好的Oligo1和Oligo2分别加水溶解至10μM，各取1μl加入到18μl 0.5×Buffer反应体系混合后。在PCR仪上进行，95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，移至室温冷却完成退火复性，获得Oligo二聚体的双链靶点接头Target1，命名为A1。

重复上述方法，获得Oligo3和Oligo4的二聚体的双链靶点接头Target2，命名为A2。

(4)将A1或A2双链靶点接头连接至Cas9/gRNA载体。按CRISPR/Cas9Vector 2μl，Oligo二聚体1μl，Enzyme Mix 1μl，H₂O 6μl，反应体系(10μl)在冰上混合各个组分，混匀后室温(20℃)反应1小时。

取出保存在-80℃的大肠杆菌感受态细胞DH5α，置于冰上进行融化，待融化后加入到上述反应体系中；轻轻混匀后放在冰上冰浴30min；42℃热激30S，迅速取出立即置于冰上2min；加入LB液体培养液200μl，放在37℃、200rpm的摇床上培养40-60min；将摇好的菌液涂板到含有Kan的LB平板上(在超净工作台上操作)。在37℃培养箱中倒置培养过夜(Kan平板一般放置12-16h)。将过夜的平板取出，挑取白色单克隆重悬于有10μl ddH₂O的小EP管中，用枪吹打混匀(菌液变浑浊)，进行编号；吸取2μl编号的菌液进行PCR检测，其中检测引物为潮霉素引物：

hpt-F:5’-TACACAGGCCATCGGTCCAGA-3’(SEQ ID NO.10)，

hpt-R:5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’(SEQ ID NO.11)；

PCR反应体系(20μl):菌液2.0μl,10×Buffer 2.0μl,dNTPs 2.0μl,引物2.0μl,Taq酶0.2μl,ddH₂O 11.8μl。PCR扩增条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，共30个循环；72℃5min。

PCR扩增产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，筛选出有条带的阳性克隆，将有条带的阳性克隆剩余菌液加入到5ml LB加Kan的液体培养基中扩大培养，在37℃、200rpm条件下过夜摇菌；吸出过夜的菌液500μl，加等量灭菌50％甘油混匀，液氮速冻后放入-80℃保存；余下的菌液用于提取质粒(参照OMEGA试剂盒说明书)，将提取的质粒经电泳检测(图1)后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，测序结果正确，显示获得了两个敲除转化载体，分别命名为：C1和C2。

实施例2：OsKTN80b cas9转化水稻

(1)将实施例1所得的两个重组质粒C1和C2，分别通过冻融法导入农杆菌菌株EHA105。每100μl EHA105感受态细胞与0.5-1μg(约2μl)质粒DNA混匀，依次在冰上、液氮和37℃水浴中各放置5min；用新鲜的LB液体培养基稀释至1ml，于28℃摇床培养2-4小时；取出200μl涂布于含抗生素Kan(50μg/ml)和Rif(50μg/ml)的LB平板上，在28℃培养2-3天。从LB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml含抗生素的LB液体培养基中于28℃摇床培养过夜，第二天按1％接种量转接入50ml含抗生素的LB液体培养基中，在200rpm继续振摇培养至OD₆₀₀为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液在4℃、5000rpm下离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的TY液体培养基中，获得含有OsKTN80b敲除载体的农杆菌菌液，分别命名为D1和D2，此时D1或D2即可用于转化水稻各种受体材料。

采用常规的农杆菌转化方法转化水稻日本晴的成熟胚愈伤组织。

(2)将日本晴水稻成熟种子去壳，于75％的酒精浸泡1min，然后用无菌水冲洗3次；加入浓度为50％的次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡30min，无菌水洗8-10次，吸去多余水分；接种到诱导培养基上，于光照培养箱中在30℃、光照条件下培养7天左右，至愈伤组织长出；将愈伤组织从种子上分离后转移到继代培养基上，于相同条件下培养1周左右，即可用于农杆菌浸染。

(3)取步骤(1)中保存于-80℃冰箱的农杆菌菌液10μl于5ml YEP培养基(Kan50mg/L；Rif 50mg/L)中，在28℃、200rpm条件下培养24-32h，取1ml菌液于50mL TY+AS培养基中，在28℃培养2-4h，至OD600约0.1-0.2。

(4)将步骤(2)中所得的水稻愈伤组织转入步骤(3)所获得的D1和D2农杆菌悬浮液中，并共孵育30min，用灭菌的滤纸吸除过多的菌液。将浸染后的愈伤组织转移到共培养基MSD+S+AS中，在22℃、黑暗条件下培养2-3天。筛选培养，用液体的MSD培养基清洗从共培养基上转移的愈伤组织，清洗3次，每次10min：用灭菌滤纸吸除多余的培养基，将愈伤组织接入筛选培养基(MSD+CH)中，在30℃、光照条件下培养2-3周；将愈伤组织转入新的筛选培养基中培养4-5周，开始出现新的抗性小愈伤组织，将这些新的愈伤组织分离出来并转接入分化培养基中，在30℃、光照条件下培养2-3周。将繁殖变大的愈伤组织转入新的分化培养基中，在30℃、光照条件下培养3周，新的抗性愈伤组织在分化培养基中培养约30天就开始变绿。将再生的转基因幼苗(大概2-5cm高)转入生根培养基中，于光照培养箱中在25-30℃，16h光照/8小时黑暗条件下培养，获得再生植株。靶位点SG1敲除(农杆菌D1浸染愈伤组织)获得转基因植株，命名为OsKTN80b-1；靶位点SG2敲除(农杆菌D2浸染愈伤组织)获得转基因植株，命名为OsKTN80b-2。将获得的OsKTN80b-1和OsKTN80b-2再生植株移栽到大田种植，提取植株叶片总DNA，经PCR检测(PCR反应体系和程序与实施例1相同)，OskTN80b-1和OskTN80b-2的两个敲除靶位点分别获得了17株独立的T0代阳性转基因株系(见图2)。

实施例3：转基因水稻基因组DNA提取、突变体的PCR检测及测序

按照如下方法进行：

采用CTAB法提取实施例2获得的T0代转基因水稻叶片基因组DNA；对T0代的转基因植株的敲除位点进行PCR测序分析。其中PCR扩增体系为：10×buffer for KOD-Plus 2.5μl、KOD plus聚合酶(5U/μl)0.25μL、25mmol/L MgSO4 1μl、dNTPs(2mmol/L)2.5μl、各引物(10μmol/L，Cas9-p80-1F与Cas9-p80-1R)0.5μl、和(10μmol/L，Cas9-p80-2F与Cas9-p80-2R)模板DNA 0.5μl，以超纯水补至25μl。反应条件为94℃2min；94℃20s、58℃30s，68℃60s，30个循环；68℃5min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳(电泳缓冲液0.5×TBE)，BIORAD凝胶成像系统观察、照相(见图3和图5)，并送成都擎科梓熙生物科技有限公司测序。

OsKTN80b敲除位点的测序引物为Cas9-OsKTN80b-1F和Cas9-OsKTN80b-1R：

Cas9-OsKTN80b-1F:5’-GCGGTAGATTCTGCTAGCGT-3’(SEQ ID NO.12)，

Cas9-OsKTN80b-1R:5’-TGTTTGGCATTGTTGGACAG-3’(SEQ ID NO.13)；

或为Cas9-OsKTN80b-2F和Cas9-OsKTN80b-2R：

Cas9-OsKTN80b-2F:5’-TTGGGCTTCCTTCGTTTAGTGA-3’(SEQ ID NO.14)，

Cas9-OsKTN80b-2R:5’-AGTCGAACAGCAACCAATGA-3’(SEQ ID NO.15)；

结果在OsKTN80b-1和OsKTN80b-2的两个敲除靶位点共获得了17株独立的阳性转基因株系，测序结果显示17株转基因苗都被敲除，OsKTN80b-1分别获得了缺失CC以及其他突变类型的突变体，OsKTN80b-2获得了A/T碱基的插入以及不同碱基长度缺失的突变体，T0代没有获得纯合的敲除突变体；选择T0代株系中，OsKTN80b-1具有CC碱基缺失的水稻植株(见图4)以及OskTN80b-2含有T碱基插入突变水稻植株(见图6)，这两种突变方式导致编码的蛋白分别移码突变后提前终止。种植T1代(T0代自交产生)，至成熟期，测定T1代纯合的敲除突变体植株和非转基因野生型植株的株高、拍照，并利用TTEST进行统计学分析野生型和T1代纯合的敲除突变体植株株高差异的显著性。结果(见图7和图8)以非转基因野生型植株株高作为100％，Cas9敲除OsKTN80b基因水稻植株的株高降低了约13-15％。

同时测定了成熟期水稻植株不同节间长度。结果(见表1)显示OsKTN80b基因被敲除水稻植株的第一节间(P1)、第二节间(P2)、第三节间(P3)、第四节间(P4)和第五节间(P5)均小于非转基因水稻。这些结果表明，OsKTN80b基因的功能缺失能够抑制每一节间的延伸。

表1Nip与OsKTN80b基因敲除突变体的植株节间长度比较

P(cm)

P1(cm)

P2(cm)

P3(cm)

P4(cm)

P5(cm)

Nip

21.18±1.94

39.95±3.30

21.84±1.70

13.53±1.32

5.94±1.82

1.65±0.79

Osktn80b

19.75±0.88

34.29±1.98

16.89±0.87

7.69±1.26

2.26±0.65

0.59±0.18

T检测

**

注：其中Nip为野生型日本晴；Osktn80b为OsKTN80b基因敲除突变体水稻植株。

综上所述，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OskTN80b基因进行敲除，获得了多个不同突变方式的突变体，其T1代纯合突变的植株都表现为株高降低。说明本发明方法可用于降低水稻株高，提高水稻的抗倒伏能力，最终提高水稻产量。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> OskTN80b基因在降低水稻株高方面的应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2814

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atgacgacca acaccaagcg cgcctacaag ctccaggagt ttgtggcgca ttcatccaat 60

gtcaactgcc tcaagattgg gaggaagact tcacgagttc tcgtgacagg aggagatgac 120

cataaggtta atctttgggc tattgggaag cccaattcaa ttttgagttt atcagggcac 180

accagtgctg tggagtctgt taattttgat tccacagaag ttttcgtggc cgcaggagca 240

gccagtggaa caataaaact atgggattta gaggaggcaa aaattgtccg cacgcttact 300

ggacataggt caaactgcat gtcagttgat ttccatcctt ttggagaatt ctttgcctcg 360

gggtcactgg acacaaatct gaagatatgg gatataagaa ggaagggctg tatccacacg 420

tacaaaggcc acacaagagg tgtaaatgca attagattca cacctgatgg ccgctgggtt 480

gtgtctggtg gtgaagataa tgttgtgaag ctctgggatc tgacagctgg aaagttatta 540

catgatttca agtgtcatga aggccagatt cagtgcatag atttccatcc ccatgagttc 600

cttctggcaa caggttcatc cgataaaact gtcaagtttt gggatttgga gacctttgaa 660

ttgattgggt ctactggacc tgagacaaca ggtgttcgat ccatgacatt caatcctgat 720

ggaagatctc tgttgtgtgg gttgcatgaa agtttaaagg ttttctcttg ggaaccaata 780

agatgtcatg ataccgttga tgtgggatgg tctagactgt ctgatctaaa tgtccacgag 840

ggaaaacttc ttggttgttc atttaatcaa agttgtgttg gaatatgggt tgtagatcta 900

acgcgtcttg agccatatgc aacgggtact tcaacaaaat taaatggtca ttcagagttg 960

aaaagttcgt caagtagcac tatgccatta caaaatgaca gtggttcaag ggctaacatt 1020

gggcggttat cagttctaca aaattctgag aataacataa agtcttctac aggaagatta 1080

tcagtttctc aaaattcaga ctctgcattg aaagagacaa aatcaacaac ttcaagcggg 1140

ttggttccag tcacacctca gagagctggt aatggctcca gtaccaaaac agttggaaat 1200

tcaacctttg catctagtgg caccaacctg aagagaggtt cactgaagag taacaactct 1260

tctagtcttc agaattttag caaaattgat gtggtgcctg tgataatacc aagaactagc 1320

tcaggaccag agctggctac tgattctagg agtgatgctg ctgatgtggg ccctgttctt 1380

tctaagagtg gtagaagaat agagattgca aatgattcta ggaaagaaag ttctgatgtg 1440

gcagcagctg ttgttcccag aacaaactct agaacagaaa tggcctctga ttcagcacct 1500

gttgttggtc ccagagctaa cttaagaatg gaagtaagcg ctgactcggc acctattgtt 1560

cccaagtcag gcagaaggtt agagtcttct gttgaatcta ggaaagaaag tactgatgta 1620

gcatctgctg ctgctccgaa gactagttca cggatggaag tggccccaga ttctgcacct 1680

cttctttcta aggcaggcag aagggtagag tctgctactg attcaaggaa agaaagtgct 1740

gatgtggcac ctgttgttcc cagaacaact tctagaatgg aaatggctcc ggattctagg 1800

agagaaattt ctgctggaag aatgtcaccg tttagggtcc aatcaagata tagtgaacta 1860

cgaaagttaa ataatgccaa agctgatgca gataaagttg atgcagggag caaaaacagt 1920

gaaacagatg attttacttg tcaaatatac cttcctcgga ggaatggtgt tgttcagtct 1980

ggaatttctg aagaaacccg ggaagatgca aaacctggtg tgattgacag gatgggattt 2040

ccaagttctg ctgaaccaaa tacacaccgc agtgagaatt atgtttctag aatgcgtaag 2100

ccaagagata actgctatat tgaagtttca agagcaggaa gaacaaggcc aactgcttct 2160

aattgggaaa gcagagatca gtcacctggt aatgaagaac cgacaacaag caattcttct 2220

tcgatggctc ctacaggccg attatattca tctagaggaa gcagtcaagc tgctgaaact 2280

ccaacgatag caagtgatga ggatgttcta tctgttctaa tggagcagca tgagctattt 2340

ctaagctcaa ctcgatctcg gttgacaaaa ttgcagattg ttcatcaaat gtggcaaaga 2400

aatgatatac ggggcattat tgcagcaatg gagaagatgt ctgatcatgc cgtatctgct 2460

gatgttgcaa gtgttctgat ggagaaaagt gaaacaatca cactagattt atgtactgtt 2520

attctgcccg tccttactga ccttctggag agtaaaactg acaggcactt aggtgtttca 2580

ctggaattgt tggtgaagct tgtcaggacg tttggatcag taatacattc aacagtatca 2640

gctggtccct cttctgttgg tgtagatctg caagcagagc aaaggcggga gcgttgcaac 2700

ctatgcttta ttgaattgga gaaggtcaaa aataagcttc catttctttc cagaagaaaa 2760

ggggcagtcg caaacacggc acaggagctc agtcttgtct tccaggaagt tatg 2814

<210> 2

<211> 938

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2

Met Thr Thr Asn Thr Lys Arg Ala Tyr Lys Leu Gln Glu Phe Val Ala

1 5 10 15

His Ser Ser Asn Val Asn Cys Leu Lys Ile Gly Arg Lys Thr Ser Arg

20 25 30

Val Leu Val Thr Gly Gly Asp Asp His Lys Val Asn Leu Trp Ala Ile

35 40 45

Gly Lys Pro Asn Ser Ile Leu Ser Leu Ser Gly His Thr Ser Ala Val

50 55 60

Glu Ser Val Asn Phe Asp Ser Thr Glu Val Phe Val Ala Ala Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ser Gly Thr Ile Lys Leu Trp Asp Leu Glu Glu Ala Lys Ile Val

85 90 95

Arg Thr Leu Thr Gly His Arg Ser Asn Cys Met Ser Val Asp Phe His

100 105 110

Pro Phe Gly Glu Phe Phe Ala Ser Gly Ser Leu Asp Thr Asn Leu Lys

115 120 125

Ile Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Cys Ile His Thr Tyr Lys Gly His

130 135 140

Thr Arg Gly Val Asn Ala Ile Arg Phe Thr Pro Asp Gly Arg Trp Val

145 150 155 160

Val Ser Gly Gly Glu Asp Asn Val Val Lys Leu Trp Asp Leu Thr Ala

165 170 175

Gly Lys Leu Leu His Asp Phe Lys Cys His Glu Gly Gln Ile Gln Cys

180 185 190

Ile Asp Phe His Pro His Glu Phe Leu Leu Ala Thr Gly Ser Ser Asp

195 200 205

Lys Thr Val Lys Phe Trp Asp Leu Glu Thr Phe Glu Leu Ile Gly Ser

210 215 220

Thr Gly Pro Glu Thr Thr Gly Val Arg Ser Met Thr Phe Asn Pro Asp

225 230 235 240

Gly Arg Ser Leu Leu Cys Gly Leu His Glu Ser Leu Lys Val Phe Ser

245 250 255

Trp Glu Pro Ile Arg Cys His Asp Thr Val Asp Val Gly Trp Ser Arg

260 265 270

Leu Ser Asp Leu Asn Val His Glu Gly Lys Leu Leu Gly Cys Ser Phe

275 280 285

Asn Gln Ser Cys Val Gly Ile Trp Val Val Asp Leu Thr Arg Leu Glu

290 295 300

Pro Tyr Ala Thr Gly Thr Ser Thr Lys Leu Asn Gly His Ser Glu Leu

305 310 315 320

Lys Ser Ser Ser Ser Ser Thr Met Pro Leu Gln Asn Asp Ser Gly Ser

325 330 335

Arg Ala Asn Ile Gly Arg Leu Ser Val Leu Gln Asn Ser Glu Asn Asn

340 345 350

Ile Lys Ser Ser Thr Gly Arg Leu Ser Val Ser Gln Asn Ser Asp Ser

355 360 365

Ala Leu Lys Glu Thr Lys Ser Thr Thr Ser Ser Gly Leu Val Pro Val

370 375 380

Thr Pro Gln Arg Ala Gly Asn Gly Ser Ser Thr Lys Thr Val Gly Asn

385 390 395 400

Ser Thr Phe Ala Ser Ser Gly Thr Asn Leu Lys Arg Gly Ser Leu Lys

405 410 415

Ser Asn Asn Ser Ser Ser Leu Gln Asn Phe Ser Lys Ile Asp Val Val

420 425 430

Pro Val Ile Ile Pro Arg Thr Ser Ser Gly Pro Glu Leu Ala Thr Asp

435 440 445

Ser Arg Ser Asp Ala Ala Asp Val Gly Pro Val Leu Ser Lys Ser Gly

450 455 460

Arg Arg Ile Glu Ile Ala Asn Asp Ser Arg Lys Glu Ser Ser Asp Val

465 470 475 480

Ala Ala Ala Val Val Pro Arg Thr Asn Ser Arg Thr Glu Met Ala Ser

485 490 495

Asp Ser Ala Pro Val Val Gly Pro Arg Ala Asn Leu Arg Met Glu Val

500 505 510

Ser Ala Asp Ser Ala Pro Ile Val Pro Lys Ser Gly Arg Arg Leu Glu

515 520 525

Ser Ser Val Glu Ser Arg Lys Glu Ser Thr Asp Val Ala Ser Ala Ala

530 535 540

Ala Pro Lys Thr Ser Ser Arg Met Glu Val Ala Pro Asp Ser Ala Pro

545 550 555 560

Leu Leu Ser Lys Ala Gly Arg Arg Val Glu Ser Ala Thr Asp Ser Arg

565 570 575

Lys Glu Ser Ala Asp Val Ala Pro Val Val Pro Arg Thr Thr Ser Arg

580 585 590

Met Glu Met Ala Pro Asp Ser Arg Arg Glu Ile Ser Ala Gly Arg Met

595 600 605

Ser Pro Phe Arg Val Gln Ser Arg Tyr Ser Glu Leu Arg Lys Leu Asn

610 615 620

Asn Ala Lys Ala Asp Ala Asp Lys Val Asp Ala Gly Ser Lys Asn Ser

625 630 635 640

Glu Thr Asp Asp Phe Thr Cys Gln Ile Tyr Leu Pro Arg Arg Asn Gly

645 650 655

Val Val Gln Ser Gly Ile Ser Glu Glu Thr Arg Glu Asp Ala Lys Pro

660 665 670

Gly Val Ile Asp Arg Met Gly Phe Pro Ser Ser Ala Glu Pro Asn Thr

675 680 685

His Arg Ser Glu Asn Tyr Val Ser Arg Met Arg Lys Pro Arg Asp Asn

690 695 700

Cys Tyr Ile Glu Val Ser Arg Ala Gly Arg Thr Arg Pro Thr Ala Ser

705 710 715 720

Asn Trp Glu Ser Arg Asp Gln Ser Pro Gly Asn Glu Glu Pro Thr Thr

725 730 735

Ser Asn Ser Ser Ser Met Ala Pro Thr Gly Arg Leu Tyr Ser Ser Arg

740 745 750

Gly Ser Ser Gln Ala Ala Glu Thr Pro Thr Ile Ala Ser Asp Glu Asp

755 760 765

Val Leu Ser Val Leu Met Glu Gln His Glu Leu Phe Leu Ser Ser Thr

770 775 780

Arg Ser Arg Leu Thr Lys Leu Gln Ile Val His Gln Met Trp Gln Arg

785 790 795 800

Asn Asp Ile Arg Gly Ile Ile Ala Ala Met Glu Lys Met Ser Asp His

805 810 815

Ala Val Ser Ala Asp Val Ala Ser Val Leu Met Glu Lys Ser Glu Thr

820 825 830

Ile Thr Leu Asp Leu Cys Thr Val Ile Leu Pro Val Leu Thr Asp Leu

835 840 845

Leu Glu Ser Lys Thr Asp Arg His Leu Gly Val Ser Leu Glu Leu Leu

850 855 860

Val Lys Leu Val Arg Thr Phe Gly Ser Val Ile His Ser Thr Val Ser

865 870 875 880

Ala Gly Pro Ser Ser Val Gly Val Asp Leu Gln Ala Glu Gln Arg Arg

885 890 895

Glu Arg Cys Asn Leu Cys Phe Ile Glu Leu Glu Lys Val Lys Asn Lys

900 905 910

Leu Pro Phe Leu Ser Arg Arg Lys Gly Ala Val Ala Asn Thr Ala Gln

915 920 925

Glu Leu Ser Leu Val Phe Gln Glu Val Met

930 935

<210> 3

<211> 9454

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

gttaattcaa aattttcgaa gcggaggagg gctgcgtctt ccttctccac cacccggccc 60

caaccagaca gctccattcc cccctccgcc tccgcctcca ccaccacctc gcccgcgcgc 120

accaaacccc aaatcgccac cgcatttgct ccacctgccc tcctctcgcc gcatctccgg 180

ggaggcggcg gcggcgggag agaggagggt ggtttggtcc cacgggggcg gtggcggcgg 240

cggaggaggc ggcgccgggt tcgcacaggg gtgggaggga ctgagggcgg gggcgtgtgt 300

ggtggagctg gcccggggga gggcggcggc gcgagatccg gggggtaggg gaggggggac 360

gggggagggg ggtggcgccg tggcggcggc gtgatctgga gatgagattg gagcccgagg 420

cgcggtgttc ggagacgacc tgcctgccat gacgaccaac accaagcgcg cctacaagct 480

ccgtatcctc gcgaattcgt ttccagtatt tttgactagt attttttgta ttttttttcg 540

aggtacattg tgtctgtttg accgatccat cgccactgtc gcattcattc tgctagctgg 600

gcgatttagt tcttcaaatt taacccatca ttttattatg cttttatctc gcttgcccct 660

cgttaagata atgggggatt tagtgtttgc tcgattttat cacttaagct gttgctgatc 720

actagttagt agtgaccgtg gttatgtctg attgtcggac aagtgggatt actgctgctt 780

tgtgcttatg aactgcctga agattgcaac atgatttatt tgggggtgat tttgtgggtg 840

aacttgcgac attggaatgc cttgacttgc gtttggcgta gaggagtttg tggcgcattc 900

atccaatgtc aactgcctca agattgggag gaagacttca cgagttctcg tgacaggagg 960

agatgaccat aaggttaatc tttgggctat tgggaagccc aattcaattt tggtaagtct 1020

ctattgtcct gttctgacta gtatgcctac tatgtaaaat gtggttctat agcaaaacag 1080

gcaagtaagt ctacccaata gtcaatgggg catttaatta accaccagat gaaaatttca 1140

ccattttagc tcttgtcgac ttctccagca tcactttctg tatgttggtg ttttattaac 1200

taggggctac ttttatgtga agtgtcaacc tactacctta catgtgttcg atcacagtgg 1260

gtctagctac tggaggtgtc atctgtgttg tttcagctga tggaatactt tatttgatta 1320

acttcttttt gttgttatac agagtttatc agggcacacc agtgctgtgg agtctgttaa 1380

ttttgattcc acagaagttt tcgtggccgc aggagcagcc agtggaacaa taaaactatg 1440

ggatttagag gaggcaaaaa gtacgtgaat gcgaatgcct tttgctgttg catatatacc 1500

tgaccacatt ccttgtctat atgtgaatgc aaatgctttt tactatcgca tgtatactga 1560

ctacattctg tgtcctatct tatttgatta gcaccacttg atttgttttg tatgcagttg 1620

tccgcacgct tactggacat aggtcaaact gcatgtcagt tgatttccat ccttttggag 1680

aattctttgc ctcggggtca ctggacacaa atctgaagat atgggatata agaaggaagg 1740

gctgtatcca cacgtacaaa ggccacacaa gaggtgtaaa tgcaattaga ttcacacctg 1800

atggccgctg ggttgtgtct ggtggtgaag ataatgttgt gaaggtaaga attgtcaatg 1860

cctaataatc tttcaaatca tacactacat cgttgtgctg attctgcggt agattctgct 1920

agcgtgaaga ttttagcaaa caggttgatt ttcctttagt gaactcaaca tgatgatgat 1980

gaatttgcct tacagtaaat tttccataga acttgttttt tcttatggta agtttgcctt 2040

ggcagctctg ggatctgaca gctggaaagt tattacatga tttcaagtgt catgaaggcc 2100

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tgttacaatg ctaatctgac acttagtcat caacttttct ttgacccttt tggttgtaca 2220

gcgtagtctg ttatacttaa ctcttgggct tccttcgttt agtgattaga aacatatgct 2280

gtacatgcta gtatagtagt atttgaaaat aatttaaatg gtaaactgca attcaccata 2340

ttatggctat aaatggtatg tgcccatata tatattgtga aagtcctggc agttttaata 2400

cactcccctt ttttgctgtc caacaatgcc aaacatcaaa ttgtcttgtt ctggcatttt 2460

ttaaattgct atgtcagtac atcggttatt atttctttgc gaaatatata tttttgcata 2520

ttttaatgac ctatttttga aatgaaagat ttgcatgaat ttttaagata ttggtatgtt 2580

ataatctttt cctccattga aattgtgtgc aatacaacaa tgtagttaga aatattttgt 2640

tcattggtgt agaataagaa tcccatttca gttatcatgg agatgcatac catttttgca 2700

gcctgggcac tgttcgaata taactgttta tgtcagaagt tgtgcttgcc tcttttttgt 2760

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catccgataa aactgtcaag ttttgggatt tggagacctt tgaattgatt gggtctactg 2880

gacctgaggt atgtaaaacc ttggggtttc gctataaagc tttgttatgc ttgcaagacc 2940

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tgtaaaggag tgcttcaaat gtttgtcctc atatttgttc tttcttatat tactccatta 3060

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tatttggtgt gcccaaccat attttactat gtcgtaatca gctctcaaca gcatgtcata 3360

acctcattat ctcctcaaaa catgtgggct acctgttcta gtgcatatgc tagaaggctc 3420

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acaactagca tatatacatc aagattagca caggctgccc aaagttcctg agaacctcaa 3600

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tcgatccatg acattcaatc ctgatggaag atctctgttg tgtgggttgc atgaaagttt 3720

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ataataccaa gaactagctc aggaccagag ctggctactg attctaggag tgatgctgct 4620

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gccccagatt ctgcacctct tctttctaag gcaggcagaa gggtagagtc tgctactgat 4980

tcaaggaaag aaagtgctga tgtggcacct gttgttccca gaacaacttc tagaatggaa 5040

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attgacagga tgggatttcc aagttctgct gaaccaaata cacaccgcag tgagaattgt 5340

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ctattcaaca acattaatgg tgcttgattt ccttgcctgt ctgtatattt tagtcataat 5460

acatgagtct tttggtactg tagatttcaa agctcatgta gatccatcga atctttatgt 5520

gatttaaacc atagttccat gtccttacac tcaatcaaga ataatgttag taactgaatt 5580

tatctgtttg aggtgttgcg ttgtatagtt agatatttgc atgtttcgtg gtcatcagct 5640

gagtctgatt aatcaatact cactttgcta catgttacct gggaaatgta tgggttggca 5700

tatcttatgt tctgattctt ttgagaaaca tgctctctgc tcttgttgag ttattatcct 5760

gtgtttcggc gaaaaaagtc tcttttcttt ggtaaactag taaattgtaa ctgctttgaa 5820

cattggtact ctttttgtag atgtttctag aatgcgtaag ccaagagata actgctatat 5880

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gctggtttta atcttgaagt atcatgtagg aagaacaagg ccaactgctt ctaattggga 6000

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attcaccatt ttaccttgat tgtatcatct ctaaccagta tggaattaaa atatagtata 6240

aatgaataaa ggaaaacgat gtcgtaagaa ttcaacatgt attccctccg tttcaaatta 6300

cttatcgttt ttgtttgtcc taagtaacat tcctaacttt gactatcagt ttctagaaat 6360

tcatatagtt caacaacatg taaactatat attatgaaag catttctcat ggtgaatcta 6420

aaaacataaa tcttatcatg ttggactata taaattttta aaaattaata gtcaaagtta 6480

gtaatgtttg acttaggaca aaagctaaaa cgacgagtaa tttgaaacgg agggagtgct 6540

tgttttattt aagagcagca aatgttgctt aatgggttat gtctttatct catggatgga 6600

tggatctgtt ttttgcccct tagtttctag ttgttgaatt agcacatact gacttctgtt 6660

acccagcttg tgtatgtgaa tatcatggac caaagatagg gcttaacaaa tccattctat 6720

accttgaata ttcaaccaaa gataaatcaa cagatcatga atcttactgt aatgaagagc 6780

tgtaaaccaa ctttgttttg gcagctctag cttatacctg gaaggttttg ccgaattcac 6840

ctattttcat gtttgatctt ctcttgtaca tggagagtca ctttctgtat cttatatttt 6900

gcagagagga agcagtcaag ctgctgaaac tccaacgata gcaagtgatg aggatgttct 6960

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tactgaaatt gtacttttta cctgaatgaa ttatgtaagt gcctatgagt tatctggctg 8220

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gctagaattg gcactttcca gtggatctta cgttttcctg aattaaatgc atagctccct 8400

gtcacttgcc gtttggttca tggtcactct ttgccacacc tcaacttagg tagctttggc 8460

cgagatagtt cattgtcacg cttgtggcaa gatttttttt taagcacctt ggtcccacat 8520

ggcattgttc accatattgt ggtgccaaat ttgttcgtct aaccttagac aagcttggca 8580

agaaaactat ggcaacccta ggcaatgtta taatacaaac caaacaacga atgtcaggct 8640

atcatgattc tgtggtatgt atttttgtaa tctttacatg ttttcccttg tttttttcaa 8700

cagaagaaaa ggggcagtcg caaacacggc acaggagctc agtcttgtct tccaggaagt 8760

tatgtagttg actgaccaca cactgtcata catacacaac tgaatgggaa atgcattccc 8820

gctgatggca ccaatgttgg gcatcagttg ccatggagag ctgttcgttc gtgcccagtc 8880

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tagtttattg tttggttgtg atgtctggtc gattcaatga caagattgat gaagagtgat 9240

tgagctcctt gtacacctgt acatcagttt tcttttgaat agtatttgag atctatactc 9300

ttgatcgaca cctttgttac tcgttggctt gtcacgtccc tacaacagct aatgtctgag 9360

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<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SG1

<400> 4

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<210> 5

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SG2

<400> 5

ttgaattgat tgggtctac 19

<210> 6

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligo1

<400> 6

tgtgtgcaga aggaactcat gggga 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligo2

<400> 7

aaactcccca tgagttcctt ctgca 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligo3

<400> 8

tgtgtgttga attgattggg tctac 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligo4

<400> 9

aaacgtagac ccaatcaatt caaca 25

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hpt-F

<400> 10

tacacaggcc atcggtccag a 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hpt-R

<400> 11

taggagggcg tggatatgtc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas9-OsKTN80b-1F

<400> 12

gcggtagatt ctgctagcgt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas9-OsKTN80b-1R

<400> 13

tgtttggcat tgttggacag 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas9-OsKTN80b-2F

<400> 14

ttgggcttcc ttcgtttagt ga 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas9-OsKTN80b-2R

<400> 15

agtcgaacag caaccaatga 20

Claims

1.OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用；其特征在于所述的OsKTN80b基因由SEQID No.1所示的核苷酸序列组成。

2.用于敲除水稻OsKTN80b基因的靶点序列，其特征在于所述的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合；其中所述的SG1由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成；所述的SG2由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成；即

SG1：5’-CAGAAGGAACTCATGGGGA-3’(SEQ ID No.4)；

SG2：5’-TTGAATTGATTGGGTCTAC-3’(SEQ ID No.5)。

3.权利要求2所述的靶点序列在降低水稻株高方面的应用。

4.用于敲除水稻OsKTN80b基因的sgRNA，其特征在于所述的sgRNA的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合。

5.权利要求4所述的sgRNA在降低水稻株高方面的应用。

6.通过敲除水稻OsKTN80b基因降低水稻株高的方法，其特征在于所述的敲除水稻OsKTN80b基因是通过CRISPR/Cas9系统实现的；所述的CRISPR/Cas9系统中，其sgRNA的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合，其中所述的SG1由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成；所述的SG2由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成。