CN101619094A

CN101619094A - 水稻株高相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101619094A
Application number: CN200810115895A
Authority: CN
Inventors: 程祝宽; 李明; 崔家骏; 唐丁
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2008-06-30
Publication date: 2010-01-06
Anticipated expiration: 2028-06-30
Also published as: CN101619094B

Abstract

本发明公开了水稻株高相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是如下a)或b)的蛋白：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与水稻株高相关的由a)衍生的蛋白质。该蛋白的编码基因具体可是如下1)或2)或3)的基因：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与株高相关蛋白的DNA分子；3)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述与株高相关蛋白的DNA分子。本发明的水稻株高相关蛋白及其编码基因，在分子育种工作中具有重要的应用价值。

Description

水稻株高相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及水稻株高相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

细胞壁是一个主要由纤维素、半纤维素、木质素、果胶和蛋白质构成的复合体(Delmer，1999)，细胞壁决定细胞的大小和形状，并且为细胞提供机械支持力和弹性，使细胞免受病原菌的侵害。研究表明，纤维素合酶(Cellulose synthase，Ces)是负责细胞壁中纤维素合成的一大类糖基转移酶。第一个被克隆的植物纤维素合酶是棉花的CesA(Cellulose synthase A)(pear，1996)，已有研究证明，CesA在植物体内以基因家族形式存在，多个CesA基因在纤维素合成过程中共同起作用。蛋白结构分析表明，纤维素合酶CesA的N末端的一段氨基酸可形成一个类似于锌指或LIM转录因子构象的特殊结构域，此种结构域具有保守序列CxxC(半胱氨酸氨-xx-半胱氨酸氨)，推测可能与蛋白间的相互作用有关(Delmer et al.，1999)。除上述已被鉴定的CesA基因家族外，植物体内还存在一大类基因家族，它们编码的氨基酸序列与CesA蛋白的序列同源性在70％～85％之间，但不含植物的CesA基因所特有的序列，而含有D、D、D、QXXRW的保守基序，属于第二糖苷转移酶家族(glycosyltransferasefamily 2，GT family 2)，被命名为纤维素合酶类似蛋白(cellulose synthase like protein，CSL)(Saxena and Brown，2000；Hazen et al.，2002)，结构分析表明，这类蛋白都具有完整的膜蛋白的结构特征，在C端有3-6个跨膜结构域，N端有1-2个跨膜结构域。目前，这些CSL基因的功能还不十分清楚，推测它们可能与细胞壁中其他多聚糖的合成有关。根据基因序列的不同，CSL可分为8个家族，分别为CslA、CslB、CslC、CslD、CslE、CslF CslG和CslH家族。生物信息学分析表明，拟南芥中CSLA、B、C、D、E、G这6个家族分别含有9、6、5、6、1和3个成员，共有30个基因(Richmond andSomerville，2000)；而水稻中的CSL基因则至少有37个成员组成，与拟南芥相比，不存在CslB和CslG家族，但是含有草本植物中特有的CslF和CslH家族(Hazen et al.，2002)。

目前尚不能从特定糖苷转移酶的氨基酸序列来推断其多糖产物的糖基组成及糖苷键类型。纤维素合酶的体外功能研究尚属空白。最近纤维素合酶类似蛋白的功能研究有了报导。在双子叶植物拟南芥中，并不存在β-D-葡聚糖，而水稻中则存在该类多糖，Burton等将水稻特有的ClsF基因转到拟南芥中进行表达，结果在转基因拟南芥中检测到了β-D-葡聚糖，证明了水稻的ClsF基因参与β-葡聚糖的合成(Burton et al.，2006)。Lipmen把4个来自拟南芥和水稻的CslA基因(AtCslA1、AtCslA2、AtCslA7和OsCslA 7)在昆虫S2细胞中表达，体外分析表明这些重组蛋白能够产生β-多聚甘露糖，表明它们具有甘露糖合成酶的功能，(Liepman et al.，2005，Keegstra and Walton，2006)。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻株高相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明的所提供的水稻株高相关蛋白，命名为ND1，来源于水稻，ND1是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与株高相关的由a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列2由1211个氨基酸残基组成。

为了使a)中的ND1便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b)中的ND1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的ND1的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述ND1的基因也属于本发明的保护范围。

ND1基因具体可为如1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与株高相关蛋白的DNA分子；

3)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述与株高相关蛋白的DNA分子。

所述步骤3)中的基因，与1)的基因最好有95％以上的同源性。

序列表中的序列1由3636个碱基组成，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质，自5′末端第1-3位为起始密码子。序列比较表明，该基因编码纤维素合酶类似蛋白，属CslD家族，与已知的OsCslD1、OsCslD2、OsCslD3序列不同。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt’s液，100ug/ml鲑鱼精DNA的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

扩增上述ND1基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述ND1编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有ND1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的ND1基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是水稻。

使用ND1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的ND1基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

本发明的另一个目的是提供一种利用ND1基因改变水稻株高和/或分蘖数的方法。

本发明所提供的利用ND1基因改变水稻株高和/或分蘖数的方法，是将ND1基因导入目的水稻组织或细胞中，得到株高和/或分蘖数改变的转基因水稻。

本发明的另一个目的是提供一种培育矮杆和/或分蘖数增加的水稻的方法，是沉默目的水稻中所含有的ND1基因，得到株高降低和/或分蘖数增加的转基因水稻。

本发明利用Co60射线对籼稻中籼3037进行辐射处理，筛选到一个水稻矮秆窄叶突变体nd1(narrow leaf and dwarf 1)，该突变体还具有多蘖、叶子半内卷等优良的农艺性状。通过构建籼粳杂交群体，利用图位克隆的方法，获得了来自中籼3037中控制这一性状的ND1基因。同时本发明构建了ND1 RNA干扰表达载体pRNAi-nd1和互补表达载体pCsld4，将RNA干扰表达载体pRNAi-nd1转入水稻中，敲除水稻的ND1基因，ND1基因敲除的水稻表现出窄叶矮杆性状；将互补表达载体pCsld4转入突变体nd1中，能恢复矮杆窄叶表型为野生型表型。这些实验结果说明ND1能控制水稻株高叶宽性状。本发明的水稻株高相关蛋白及其编码基因，在分子育种工作中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为籼稻中籼3037突变体nd1与籼稻中籼3037表型

A：苗期的籼稻中籼3037突变体nd1与籼稻中籼3037，左为籼稻中籼3037，右为突变体nd1；

B：成熟期的籼稻中籼3037突变体nd1与籼稻中籼3037，左为籼稻中籼3037，右为突变体nd1。

图2为籼稻中籼3037突变体nd1与籼稻中籼3037茎节和叶片切片

A：中籼3037第一茎节的纵切图，B：中籼3037突变体nd1第一茎节的纵切图，C：中籼3037突变体nd1叶片的横切图，D：中籼3037突变体nd1叶片的横切图。

图3：ND1基因敲除后日本晴植株表型及转对照载体的植株表型

具体实施方式

实施例1、ND1基因全长ORF的获得

1.水稻窄叶矮杆突变体nd1

a)水稻窄叶矮杆突变体nd1的表型分析

利用Co60射线对籼稻品种中籼3037的种子进行辐射处理，筛选到一个水稻矮秆窄叶突变体，命名为nd1(narrow leaf and dwarf 1)。该突变体的基本特征是：植株矮化，叶片变窄，且呈半内卷状态，分蘖数增加。nd1从苗期就有突变性状，如图1A所示，植株成熟后表型更加明显，如图1B所示。抽穗后，nd1的株高大约相当于野生型株高的60％，每个叶片都变窄，长度也明显变短，并且呈半内卷。PSII系统的光能利用率是植物衰老的一个重要指标，当植株叶片开始衰老时其光能利用率会随着降低。对成熟后期(抽穗20天)的nd1和野生型植株的光合系统II(PSII)的光能利用率进行测定，nd1的PSII系统的光能利用率相对较高，结果见表1，与野生型相比，nd1在成熟后期的衰老相对延迟。

一般情况下，水稻植株的矮化会直接或间接地影响植株的分蘖。为了比较nd1与野生型的分蘖，对二者的分蘖情况进行了调查。结果表明，nd1主茎各叶内初级分蘖的发生时期和野生型植株没有明显的差异。但nd1的分蘖数相比野生型明显地增加，在拔节期，野生型植株的分蘖数平均为10.23，而nd1的分蘖则为13.54个，结果如表1。

表1突变体nd1和野生型植株分蘖和光系统II比较

b)水稻突变体nd1的遗传分析

nd1来源于中籼3037，相对于水稻高秆品种南京6号而言，野生型中籼3037本身就含有一对隐性纯合矮秆基因SD1。将突变体nd1和高秆野生型品种南京6号进行杂交，根据株高的分布特征，nd1/南京6号的杂种F₂群体可以明显划分为高秆、半矮秆和矮秆(类似于nd1的株高)3类，这说明突变体nd1中含有两对矮秆基因，除含有野生型3037含有的SD1矮秆基因外，还含有一对新的矮秆基因ND1。

同时本发明构建了突变体nd1/3037和nd1/武运粳8号杂交组合，并且调查了1300株F₂个体植株。在这2000株F₂个体，矮生和窄叶这两个性状是共分离的，而且分离比为3∶1，结果见表2。

表2突变体nd1在不同组合F2代中的分离

c)突变体nd1的细胞学观察

本发明对突变体nd1和野生型植株的穗下节间进行了纵切，并通过显微镜进行了细胞学观察。结果表明突变体nd1与野生型相比，虽然细胞的排列上没有明显的变化，但细胞的长度明显缩短如图2A、B。另外，突变体nd1叶片主脉的发育也不正常，如图2C、D。这些结果说明突变体nd1的矮化可能主要由于节间伸长区细胞不能正常地伸长的缘故，但也不能排除由于细胞总体数目减少的因素。

2.ND1基因的获得

遗传分析证明该nd1突变是单基因隐性突变。利用图位克隆技术，通过配置的籼粳交F2群体，克隆ND1基因。

图位克隆(map-based cloning)，又称定位克隆(positional cloning)，1986年首先由剑桥大学的Coulson提出。该方法可以在基因产物未知的情况下，根据功能基因在基因组中的位置进行的，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因定位到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因。

1)ND1的初步定位

将突变体nd1和粳稻武运粳8号进行杂交并获得了F₂群体，选择200株具有典型突变性状的植株进行ND1基因的初步定位。应用STS分子标记，利用PCR的方法，发现位于第12染色体上的STS标记C60772、R877和S11447与突变位点在位置上具有明显的连锁性。突变位点和C60772之间的交换单株，绝大多数在突变位点和R877之间也进行交换，而这些交换单株又与突变位点和S11447之间的交换单株不同，因此推断突变基因可能位于标记R877和标记S11447之间的区域。参照已经完成的水稻基因组序列(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/和http://btn.genomics. org.cn)，对粳稻和籼稻的序列进行比较，利用序列差异发展了11个新的STS和CAPS分子标记，STS和CAPS分子标记序列见表3。利用这些标记对200个F₂突变体单株进行分析，发现标记S3和S2只能检测到一个交换单株，而且交换单株不同。而利用标记S5和S8在200个F₂突变体单株找不到交换单株，这2个标记和突变位点是共分离的。由于该区域的跨叠BAC序列已经测通，序列分析表明标记S2和S3之间的物理距离为280kb。因此，通过初步定位将候选基因定位于280kb的区域内。

表3.STS和CAPS标记

标记	引物序列	大小(bp)	内切酶	所在BAC
标记	引物序列	大小(bp)	内切酶	所在BAC	S1	5′-TAGGCCCATAAGGTCCATAG-3′5′-GGCACTCCAAGCAGCAGAT-3′	121	AL732640
S2	5′-ACAGGTCGCACTGAACTGGT-3′5′-CAACCGATGGCCGTGTTTA-3′	130		AL935070	S1	5′-TAGGCCCATAAGGTCCATAG-3′5′-GGCACTCCAAGCAGCAGAT-3′	121	AL732640
S2	5′-ACAGGTCGCACTGAACTGGT-3′5′-CAACCGATGGCCGTGTTTA-3′	130		AL935070	S3	5′-ATATTTTCGCTGGCGGTCCTC-3′5′-TTGTCAAATACGAATACCAG-3′	142	AL845342
S4	5′-AGGATCATATAGAGAACGCA-3′5′-AATCAGTTACTGCCACTCT-3′	161		AL845342	S3	5′-ATATTTTCGCTGGCGGTCCTC-3′5′-TTGTCAAATACGAATACCAG-3′	142	AL845342

S5	5′-TGTGGTTGAATTTGGAGGCT-3′5′-AATCTTCTAGCTGTCATTGT-3′	110		AL845342
S5	5′-TGTGGTTGAATTTGGAGGCT-3′5′-AATCTTCTAGCTGTCATTGT-3′	110		AL845342	S6	5′-TGTTTATAAACGATGGTGAT-3′5′-ATCCTTATGTGGAAATGACT-3′	146		AL845342
S7	5′-CCCATCGGTCTTATTCTACTG-3′5′-ACTGCGAGCTTTCTCCATT-3′	164		AL845342	S6	5′-TGTTTATAAACGATGGTGAT-3′5′-ATCCTTATGTGGAAATGACT-3′	146		AL845342
S7	5′-CCCATCGGTCTTATTCTACTG-3′5′-ACTGCGAGCTTTCTCCATT-3′	164		AL845342	S8	5′-ACGCCATCTGTGTATTAGTC-3′5′-GTTAGCATGCGAGTTTATC-3′	134		AL845342
C1	5′-CGCCCGGCTCGAGATCAAGT-3′5′-GGCCCTCCGTTTGTTTAGTTC-3′	1050	HaeIII	AL845342	S8	5′-ACGCCATCTGTGTATTAGTC-3′5′-GTTAGCATGCGAGTTTATC-3′	134		AL845342
C1	5′-CGCCCGGCTCGAGATCAAGT-3′5′-GGCCCTCCGTTTGTTTAGTTC-3′	1050	HaeIII	AL845342	C2	5′-CATAGTGCGGTCCTGTTCATC-3′5′-GCAGCCCAATTCCTCACAAAG-3′	900	RsaI	AL845342

2)ND1精细定位

进一步扩大突变体nd1和粳稻武运粳8号的杂交组合，获得了包含7024株突变单株的F₂分离群体，应用新发展的标记对该基因进行了精细定位。利用标记S2和S3对7024株突变单株进行分析，结果共检测到59个交换单株：标记S3检测到35个，而标记S2只检测到24个。利用位于这两个标记间的标记对检测到的59个交换单株进行分析，结果标记S5筛选到20个交换单株，标记C1筛选到7个交换单株；利用另一侧的标记S4检测到了14个交换单株，标记S8检测到了7个交换单株而标记S7检测到了2个交换单株；标记S6和C2检测不到交换单株，表明这两个标记和突变位点是共分离的。通过比较交换单株可以发现，两侧的交换单株都不相同。综上结果表明ND1基因最终被限定在水稻12号染色体AL845342BAC的标记C1和标记S7之间，这两个标记之间的物理距离约为24kb。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/rgadb)分析表明，24kb区域内共有3个基因，分别是：种子萌发相关基因，抗病相关基因PR-10a和类纤维素合酶D家族基因(putative Cellulose synthase-like D5)。

3)ND1基因的确定

通过上述的基因精细定位及生物信息学方面的分析，目的基因被锁定在三个候选基因之中。利用DNA序列测定的方法，分别将突变体基因组DNA和野生型基因组DNA中的种子萌发相关基因，抗病相关基因PR-10a和类纤维素合酶基因进行了序列分析，结果表明前两个基因没有发生突变，而类纤维素合酶基因的第二个外显子上有一个碱基发生了由C变成T的替换，从而导致该蛋白的第961个氨基酸发生了变化，由丙氨酸(Ala)变成了缬氨酸(Val)。因此，将类纤维素合酶基因确定为目标基因，命名为ND1。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS信息表明，该基因从起始密码子到终止密码子的基因组全长为3972bp，共有2个外显子，1个内含子，mRNA的全长为3636bp，共编码1211个氨基酸。

4)ND1基因全长ORF的获得

水稻中籼3037叶片总RNA提取采用QIAGEN公司RNA提取试剂盒，以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，用引物primer 1(5’-ATGTCGCGGCGGCTGTCGTT-3’)和primer 2(5’-CTATGGGAAGCTGAATCCGC-3’)，进行PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：

模板(cDNA) 5μl(5ng)

primer 1和primer 2 终浓度各0.2μM

dNTP 终浓度各200μM

LA Taq DNA聚合酶 2.5U

10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5μl

用双蒸水补足至50μl体积。

反应程序如下：

94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸3分钟，扩增30个循环；最后在72℃下延伸10分钟。

扩增产物用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen，28706)按产品说明书进行纯化，然后与pGEM-T EASY载体(Promega，A1360)在16℃下连接8小时，构建重组载体pGEM-ND1。使用2mm电极杯，2500V将重组载体pGEM-ND1转化大肠杆菌DH5a，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，对质粒进行测序，测序使用AbI PRISM 3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)，测序结果表明，扩增到的片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，将该片段命名为ND1，ND1全长3636bp，其编码的氨基酸序列见序列表中序列2。

实施例3、ND1功能互补实验

1)互补表达载体pCsld4的构建

利用XbaI和HpaI对BAC OsJNBa0027H05(购自中国科学院国家基因研究中心)进行酶切，获得包含有ND1的起始密码子ATG上游的3005个碱基和终止密码子TGA后的3360个碱基的全长序列的DNA片段(10268bp)，克隆到pCAMBIA1300(CAMBIA，Canberra，Australia)的XbaI和SmaI识别位点间，即构建成了互补表达载体pCsld4。将构建好的互补载体pCsld4用BamHI酶切，去除ND1基因的编码区，保留基因的5′启动子区域和3′调控区，即构建成了互补对照载体pCsld4T。

2)ND1功能互补

互补表达载体pCsld4和互补对照载体pCsld4T通过电击的方法分别转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105中，利用农杆菌的介导法分别将pCsld4和pCsld4T转入矮杆窄叶突变体nd1与日本晴杂交群体的自交F3代隐性个体(具有矮杆窄叶表型的个体)。转化的具体方法如下：将该F3代隐性个体幼胚脱壳灭菌，接种到诱导愈伤组织的培养基中，培养3周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体；用含有pCsld4和pCsld4T质粒的EHA105菌株分别浸染水稻愈伤组织；在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株；将潮霉素抗性植株在阴凉处练苗，7天后移栽到水田，观察转基因植株的表型恢复情况。

ND1功能互补实验结果表明，转pCsld4载体的水稻154株中有135株恢复矮杆窄叶表型为野生型表型，而转pCsld4T载体的水稻138株中没有一株恢复矮杆窄叶表型为野生型表型，说明ND1能控制水稻矮杆窄叶性状。

实施例4、培育矮杆和/或分蘖数增加的水稻

1)ND1 RNA干扰载体的构建

提取水稻中籼3037叶片总RNA，以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，用引物primer 3(5’-ctgcagcattcacatgagagatcctc-3，下划线为PstI识别位点)和primer 4(5’-ctgcagagaagttgagcacgtggccg-3，下划线为PstI识别位点)，进行PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积50μl：模板，5μl(5ng)；正向引物primer 3和反向引物primer 4，终浓度各0.2μM；dNTP，终浓度各200μM；LA Taq DNA聚合酶，2.5U；10×Taq DNA聚合酶缓冲液，5μl；用双蒸水补足至50μl体积。

反应程序如下：

94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸40秒，扩增30个循环；最后在72℃下延伸10分钟。

扩增产物用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen，28706)按产品说明书进行纯化，然后与pGEM-T EASY载体(Promega，A1360)在16℃下连接8小时，构建重组载体pGEM-ND1。使用2mm电极杯，2500V将重组载体pGEM-ND1转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，对质粒进行测序。将测序正确的pGEM-ND1质粒用PstI双切，回收605bp片段，将该片段正反双向连接到用PstI酶切的pCAMBIA23A(以pCAMBIA2300为出发载体，在其KpnI和SmaI位点插入Actin启动子)载体上，即构建成了RNA干扰载体，命名为：pRNAi-nd1。

2)矮杆和/或分蘖数增加的水稻的获得

将RNAi-nd1载体和pCAMBIA23A载体(空载体)通过电击的方法分别转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105中，利用农杆菌的介导法分别将RNAi-nd1和空载体转入日本晴，水稻转化的具体方法如实施例3。

将上述获得的抗性植株在阴凉处练苗，7天后移栽到水田，观察转基因植株的表型情况。

在水稻拔节期和抽穗后10天分别统计转RNAi-nd1载体和空载体的水稻的分蘖数和株高。转RNAi-nd1载体和空载体的水稻的株高和分蘖数的结果如表4。

表4.转RNAi-nd1载体和空载体的水稻的株高和分蘖数对比

名称	转RNAi-nd1载体的水稻(日本晴)	转空载体的水稻(日本晴)	未转基因的水稻(日本晴)
名称	转RNAi-nd1载体的水稻(日本晴)	转空载体的水稻(日本晴)	未转基因的水稻(日本晴)	抽穗后10天株高	49.85±0.87	90.39±0.54	90.55±0.68
拔节期的有效分蘖数	28±0.33	15.23±0.54	15.38±0.68	抽穗后10天株高	49.85±0.87	90.39±0.54	90.55±0.68

统计结果表明，转RNAi-nd1载体的水稻主茎各叶内初级分蘖的发生时期与野生型和转空载体的水稻没有明显的差异。与野生型和转空载体的水稻相比，转RNAi-nd1载体的水稻的分蘖数明显地增加，在拔节期，转RNAi-nd1植株的分蘖数为28±0.33个，而转空载体的水稻的分蘖则为15.23±0.54个；与抽穗后10天时的野生型和转空载体的水稻相比，转RNAi-nd1载体的水稻的株高为49.85±0.87明显低于野生型和转空载体的水稻的株高90.39±0.54。

上述实验结果综合表明，利用本实施例的方法，能够改变水稻的株高和分蘖数，培育矮杆和/或分蘖数增加的水稻品种。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>水稻株高相关蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARW81458

<160>2

<210>1

<211>

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa indica)

<400>1

atgtcgcggc ggctgtcgtt gccggcgggg gcgccggtga cggtggcggt gtcgccggtg 60

cggagcccgg ggggtgacgc ggtggtgagg agggggagcg ggctgacgtc ccccgtgccg 120

aggcactcgc tcgggtcgtc caccgccacg ctgcaggtgt cgccggtgag gcggagcggc 180

gggagtaggt acctcggcgc gtcgagggat ggcggcgccg atgagagcgc cgagttcgtg 240

cactacaccg tgcacatccc gcccacgccc gaccgggcga cggcgtccgt ggcgagcgag 300

gcggaggccg aggaggtgca ccggccgcag cggagctaca tctccgggac gatattcacc 360

ggggggctca actgcgccac gcgcggccac gtgctcaact tctccggcga gggcggcgcc 420

accgccgcct ccagggcggc ggcgtcgggg aacatgtcgt gcaagatgcg cgggtgcgac 480

atgcccgcgt tcctcaacgg cggccgcccg ccgtgcgact gcgggttcat gatctgcaag 540

gagtgctacg cggagtgcgc cgcgggcaac tgccccggtt gcaaggaggc cttctccgcg 600

ggctccgaca ccgacgaatc cgactccgtc accgacgacg acgacgacga ggccgtctcc 660

tcctccgagg agagggacca gctgccgctg acatccatgg cgaggaaatt ttccgtggtg 720

cactccatga aggtccccgg cgccgccgcc aacggcaacg gcaagccggc cgagttcgac 780

cacgcccgct ggctcttcga gaccaagggc acctatggct acggcaacgc tctctggccc 840

aaggacggcc acgcccatag cggcgccggc ttcgtcgccg ccgacgagcc ccccaacttc 900

ggtgcccgct gccgccgccc cctcaccaga aaaaccagcg tctcccaagc cattctcagc 960

ccctacaggt tgttgattgc gattcggctg gtggcgctgg ggttcttcct cgcgtggagg 1020

attcggcatc cgaatccgga ggcggtgtgg ctgtgggcga tgtcggtggc gtgcgaggtg 1080

tggttcgcct tctcatggct gctcgacagc ctccccaagc tctgccccgt ccaccgcgcc 1140

gccgacctcg ccgtcctcgc cgagcggttc gagtcgccga cggcgcgcaa ccccaagggc 1200

cgctccgacc tccccgggat cgacgtgttc gtcaccagcg ccgacccgga gaaggagccg 1260

ccgctggtca ccgccaacac catcctctcc atcctcgccg cggactaccc cgtcgagaag 1320

ctcgcttgct acctctccga cgacggcggc gcgctgctgt cgttcgaggc gctcgccgag 1380

acggccagct tcgcgcgcac gtgggtgcca ttctgccgca agcacggcgt cgagccgcgg 1440

tgccccgagg cgtatttcgg ccagaagagg gacttcctca agaacaaggt gcgcgtcgac 1500

ttcgtccgcg agaggcggaa ggtgaagcgc gagtacgacg agttcaaggt gcgggtgaac 1560

tcgctccccg aggcgatccg gcggcgctcc gacgcgtaca acgccggcga ggaactgcgc 1620

gccaggaggc ggcagcagga ggaggccgcc gccgcggctg ccgccggcaa cggcgagctt 1680

ggagcggcgg cggtcgagac cgccgccgtg aaggccacgt ggatgtcgga cggctcgcac 1740

tggccgggga cgtggacgtg ccccgcggcg gaccacgccc gcggcgacca cgccgggatc 1800

atccaggcga tgctggcgcc gccgacctcg gagccggtga tgggaggcga ggcggcggag 1860

tgcggcgggc tgatcgacac cacgggcgtg gacgtccgcc tcccgatgct ggtgtacgtg 1920

tcgcgggaga agcgcccggg ctacgatcac aacaagaagg ccggcgccat gaacgcgctg 1980

gtgcggacga gcgccatcat gtcgaacggg cccttcatcc tcaacctcga ctgcgaccac 2040

tacgtgcaca actcgtcggc gctccgggag gggatgtgct tcatgctcga ccgcggcggc 2100

gaccgcgtgt gcttcgtcca gttcccgcag cggttcgagg gcgtcgaccc cagcgaccgg 2160

tacgccaacc acaacctcgt cttcttcgac gtgtccatgc gcgccatgga cgggcttcag 2220

ggccccatgt acgtcggcac cggctgcgtc ttccgccgca ccgcgctgta cggcttcagc 2280

ccgccccgcg ccaccgagca ccatggctgg ctcggccgca ggaagatcaa gctgttcctc 2340

accaagaaga agagcatggg caagaagacg gacagggccg aggacgacac cgagatgatg 2400

ctgccgccga tcgaggacga cgacggcggc gccgacattg aggcctcggc tatgctaccg 2460

aagcggttcg gcgggtcggc gacgttcgtg gcgtcgatac ccgtggcgga gtaccagggt 2520

cggctgctgc aggacacccc cgggtgccac cacggccgcc ctgcgggcgc gctcgctgtg 2580

ccgcgcgagc cgctcgacgc ggcgacggtg gcggaggcca tcggcgtgat ctcctgcttc 2640

tacgaggaga agacggagtg ggggcggcgc atcgggtgga tctacggctc cgtcaccgag 2700

gacgtggtca ccggctaccg gatgcacaac cgcgggtggc gctccgtcta ctgcgtgacg 2760

ccgcggcgcg acgcgttccg cggcacggcg ccgatcaacc tcaccgaccg cctccaccag 2820

gtgctccggt gggcgacggg ctccgtcgag atcttcttct cccgcaacaa cgccctcttc 2880

gcctcgccgc ggatgaagct gctgcagcgc gtcgcctact tcaacgccgg gatgtacccc 2940

ttcacctccg tgttcctcct cgcctactgc ctcctcccgg ccgtctccct cttctccggc 3000

aagctcatcg tgcagcgact cagcgccacc ttcctcgcct tcctcctcgt catcaccctc 3060

accctctgcc tcctcgccct gctcgagatc aagtggtccg ggatcacgct ccacgagtgg 3120

tggcgcaacg agcagttctg ggtgatcggc ggcaccagcg cgcacccggc cgccgtgctg 3180

cagggcctac tcaaggtgat cgccggcgtg gacatctcct tcacgctgac ctccaagccg 3240

gggaacggcg gcggcgatgg cggggtcggc ggcgagggga acgacgacga ggcgttcgcg 3300

gagctgtacg aggtgaggtg gagctacctg atggtgccgc cggtgacgat catgatggtg 3360

aacgcggtgg cgatcgcggt ggcggcggcg aggacgctgt acagcgagtt cccgcagtgg 3420

agcaagctgc tcggcggcgc cttcttcagc ttctgggtgc tgtgccacct ctacccgttc 3480

gccaagggcc tcctcggccg ccgcggccgc gtgcccacca tcgtcttcgt ctggtcgggc 3540

ctcatctcca tgatcatctc cctcctctgg gtctacatca acccgcccgc cggcgcccgg 3600

gagcgcatcg gcggcggcgg attcagcttc ccatag 3636

<210>2

<211>

<212>PRT

<213>稻属水稻(Oryza sativa indica)

<400>2

Met Ser Arg Arg Leu Ser Leu Pro Ala Gly Ala Pro Val Thr Val Ala

1 5 10 15

Val Ser Pro Val Arg Ser Pro Gly Gly Asp Ala Val Val Arg Arg Gly

20 25 30

Ser Gly Leu Thr Ser Pro Val Pro Arg His Ser Leu Gly Ser Ser Thr

35 40 45

Ala Thr Leu Gln Val Ser Pro Val Arg Arg Ser Gly Gly Ser Arg Tyr

50 55 60

Leu Gly Ala Ser Arg Asp Gly Gly Ala Asp Glu Ser Ala Glu Phe Val

65 70 75 80

His Tyr Thr Val His Ile Pro Pro Thr Pro Asp Arg Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Val Ala Ser Glu Ala Glu Ala Glu Glu Val His Arg Pro Gln Arg Ser

100 105 110

Tyr Ile Ser Gly Thr Ile Phe Thr Gly Gly Leu Asn Cys Ala Thr Arg

115 120 125

Gly His Val Leu Asn Phe Ser Gly Glu Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ser

130 135 140

Arg Ala Ala Ala Ser Gly Asn Met Ser Cys Lys Met Arg Gly Cys Asp

145 150 155 160

Met Pro Ala Phe Leu Asn Gly Gly Arg Pro Pro Cys Asp Cys Gly Phe

165 170 175

Met Ile Cys Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Cys Ala Ala Gly Asn Cys Pro

180 185 190

Gly Cys Lys Glu Ala Phe Ser Ala Gly Ser Asp Thr Asp Glu Ser Asp

195 200 205

Ser Val Thr Asp Asp Asp Asp Asp Glu Ala Val Ser Ser Ser Glu Glu

210 215 220

Arg Asp Gln Leu Pro Leu Thr Ser Met Ala Arg Lys Phe Ser Val Val

225 230 235 240

His Ser Met Lys Val Pro Gly Ala Ala Ala Asn Gly Asn Gly Lys Pro

245 250 255

Ala Glu Phe Asp His Ala Arg Trp Leu Phe Glu Thr Lys Gly Thr Tyr

260 265 270

Gly Tyr Gly Asn Ala Leu Trp Pro Lys Asp Gly His Ala His Ser Gly

275 280 285

Ala Gly Phe Val Ala Ala Asp Glu Pro Pro Asn Phe Gly Ala Arg Cys

290 295 300

Arg Arg Pro Leu Thr Arg Lys Thr Ser Val Ser Gln Ala Ile Leu Ser

305 310 315 320

Pro Tyr Arg Leu Leu Ile Ala Ile Arg Leu Val Ala Leu Gly Phe Phe

325 330 335

Leu Ala Trp Arg Ile Arg His Pro Asn Pro Glu Ala Val Trp Leu Trp

340 345 350

Ala Met Ser Val Ala Cys Glu Val Trp Phe Ala Phe Ser Trp Leu Leu

355 360 365

Asp Ser Leu Pro Lys Leu Cys Pro Val His Arg Ala Ala Asp Leu Ala

370 375 380

Val Leu Ala Glu Arg Phe Glu Ser Pro Thr Ala Arg Asn Pro Lys Gly

385 390 395 400

Arg Ser Asp Leu Pro Gly Ile Asp Val Phe Val Thr Ser Ala Asp Pro

405 410 415

Glu Lys Glu Pro Pro Leu Val Thr Ala Asn Thr Ile Leu Ser Ile Leu

420 425 430

Ala Ala Asp Tyr Pro Val Glu Lys Leu Ala Cys Tyr Leu Ser Asp Asp

435 440 445

Gly Gly Ala Leu Leu Ser Phe Glu Ala Leu Ala Glu Thr Ala Ser Phe

450 455 460

Ala Arg Thr Trp Val Pro Phe Cys Arg Lys His Gly Val Glu Pro Arg

465 470 475 480

Cys Pro Glu Ala Tyr Phe Gly Gln Lys Arg Asp Phe Leu Lys Asn Lys

485 490 495

Val Arg Val Asp Phe Val Arg Glu Arg Arg Lys Val Lys Arg Glu Tyr

500 505 510

Asp Glu Phe Lys Val Arg Val Asn Ser Leu Pro Glu Ala Ile Arg Arg

515 520 525

Arg Ser Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Glu Glu Leu Arg Ala Arg Arg Arg

530 535 540

Gln Gln Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asn Gly Glu Leu

545 550 555 560

Gly Ala Ala Ala Val Glu Thr Ala Ala Val Lys Ala Thr Trp Met Ser

565 570 575

Asp Gly Ser His Trp Pro Gly Thr Trp Thr Cys Pro Ala Ala Asp His

580 585 590

Ala Arg Gly Asp His Ala Gly Ile Ile Gln Ala Met Leu Ala Pro Pro

595 600 605

Thr Ser Glu Pro Val Met Gly Gly Glu Ala Ala Glu Cys Gly Gly Leu

610 615 620

Ile Asp Thr Thr Gly Val Asp Val Arg Leu Pro Met Leu Val Tyr Val

625 630 635 640

Ser Arg Glu Lys Arg Pro Gly Tyr Asp His Asn Lys Lys Ala Gly Ala

645 650 655

Met Asn Ala Leu Val Arg Thr Ser Ala Ile Met Ser Asn Gly Pro Phe

660 665 670

Ile Leu Asn Leu Asp Cys Asp His Tyr Val His Asn Ser Ser Ala Leu

675 680 685

Arg Glu Gly Met Cys Phe Met Leu Asp Arg Gly Gly Asp Arg Val Cys

690 695 700

Phe Val Gln Phe Pro Gln Arg Phe Glu Gly Val Asp Pro Ser Asp Arg

705 710 715 720

Tyr Ala Asn His Asn Leu Val Phe Phe Asp Val Ser Met Arg Ala Met

725 730 735

Asp Gly Leu Gln Gly Pro Met Tyr Val Gly Thr Gly Cys Val Phe Arg

740 745 750

Arg Thr Ala Leu Tyr Gly Phe Ser Pro Pro Arg Ala Thr Glu His His

755 760 765

Gly Trp Leu Gly Arg Arg Lys Ile Lys Leu Phe Leu Thr Lys Lys Lys

770 775 780

Ser Met Gly Lys Lys Thr Asp Arg Ala Glu Asp Asp Thr Glu Met Met

785 790 795 800

Leu Pro Pro Ile Glu Asp Asp Asp Gly Gly Ala Asp Ile Glu Ala Ser

805 810 815

Ala Met Leu Pro Lys Arg Phe Gly Gly Ser Ala Thr Phe Val Ala Ser

820 825 830

Ile Pro Val Ala Glu Tyr Gln Gly Arg Leu Leu Gln Asp Thr Pro Gly

835 840 845

Cys His His Gly Arg Pro Ala Gly Ala Leu Ala Val Pro Arg Glu Pro

850 855 860

Leu Asp Ala Ala Thr Val Ala Glu Ala Ile Gly Val Ile Ser Cys Phe

865 870 875 880

Tyr Glu Glu Lys Thr Glu Trp Gly Arg Arg Ile Gly Trp Ile Tyr Gly

885 890 895

Ser Val Thr Glu Asp Val Val Thr Gly Tyr Arg Met His Asn Arg Gly

900 905 910

Trp Arg Ser Val Tyr Cys Val Thr Pro Arg Arg Asp Ala Phe Arg Gly

915 920 925

Thr Ala Pro Ile Asn Leu Thr Asp Arg Leu His Gln Val Leu Arg Trp

930 935 940

Ala Thr Gly Ser Val Glu Ile Phe Phe Ser Arg Asn Asn Ala Leu Phe

945 950 955 960

Ala Ser Pro Arg Met Lys Leu Leu Gln Arg Val Ala Tyr Phe Asn Ala

965 970 975

Gly Met Tyr Pro Phe Thr Ser Val Phe Leu Leu Ala Tyr Cys Leu Leu

980 985 990

Pro Ala Val Ser Leu Phe Ser Gly Lys Leu Ile Val Gln Arg Leu Ser

995 1000 1005

Ala Thr Phe Leu Ala Phe Leu Leu Val Ile Thr Leu Thr Leu Cys

1010 1015 1020

Leu Leu Ala Leu Leu Glu Ile Lys Trp Ser Gly Ile Thr Leu His

1025 1030 1035

Glu Trp Trp Arg Asn Glu Gln Phe Trp Val Ile Gly Gly Thr Ser

1040 1045 1050

Ala His Pro Ala Ala Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Val Ile Ala

1055 1060 1065

Gly Val Asp Ile Ser Phe Thr Leu Thr Ser Lys Pro Gly Asn Gly

1070 1075 1080

Gly Gly Asp Gly Gly Val Gly Gly Glu Gly Asn Asp Asp Glu Ala

1085 1090 1095

Phe Ala Glu Leu Tyr Glu Val Arg Trp Ser Tyr Leu Met Val Pro

1100 1105 1110

Pro Val Thr Ile Met Met Val Asn Ala Val Ala Ile Ala Val Ala

1115 1120 1125

Ala Ala Arg Thr Leu Tyr Ser Glu Phe Pro Gln Trp Ser Lys Leu

1130 1135 1140

Leu Gly Gly Ala Phe Phe Ser Phe Trp Val Leu Cys His Leu Tyr

1145 1150 1155

Pro Phe Ala Lys Gly Leu Leu Gly Arg Arg Gly Arg Val Pro Thr

1160 1165 1170

Ile Val Phe Val Trp Ser Gly Leu Ile Ser Met Ile Ile Ser Leu

1175 1180 1185

Leu Trp Val Tyr Ile Asn Pro Pro Ala Gly Ala Arg Glu Arg Ile

1190 1195 1200

Gly Gly Gly Gly Phe Ser Phe Pro

1205 1210

Claims

1、一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与水稻株高相关的由a)衍生的蛋白质。

2、权利要求1所述蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述编码基因是如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

4、含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在出发载体pCAMBIA1300的多克隆位点插入权利要求2或3所述基因，获得的重组表达载体。

6、扩增权利要求2或3所述基因全长或任一片段的引物对。

7、含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。

8、权利要求1所述蛋白的编码基因在改变水稻株高中的应用。

9、一种改变水稻株高和/或分蘖数的方法，是将权利要求2或3所述的基因导入目的水稻组织或细胞中，得到株高和/或分蘖数改变的转基因水稻。

10、一种培育矮杆和/或分蘖数增加的水稻的方法，是沉默目的水稻中所含有的权利要求2或3所述的基因，得到株高降低和/或分蘖数增加的转基因水稻。