CN110250270A - 一种利用植物乳杆菌提高发酵乳叶酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用植物乳杆菌提高发酵乳叶酸含量的方法。本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP‑7或其菌剂在提高发酵食品叶酸含量或者制备富含叶酸的发酵食品中的应用；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP‑7在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.17171。本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP‑7能够提高发酵乳叶酸含量。本发明对于开发和制作富含叶酸的发酵食品具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及发酵食品领域，特别涉及一种利用植物乳杆菌提高发酵乳叶酸含量的方法。
背景技术
叶酸(Folic acid)是重要的一碳单位的载体，参与体内DNA，RNA及蛋白质的合成密切相关，在机体内代谢过程中发挥着非常重要的作用，人体自身无法合成。我国孕妇、婴幼儿和中老年人群叶酸缺乏情况较为普遍。“国民营养计划(2017-2030年)”明确提出2030年将孕妇叶酸缺乏率控制在5％以下。世界卫生组织推荐的叶酸摄入量为：成人200μg/d，婴儿60μg/d，儿童100μg/d，孕妇400μg/d。对于孕妇等高叶酸需求人群，普通食物难于满足身体叶酸需求，药物补充存在增加消费者负担、部分情况下有副作用等问题。
植物乳杆菌是一种常见乳酸菌，广泛分布于泡菜、奶干、藏灵菇、火腿等多种发酵食品中，是我国可食用菌种名单中的菌株，近年研究发现一些植物乳杆菌具有潜在的产叶酸活性，因此开发基于高产叶酸的植物乳杆菌的发酵乳制品，增加居民叶酸摄入的途径，对于缓解和消除叶酸缺乏具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用植物乳杆菌提高发酵乳叶酸含量的方法。
第一方面，本发明要求保护植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7或其菌剂在提高发酵食品叶酸含量中的应用；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.17171。
其中，所述发酵食品可为发酵乳制品或含发酵乳制品的食品。
进一步地，所述发酵乳制品可为干酪、酸乳、发酵乳饮料或者乳酸菌饮料等。
发酵乳是指以生牛(羊)乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH值降低的产品。发酵乳饮料乳蛋白含量大于1％，乳酸菌饮料乳蛋白含量大于0.7％。
第二方面，本发明要求保护一种提高发酵乳制品中叶酸含量的方法(也可以看做是一种制备富含叶酸的发酵乳制品的方法)。
本发明所要求保护的提高发酵乳制品中叶酸含量的方法，可包括如下步骤：在制备发酵乳制品的过程中，调整原料乳的钙离子浓度，加入产叶酸乳酸菌，然后进行发酵，从而提高发酵乳中叶酸含量。
其中，所述发酵乳制品可为干酪、酸乳、发酵乳饮料或者乳酸菌饮料等。
在所述方法中，从所述产叶酸乳酸菌的加入时机上看：
对于所述干酪而言，所述产叶酸乳酸菌可于发酵时与干酪发酵剂一同加入或者在拌盐过程中拌入。
对于所述酸乳、所述发酵乳饮料和所述乳酸菌饮料而言，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7于发酵前加入。
在所述方法中，从所述产叶酸乳酸菌的加入方式上看：
对于所述酸乳而言，所述产叶酸乳酸菌可以与其他发酵菌组成的复配菌剂的形式加入；在所述复配剂中，所述产叶酸乳酸菌和所述其他发酵菌的接种量活菌数比值为20:1。其中，所述其他发酵菌可为保加利亚乳杆菌和/或嗜热链球菌。在本发明的具体实施方式中，所述其他发酵菌具体为丹尼斯克菌种YO-MIX300(由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成)。
对于所述发酵乳饮料和所述乳酸菌饮料而言，所述产叶酸乳酸菌可为单独使用，无需加入其他发酵菌。
对于所述干酪而言，所述产叶酸乳酸菌与所述干酪发酵剂的接种量活菌数比值可为10:1。其中，所述干酪发酵菌可为嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌和/或瑞士乳杆菌等。在本发明的具体实施方式中，所述干酪发酵菌具体为科汉森R704(由乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种组成)。
在所述方法中，从所述产叶酸乳酸菌的加入量上看：
对于所述酸乳，所述产叶酸乳酸菌在所述原料乳中的接种量为2×108CFU/mL。对于所述发酵乳饮料和所述乳酸菌饮料，所述产叶酸乳酸菌在所述原料乳中的接种量为1×107CFU/mL。对于所述干酪，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7在所述原料乳中的接种量1×108CFU/mL。
进一步地，所述调整原料乳的钙离子浓度可为用钙强化剂或/和钙添加剂调整原料乳的钙离子浓度。
更进一步地，所述调整原料乳的钙离子浓度可为采用氯化钙调整原料乳的钙离子浓度。
更加具体地，对于所述酸乳而言，可调整原料乳中钙离子浓度为100mg/L。对于所述发酵乳饮料和所述乳酸菌饮料而言，可调整原料乳中钙离子浓度为50mg/L。对于所述干酪而言，可调整原料乳中钙离子浓度为200mg/L。
在所述方法中，从加入所述产叶酸乳酸菌后的发酵条件看：
对于所述酸乳而言，发酵的温度可为42℃，发酵的时间可为6小时。
对于所述发酵乳饮料和所述乳酸菌饮料而言，发酵的温度可为37℃，发酵的时间可为16小时。
对于所述干酪而言，在于发酵时与所述干酪发酵剂一同加入所述产叶酸乳酸菌后，发酵的温度可为31℃，发酵的时间可为45min；成熟的温度可为25℃，成熟的时间可为8周。
进一步地，所述产叶酸乳酸菌可为产叶酸的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
更进一步地，所述产叶酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)具体可为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7；所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)GSLP-7在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.17171。
第三方面，本发明要求保护利用前文所述方法制备得到的发酵乳制品。
第四方面，本发明要求保护所述发酵乳制品在补充人体所需叶酸或增加人体对叶酸的摄入量中的应用。
所述应用为非疾病诊断治疗性应用。
实验证明，本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7能够提高发酵乳叶酸含量。本发明对于开发和制作富含叶酸的发酵食品，缓解和治疗叶酸缺乏症状具有重要意义。
保藏说明
菌株名称：植物乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus plantarum
参椐的生物材料(株)：GSLP-7
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2019年01月14日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17171
附图说明
图1为API 50CHL(bioMérieux,Inc.,Marcy l'Etoile,France)糖醇发酵反应结果。
图2为菌株GSLP与NCBI的BLAST比对结果。
图3为不同乳酸菌在SDM培养基中的叶酸产量。
图4为不同浓度甲氨蝶呤平板选育。1-5号平板甲氨蝶呤浓度依次递增，分别为0.625mg/L，1.25mg/L，2.5mg/L，5mg/L，10mg/L。
图5为不同含钙化合物对植物乳杆菌GSLP-7胞内叶酸产量影响(P<0.01)。
图6为钙离子胁迫下植物乳杆菌叶酸合成关键酶基因表达量差异。
图7为钙离子浓度对植物乳杆菌GSLP-7发酵制备酸乳中叶酸含量的影响(p<0.01)。
图8为其他发酵剂与GSLP-7复配比例对酸乳叶酸含量的影响。
图9为GSLP-7酸乳叶酸含量随保藏时间的变化。
图10为发酵温度对复配发酵剂酸乳中叶酸产量的影响。
图11为钙离子浓度对植物乳杆菌GSLP-7发酵制备干酪中叶酸含量的影响。
图12为植物乳杆菌GSLP-7的不同加入方式和加入量对发酵制备干酪中叶酸含量的影响。
图13为不同温度成熟的干酪叶酸含量随成熟时间变化。
图14为钙离子浓度对植物乳杆菌GSLP-7发酵制备乳酸菌饮料中叶酸含量的影响。
图15为发酵温度对植物乳杆菌GSLP-7发酵制备乳酸菌饮料中叶酸产量的影响。
图16为发酵时间对植物乳杆菌GSLP-7发酵制备乳酸菌饮料中叶酸产量的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
SDM培养基的配制方法：胰蛋白胨10.0g、YNB(酵母氮源)6.7g、K2HPO4 2.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸钠5.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL，加蒸馏水至1000mL，1mol/L乙酸调pH 6.6，121℃灭菌15min。
实施例1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7的分离与鉴定
一、菌种的分离纯化
从我国传统发酵乳制品藏灵菇中分离乳酸菌。取5g待分离样品加入45mL生理盐水中，震荡混匀后逐级稀释，取稀释后的菌液50μL涂布于MRS(MRS培养基配方：蛋白陈l0g，牛肉浸膏l0g，酵母膏5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，吐温80 1mL，柠檬酸二胺2g，七水合硫酸镁0.58g，四水合硫酸锰0.25g，蒸馏水1000m1，pH6.2-6.4。)琼脂平板(MRS中加入1.5％质量分数的琼脂)，于37℃厌氧条件下培养48-72h。重复划线培养3次，挑取单菌落。将通过以上方法筛选出的其中一个菌株，编号为GSLP。
二、菌株GSLP的常规鉴定
挑取平板上生长的乳杆菌典型菌落进行革兰氏染色，镜检结果显示菌株GSLP为阳性；
过氧化氢酶试验，试验结果显示菌株GSLP为阴性，初步鉴定菌株GSLP为乳杆菌。
再通过API 50CHL(bioMérieux,Inc.,Marcy l'Etoile,France)糖醇发酵反应进一步鉴定，结果显示菌株GSLP为植物乳杆菌(图1)。
16s rDNA检测：提取菌株基因组，PCR扩增16s rDNA特征序列片段，通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。测序获得GSLP-7 16srDNA序列为SEQ ID No.1，其与NCBI的BLAST比对结果显示菌株GSLP为植物乳杆菌(图2)。
三、高产叶酸植物乳杆菌GSLP-7的选育
1、高产叶酸植物乳杆菌的筛选
将15株乳酸菌(图3)活化2代后，接种到SDM培养基中37℃培养16h后，对培养液进行离心(7000rpm/10min)处理去除菌体，上清用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱检测上清中叶酸含量，减去SDM空白培养基中固有的叶酸含量值(SDM中的胰蛋白胨和YNB等会含有少量的叶酸)，结果发现植物乳杆菌GSLP叶酸产量最高，为1.6μg/mL(如图3所示)。
2、高产叶酸植物乳杆菌的培育
甲氨蝶呤为叶酸的类似物会与菌株叶酸受体结合，抑制菌株的生长繁殖。高产叶酸菌株能够自身合成叶酸抵抗其抑制作用。因此，采用不同浓度的甲氨蝶呤(CAS#:59-05-2，美国Sigma公司)0.625mg/L，1.25mg/L，2.5mg/L，5mg/L和10mg/L进一步对植物乳杆菌GSLP进行叶酸高产菌株的选育。具体操作如下：在SDM培养基中添加上述不同浓度的甲氨蝶呤和1.5％的琼脂，制备甲氨蝶呤SDM平板，将植物乳杆菌GSLP活化后涂布于0.625mg/L平板上，涂布浓度为10-100CFU/板，37℃培养2天，挑取平板上菌落涂布于更高一级浓度平板1.25mg/L，依次最终涂布于10mg/L平板，且保藏每个平板上的菌落。然后将各单菌落活化2代后，接种到SDM培养基中37℃培养16小时后，对培养液进行离心(7000rpm/10min)处理去除菌体，上清用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱检测上清中叶酸含量，减去SDM空白培养基中固有的叶酸含量值，即为胞外叶酸含量。胞内叶酸含量是将菌株发酵的SDM培养液，采用Constant TS 0.75kw细胞破碎仪进行高压细胞破壁，压力2000bar，连续处理3次，之后液相色谱检测上清中叶酸含量并减掉破壁前发酵上清中叶酸含量。
结果显示：在5mg/L甲氨蝶呤平板上获得高产叶酸菌株，液相色谱检测胞外叶酸产量为3.5μg/mL、胞内叶酸产量为6.5～9.7μg/mL(图4和表1)。将该高产叶酸菌株命名为GSLP-7。
表1不同单菌落的叶酸胞外产量
经上述鉴定，可知菌株GSLP-7为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株已经于2019年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17171。
实施例2、植物乳杆菌GSLP-7在提高发酵乳叶酸含量中应用
一、钙离子对于植物乳杆菌合成叶酸产量的影响
1、考察了碳酸钙、磷酸钙和氯化钙三种含钙化合物(均为国药集团产品，食品级)对植物乳杆菌GSLP-7叶酸产量的影响，将3种含钙化合物加入到SDM培养基中至终浓度0.1mol/L，115℃，15min灭菌，冷却至室温接种GSLP-7菌株1×107CFU/mL，37℃发酵16小时，液相色谱检测发酵液上清和GSLP-7菌体破壁后叶酸含量。菌体破壁采用超压破壁法，将菌液经2000bar瞬时压力连续处理3次后检测上清叶酸含量减掉破壁前上清的叶酸含量即为菌株胞内叶酸含量(Constant TS 0.75KW超高压细胞破壁仪)。
结果如图5所示，3种含钙化合物均能显著提高植物乳杆菌GSLP-7的叶酸产量(p<0.05)，其中氯化钙对植物乳杆菌GSLP-7的叶酸产量促进作用最强(p<0.05)，液相色谱检测氯化钙组植物乳杆菌GSLP-7胞内提取液的叶酸含量达11.52μg/mL。
2、采用转录组学技术，研究了钙离子胁迫下植物乳杆菌GSLP-7叶酸关键合成酶基因的表达差异。将GSLP-7菌株分别接种于氯化钙浓度分别为0mg/mL和100mg/mL的500mLSDM培养基中(3平行)，接种量1×107CFU/mL，37℃培养16小时后，离心获得菌体，提取总RNA，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量2ug，浓度≥100ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。去除rRNA。片段化mRNA，加入fragmentation buffer(invitrogen公司)，将mRNA随机断裂成200bp左右的小片段。反转合成cDNA，在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP(Sigma公司)，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。连接adaptor，双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix(Invitrogen公司)将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。最后采用Illumina Hiseq上机测序。获得数据进行DESeq2表达量差异分析。
结果如图6所示，叶酸合成的关键酶folp基因(二轻喋呤合成酶基因，dihydropteroate synthase)在100mg/L钙离子胁迫下表达量上调了2.067倍(p<0.05)。
二、植物乳杆菌GSLP-7提高酸乳中叶酸含量
制备酸乳的工艺流程：①配料：生牛乳添加7％的蔗糖和添加剂(如氯化钙、明胶等)，搅拌溶解；②杀菌：采用巴氏杀菌工艺(72℃，15分钟)；③降温至40℃；④接种：其他发酵剂和GSLP-7；⑤发酵；⑥终止发酵：冷却降温至5-10℃；⑦搅拌灌装；⑧酸乳成品。
1、原料乳钙离子浓度的确定
将植物乳杆菌GSLP-7分别接种于氯化钙含量为0mg/L，20mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L和200mg/L的巴氏杀菌乳中，接种量1×107CFU/mL，37℃发酵18小时后，液相色谱法检测发酵乳上清中的叶酸含量。检测前发酵乳样品进行处理：量取10g发酵乳样品，转入100mL锥形瓶中，加30mL磷酸缓冲液，振摇5min后，加入1mL鸡胰腺溶液(鼎国公司)和1mL胃蛋白酶溶液(鼎国公司)，加入3滴～5滴甲苯后，混合置于37℃恒温培养箱内酶解16～20h，在此期间，避光。然后取出，进行高压破壁处理，Constant TS 0.75KW,2000bar连续处理3次。离心10000r/min，10min，用无菌注射器吸取上清液，过0.45μm微孔滤膜，注入棕色液相小瓶中液相色谱检测。
结果如图7所示。将植物乳杆菌GSLP-7分别接种于氯化钙浓度为0mg/L，20mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L和200mg/L的巴氏杀菌乳中，发酵18小时后，检测发酵乳上清中的叶酸含量分别为0.61μg/mL、1.23μg/mL、1.55μg/mL、2.02μg/mL、1.62μg/mL和1.58μg/mL，在氯化钙浓度为100mg/L左右的叶酸产量显著高于其他浓度组(p＜0.01)，且添加氯化钙后叶酸产量均高于不添加氯化钙的样品。
2、植物乳杆菌GSLP-7加入方式和加入量的确定
为了检测植物乳杆菌GSLP-7与酸乳发酵菌株(嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌)复配对酸乳叶酸含量的影响，研究向巴氏杀菌(72℃，15min)后的牛乳中接种不同活菌数比例的GSLP-7菌株(冻干粉)与商品发酵剂干粉(丹尼斯克YO-MIX300，由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)，包括YO-MIX 300：GSLP-7＝20：1(GSLP-7接种量为1×107CFU/mL)，10:1(GSLP-7接种量为1×107CFU/mL)，1:1(GSLP-7接种量为1×107CFU/mL)，1:10(GSLP-7接种量为1×108CFU/mL)，1：20(GSLP-7接种量为2×108CFU/mL)，接种后42℃发酵牛乳6小时，液相色谱法检测酸乳中叶酸含量，确定最优复配比例，研究以YO-MIX 300(接种量1×107CFU/mL)单独发酵的酸乳为对照。
结果如图8所示，植物乳杆菌GSLP-7比例越高其叶酸产量越高，在商业发酵剂(丹尼斯克菌种YO-MIX300)与植物乳杆菌GSLP-7接种比例为1：20(活菌数比值)时，叶酸含量为1.81μg/mL，而只用发酵剂(丹尼斯克菌种YO-MIX300)发酵的酸乳测得叶酸含量只有0.02μg/mL，两者相差91倍。且通过图9可知到达发酵终点后，储藏于0～4℃条件下，10天储藏期内测得叶酸含量无大幅度下降。活菌计数结果显示(表2)，酸乳中总的乳酸菌活菌数达到109CFU/mL的数量级，符合国家酸乳活菌数标准(≥1×106CFU/mL)。
表2 GSLP-7酸乳样品总活菌数变化109CFU/mL(n＝3，x士SD)
3、发酵温度的确定
考察了在酸乳复配发酵剂中(丹尼斯克菌种YO-MIX300与植物乳杆菌GSLP-7)，发酵温度对酸乳叶酸含量的影响。巴氏杀菌牛乳(72℃，15min)中接种丹尼斯克菌种YO-MIX300和GSLP-7菌株，接种比例1:20(活菌数比值)GSLP-7接种量为2×108CFU/mL)，接种后分别置于30，37，42和45℃下发酵6小时后，液相色谱法检测发酵乳上清中叶酸含量。
结果如图10所示。结果显示当发酵温度为42℃时，菌株的叶酸产量最高为1.82μg/mL。
通过上述实验，最终确定在制备酸乳的过程利用植物乳杆菌GSLP-7提高酸乳中叶酸含量的最优条件如下：1、采用氯化钙调整原料乳钙离子浓度为100mg/L。2、植物乳杆菌GSLP-7于发酵前加入，以与其他发酵菌(丹尼斯克菌种YO-MIX300)组成的复配菌剂的形式加入；在所述复配剂中，所述植物乳杆菌GSLP-7和所述其他发酵菌的配比为20:1(活菌数比值)；植物乳杆菌GSLP-7的加入量为原料乳的GSLP-7接种量为2×108CFU/mL。3、加入植物乳杆菌GSLP-7后的发酵条件：发酵温度42℃，发酵时间6h。
三、植物乳杆菌GSLP-7提高干酪中叶酸含量
制备干酪的工艺流程：①新鲜牛奶经过65℃，30min巴氏杀菌后冷却到31℃，②加入干酪发酵剂(R704，科汉森公司)和GSLP-7菌株(接种量1×108CFU/mL)，在31℃，45min条件下发酵，③加入氯化钙200mg/L(市售食品添加剂)、凝乳酶(科汉森公司)，静置40min等待凝乳，④待凝固后取出干酪切成1cm左右的方块，继续升温，每5min升高1℃，至38℃，在pH降低至6.1—6.2时，⑤排乳清，⑥在38℃堆酿，⑦待pH继续降低至5.4—5.5时，将干酪揉碎，同时加入2％(w/w)的食盐，⑧装入模具压榨将乳清排出。⑨真空包装，25℃条件下成熟8周。叶酸检测前干酪样品处理：取干酪样品加入10倍体积的0.01M PBS，匀浆。取10mL干酪浆转入100mL锥形瓶中，加30mL磷酸缓冲液，振摇5min后，加入1mL鸡胰腺溶液(鼎国公司)和1mL胃蛋白酶溶液(鼎国公司)，加入3滴～5滴甲苯后，混合置于37℃恒温培养箱内酶解16～20h，在此期间，避光。然后取出，进行高压破壁处理，Constant TS 0.75KW,2000bar连续处理3次。离心10000r/min，10min，用无菌注射器吸取上清液，过0.45μm微孔滤膜，注入棕色液相小瓶中液相色谱检测。
1、原料乳钙离子浓度的确定
干酪制作、检测方法与上述相同，仅步骤③中添加的氯化钙设置两个浓度0mg/L(对照组)和200mg/L(市售食品添加剂)，制作2组干酪，考察添加氯化钙对干酪中叶酸含量的影响。
结果显示：氯化钙添加量为200mg/L时，干酪中的叶酸含量为0.436μg/g，显著高于未添加组干酪的叶酸含量0.155μg/g(p<0.05)(图11)。
2、植物乳杆菌GSLP-7加入方式和加入量的确定
干酪加工与检测方法与上述相同，区别在于分别将GSLP-7菌株以4种方式添加：
①干酪发酵剂与GSLP-7菌株(接种量1×107CFU/mL)同时加入，比例为1：1；
②干酪发酵剂与GSLP-7菌株(接种量1×108CFU/mL)同时加入，比例为1：10；
③GSLP-7菌株(接种量1×107CFU/mL)在拌盐时加入，与干酪发酵剂比例为1：1；
④GSLP-7菌株(接种量1×108CFU/mL)在拌盐时加入，与干酪发酵剂比例为1：10；
结果显示：添加GSLP-7菌株后干酪中的叶酸含量均高于对照组未添加GSLP-7的干酪，相同添加比例GSLP-7菌株与干酪发酵剂一同加入高于在拌盐过程中加入(p<0.05)，当植物乳杆菌GSLP-7与干酪发酵剂一同加入且比例为“发酵剂：GSLP-7(接种量1×108CFU/mL)＝1:10”时，最终所得干酪中叶酸含量最高，可达0.436μg/g(图12)。
3、干酪成熟温度和时间的确定
干酪制作和检测方法与上述相同，区别在于干酪包装后置于不同的温度下(4℃，10℃和25℃)成熟，并在1，2，4，6，8周是采样检测干酪中叶酸的含量，考察成熟温度对干酪中叶酸含量的影响。
结果如图13所示。在对干酪进行液相色谱检测发现，在相同成熟温度及时间条件下，添加植物乳杆菌GSLP-7菌株(与干酪发酵剂一同添加，GSLP接种量为1×108CFU/mL)的实验组干酪叶酸含量要高于对照未添加植物乳杆菌GSLP-7组的叶酸含量。添加GSLP-7菌株的干酪随成熟时间延长叶酸含量不断增加，而对照组则叶酸含量无显著变化(p>0.05)。添加GSLP-7菌株的干酪在25℃，成熟8周时叶酸含量达0.436μg/g，是同条件下对照组的3.69倍(p<0.05)。
通过上述实验，最终确定在制备干酪的过程利用植物乳杆菌GSLP-7提高干酪中叶酸含量的最优条件如下：1、采用氯化钙调整原料乳钙离子浓度为200mg/L。2、植物乳杆菌GSLP-7(1×108CFU/mL)与干酪发酵剂(R704，科汉森)以10:1比例一同加入。3、加入植物乳杆菌GSLP-7后的发酵条件：发酵温度31℃，发酵时间45min；成熟的温度为25℃，成熟的时间为8周。
四、植物乳杆菌GSLP-7提高乳酸菌饮料中叶酸含量
制备乳酸菌饮料的一般工艺流程：①配料：90℃纯水溶解15％质量分数的白砂糖(市售)，保温5min，冷却至40℃以下，加入1.5-2％(w/w)脱脂奶粉和氯化钙40-50℃剪切乳化15min。②杀菌：63-65℃，30分钟；③降温：降温至37±1℃；④接种：加入植物乳杆菌GSLP-7，接种量1×107CFU/mL；⑤发酵：37℃发酵16小时；⑥调味，定容：加水定容至乳蛋白含量不低于0.7％，用柠檬酸(市售)调总酸度0.42％(w/w)；⑦灌装冷藏(4℃)乳酸菌饮料成品。
1、原料乳钙离子浓度的确定
加工和检测方法与上述相同，区别在于配料①环节分别添加0mg/L，50mg/L和100mg/L的氯化钙，考察不同浓度钙离子对饮料叶酸含量的影响。
结果显示：氯化钙添加量50mg/L和100mg/L时的乳酸菌饮料叶酸含量高于未添加组(0mg/L)(p<0.05)，50mg/L和100mg/L两组差异不明显，但100mL组饮料出现沉淀，因此较为合适的氯化钙添加量为50mg/L，此时的乳酸菌饮料叶酸含量为1.74μg/mL(图14)。
2、加入植物乳杆菌GSLP-7后发酵温度和时间的确定
加工方法如上所述，不同之处在于，将步骤⑤的发酵温度分别调整为10℃，20℃，30℃，37℃和42℃，考察不同发酵温度对GSLP-7菌株在饮料中叶酸产量的影响。
结果如图15所示，对于制备发酵乳饮料和乳酸菌饮料而言，植物乳杆菌GSLP-7相同接种量(1×107CFU/mL)条件下，发酵温度为37℃时发酵乳中叶酸的含量最高1.74μg/mL(p<0.05)。
加工方法如上所述，不同之处在于，将步骤⑤的发酵温度设为37℃，考察不同发酵时间(3，6，9，12，16，18，24和36小时)对GSLP-7菌株在饮料中叶酸产量的影响。
结果如图16所示，随着发酵时间的延长，叶酸的合成量逐渐增加，在16小时左右达到最高值，叶酸含量达1.66μg/mL，且在一定时间范围内保持稳定不变，培养后期略有下降。应该是由于初期菌种在发酵过程中会消耗部分叶酸，叶酸含量增长较慢，当菌种生长开始进入到对数期，叶酸的产生量大于消耗量，叶酸含量呈现除了不断上升的趋势；后期随着菌体老化发生老化，且产酸量过高，合成的叶酸在酸性条件下稳定性差而导致部分分解，所以后期阶段叶酸产量有下降趋势。
通过上述实验，最终确定在制备发酵乳饮料和乳酸菌饮料的过程利用植物乳杆菌GSLP-7提高发酵乳饮料和乳酸菌饮料中叶酸含量的最优条件如下：1、采用氯化钙调整原料乳钙离子浓度为50mg/L。2、植物乳杆菌GSLP-7于发酵前单独加入，加入量为原料乳的1×107CFU/mL，无需加入其他发酵菌。3、加入植物乳杆菌GSLP-7后的发酵条件：发酵温度37℃，发酵时间16h。
实施例3、植物乳杆菌GSLP-7发酵的酸乳对叶酸缺乏大鼠的治疗效果
本实施例考察了GSLP-7发酵的酸乳对叶酸缺乏大鼠的治疗效果。实验流程：叶酸缺乏大鼠造模，
①前6周的时间，按照以下分组进行饲喂(所用饲料均采购自南通特洛菲饲料科技有限公司)：
第1组空白对照组：6只SD大鼠，采用标准对照饲料(含叶酸不含抗生素)饲喂；
第2组阴性对照组：6只SD大鼠，叶酸缺乏饲料(不含叶酸含抗生素)；
第3组阳性对照组：6只SD大鼠，叶酸缺乏饲料(不含叶酸含抗生素)；
第4组GSLP-7酸奶饲喂组：6只SD大鼠，叶酸缺乏饲料(不含叶酸含抗生素)；
第5组普通酸奶饲喂组：6只SD大鼠，叶酸缺乏饲料(不含叶酸含抗生素)；
造模六周后，眼球采血，检测血清叶酸浓度。
②第7周开始干预治疗阶段，时间持续两周：
第1组空白对照组：6只SD大鼠，采用标准对照饲料(含叶酸不含抗生素)饲喂，同时每天灌胃3mL无菌生理盐水；
第2组阴性对照组：6只SD大鼠，叶酸缺乏饲料(不含叶酸含抗生素)，同时每天灌胃3mL无菌生理盐水；
第3组阳性对照组：6只SD大鼠，含叶酸不含抗生素的标准对照饲料，同时每天灌胃3mL无菌生理盐水；
第4组GSLP-7酸奶饲喂组：6只SD大鼠，不含叶酸不含抗生素的标准对照饲料，灌胃添加了植物乳杆菌GSLP-7的酸奶样品3mL/天；
第5组普通酸奶饲喂组：6只SD大鼠，不含叶酸不含抗生素的标准对照饲料，灌胃不添加植物乳杆菌GSLP-7的普通酸奶样品3mL/天；
干预治疗结束后，眼球采血，检测血清叶酸浓度。
血清的叶酸检测采用Rat FAELISAKIT试剂盒(mlbio公司)。
结果如表3所示。可见，正常饲喂的空白对照组大鼠血清叶酸浓度为2.9～3.3nmol/L，叶酸缺乏饲料造模饲喂六周之后，大鼠血清叶酸浓度降低至0.7～0.9nmol/L左右的水平，随后的干预治疗阶段，GSLP-7酸乳组对大鼠血清叶酸浓度影响最为显著，干预治疗约两周后可以达到4.11±0.18nmol/L左右的水平，是治疗前叶酸缺乏大鼠血清叶酸浓度的6倍，是空白对照(健康大鼠)的1.4倍左右，普通酸乳组2.2～2.4nmol/L(P<0.01)，血清叶酸水平比空白对照(健康大鼠)略低(p<0.01)。
表3 SD大鼠血清叶酸含量
<110> 北京工商大学
<120> 一种利用植物乳杆菌提高发酵乳叶酸含量的方法
<130> GNCLN191440
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
tgcaagtcga acgacctctg cgtatagatt ggtgcttgca tcatgattta catttgagtg 60
agtggcgaac tggtgagtaa cacgtgggca acctgcccag aagcggggga taacacctgg 120
aaacagatgc taataccgca taacaacttg gaccgcatgg tccgagcttg aaagatggct 180
tcggctatca cttttggatg gtcccgcggc gtattagcta gatggtgggg taacggctca 240
ccatggcaat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg actgagacac 300
ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat 360
ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt gttaaagaag 420
aacatatctg agagtaactg ttcaggtatt gacggtattt aaccagaaag ccacaattaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 540
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gtgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac 720
tgacgctgag gctcgaaagt atgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccatac 780
cgtaaacgat gaatgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcattc cgcctgggga gtacggccgc ttggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt 960
ctagacatac tatgcaaatc taagagatta gacgttccct tcggggacat ggatacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg cagcgagcgc 1080
aacccttatt atcagttgcc agcattaagt tgggcactct ggtgagactg cgcctgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg aactcgcgag agtaagctaa tctcttaaag 1260
ccattctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggataa gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccatgagagt ttgtaacacc ccaagtcggt agggtaacct tttaggaacc agccgcct 1438
Claims (10)
1.如下任一应用：
(A1)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7或其菌剂在提高发酵食品叶酸含量中的应用；
(A2)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7或其菌剂在制备富含叶酸的发酵食品中的应用；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.17171。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵食品为发酵乳制品。
3.一种提高发酵乳制品中叶酸含量的方法，或者一种制备富含叶酸的发酵乳制品的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：调整原料乳的钙离子浓度，加入产叶酸乳酸菌，然后进行发酵，从而提高发酵乳中叶酸含量。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵乳制品为干酪、酸乳、发酵乳饮料或者乳酸菌饮料；和/或
进一步地，所述产叶酸乳酸菌为产叶酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
更进一步地，所述产叶酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.17171。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对于所述干酪，在制备过程中，所述产叶酸乳酸菌于发酵时与干酪发酵剂一同加入或者在拌盐过程中拌入；
或
对于所述酸乳、所述发酵乳饮料和所述乳酸菌饮料，在制备过程中，所述产叶酸乳酸菌于发酵前加入。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：对于所述酸乳，在制备过程中，所述产叶酸乳酸菌以与其他发酵菌组成的复配菌剂的形式加入；在所述复配剂中，所述产叶酸乳酸菌和所述其他发酵菌的活菌数比值为20:1；
进一步地，所述其他发酵菌为保加利亚乳杆菌和/或嗜热链球菌；
或
对于所述发酵乳饮料和所述乳酸菌饮料，在制备过程中，所述产叶酸乳酸菌单独使用；
或
对于所述干酪，在制备过程中，所述产叶酸乳酸菌与所述干酪发酵剂的接种量活菌数比值为10:1；
进一步地，所述干酪发酵菌为嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌和/或瑞士乳杆菌。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：对于所述酸乳，在制备过程中，所述产叶酸乳酸菌的加入量为2×108CFU/mL原料乳；
或
对于所述发酵乳饮料和所述乳酸菌饮料，在制备过程中，所述产叶酸乳酸菌的加入量为1×107CFU/mL原料乳；
或
对于所述干酪，在制备过程中，所述产叶酸乳酸菌的加入量为1×108CFU/mL原料乳。
8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于：所述调整原料乳的钙离子浓度为用钙强化剂或/和钙添加剂调整原料乳的钙离子浓度；
更进一步地，所述调整原料乳的钙离子浓度为采用氯化钙调整原料乳的钙离子浓度；
更加具体地，对于所述酸乳，调整原料乳中钙离子浓度为100mg/L；或
更加具体地，对于所述发酵乳饮料和所述乳酸菌饮料，调整原料乳中钙离子浓度为50mg/L；或
更加具体地，对于所述干酪，调整原料乳中钙离子浓度为200mg/L。
9.根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于：对于所述酸乳，发酵的温度为42℃，和/或发酵的时间为6h；
或
对于所述发酵乳饮料和所述乳酸菌饮料，发酵的温度为37℃，和/或发酵的时间为16h；
或
对于所述干酪，在于发酵时与所述干酪发酵剂一同加入所述产叶酸乳酸菌后，发酵的温度为31℃，和/或发酵的时间为45min；和/或成熟的温度为25℃，和/或成熟的时间为8周。
10.利用权利要求3-9所述方法制备得到的发酵乳制品；
或
所述发酵乳制品在补充人体所需叶酸或增加人体对叶酸的摄入量中的应用。
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