CN110241052A - 一株高产叶酸植物乳杆菌gslp-7及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产叶酸植物乳杆菌GSLP‑7及其应用。本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP‑7，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.17171。本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP‑7能够高效合成叶酸，在SDM培养基中37℃，培养16小时，胞外叶酸产量达3.5μg/mL，胞内叶酸产量达9.7μg/mL。本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP‑7对开发和制作富含叶酸的发酵食品具有重要意义。

Description

一株高产叶酸植物乳杆菌GSLP-7及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一株高产叶酸植物乳杆菌GSLP-7及其应用。
背景技术
叶酸(Folic acid)是生物体中一种重要的维生素，作为一碳单位的载体参与的甲基化反应，与体内DNA，RNA及蛋白质的合成密切相关，在机体内代谢过程中发挥着非常重要的作用。我国孕妇、婴幼儿和中老年人群叶酸缺乏情况较为普遍。“国民营养计划(2017-2030年)”明确提出2030年将孕妇叶酸缺乏率控制在5％以下。世界卫生组织推荐的叶酸摄入量为：成人200μg/d，婴儿60μg/d，儿童100μg/d，孕妇400μg/d。增加叶酸摄入目前主要有四种方式，①药物；②叶酸强化食品；③改善食品结构增加摄入富含叶酸的食物；④富含叶酸的发酵食品。药物补充叶酸目前已在我国孕期妇女人群中广泛开展，但存在价格高，部分服药者不易坚持和心理排斥现象。叶酸强化食品仅在美国、加拿大等国家实施，目前我国尚未实施。改善食品结构存在受地域限制不易推广和成本过高的问题，如西北和内蒙地区蔬菜和水果消费量普遍偏低，另外一些果蔬中叶酸的人体吸收和利用率低，导致孕妇等叶酸高需求人群需大量摄入，对肠胃、消化系统造成压力。一些发酵食品富含叶酸，其中的微生物能够合成高活性的四氢叶酸直接为人体利用，具有良好的食品工业应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产叶酸植物乳杆菌GSLP-7及其应用。
第一方面，本发明要求保护一株植物乳杆菌。
本发明要求保护的植物乳杆菌具体为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.17171。
第二方面，本发明要求保护一种菌剂。
本发明要求保护的菌剂为含有所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7的菌剂。
所述菌剂的活性成分为所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7，还可含有其他辅料、助剂等。
第三方面，本发明要求保护所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7或所述菌剂在如下任一中的应用：
(A1)生产叶酸；
(A2)制备用于生产叶酸的产品。
第四方面，本发明要求保护一种生产叶酸的方法。
本发明所要求保护的生产叶酸的方法，可包括如下步骤：将所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7在发酵培养基中进行发酵培养，从发酵产物中获得叶酸。
进一步地，所述发酵培养基可为SDM培养基。
更进一步地，所述SDM培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：胰蛋白胨10.0g/L、YNB(酵母氮源)6.7g/L、K2HPO4 2.0g/L、无水乙酸钠5.0g/L、柠檬酸钠5.0g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1.0mL/L；pH 6.6。
更进一步地，所述发酵培养的温度为37±3℃(如37℃)。培养温度降低，叶酸产量下降，降低至10℃产量下降15％；培养温度过高，叶酸产量下降，温度42℃，叶酸产量降低28％。所述发酵培养的时间为16±1小时(如16小时)。培养时间延长或缩短2小时产量降低约14％。
第五方面，本发明要求保护所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7在制备所述菌剂中的应用。
实验证明，本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7能够高效合成叶酸，在SDM培养基中37℃，培养16小时，胞外叶酸产量达3.5μg/mL，胞内叶酸产量达9.7μg/mL。本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7对于开发和制作富含叶酸的食品具有重要意义。
保藏说明
菌株名称：植物乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus plantarum
参椐的生物材料(株)：GSLP-7
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2019年01月14日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17171
附图说明
图1为API 50CHL(bioMérieux,Inc.,Marcy l'Etoile,France)糖醇发酵反应结果。
图2为菌株GSLP与NCBI的BLAST比对结果。
图3为不同乳酸菌在SDM培养基中的叶酸产量。
图4为不同浓度甲氨蝶呤平板选育。1-5号平板甲氨蝶呤浓度依次递增，分别为0.625mg/L，1.25mg/L，2.5mg/L，5mg/L，10mg/L。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
SDM培养基的配制方法：胰蛋白胨10.0g、YNB(酵母氮源)6.7g、K2HPO4 2.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸钠5.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL，加蒸馏水至1000mL，1mol/L乙酸调pH 6.6，121℃灭菌15min。
实施例1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7的分离与鉴定
一、菌种的分离纯化
从我国传统发酵乳制品藏灵菇中分离乳酸菌。取5g待分离样品加入45mL生理盐水中，震荡混匀后逐级稀释，取稀释后的菌液50μL涂布于MRS(MRS培养基配方：蛋白陈l0g，牛肉浸膏l0g，酵母膏5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，吐温80 1mL，柠檬酸二胺2g，七水合硫酸镁0.58g，四水合硫酸锰0.25g，蒸馏水1000m1，pH6.2-6.4。)琼脂平板(MRS中加入1.5％质量分数的琼脂)，于37℃厌氧条件下培养48-72h。重复划线培养3次，挑取单菌落。将通过以上方法筛选出的其中一个菌株，编号为GSLP。
二、菌株GSLP的常规鉴定
挑取平板上生长的乳杆菌典型菌落进行革兰氏染色，镜检结果显示菌株GSLP为阳性；
过氧化氢酶试验，试验结果显示菌株GSLP为阴性，初步鉴定菌株GSLP为乳杆菌。
再通过API 50CHL(bioMérieux,Inc.,Marcy l'Etoile,France)糖醇发酵反应进一步鉴定，结果显示菌株GSLP为植物乳杆菌(图1)。
16s rDNA 检测：提取菌株基因组，PCR扩增16s rDNA特征序列片段，通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。测序获得GSLP-7 16srDNA序列为SEQ ID No.1，其与NCBI的BLAST比对结果显示菌株GSLP为植物乳杆菌(图2)。
三、高产叶酸植物乳杆菌GSLP-7的选育
1、高产叶酸植物乳杆菌的筛选
将15株乳酸菌(图3)活化2代后，接种到SDM培养基中37℃培养16h后，对培养液进行离心(7000rpm/10min)处理去除菌体，上清用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱检测上清中叶酸含量，减去SDM空白培养基中固有的叶酸含量值(SDM中的胰蛋白胨和YNB等会含有少量的叶酸)，结果发现植物乳杆菌GSLP叶酸产量最高，为1.6μg/mL(如图3所示)。
2、高产叶酸植物乳杆菌的培育
甲氨蝶呤为叶酸的类似物会与菌株叶酸受体结合，抑制菌株的生长繁殖。高产叶酸菌株自身能够合成叶酸抵抗其抑制作用。因此，采用不同浓度的甲氨蝶呤(CAS#:59-05-2，美国Sigma公司)0.625mg/L，1.25mg/L，2.5mg/L，5mg/L和10mg/L)进一步对植物乳杆菌GSLP进行叶酸高产菌株的选育。具体操作如下：在SDM培养基中添加上述不同浓度的甲氨蝶呤和1.5％的琼脂，制备甲氨蝶呤SDM平板，将植物乳杆菌GSLP活化后涂布于0.625mg/L平板上，涂布浓度为10-100CFU/板，37℃培养2天，挑取平板上菌落涂布于更高一级浓度平板1.25mg/L，依次最终涂布于10mg/L平板，且保藏每个平板上的菌落。然后将各单菌落活化2代后，接种到SDM培养基中37℃培养16小时后，对培养液进行离心(7000rpm/10min)处理去除菌体，上清用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱检测上清中叶酸含量，减去SDM空白培养基中固有的叶酸含量值，即为胞外叶酸含量。胞内叶酸含量是将菌株发酵的SDM培养液，采用Constant TS 0.75kw细胞破碎仪进行高压细胞破壁，压力2000bar，连续处理3次，之后液相色谱检测上清中叶酸含量并减掉破壁前发酵上清中叶酸含量。
结果显示：在5mg/L甲氨蝶呤平板上获得高产叶酸菌株，液相色谱检测胞外叶酸产量为3.5μg/mL、胞内叶酸产量为6.5～9.7μg/mL(图4和表1)。将该高产叶酸菌株命名为GSLP-7。
表1不同单菌落的叶酸胞外产量
经上述鉴定，可知菌株GSLP-7为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株已经于2019年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17171。
实施例2、植物乳杆菌GSLP-7的其他性质的鉴定
一、耐酸特性鉴定
将活化后的植物乳杆菌GSLP-7(CGMCC No.17171)菌种按3％(v/v)接种量接种到pH＝2.0和3.0的MRS培养基中，37℃恒温培养，分别在培养后1h、3h和6h，采用涂布平板计数法测定培养基中活菌数，以不调pH的MRS培养基(pH～6.8)为空白，试验重复2次。
试验结果表明植物乳杆菌GSLP-7(CGMCC No.17171)在pH＝3.0的MRS培养基中有着较好的耐受性，在培养3h后其有效活力为8.1×107cfu/mL，经过6h的培养后其有效活力仍然能达到6.57×107cfu/mL，这说明植物乳杆菌GSLP-7完全能耐受pH＝3.0的酸性环境。见表2。
表2植物乳杆菌GSLP-7对低pH值的耐受性结果
二、耐胆盐特性鉴定
将活化后的植物乳杆菌GSLP-7(CGMCC No.17171)菌种按3％(v/v)接种量接种到含有3mg/mL和6mg/mL胆盐的MRS培养基中，37℃恒温培养，分别在培养1h、3h和6h后，采用涂布平板计数法测定培养基中活菌数，以不加胆盐的MRS培养基为空白，试验重复2次，分别计算其有效活力。
结果表明植物乳杆菌GSLP-7(CGMCC No.17171)在含高胆盐质量浓度的培养基中，表现出较好的耐受性，在含3mg/mL和6mg/mL胆盐的MRS培养基中培养6h后，其有效活力分别为3.12×108cfu/mL和2.27×108cfu/mL，这表明植物乳杆菌GSLP-7完全能耐受高胆盐环境。见表3。
表3植物乳杆菌GSLP-7对高浓度胆盐的耐受结果
三、胆固醇清除能力鉴定
将植物乳杆菌GSLP-7(CGMCC No.17171)依次传代活化3代后使其恢复活力，按3％(v/v)的接种量接种于含有约100μg/mL胆固醇的MRS培养基中，37℃恒温培养24h后，采用邻苯二甲醛比色法测定培养基中残留胆固醇含量。
结果显示：植物乳杆菌GSLP-7(CGMCC No.17171)在MRS培养基中经过37℃培养24h后，对培养基中胆固醇有较高的胆固醇移除率，达到85.2％。
四、抗生素敏感性鉴定
采用抑菌圈法检测了植物乳杆菌GSLP-7(CGMCC No.17171)的抗生素敏感特性，结果显示：青霉素抑菌圈直径20.4mm(敏感)，氯霉素16.5mm(中度敏感)，赤霉素0mm(耐药)，红霉素23.7mm(敏感)，利福平14mm(耐药)，头孢噻肟21.5mm(中度敏感)，硫酸链霉素、硫酸卡那霉素、硫酸庆大霉素、盐酸万古霉素均为0mm(耐药)。与已报道的商品对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG相近。
<110> 北京工商大学
<120> 一株高产叶酸植物乳杆菌GSLP-7及其应用
<130> GNCLN191439
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
tgcaagtcga acgacctctg cgtatagatt ggtgcttgca tcatgattta catttgagtg 60
agtggcgaac tggtgagtaa cacgtgggca acctgcccag aagcggggga taacacctgg 120
aaacagatgc taataccgca taacaacttg gaccgcatgg tccgagcttg aaagatggct 180
tcggctatca cttttggatg gtcccgcggc gtattagcta gatggtgggg taacggctca 240
ccatggcaat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg actgagacac 300
ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat 360
ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt gttaaagaag 420
aacatatctg agagtaactg ttcaggtatt gacggtattt aaccagaaag ccacaattaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 540
taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctc aaccgaagaa 600
gtgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac 720
tgacgctgag gctcgaaagt atgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccatac 780
cgtaaacgat gaatgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcattc cgcctgggga gtacggccgc ttggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt 960
ctagacatac tatgcaaatc taagagatta gacgttccct tcggggacat ggatacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg cagcgagcgc 1080
aacccttatt atcagttgcc agcattaagt tgggcactct ggtgagactg cgcctgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg aactcgcgag agtaagctaa tctcttaaag 1260
ccattctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggataa gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccatgagagt ttgtaacacc ccaagtcggt agggtaacct tttaggaacc agccgcct 1438

Claims (8)

1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.17171。
2.菌剂，其活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7或权利要求2所述的菌剂在如下任一中的应用：
(A1)生产叶酸；
(A2)制备用于生产叶酸的产品。
4.一种生产叶酸的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7在发酵培养基中进行发酵培养，从发酵产物中获得叶酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基为SDM培养基。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为37±3℃。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的时间为16±1小时。
8.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GSLP-7在制备权利要求2所述菌剂中的应用。
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